Identificarea ADN uman prin tehnica PCR

Principiu
Orice organism poate fi identificat prin PCR utiliznd primeri specie specifici (a cror
secven se regsete doar n genomul unei singure specii). Pentru identificarea
speciei umane vom folosi o pereche de primeri descrii n literatura de specialitate
(Galmozzi E et al, J Viral Hepat, 2009) i care amplific o regiune necodificatoare
localizat pe cromosomul 19. Rezultatul pozitiv al testrii PCR utiliznd aceast
pereche de primeri va indica proveniena uman a materialului biologic din care a fost
extras ADN.
Mod de lucru
1.
Noteaz pe capacele a trei tuburi de 0.2 mL numerele probelor ce urmez a fi
analizate
2.
ntr-un tub de 1.5 mL realizez un mix PCR prin pipetarea reactivilor din
tabelul urmtor:
Nr.
crt.

Component

Volum
per
prob
(L)
26.7

Nr. de
probe

Volum final
(L)

106.8

1.

Ap ultrapur

2.

Tampon de reacie (concentrat 5X)

10

40

3.

Clorur de magneziu ( 25mM)

12

4.

Primer OUTER F (10 M)

5.

Primer OUTER R (10 M)

6.

Mix dNTPs (10 mM fiecare dNTP)

7.

Taq Polimeraz (5U/L)

0.3

1.2

3.
Omogenizeaz amestecul realizat la punctul 2
4.
Repartizeaz 45 L mix n tuburile de 0.2 mL marcate la punctul 1
5.
Adaug 5 L ADN n tuburile de 0.2 mL marcate corespunzator, respectiv 5 L
ap ultrapur n martorul negativ
6.
Incubeaz tuburile ntr-o main PCR folosind urmtorul profil termic:
Denaturare
iniiala

40 cicluri amplificare

94 C

Denaturare
94C

Hibridizare
58C

Elongare
72C

3 minute

30 secunde

30 secunde

1 minut

Elongare
final
72C
5 minute