Lucrarea Practică Nr.

12

Dozarea spectrotofometrică în domeniul vizibil (VIS) a α- amino

acizilor din probe de analizat

1.a. Determinarea spectrotofometrică în domeniul vizibil (VIS) a α -L-Alaninei dintr-o

probă de analizat în urma reacţiei de culoare cu Ninhidrina (2,2-Dihidroxi-indan-1,3-
diona sau tricetohidrinden-hidrat; 1,2,3 -indantriona hidrat )

O O
OH H
R CH COOH + + R-CHO
OH - CO2 OH
NH2 - NH3
O O
(1)
α-aminoacid Ninhidrina Diceto-alcool monohidroxilic aromatic
Hidrindantina (forma redusă a Ninhidrinei)

O O O NH4 O
H HO
+ NH3 + N
OH H
O O O O

(2) Diceto-alcool monohidroxilic Colorant indantrenic sub formă de

aromatic (Hidrindantina) Sare de amoniu albastră-violet
λmax. = 570 nm
pH = 4 – 8

Dacă radicalul R = -H, aminoacidul este α -L-Glicina, iar dacă R = -CH3, aminoacidul va
fi α -L-Alanina.
Principiul metodei. Mecanism: Ninhidrina (caracter oxidant pronunţat) reacţionează
cantitativ cu un α-aminoacid (Exemplu: glicina sau alanina) şi scindează complet molecula
aminoacidului, la încălzire t = 60-70 ͦ C timp de circa 8-10 minute, cu eliberare de dioxid de carbon
(CO2) obţinut din degradarea gruparea carboxil -COOH a aminoacidului şi amoniac NH3, format

1
prin descompunerea grupei amino -NH2 a α – aminoacidului. Ca produs principal de reacţie rezultă
un compus carbonilic (o aldehidă) R-CHO formată prin oxidarea restului catenei rămase de α-
aminoacid (de tipul R-CH-) → reacţia (1), în timp ce ninhidrina este redusă la un diceto-alcool
monohidroxilic aromatic (Hidrindantina). Dacă α- aminoacidul studiat este Glicina, atunci se
formează aldehida formică H-CHO; în caz că aminoacidul studiat este Alanina, atunci rezultă
aldehida acetică H3C-CHO, ambele cu un atom de Carbon C mai puţin decât aminoacidul iniţial.
În reacţia (2), diceto-alcoolul monohidroxilic aromatic intermediar format în exces (2
moli), reacţionează complet, cantitativ, cu molecula amoniacului NH3 eliberat din grupa amino (-
NH2) în reacţia (1), cu formarea unei sări de amoniu colorate în albastru-violet ce prezintă un
maxim de absorbţie la lungimea de undă λmax. = 570 nm (pH = 4-8) şi care poate fi dozată
spectrofotometric la această lungime de undă. Cele două reacţii chimice au loc succesiv, simultan,
una după cealaltă, doar la încălzire pe baie de apă sau bec de gaz. Sarea de amoniu (albastră-violet
intens) se formează într-un raport direct proporţional cantitativ cu α-aminoacidul luat în studiu. Prin
dozarea complexului albastru-violet intens la lungimea de undă λmax. = 570 nm, se determină
spectrofotometric cantitativ în mod direct α-aminoacidul studiat.
Această reacţie a aminoacizilor cu ninhidrina este o reacţie foarte sensibilă şi specifică,
utilizată frecvent pentru identificarea grupelor amino libere -NH2 din moleculele aminoacizilor
(analiză calitativă) , cât şi pentru determinarea cantitativă a acestor grupe amino primare libere -
NH2 din moleculele aminoacizilor (analiză cantitativă). Reacţia cu ninhidrina este dată doar de α-
aminoacizii ce prezintă grupe amino primare libere -NH2 în moleculă. Prolina şi hidroxiprolina nu
reacţionează cu ninhidrina deoarece grupele lor amino- sunt blocate de tip (-NH).

Structura chimică a Prolinei Structura chimică a Hidroxiprolinei

(acid pirolidin-2-carboxilic) (acid 4-hidroxipirolidin-2-carboxilic)

2
 Reactivi şi aparatură.
- pulbere cristalină standard pură p.a. de α-L Alanină din care se prepară soluţia stoc de α-
aminoacid şi apoi soluţiile etalon de α-L Alanină (utilizate pentru realizarea scării etalon şi
calibrarea spectrofotometrului);-
- soluţie stoc de L- Alanină, 300 μg/mL (0,03 g %) obținută din pulberea standard pură de
; α-L Alanină;
- soluție alcoolică de Ninhidrină 0,1 % preparată în alcool metilic sau alcool etilic absolut
p.a.;
- H2O distilată
- o serie de treisprezece soluţii etalon de L- Alanină cu un conţinut de 1,50 – 45,00
μg/mL α-L-alanină, preparate direct din soluţia stoc de α – L -Alanină de concentrație 300 μg/mL,
prin măsurarea exactă a volumelor de soluţie stoc 300 μg/mL, adăugarea volumelor
corespunzătoare de Ninhidrină 0,1% (Tabelul 1) și diluţii corespunzătoare cu apă distilată exact
până la VE = 20 mL;
- probă solidă de analizat ce conţine α – L -Alanină;
- spectrofotometru în UV-VIS tip CECIL;
- eprubete gradate de 20 mL;

Modul de lucru.
a) Prepararea soluţiei stoc de α – L -Alanină, 300 µg/mL (0,03 g %) :
Se cântăresc cu exactitate la balanţa analitică a = 0,0300 g de α – L -Alanină standard pur
solid cristalizat, ce se aduc cantitativ cu apă distilată într-un balon cotat V = 100 mL. Se
omogenizează până la dizolvare completă şi apoi se aduce cu acelaşi solvent la semn.
b) Prepararea soluţiilor etalon de α – L -Alanină (1,50 - 45,00 μg/mL) direct din soluţia
stoc 300 μg/mL, prin adăugarea volumelor corespunzătoare de soluţie alcoolică de Ninhidrină 0,1%
(Tabelul 1) şi diluţii corespunzătoare cu H2O distilată. Se folosesc eprubete gradate de 20 mL.
După măsurarea exactă cu pipeta a diferitelor volume calculate de soluţie stoc de α – L -
Alanină 300 μg/mL (0,03 g%) şi adăugarea volumelor corespunzătoare de soluţie alcoolică de
Ninhidrină 0,1% (Tabelul 1), toate eprubetele se agită bine şi se lasă în repaos 5 minute. Apoi se
încălzesc pe baie de apă progresiv la temperatură constantă de 60-70 ͦ C timp de circa 8-10 minute.
Se lasă în repaos alte 5 minute şi se răcesc forţat sub jet de apă rece. Se completează apoi cu H2O
distilată exact până la semn (VE = 20 mL), sub agitare, în fiecare caz în parte (Tabelul 1).
Obţinerea soluţiilor etalon este redată în tabelul 1. Se citesc apoi absorbanțele celor 13 soluții etalon
obţinute, față de apa distilată ca martor la lungimea de undă λmax. = 570 nm. Se realizează câte 3
determinări pentru fiecare soluție etalon și se trec în Tabelul 1 valorile medii ale absorbanțelor
3
soluţiilor etalon. Cu valorile medii măsurate ale absorbanțelor se trasează dreapta (curba) de
etalonare a spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 570 nm pentru α – L -Alanină , faţă de
H2O distilată ca martor: A = f ( C ).

c) Calculul concentraţiilor soluţiilor etalon de α – L -Alanină, 1,50-45,00 µg/mL, C (µg

/mL) → Tabelul 1

Conform relaţiei, Ci .Vi = Cf .Vf, unde Ci = concentraţia iniţială a fiecărei soluţii

etalon înainte de adăugarea volumelor corespunzătoare de soluţie alcoolică de ninhidrină 0,1% şi
a H2O distilate în fiecare eprubetă = concentraţia soluţiei stoc de α – L -Alanină = 300 µg/mL.

Vi = volumul iniţial de soluţie din fiecare eprubetă etalon, înainte de adăugarea volumelor
corespunzătoare de soluţie alcoolică de ninhidrină 0,1% şi a H2O distilate în fiecare eprubetă =

(0,1 - 3,0 ) mL soluţie stoc de α – L -Alanină, 300 µg/mL. Cf = concentraţia finală a fiecărei
soluţii etalon obţinute după adăugarea volumelor corespunzătoare de soluţie alcoolică de

ninhidrină 0,1% şi a H2O distilate în fiecare eprubetă (Tabelul 1) = necunoscută = C, iar Vf =

volumul final de soluţie etalon din fiecare eprubetă, după adăugarea volumelor corespunzătoare de
soluţie alcoolică de ninhidrină 0,1% şi a H2O distilate în fiecare eprubetă (Tabelul 1) → Vf =

VE = 20 mL (Tabelul 1).

Soluţia 1 etalon: 300 . 0,1 = C1 .20, de unde C1 = (300 . 0,1) / 20 = 1,50 µg/mL, deci
C1 = 1,50 µg/mL.
Soluţia 2 etalon: 300 . 0,2 = C2. 20, de unde C2 = (300 . 0,2) / 20 = 3,00 µg/mL, deci
C2 = 3,00 µg/mL.
Soluţia 3 etalon: 300 . 0,3 = C3. 20, de unde C3 = (300 . 0,3) / 20 = 4,50 µg/mL, deci
C3 = 4,50 µg/mL.
Soluţia 4 etalon: 300 . 0,4 = C4. 20, de unde C4 = (300 . 0,4) / 20 = 6,00 µg/mL, deci
C4 = 6,00 µg/mL.
Soluţia 5 etalon: 300 . 0,5 = C5. 20, de unde C5 = (300 . 0,5) / 20 = 7,50 µg/mL, deci
C5 = 7,50 µg/mL..
Soluţia 6 etalon: 300 . 0,6 = C6. 20, de unde C6 = (300 . 0,6) / 20 = 9,00 µg/mL, deci
C6 = 9,00 µg/mL.
Soluţia 7 etalon: 300 . 0,7 = C7. 20, de unde C7 = (300 . 0.7) / 20 = 10,50 µg/mL, deci
C7 = 10,50 µg/mL.

4
 Soluţia 8 etalon: 300 . 0,8 = C8. 20, de unde C8 = (300 . 0,8) / 20 = 12,00 µg/mL, deci
C8 = 12,00 µg/mL.
Soluţia 9 etalon: 300 . 0,9 = C9. 20, de unde C9 = (300 . 0,9) / 20 = 13,50 µg/mL, deci
C9 = 13,50 µg/mL.
Soluţia 10 etalon: 300 . 1,0 = C10. 20, de unde C10 = (300 . 1,0) / 20 = 15,00 µg/mL,
deci C10 = 15,00 µg/mL.
Soluţia 11 etalon: 300 . 1,5 = C11. 20, de unde C11 = (300 . 1,5) / 20 = 22,50 µg/mL,
deci C11 = 22,50 µg/mL.
Soluţia 12 etalon: 300 . 2,0 = C12. 20, de unde C12 = (300 . 2,0) / 20 = 30,00 µg/mL,
deci C12 = 30,00 µg/mL.
Soluţia 13 etalon: 300 . 3,0 = C13. 20, de unde C13 = (300 . 3,0) / 20 = 45,00 µg/mL,
deci C13 = 45,00 µg/mL.

Tabelul 1. Prepararea soluţiilor etalon de α-L-Alanină (1,50-45,00 µg/mL) și valorile

măsurate ale absorbanțelor soluțiilor etalon (VE = 20 mL, în eprubete gradate) la lungimea
de undă, λmax. = 570 nm.

Nr. mL soluție stoc mL

det. α – L -Alanină, Ninhidrină mL H2O distillată C (μg/mL) A (λ)
300 µg/mL 0,1%
1. 0,1 1,0 18,9 1,50 0,059
2. 0,2 1,0 18,8 3,00 0.082
3. 0,3 1,0 18,7 4,50 0,108
4. 0,4 1,0 18,6 6,00 0,128
5. 0,5 1,0 18,5 7,50 0,149
6. 0,6 1,0 18,4 9,00 0,169
7. 0.7 1,0 18,3 10,50 0,192
8. 0,8 1,0 18,2 12,00 0,213
9. 0,9 1,0 18,1 13,50 0,235
10.. 1,0 1,0 18,0 15,00 0,256
11.. 1,5 1,0 17,5 22,50 0,363
12. 2,0 1,0 17,0 30,00 0,459
13. 3,0 1,0 16,0 45,00 0,663

Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie cuprinsă întotdeauna între

absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată spectrofotometric în UV-VIS.

d) Pregătirea soluţiilor probă de dozat ce conţin α – L -Alanină de dozat .

Se cântăresc la balanţa analitică digitală circa a = 0,0540 g probă solidă impură ce
conţine aminoacidul α – L -Alanină, cu o puritate, de minim 67 % (cu un conţinut procentual
5
cunoscut α – L -Alanină pură de minim 67%), care se aduc cantitativ cu apă distilată într-un balon
cotat V1 = 100 mL. Se omogenizează până la dizolvare completă şi se completează cu apă
distilată la semn. Apoi se măsoară exact cu pipeta două volume diferite din soluţia probă iniţială
preparată, v1 = 0,8 mL (pentru soluţia probă P1) și respectiv v2 = 1,4 mL ( pentru soluţia

probă P2), soluţie probă ce conţin α – L -Alanină, care se aduc cantitativ în 2 eprubete gradate
identice de 20 mL fiecare, se adaugă câte 1,0 mL soluție alcoolică de Ninhidrină 0,1% în fiecare se
agită bine şi se lasă în repaos 5 minute. Apoi se încălzesc pe baie de apă progresiv la temperatură
constantă de 60-70 ͦ C timp de circa 8-10 minute. Se lasă în repaos alte 5 minute şi se răcesc forţat
sub jet de apă rece. Se agită bine eprubetele pentru omogenizare apoi se completează cu apă
distilată H2O exact până la 20 mL (la semn), VP = 20 mL Se omogenizează conţinutul
eprubetelor și se citesc, absorbanţele probelor (Ap1 și Ap2) la lungimea de undă λmax. = 570 nm,
în cuva de 1 cm, faţă de apa distilată H2O ca martor. Se fac câte 3 determinări pentru fiecare probă
și se calculează absorbanța medie. Prepararea soluţiilor de probe este redată în tabelul 2.
Absorbanţele medii ale celor două probe au fost: Ap1 = 0,226 (pentru proba P1) , respectiv Ap2

= 0,415 (pentru proba P2) şi sunt redate în tabelul 2

Tabelul 2. Prepararea soluţiilor probă de α-L-Alanină și valorile măsurate ale absorbanțelor

probelor Ap1 și Ap2 (VP = 20 mL – eprubete gradate)

Nr. det. mL soluție mL soluţie mL H2O Cp1,2 Ap1,2

probă α – L - alcoolică de distilată (μg/mL) (λ)
Alanină Ninhidrină 0,1%
1. 0,8 1,0 19,2 13,123 0,226
2. 1,4 1,0 18,0 26,819 0,415

e) Modul de calcul - etape

A) Trasarea dreptei de calibrare (etalonare) a spectrofotometrului cu ajutorul celor 13
soluții etalon de α-L- alanină la lungimea de undă ʎ max. = 570 nm față de H2O distilată ca
martor și calculul concentrațiilor probelor CP1,2 (μg/mL) în α-L- alanină pură din ecuația
dreptei de calibrare
Se trasează curba de etalonare (de calibrare) a spectrofotometrului, A = f(C) cu ajutorul
celor treisprezece soluţii etalon de α – L -Alanină, de concentraţii C = 1,50 - 45,00 mg/mL (figura
1) .

6
 Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de α – L -Alanină (1,50 µg/mL – 45
µg/mL)

Din curbă,, prin interpolare grafică, se determină concentraţia Cp (μg/mL) a probei

analizate în α – L -Alanină pură. Ecuația dreptei de calibrare este y = ax + b, unde y =
absorbanța probei Ap, iar x = concentrația probei în α – L -Alanină = Cp. Din noua formă a
ecuației dreptei Ap = Cp.a + b, se poate determina concentraţia probelor în α – L -Alanina de dozat
: Cp = (Ap – b) / a, exprimate în (μg/mL). Ecuaţia dreptei de calibrare a fost: y =

0,0138.x + 0,0449 (fig. 1). Deci , y1,2 = 0,0138.x1,2 + 0,0449. Dar, y1,2 = Ap1,2 şi x1,2 =
Cp1,2. Noua formă a ecuaţiei dreptei de calibrare va fi: Ap1,2 = 0,0138. Cp1,2 + 0,0449.
Pentru soluţia probă 1 (P1):
Ap1 = 0,0138. Cp1 + 0,0449. Deci, Cp1 = (Ap1 – 0,0449) / 0,0138, Dar se ştie
că Ap1 = 0,226. Prin înlocuire, se obţine: Cp1 = (0,226 – 0,0449) / 0,0138 = 13,123

μg/mL. Deci, Cp1 = 13,123 μg/mL a reprezentat concentraţia în α – L -Alanină pură din
prima soluţie probă (P1) dedusă din ecuaţia dreptei de calibrare şi exprimată în μg/mL.
Pentru soluţia probă 2 (P2):

7
 Ap2 = 0,0138. Cp2 + 0,0449. Deci, Cp2 = (Ap2 – 0,0449) / 0,0138, Dar se ştie
că Ap2 = 0,415. Prin înlocuire, se obţine: Cp2 = (0,415 – 0,0449) / 0,0138 = 26,819

μg/mL. Deci, Cp2 = 26,819 μg/mL a reprezentat concentraţia în α – L -Alanină pură din a
doua soluţie probă (P2) dedusă din ecuaţia dreptei de calibrare şi exprimată în μg/mL.

B) Calculul efectiv al cantităților X1,2(μg) de α – L -Alanină pură din Vp = 20 mL

soluții probe (din cele două eprubete gradate P1 şi P2), având ca punct de plecare concentrațiile
CP 1,2 (μg/mL) calculate din ecuaţia dreptei de calibrare.
Cp 1,2 μg......................................................1 mL
X 1,2 μg..............................................................VP ( 20 mL) eprubete gradate, de unde;
X1,2 = VP . Cp1,2 = 20. Cp1,2, au reprezentat cantităţile exprimate în μg de α – L -
Alanină pură din VP = 20 mL soluții probe (cele două eprubete gradate).
Pentru soluţia probă 1 (P1):
X1 = 20. Cp1 = 20 . 13,123 = 262,46 μg . Deci, X1 = 262,46 μg de α – L -Alanină pură
din prima eprubetă gradată de 20 mL cu soluţie probă (P1).

Pentru soluţia probă 2 (P2):

X2 = 20. Cp2 = 20 . 26,819 = 536,38 μg . Deci, X2 = 536,38 μg de α – L -Alanină pură
din a doua eprubetă gradată de 20 mL cu soluţie probă (P2).

C) Calculul efectiv al cantităților Y1,2 (μg) de α – L -Alanină pură existentă în V1 =

100 mL soluție iniţială de probă preparată (balon cotat) pentru ambele soluţii de probe studiate
(din cele două eprubete gradate P1 şi P2). Se transformă direct 1 µg = 10-6 g.
X1,2 μg...........................................v1,2 mL probe (v1 = 0,8 mL, respectiv v2 = 1,4 mL)
Y1,2 μg............................................V1 (100 mL) probă balon cotat, de unde;
Y1,2 = (X1,2 . V1 ) / v1,2 = (X 1,2. 100) / v1,2 au reprezentat cantităţile exprimate în μg
α – L -Alanină pură pentru cele 2 eprubete gradate cu soluţii probe (P1) şi (P2),
corespunzătoare volumelor v1 = 0,8 mL, respectiv v2 = 1,4 mL măsurate exact din V1 = 100

mL soluție probă totală preparată iniţial (balon cotat).

8
 Pentru soluţia probă 1 (P1):
Y1 = (X1 . V1 ) / v1 = (X 1 . 100) / v1 = (262,46 . 100) / 0,8 = 32807,50 μg =
0,03280750 g . Deci, Y1 = 32807,50 μg = 0,03280750 g a reprezentat cantitatea în μg
şi apoi în g de α – L -Alanină pură corespunzătoare volumului v1 = 0,8 mL exact măsurat din
V1 = 100 mL soluție iniţială de probă preparată (balon cotat), raportată la prima soluţie probă
(P1).

Pentru soluţia probă 2 (P2):

Y2 = (X2 . V1 ) / v2 = (X2 . 100) / v2 = (536,38. 100) / 1,4 = 38312,86 μg =
0,03831286 g. Deci, Y2 = 38312,86 μg = 0,03831286 g , a reprezentat cantitatea în μg
şi apoi în g de α – L -Alanină pură corespunzătoare volumului v2 = 1,4 mL exact măsurat din
V1 = 100 mL soluție iniţială de probă preparată (balon cotat), raportată la a doua soluţie probă
(P2).

D) Calculul practic al concentrațiilor procentuale Z1,2 % de α – L -Alanină pură din

cele a = 0,0540 g probă solidă impură luată în studiu, în cazul ambelor soluţii de probe
studiate (P1 şi P2). Se transformă direct 1 µg = 10-6 g .
Y1,2 g..........................................a g probă solidă
Z1,2 %.....................................100 g probă solidă, de unde Z1,2 % = (100
.Y1,2) / a = au reprezentat concentrațiile procentuale exprimate în g % de α – L -Alanină pură
din cele a g probă solidă cântărită inițial (a = 0,0540 g), în cazul ambelor soluţii probe

studiate (P1 şi P2).

Pentru soluţia probă 1 (P1):

Z1 % = (100 .Y1 ) / a = (100 . 0,03280750)/ 0,0540 = 60,7546 %. Deci, Z1 %
= 60,7546 % a reprezentat concentrația procentuală exprimată în g % de α – L -Alanină pură
din cele a g probă solidă cântărită inițial (a = 0,0540 g), în cazul primei soluţii de probă (P1).

Pentru soluţia probă 2 (P2):

Z2 % = (100 .Y2 ) / a = (100 . 0,03831286)/ 0,0540 = 70,9497 %. Deci, Z2 %
= 70,9497 % a reprezentat concentrația procentuală exprimată în g % de α – L -Alanină pură

9
din cele a g probă solidă cântărită inițial (a = 0,0540 g), în cazul celei de-a doua soluţii de
probă (P2) .

E) Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).- liniaritatea

metodei de analiză pe domeniul de concentrații ales (1,50 μg/mL – 45 μg/mL) soluţii etalon α – L
-Alanină. Calculul limitei de detecţie LD şi a limitei de cuantificare LQ
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în
interiorul unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei
analizate dintr-o probă, ce aparţine unui anumit eşantion. Întensitatea semnalului
analitic (absorbanţa măsurată) variază direct proporţional cu concentraţia analitului
dintr-o probă, pentru un anumit domeniu. Valoarea acceptată pentru coeficientul de
corelaţie este : r ˃ 0,999, coeficientul de regresie liniară, r2 ≥ 0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., redaţi în tabelul 3.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o
probă ce poate fi detectată (sesizată) într-un eşantion față de un martor, în condiţii
experimentale stabilite. Se exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi
se calculează folosind următoarea formulă: LD = 3 x SE/ Panta (1)
Limita de cuantificare (LQ) este dată de cea mai mică concentrație de analit
dintr-o probă ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată sau măsurată) cu o
precizie și acuratețe acceptabilă, în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei
s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ
= 10 x SE / Panta (2), unde SE a reprezentat eroarea standard a dreptei de regresie
(tabelul 3).
Din meniul situat în partea de sus a paginii în Microsoft Excel se face click
stânga pe DATA → DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA
ANALYSIS se descarcă : Excel Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o
înșiruire de funcții . Se caută funcția REGRESSION, se selectează și apare alt meniu
(Regression). “Imput Y range” (se selectează toată coloana 2 cu valorile numerice
ale lui Y – absorbanțele), apoi „Imput X range” (se selectează toată coloana 1 cu

10
valorile lui X – concentrațiile) . Se dă OK și apare încă o foaie nouă în Excel cu mai
multe tabele. Se copiază în documentul Microsoft Word primul tabel din foaie
(Regression Statistics):
Tabelul 3. Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare
Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.99976449
2
Coeficientul de regresie lineară R 0.99952904
2
Coeficientul de regresie R adjustat 0.99948623
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.00384996
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 13

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0,0138.x + 0,0449 (fig. 1),, sau Ap1,2 =
0,0138. Cp1,2 + 0,0449. Intersecţia cu ordonata a avut valoarea (+) 0,0449, iar panta
dreptei a fost 0,0138 (fig.1). Coeficientul de regresie lineară a avut valoarea R2 =
0.99952904, R2 ≥ 0.999, iar coeficientul de corelaţie (R ˃ 0,999) s-au situat perfect
între limitele normale de valori, peste valoarea minimă admisă. (Tabelul 3). S-a
constatat variaţia direct proporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon
cu concentraţiile acestora (aspect redat şi în Fig. 1). Eroarea standard (SE) a dreptei
de regresie a avut valoarea SE = 0.00384996 (Tabel 3).
Limita de detecţie a avut valoarea: LD = 3. 0,00384996/ 0,0138 = 0,8369
μg/mL, Limita de cuantificare. LQ = 10 . 0,00384996 / 0,0138 = 2,7898 μg/mL.

Concluziile Experimentului

Concentrațiile (μg/mL) în α – L -Alanină pură din proba luată în studiu (a =

0,0540 g probă cristalină solidă) au fost: CP1 = 13,123 μg/mL (calculată pentru un
volum v1= 0,8 mL soluție probă α – L -Alanină luaţi în studiu); respectiv CP2 =
26,819 μg/mL (calculată pentru un alt volum v2 = 1,4 mL soluție probă α – L -Alanină

luaţi în lucru). Concentraţiile procentuale de α – L -Alanină pură din cele a =

0,0540 g probă solidă impură au fost: Z1 % = 60,7546 % şi Z2 % = 70,9497 % din
cele a = 0,0540 g probă solidă cântărite iniţial (exprimate în g α – L -Alanină pură
raportate la 100 g probă solidă luată în studiu). Restul până la 100% au fost
11
impurităţi, în ambele cazuri. Concentraţia procentuală corectă în acest caz studiat a
fost Z2 % = 70,9497 % α – L -Alanină pură , dacă se ştie că proba iniţială
solidă luată în studiu a avut o puritate de minim 67% în α – L -Alanină pură.
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a α – L -
Alaninei dintr-o probă a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales 1,50
μg/mL - 45 μg/mL ; coeficientul de regresie liniară a fost: R2 = 0.99952904, R2 ≥
0.9990, iar cel de corelaţie: R = 0.99976449, R > 0,9990. Aceşti parametri statistici s-
au încadrat perfect între limitele normale de valori, s-au situat peste valorile minime
admise. Eroarea standard a dreptei de regresie a fost SE = 0.00384996 , o valoare
foarte mică, acceptabilă statistic. Limita de detecţie, LD = 0,8369 μg/mL și limita de
cuantificare, LQ = 2,7898 μg/mL au prezentat valori mici, foarte bune, acceptabile
statistic Metoda de dozare spectrofotometrică în domeniul VIS propusă poate fi
aplicată în practica de laborator, în laboratorul de chimie, pentru determinarea
cantitativă a aminoacidului α – L -Alanină din diferite probe solide studiate.

Aminoacizii şi importanţa lor pentru organismul uman. Există 23 de α-

aminoacizi naturali, dintre care 9 α-aminoacizi sunt clasificaţi ca fiind esenţiali sau
indispensabili organismului uman, nu sunt sintetizaţi de organism şi sunt obtinuţi doar prin aportul
extern de alimente, printr-un consum nutriţional adecvat. Cei rămaşi sunt considerati a fi
dispensabili sau aminoacizi neesenţiali, întrucât organismul este capabil întotdeauna să-i
sintetizeze din alti aminoacizi sau din alte molecule active sau radicali organici.
Aminoacizii esenţiali nu pot fi produsi de către organism, sunt absolut necesari proceselor
metabolice ce au loc în organismal uman, sunt indispensabili, prin urmare ei trebuie să fie obţinuţi
numai prin aport alimentar din diferite surse alimentare, sau prin administrarea de suplimente
alimentare care îi cuprind.
Aminoacizii esenţiali sunt: Izoleucina (Ile), Leucina (Le), Lizina (Lys), Metionina (Met),
Fenilalanina (Phe), Treonina (Thr), Triptofanul (Trp), Valina (Val). Arginina (Arg) şi Histidina
(His – un aminoacid esenţial numai pentru sugari)- Pentru un organism adult este un aminoacid
neesenţial, întrucât organismul unui adult îl poate uşor sintetiza.
Aminoacizii neesenţiali sunt produşi numai de către organismal uman, în absenţa unei
alimentaţii corespunzătoare care să-i ofere. Sunt furnizaţi organismului pentru buna desfăşurare a

12
proceselor metabolice exclusiv prin biosinteză internă şi nu este necesar un aport alimentar adecvat.
Aceştia sunt: Alanina (Ala), Asparagina. Acidul Aspartic, Acidul Glutamic. Glutamina , Cisteina,
Cistina, Selenocisteină, Tirozina, Glicina, Ornitina, Prolina, Hidroxi-prolina şi Serina.
Arginina este un α- aminoacid absolut necesar, indispensabil pentru funcționarea, în bune
condiții, normale,a glandei hipofize. Împreună cu fenilalanina, ornitina și alte substanțe cu acțiune
neurologică, arginina este indispensabilă pentru sinteza hormonului de creștere secretat de această
glandă. Necesarul de arginină este ceva mai mare la bărbați pentru că lichidul seminal conține în
cantitate de aproximativ 80% acest aminoacid, iar deficitul poate duce la sterilitate. S-a demonstrat
că Arginina ajută, în mod direct, la producerea (biosinteza) hormonului de creștere (GH) secretat
de glanda pituitară (hipofiza). Hormonul de creștere promovează un anabolism natural și sănătos în
tot organismul şi ajută la biosinteza proteinelor la nivelul tuturor celulelor şi ţesuturilor
organismului. Datorită rolului reparator al țesuturilor afectate, arginina ajută la repararea,
vindecarea rănilor și a sistemului osos (a oaselor). În stare naturală se găseşte în concentraţii
considerabile, mari, în nuci, alune, migdale, ciocolată, floricele de porumb, dulciuri pe bază
de gelatină, orezul brun, făină de ovăz, stafide, semințe de susan și floarea soarelui, pâinea integrală
și alte alimente bogate în proteine.
Importanţă biologică: α-aminoacizii joacă roluri foarte importante în organismul uman:

- participă activ şi direct la biosinteza proteinelor (compuşi macromoleculari activi

biologic, macromolecule biologic-active) din organism;
- participă la biosinteza de vitamine şi de poliamine;
- sunt implicaţi în biosinteza catalizată enzimatic a aminelor biogene (Histamina,
Putresceina, Cadaverina) în organism; Serotonina este sintetizată din 5-
hidroxitriptofan. Reacția este catalizată de o enzimă (decarboxilază) care are ca
coenzimă piridoxalfosfatul (vitamina B6). Putresceina se obţine direct prin
decarboxilarea pe cale enzimatică a ornitinei, în timp de Cadaverina este obţinută prin
decarboxilarea entimatică a lizinei. Histamina se obţine direct prin decarboxilarea
enzimatică a histidinei, iar Serotonina este obţinută prin decarboxilarea enzimatică
directă a aminoacidului α-L-Triptofan.
- α - aminoacizii contribuie direct la biosinteza bazelor azotate purinice şi pirimidinice ce
intră în constituţia acizilor nucleici (ADN şi ARN);
- participă activ la sinteza de molecule active biologic (cum ar fi acidul γ-aminobutiric
GABA, care este un produs de decarboxilare a acidului glutamic, strâns legat de
metabolismul oxidativ al hidrocarbonaților la nivelul Sistemului Nervos Central. Sinteza
este asigurată de către enzima glutamat-decarboxilaza.); GABA este considerat a fi unul
13
 dintre cei mai importanți mediatori chimici cu rol inhibitor, deprimant la nivelul
Sistemului Nervos Central (SNC); acidul ϒ-aminobutiric (GABA) este considerat a
determina efecte intense inhibitoare şi deprimante SNC la nivelul scoarței cerebrale, al
nucleilor amigdalian și caudat. Eliberat de axonii celulelor Purkinje, determină inhibiția
neuronilor din nucleul Deiters. Acționează la nivelul membranei postsinaptice,
determinând hiperpolarizarea și potențiale inhibitoare prin creșterea conductanței pentru
anionii clorură Cl-. Participă activ , de asemenea, în mecanismele inhibitoare medulare.
- α - aminoacizii sunt utilizaţi ca sursă importantă de energie pentru organism (prin
catabolismul sau degradarea lor ce are loc la nivelul ţesutului muscular, hepatic);
- formează situsul activ al enzimelor (serina intră nemijcocit în constituţia situsurilor
active ale tripsinei şi chimotripsinei);
- intră nemijlocit în structura coenzimelor din organism;
- joacă un rol deosebit de important în transmiterea impulsului nervos;
- participă la conjugarea cu compuşi endogeni şi exogeni;
- sunt furnizori de atomi de carbon, de radicali metil, de fragmente radicalice alifatice
saturate ce cuprind atomi de Carbon C în principal; exemplu: Metionina care este
implicată direct în procesele de transfer de grupe metil -CH3 în cadrul unor căi
metabolice, în procesele de transsulfurare şi aminopropilare ce au loc în organism.
- Serina este an aminoacid neesenţial ce ajută în mod decisiv la biosinteza fosfolipidelor
care sunt necesare pentru a crea şi dezvolta fiecare celulă din corpul uman. În plus, acest
aminoacid este implicat direct în buna funcționare şi în metabolismul la parametrii
optimi a acizilor nucleici ARN și ADN.
- Serina este implicată nemijlocit în formarea şi dezvoltarea mușchilor (scheletici);
facilitează absorbția creatinei în organism ce ajută la construirea și dezvoltarea
ulterioară a mușchilor organismului precum și în menținerea unui sistem imunitar
sănătos şi puternic, prin facilitarea producerii de imunoglobuline și anticorpi în
organism;
- Triptofanul, este un aminoacid esențial folosit pentru a produce direct serotonina
(mediator chimic al creierului responsabil pentru starea de somn), un mediator chimic
deosebit de important al inducerii somnului şi stării de linişte. Serotonina acționează
ca neurotransmițător; intervine în producerea somnului, în procese mintale și afective
(depresie și anxietate, tulburare obsesiv-compulsivă), în funcții motorii, în termoreglare,
în reglarea presiunii arteriale, în actul vomei, în funcții hormonale.), nu poate fi produs
în organism fără existenţa serinei;. atât deficitul de serotonină cât și implicit deficitul

14
 de triptofan se crede că determină apariţia unei serii de tulburări psihice frecvente
precum depresie, stări de agitaţie psihomotorie, insomnie și anxietate.
- Leucina este folosită în special de către ficat, țesutul adipos și cel muscular. Aceasta
încetinește şi chiar suprimă degradarea şi atrofierea țesutului muscular, prin mărirea şi
intensificarea biosintezei proteinelor musculare (actina şi miozina în principal). De
asemenea, este prezentă în cantități relativ mari în lână și în hemoglobină (~ 15%).
- Leucina este necesară pentru creșterea optimă şi dezvoltarea generală a organismului la
copii și menținerea echilibrului de azot (balanţei azotului în organism) la adulți. De
asemenea, joacă un rol primordial fundamental în refacerea țesuturilor osos și muscular,
precum și a pielii, după diferite leziuni.. Se găsește în cantități mari în soia, alune și
ovăz.
- Leucina este un aminoacid esenţial, cu capacitatea de a stimula direct sinteza proteinei
musculare miofibrilare. Acest efect al leucinei rezultă din rolul său de activator al țintei
mecanice a rapamicinei (mTOR), o protein-kinază tip serină-treonină care reglează
biosinteza proteinelor și creșterea celulelor. Metabolismul leucinei apare în multe
țesuturi din corpul uman; cu toate acestea, marea majoritatea a leucinei dietetice este
metabolizată în ficat, țesutul adipos și mușchi (scheletici, striaţi).
- Alanina, aminoacid neesenţial ce joacă un rol-cheie esenţial în buna funcţionare a
ciclului glucoză-α-alanină între țesuturile extrahepatice și ficat. În mușchi și în alte
țesuturi care degradează aminoacizii pentru combustibil (ţesutul hepatic - ficatul),
grupările amino- ale alaninei sunt colectate sub formă de glutamat prin transaminare.
Glutamatul poate apoi transfera grupul său amino- NH2 la anionul piruvat, un produs
al glicolizei musculare, prin acțiunea alanin-aminotransferazei, cu formarea α-alaninei
și α-cetoglutaratului. Alanina intră în circuitul sanguin și este transportată la ficat.
Alanin -aminotransferaza catalizează procesul invers la nivelul ficatului, unde piruvatul
regenerat este utilizat în gluconeogeneză şi formează glucoza, care revine la nivelul
mușchilor (ţesutului muscular) prin sistemul de circulație sanguină, ca sursă
fundamentală de energie pentru procesele de ardere ce au loc la acest nivel . Glutamatul
din ficat intră în mitocondrie și este degradat de glutamat-dehidrogenază în α-
cetoglutarat și amoniu (amoniac) - care participă la ciclul ureei pentru a forma uree
care este excretată la nivel renal, prin intermediul rinichilor.
- Ciclul glucoză- α-alanină permite îndepărtarea piruvatului și a glutamatului din mușchi
și transportul acestora în siguranță către ficat. Odată ajuns la nivelul ficatului, piruvatul
este utilizat pentru a regenera glucoza, după care glucoza revine la nivelul mușchilor
pentru a fi metabolizată pentru producerea de energie;: în urma acestui fapt este
15
 transferat complet rolul energetic furnizor de energie al gluconeogenezei către ficat, în
loc să fie păstrat la nivel muscular (al muşchilor) iar toate moleculele de ATP (acizii
adenozin trifosforici şi grupări adenozin-trifosfat furnizoare importante de energie şi de
grupe fosfat) disponibile la nivelul mușchilor pot fi angajate exclusiv în realizarea
contracţiei musculare. Este o cale catabolică și se bazează pe degradarea proteinelor la
nivelul țesutului muscular.
- modificările (perturbările) din ciclul glucoză- α-alanină, care cresc concentrațiile serice
de alanin-aminotransferază (ALT), sunt strâns legate de dezvoltarea diabetului zaharat
de tip II.

Bibliografie

1. Rodica Cuciureanu, Igiena Alimentului, ediţia a II-a revizuită şi adăugită, pag. 75-132, Editura
Performantica, Iaşi, 2012.
2. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Marcel Florin Musteaţă, Chimie Analitică, pag 164-331, Editura
Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2003.
3. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Metode Chimice şi Instrumentale de Analiză, Ediţia a II-A
Revizuită, pag 236-332, Editura Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2007.
4. Vasile Dorneanu, Maria Stan, Chimie Analitică – lucrări practice, pag. 224-322, Editura
Universităţii de Medicină şi Farmacie “Gr.T.Popa”, Iaşi, 2000.
5. ***SR 8662-1;2/96 şi SR ISO 6333/96. (standarde în vigoare)..
6. Maria Dorneanu, Eugenia Ştefănescu, Odette Rogut, Chimie organică. Sinteze şi reacţii de
recunoaştere, 2002, Editura “Gr.T.Popa”, Iaşi, Universitatea de Medicină şi Farmacie.
7. Mircea Iovu, Chimie Organică, 1999, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti.,
8. Valeriu Şunel, Chimie Organică, curs litografiat, 1991, Univ. Al.I.Cuza, , Iaşi, Facultatea de
Chimie.
9. Veronica Dinu, Eugen Truţia, Elena Popa-Cristea, Aurora Popescu, Biochimie Medicală, mic
tratat, 2000, Editura Medicală, Bucureşti.

16