Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a anionilor nitrat

(NO3-) din probe de apă

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a anionilor nitrat (NO 3-) din
trei surse de apă destinate consumului.
Obiectivele lucrării :
- utilizarea unei metode spectrofotometrice de dozare anionilor nitrat (NO3-) în
domeniul vizibil (VIS);
- compararea rezultatelor obținute cu valoarea nivelulului maxim admis de anioni NO3-
din apa potabilă (50 mg/L) , conform Normelor Europene şi Internaţionale în vigoare.

Principiul metodei. Nitraţii prezenţi în proba de analizat reacţionează cu acidul

fenoldisulfonic, cu formarea acidului nitrofenoldisulfonic , colorat în galben intens în mediu
puternic amoniacal. Compusul format prezintă un maxim de absorbţie la lungimea de undă ʎ
= 410 nm. Acidul nitrofenoldisulfonic se formează cantitativ direct proproțional cu ionii
nitrat NO3 - luați în lucru. şi poate fi dozat spectrofotometric în domeniul vizibil, Reacţia ce a
avut loc este redată mai jos:

OH OH OH
SO3H SO3H O2N SO3-NH4+
O2N
+ HO. NO2 + 2 NH4OH
- H2O - 2 H2O
SO3H SO3H SO3-NH4+
acid fenoldisulfonic acid nitrofenoldisulfonic compus colorat în galben

Reactivi necesari şi aparatură:

- soluţie stoc de KNO3 0,18 % (1800 µg/mL), preparată din pulbere cristalină pură de
KNO3
- probe de apă neîmbuteliată destinată consumului casnic provenită din trei surse;
- apă distilată;
- soluţie standard de lucru de anioni nitrat (NO 3-) în apă distilată 90 µg/mL, preparată
prin o diluţie 1:20 din soluţia stoc;
- acid fenoldisulfonic: 12 g fenol cristalizat purificat s-a dizolvat complet în 144 g
H2SO4 98% (cu d = 1,84 g/mL) ce a fost încălzit la fierbere circa 5-10 minute pentru
îndepărarea completă a urmelor de HNO3.

1
 - NH3 concentrat, 25%;
- spectrofotometru UV-VIS prevăzut cu două cuve de sticlă CECIL
- balanţă analitică digitală cu afişaj electronic.
-
Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λ max. = 410
nm, față de acidul nitrofenoldisulfonic (compus galben intens ) , cu ajutorul soluțiilor
etalon de ioni nitrat NO3- (0 – 7,20 μg/mL), preparate din KNO3 sare pură.

Din soluția stoc de ioni nitrat NO3 1800 µg/mL se prepară, printr-o diluție 1:20, o
soluție standard de lucru de lucru ioni nitrat NO3- 90 μg/mL Din soluția de lucru de ioni
NO3- 90 μg/mL, se obțin nouă soluții etalon de anioni NO 3-, conform tabelului 1. Se
măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute în urma reacției de culoare de mai sus,
cu concentrații cuprinse între 0 – 7,20 μg/mL în funcție de H 2O distilată ca martor, la
lungimiea de undă λmax. = 410 nm. (tabel 1). Volumul final de soluție în cele 9 eprubete cu
soluții etalon a fost Vf = 25 mL. Cu valorile măsurate ale absorbanțelor se trasează dreapta
(curba ) de etalonare a spectrofotometrului la λmax. = 410 nm, față de acidul
nitrofenoldisulfonic format în urma reacției dintre acidul fenoldisulfonic și nitrați NO 3- A =
f ( C ) . (fig. 1).

- Tabel 1
Valorile măsurate ale absorbanţelor în funcţie de concentraţiile soluţiilor etalon de
ioni NO3-
-
Nr. mL soluţie mL H2O
det. standard, NO3- distilată mL NH3, 25% Ce (µg/mL) A (ʎ)
90 µg/mL
0 0 0 0 0 0
1. 0,1 9 10 0,36 0,045
2. 0,2 9 10 0,72 0,092
3. 0,3 9 10 1,08 0,150
4. 0,4 9 10 1,44 0,190
5. 0,5 9 10 1,80 0,238
6. 0,7 9 10 2,52 0,342
7. 1,0 9 10 3,60 0,475
8. 1,5 9 10 5,40 0,698
9. 2,0 9 10 7,20 0,945

2
 Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 1 s-a trasat dreapta de calibrare a
spectrofotometrului la lungimea de undă λ = 410 nm în raport cu acidul
nitrofenoldisulfonic (conpusul colorat în galben intens) , ce a fost redată în figura 1.

Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de ioni NO3-

( Foarte Bine !)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert → Scatter. Apare
graficul format doar din puncte. Se dă click dreapta pe puncta (se selectează toate punctele)
apare un meniu cu Add Trendline. Se dă click stânga pe această comandă , apare un alt
meniu mare în partea dreaptă cu Format Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de
jos, ultimele 2 căsute (“Display Equation on chart “ și “Display R-squared value on
chart”) . Prin acest fapt, se afișează ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului
de regresie R2. Se obține astfel Fig.1. Astfel se procedează în toate determinările
spectrofotometrice ale unor analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Important: Atunci când se dozează cantități foarte mici (urme) de analiți din probe (cationi
și anioni metalici din probe de apă de exemplu, sau alți analiți din probe biologice recoltate) ,
se pornește de la zero 0 în trasarea dreptei de calibrare în Excel, se bifează și căsuța “Set
Intercept” !

3
 Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 9 soluții etalon de Ioni NO3 - ( scrise
cu bold → tabelul 1):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției din care am preparat
soluțiile etalon = 90 µg/mL = soluția standard de lucru de ioni NO3-. Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon, ce trebuie calculată., Vi = volumul inițial de
soluție standard 90 µg/mL ce trebuie măsurat pentru a prepara fiecare din cele 9 eprubete
etalon (coloana 2 din tabelul 1), iar Vf = volumul final de soluție după adăugarea tuturor
reactivilor și a H2O distillate în fiecare eprubetă cu soluție etalon, Vf = 25 mL.

Eprubeta 1. 90 . 0.1 = Cf 1 . 25 de unde Cf 1= (90 . 0,1) / 25 = 0,36 µg/mL .

Deci Cf 1 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 2. 90 . 0.2 = Cf 2 . 25 de unde Cf 2= (90 . 0,2) / 25 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 3. 90 . 0.3 = Cf 3 . 25 de unde Cf 3 = (90 . 0,3) / 25 = 1,08 µg/mL .
Deci Cf 3 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 4. 90 . 0.4 = Cf 4 . 25 de unde Cf 4 = (90 . 0.4) / 25 = 1,44 µg/mL .
Deci Cf 4 = 1,44 µg/mL
Eprubeta 5. 90 . 0.5 = Cf 5 . 25 de unde Cf 5 = (90 . 0,5) / 25 = 1,80 µg/mL .
Deci Cf 5 = 1,80 µg/mL
Eprubeta 6. 90 . 0.7 = Cf 6 . 25 de unde Cf 6 = (90 . 0,7) / 25 = 2,52 µg/mL .
Deci Cf 6 = 2,52 µg/mL
Eprubeta 7. 90 . 1.0 = Cf 7 . 25 de unde Cf 7 = (90 . 1,0) / 25 = 3,60 µg/mL .
Deci Cf 7 = 3,60 µg/mL
Eprubeta 8. 90 . 1,5 = Cf 8 . 25 de unde Cf 8 = (90 . 1,5) / 25 = 5,40 µg/mL .
Deci Cf 8 = 5,40 µg/mL .
Eprubeta 9. 90 . 2,0 = Cf 9 . 25 de unde Cf 9 = (90 . 2,0) / 25 = 7,20 µg/mL .
Deci Cf 9 = 7,20 µg/mL

4
 Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probelor de apă de dozat ce conțin ioni nitrat NO 3- și
citirea absorbanțelo celor trei probe AP1, AP2 și AP3.
Probele de apă de analizat au fost atent recoltate conform normelor în vigoare în două
recipeinte perfect curate de volume V1 V2 şi V3 uscate în prealabil, după ce au fost mai intâi
bine clătite chiar cu apele recoltate din cele trei surse fiecare.
Trei volume a câte 4 mL probe de apă de analizat din cele 3 surse (v1 = v2 = v3 = 4
mL) au fost măsurate cu precizie din V1 = V2 = V3 = 1000 mL şi au fost apoi aduse în trei
capsule de porţelan după care s-au evaporat la sec pe baie de apă , După răcire, peste
reziduurile obţinute s-a adaugat câte 1 mL acid fenol disulfonic, s-a agitat bine, astfel încât tot
reziduul să vină uniform în contact cu reactivul. S-au lăsat 15 -18 minute în repaos pentru a
avea loc reacţia şi s-a adaugat apoi câte 9 mL de H 2O distilată şi 10 mL NH3 , 25% în fiecare,
după care s-a transvazat conţinutul capsulelor în alte 3 eprubete cu dop, sub agitare. Și s-a
completat cu H2O distilată până la 25 mL. Deci volumele finale de soluție de probe din
fiecare eprubetă au fost VP = 25 mL S-au determinat absorbanţele celor 2 probe în funcţie de
martor (apa distilată) la lungimea de undă ʎmax. = 410 nm. S-au realizat câte 3 măsurători şi s-
au calculat absorbanţele medii ale probelor Ap1 şi Ap2. Rezultatele obţinute au fost trecute în
tabelul 2.

Tabel 2
Concentraţia probelor de apă în nitraţi şi cantităţile de ioni NO3- calculate
Proba A AP 1 Cp1 (µg/mL) XA (μg NO3-/25 mL YA (mg NO3-/ 1000 mL
( apa de izvor) aoluție – eprubetă ) apă)
0,494 3,765 94,125 23,531
Proba B AP 2 Cp2 (µg/mL) XB (μg NO3-/25 mL YB (mg NO3-/ 1000 mL
(apa de fântănă) soluție - eprubetă) apă)
0,622 4,741 118,525 29,631
Proba C AP3 Cp3 (µg/mL) XC (μg NO3-/25 mL YC (mg NO3-/1000 mL
(apa de la robinet) soluție - eprubetă) apă)
0,100 0,762 4,7625 4,7625 . 10-3

Cele trei probe au fost făcute și citite de voi , sunt foarte bune!

Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie cuprinsă întotdeauna între

absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată spectrofotometric în UV-
VIS.

5
Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a anionilor NO3- din probele de analizat, calculul
concentrațiilor de NO3- din probe (μg/mL ) și exprimarea rezultatelor finale în mg/L.
În ecuația dreptei de regresie (fig. 1) : y = 0,1312 .x , se înlocuiește y = AP și
x = CP și se obține: AP = 0,1312..CP . Dar : AP1 = 0,494, AP2 = 0,622, iar AP3 = 0,100. Din
ecuația dreptei de calibrare, CP1 = AP1 / 0,1312 = 0,494 / 0,1312 , deci CP1 = 3,765 μg/mL.
În mod identic, CP2 = AP2 / 0,1312 = 0,622 / 0,1312 , deci CP2 = 4,741 μg/mL, iar CP3 =
AP3 / 0,1312 = 0,100 / 0,1312 , deci CP3 = 0,762 μg/mL.
Calculul cantităţilor de anioni NO3- din VP = 25 mL soluţii probe (eprubete
gradate)
Cp μg........................................1 mL
X μg.........................................VP ( 25 mL) eprubete gradate, de unde;
X = VP . Cp = 25.. Cp, μg ioni NO 3- din VP = 25 mL soluții probe (eprubete
gradate) (1)
Calculul concentraţiilor de anioni NO3- din 1000 mL (1 L) soluţii de probe de apă
recoltate
X μg........................................v mL probe apă (v = 4,0 mL)
Y μg.........................................V ( 1000 mL) , de unde;
Y = (X . V) / v = (X. 1000) / v = μg NO3- din V = 1000 mL sticle cu apă . (2)

Calculul pentru Probe :

proba A – apa de izvor: (1) XA = 20 . Cp1 = 25 . 3,765 μg/mL = 94,125 μg/mL
(2): YA = ( X. V) / v = (94,125 . 1000) / 4,0 = 23531,25 μg/1000
mL = 23531,25 μg/L Valoarea lui Y se transformă apoi în mg/L: YA = 23,531 mg/L ioni
NO3-= rezultat final ( valoarea este foarte bună) ce reprezintă concentrația de ioni NO3-
din 1000 mL (1 L) apă de izvor.
proba B – apa de fântână : (1) XB = 25 . Cp2 = 25 . 4,741 μg/mL = 118,525 μg/mL
(2): YB = ( X. V) / v = (118,525 . 1000) / 4,0 = 29631,25 μg/1000
mL = 29631,25 μg/L Valoarea lui Y se transformă apoi în mg/L: YB = 29,631 mg/L ioni
NO3-= rezultat final ( valoarea este foarte bună) ce reprezintă concentrația de ioni NO3-
din 1000 mL (1 L) apă de fântână.

6
proba C – apa de la robinet : (1) XC = 25 . Cp3 = 25 . 0,762 μg/mL = 19,05 μg/mL
(2): YC = ( X. V) / v = (19,05 . 1000) / 4,0 = 4,7625 μg/1000 mL =
4,7625 μg/L Valoarea lui Y se transformă apoi în mg/L: YC = 0,0047625 mg/L ioni NO3-=
4,7625 . 10-3 mg/L ioni NO3- rezultat final ( valoarea este foarte bună) ce reprezintă
concentrația de ioni NO3- din 1000 mL (1 L) apă de la robinet.

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul unui
interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-un
anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarea acceptată pentru
coeficientul de corelaţie este :r ˃ 0,999, coeficientul de regresie liniară r2 ≥ 0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului Microsoft
Office Excel 2016., redaţi în tabelul 2.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce poate fi
detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se exprimă în
aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea formulă: LD
= 3 x SE/ Panta (1)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o probă,
ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă, în
aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 x SE / Panta (2), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA → DATA
ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel Option – Add
In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția REGRESSION, se
selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează toată coloana lcu
valorile numerice ale ui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se selectează toată coloana
cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie Excel cu mai multe tabele.
Se ia primul tabel din foaie:

7
 Tabel 3 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare
Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.9998201
2
Coeficientul de regresie lineară R 0.9996403
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0.9995954
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.0061473
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 10

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.1312 x , sau Ap (λ) = 0,1312. Cp (μg/mL) .

Intersecţia cu ordonata a fost nulă ( dreapta a pornit din origine) iar panta dreptei a fost
0,1312. Coeficientul de regresie R2 = 0,9996403, iar coeficientul de corelaţie R s-au situat
perfect în limitele normale, S-au situat puțin peste valoarea minimă admisă. (tabelul 2), S-a
constatat variaţia direct proporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate foarte bună a metodei). . Eroarea standard (SE) a dreptei de
regresie a avut valoarea 0,0061473 (valoare foarte bună, perfect acceptabilă !) (tabel 2)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,0061473 / 0,1312 = 0,141 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,0061473 / 0,1312 = 0,469 μg/mL. (valori foarte bune,
acceptabile !)

Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil a anionilor nitrat NO 3- din trei
probe de apă a fost perfect liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales 0 – 7,20 μg/mL;
(din fig. 1 se observă că toate punctele sunt chiar pe dreaptă , cu excepția unui singur punct
tangent la dreaptă) coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,9996403, iar cel de corelaţie R =
0,9998201, s-au încadrat perfect în intervalul normal de valori (R2 ≥ 0,999, R > 0,999). .
Eroarea standard a dreptei de regresie a fost SE = 0,0061473. (valoare bună ! ) Limita de
detecţie, LD = 0,141 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 0,469 μg/mL s-au încadrat în
limitele normale de valori. Cea mai mare concentrație (mg/L) de anioni nitrat NO3- a fost
găsită în proba B (apa de fântână) → YB = 29,631 mg/L, urmată de proba A (apa de izvor)
→ YA = 23,531 mg/L Cea mai mică concentrație de anioni nitrat a fost descoperită în proba C
(apa de la robinet) → YC = 4,7625 . 10-3 mg/L. Toate cele trei valori obţinute pentru cele
apa provenită din cele trei surse s-au încadrat sub nivelul maxim admis de anioni nitrat NO 3-
din apa potabilă (50 mg/L). Apa provenită din cele trei surse poate fi destinată consumului
public, fără nici un risc de îmbolnăvire ce ar fi putut fi cauzat de concentrații prea mari de
ioni NO3-.
8
9