Laboratorul de Nanotehnologii

TEHNICI DE SPECTROSCOPIE

Mihaela Miu (mihaela.miu@imt.ro)

Definitie generala:

Spectroscopia presupune analiza efectului interactiei radiatiei electromagnetice cu proba

Proprietatile radiatiei electromagnetice

 energia;

 viteza;
Lungine de unda
Amplitudine
 amplitudinea; Modificarea a cel putin una din
 frecventa; proprietati are loc la interactia
 unghiul de faza; radiatiei electromagnetice cu proba

 polarizarea;

 directia de propagare.
 UV Vis:
IR: unde Radio :
raze X: excitatia
starile de spin nuclear
excitatia electronilor electronilor de vibratii moleculare
(in camp magnetic)
adanci valenta
 Excitarea electronica a electronilor intre orbitalii moleculari 4 tipuri de tranzitii posibile:

Orbitalii legaturilor simple

σ* – de antilegatura (neocupati) Nivele energetice libere

 σ → σ* necesita cea mai mare energie
Orbitalii legaturilor duble (posibile stari excitate > Ee)
(λ<150nm → UV indepartat) ;

π* – de antilegatura (neocupati)  n → σ* sunt caracteristice sistemelor cu

heteroatomi (N, O etc.) care contin electroni

neparticipanti (λ ≈ 180 - 370 nm);
radiatie Orbitalii legaturilor duble
Nivele energetice ocupate  π → π* şi n → π* sunt caracteristice in cazul
λ π– de legatura (ocupati) (stari fundamentale > Ef) moleculelor cu legături duble (λ ≈ 200 - 700 nm).

Orbitalii legaturilor simple

σ– de legatura (ocupati)
ΔE = Ee – Ef = hc/λ

Nivelele vibrationale si rotationale superimpuse peste nivelele electronice

Nivele rotationale

Nivele vibrationale

Stari electronice
excitate
Nivele rotationale

Nivele vibrationale

Stari electronice
fundamentale
 Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica
electromagnetica lungimi de unda frecventa

Spectroscopie UV Vis masoara absorbtia pentru a avea

tranzitii din starea fundamentala
schimbarea
starii in starea excitata
Lumina vizibila
electronilor Electronii exteriori → determina comportarea
masoara tranzitiile din starea
1000 nm – 100chimica
nm
3·1014Hz - 3·1016Hz 104 – 106 cm-1
Spectroscopie de Radiatie UV
exteriori excitata in starea fundamentala
fluorescenta

Inregistreaza aparitia unor

Spectroscopia IR miscari vibrationale ale
moleculelor
schimbarea radiatie IR 100 μm – 1μm
starii de Inregistreaza aparitia unor 3·1012Hz - 3·1014Hz 100 - 104 cm-1
Spectroscopie Raman oscilatie miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului

Spectroscopie de
radiatia Rőntgen 3·1016Hz - 3·1018Hz 106 – 108 cm-1
electroni (ESCA) schimbarea starii electronilor adanci 10 nm -100 pm

Spectroscopia de
rezonanta de spin (ESR) schimbarea starii de spin a electronului sau a microunde 1 m – 1 cm 300 MHz – 30 GHz 0,01 – 1 cm-1
starii hiperfine

Spectroscopia de
rezonanta magnetica schimbarea starii de spin a nucleului unde radio 100 m – 1 m 3 MHz - 300 MHz 10-4 – 0.01 cm-1

nucleara (RMN)
 I

Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica
electromagnetica lungimi de unda frecventa

Spectroscopie UV Vis masoara absorbtia pentru a avea

tranzitii din starea fundamentala
schimbarea
starii in starea excitata
Lumina vizibila
electronilor 1000 nm – 100 nm 104 – 106 cm-1
Spectroscopie de masoara tranzitiile din starea Radiatie UV 3·1014Hz - 3·1016Hz
exteriori excitata in starea fundamentala
fluorescenta
1 SPECTROSCOPIE UV - VIZ
Spectrul vizibil
Frecvente mari Frecvente mici

Lungimi de unda (nm)

Violet: 400 - 420 nm

Indigo: 420 - 440 nm

Blue: 440 - 490 nm

Green: 490 - 570 nm

Yellow: 570 - 585 nm

> Cand lumina traverseaza sau este reflectata de o substanta
Orange: 585 - 620 nm
colorata, o parte caracteristica a lungimilor de unda este absorbita.
Red: 620 - 780 nm

> Lumina ramasa din spectru se presupune a fi complementara in

culoare cu lungimile de unda absorbite.
 Absorbtia luminii in domeniul 420-430 nm
face ca substanta sa fie galbena, iar

 Absorbtia luminii in domeniul 500-520 nm

face ca substanta sa fie rosie.

Absorbtia luminii din spectru este datorata tranzitiilor electronice

 Schema de detectie in spectroscopia UV-Vis

Spectrometru cu monofascicul Spectrometru cu retea de diode

(tot spectrul este obtinut odata)
(pentru fiecare lungime de unda este detectata
cantitatea de lumina transmisa / reflectata)

Spectrometru dublufascicul
 1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

Transmitanta: T = I / I0

Absorbanta: A = log10 I0 / I= log101/T = - log T

α – coeficient de absorbtie;

c – concentratia speciilor absorbante;

α = εc
ε – absorbtivitatea molara sau
coeficient de extincţie molara.

A = ε·c·l Legea Lambert – Beer

lumina incidenta lumina transmisa lumina incidenta lumina transmisa lumina incidenta lumina transmisa

Absorbanta este direct proportionala cu concentratia solutiei > dublarea concentratiei dubleaza absorbtia

Absorbanta este direct proportionala cu distanta parcursa in solutie > dublarea distantei dubleaza absorbtia
 1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

A = ε·c·l Legea Lambert – Beer

Exemplu de curbe

de absorbţie la

diferite

concentraţii de curba de etalonare a

analit absorbantei la maximul de

absorbţie la λmax

Deviatii de la legea Beer – descrie corect solutiile diluate

La concentratii mari (> 10-2 M) apar interactii intre particulele absorbante.

In plus, se modifica indicele de refractie al solutiei

Evolutia spectrului de absorbtie pentru nanocristale
cu diametre de la 1,7 nm pana la 12 nm 2. Se poate calcula dimensiunea cristalitelor
(CdSe/ZnS core/shell QD)
450 nm 700 nm

Lungimi de unda mai mici / energii mai mari

 Apare deplasarea spre albastru – blue shift – odata cu scaderea dimensiunilor

Eg (CdSebulk) = 1.75 eV → λbulk = 710 nm

Δλ ≈ 260 nm
Eg (CdSeOD) = 2.75 eV → λQD = 450 nm

 scaderea dimensiunilor unui cristal Ex: largirea BI ΔEg = 1eV corespunde unei deplasari Δλ ≈ 262 nm
pana la valori nanometrice determina

aparitia fenomelor de confinare cuantica Apare fenomenul de largire a benzii interzise (BI)
2 SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENTA

 detectie complementara spectroscopiei UV-Vis

> daca in spectroscopia UV-Viz se masoara energia absorbita de o molecula pentru a trece

dintr-o stare fundamentala in stare excitata,

> in spectroscopia de fluorescenta se masoara energia emisa de o molecula pentru a trece din

starea excitata in starea fundamentala.

Schema procesului de aparitie a fluorescentei

excitare

Fluorescenta

dezexcitare
Schema de detectie a unui spectrometru de fluorescenta
cu o geometrie la 90º utilizand o sursa de Xe

Detaliu drum optic

Schema de detectie a fluorescentei in “Microarray technology”
 Diagrama Jablonski
Conversie interna > tranzitii neradiative

Vi – stari energetice de vibratie

S0 – stare fundamentala;

S1 – prima stare de tranzitie electronica excitata

 Time resolve fluorescence Se obtine timpul de viata al unei

Proba este supusa unei iluminari in pulsuri specii moleculare excitate
(durata pulsurilor trebuie sa fie mai scurta
ca timpul de viata) > nanoFlash Lamp

ns μs

fluorescenta fosforescenta

 Steady state fluorescence Se obtine spectrul de emisie

Proba este supusa unei iluminari continue
(de fapt este o mediere a fenomenelor ‘time resolve’)
 Investigarea constantei de legatura a bioconjugatelor
BSA-Nanoparticule de aur
prin spectroscopia de fluorescenta
M. Iosin, F. Toderas, and S. Astilean,
Institutul de Cercetari Experimentale Interdisciplinare, Laborator de Nanobiofotonica, Universitatea Babes Bolyai, Cluj-Napoca

Fenomen de stingere a
fluorescentei
 II

Metoda Fenomenul ce sta la baza Tipul de radiatie Domeniul de Domeniul de Numar de unda
spectroscopica
electromagnetica lungimi de unda frecventa

Inregistreaza aparitia unor

Spectroscopia IR miscari vibrationale ale
moleculelor
schimbarea
starii de Inregistreaza aparitia unor 100 μm – 1μm 3·1012Hz - 3·1014Hz 100 - 104 cm-1
radiatie IR
Spectroscopie Raman oscilatie miscari vibrationale ale
moleculelor atunci cind sint
insotite de o modificare in
momentul dipolului
 3 SPECTROSCOPIE IR si Raman

Fiecare atom are 3 grade de libertate > o molecula cu n atomi are 3n grade de libertate

3 grade de libertate descriu 3 grade de libertate descriu

+
translatia moleculei rotatia moleculei

Pentru o molecula liniara, rotatia in jurul axei nu 3n-6 grade de libertate descriu vibratiile fundamentale
conteaza (nu afecteaza energia moleculei)

Cele care produc o modificare neta

3n – 5 grade de liberate descriu vibratiile fundamentale

in momentul dipolului in polarizare pot da o

pot da o activitate IR activitate Raman

Sunt vibratii active atat IR cat si Raman

Exemple:

• H2O – molecula neliniara cu 3 atomi 3n – 6 = 3 stari vibrationale

• CO2 – molecula liniara cu 3 atomi 3n – 5 = 4 stari vibrationale

• C6H6 (benzen) – molecula foarte mica, dar cu 30 de benzi de vibratie in IR si Raman

• molecula polimer – polistiren – contine 1000 de unitati monomere (16000 atomi) → aproximativ 50.000 de vibratii diferite
Este imposibili identificarea tuturor starilor vibrationale → simplificam luand in considerare numai gruparile chimice repetitive (ex: benzile nucleului aromatic, vibratiile C-H, C-C sau C=C
Teoria spectroscopiei de absorbtie in infrarosu

Pentru ca o molecula sa absoarba radiatia IR, vibratiile sau rotatiile in

interiorul ei trebuie sa determine o schimbare neta in momentul de dipol

Campul electric oscilant al radiatiei electromagnetice

interactioneaza cu fluctuatiile momentului de dipol al moleculei

Daca frecventa radiatiei se potriveste cu frecventa vibrationala

a moleculei, atunci radiatia va fi absorbita

Va aparea o modificare in amplitudinea vibratiei moleculare.

Factori care afecteaza pozitia vibratiilor moleculelor in spectrul absorbtiilor
I // Cazul unor molecule liniare

(i) Tipul de vibratii (ii) Taria legaturii

Exemplu Exemplu

Legatura C - N absoarbe la Legatura C ≡ N absoarbe la

1050– 1650 cm-1 ≈ 2200 cm-1

Energie mai mica Energie mai mare

Exemplu Exemplu
In cazul unor legaturi similare, diferenta in energia
Legatura C - H stretch in alkene Legatura C - H bend in alkene absoarbe de absorbtie este data de masa atomilor constituenti
absoarbe la 2600 – 2800 cm-1 la 1365 – 1485 cm-1

Atomul cu masa mai mica Atomul cu masa mai mare va

va vibra mai puternic vibra mai putin
Energie mai mare Energie mai mica

Legatura C – Cl absoarbe Legatura C – Br absoarbe

la 600 – 800 cm-1 la 500 – 600 cm-1

Atomul de Cl e mai usor >

energie mai mare de vibratie Atomul de Br e mai greu >
energie mai mica de vibratie
I I // Cazul unor molecule neliniare

Exemplu: apa (H2O) – molecula neliniara cu 3 atomi

3n – 6 = 3 stari vibrationale

3 benzi de absorbtie in IR si Raman

n – 1 = 2 → vibratii streching 2n – 5 = 1 → vibratii bending

pentru legaturile H - O pentru structura H – O - H

 Felul in care radiatia este utilizata difera in spectroscopia Raman fata de spectroscopia IR :

 in FTIR energia care acopera un interval de frecvente este directionata catre proba;

> absorbtia are loc cand frecventa radiatiei incidente se identifica cu cea la care molecula

trece intr-o stare excitata vibrationala

 in Raman se utilizeaza o singura frecventa a radiatiei pentru iradierea probei

> radiatia este imprastiata de molecula, detectandu-se unitatile de energie vibrationale

diferite de cele incidente (lumina care interactioneaza cu moleculele distorsioneaza – polarizeaza – norul electronic)
Imprasierea Raman trebuie exprimata ca o deplasare in energie fata de radiatia de excitatie

 Pentru legaturi cu un moment puternic de dipol (care sunt active IR) mobilitatea electronilor sau polarizabilitatea este de obicei scazuta.

 Pentru legaturi cu un moment slab de dipol (care sunt inactive IR) polarizabilitatea este de obicei mare si starile vibrationale ale legaturilor sint active Raman.

Spectru IR

Acid benzoic

Spectru Raman
Spectroscopie Raman

Nu implica nici absorbtia, nici emisia, ci imprastierea radiatiei

Radiatia IR incidenta determina miscarea electronilor in legaturi si poate fi: Este sensibila la

mobilitatea electronilor in legaturi

 absorbita;
(polarizabilitatea legaturilor)
 difuzata fara a i se modifica lungimea de unda > difuzie Rayleigh; Masoara cit de usor este sa misti un
electron si implicit sa polarizezi o legatura
- intensitatea Rayleigh depinde puternic de lungimea de unda I ~ λ-4

 imprastiata Raman-Stokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mare decât cea a radiatiei incidente);

 imprastiata Raman-antiStokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mica decât cea a radiatiei incidente);
Spectroscopie IR

 Energia asociata radiatiilor IR este suficienta sa stimuleze vibratiile moleculare (ale legaturilor chimice)

Conditii pentru ca o molecula sa absoarba radiatia în domeniul IR:

􀂄 sa aiba o structura de dipol sau sa poata dobandi o astfel de structura prin excitatie

􀂄 perioada de vibratie trebuie sa fie in faza cu perioada de oscilatie a radiatiei

incidente

􀂄 cantitatea de energie a radiaţiei IR trebuie sa fie permisa de restrictiile cuantice

Spectrul IR rezultat reprezinta absorbtia si transmisia

moleculara, fiind amprenta moleculara a probei

 Spectrele utilizate curent sunt de fapt spectre asupra carora s-a aplicat transformata Fourier

Spectroscopia FTIR - o metoda de masura a tuturor frecventelor IR simultan utilizand interferometria

Schema de detectie Fasciculul IR incident este

divizat in 2 fascicule optice

Un fascicul se reflecta pe o Al 2-lea fascicul se reflecta pe o oglinda

oglinda plata fixa plata care se deplaseaza pe distante
scurte (inainte – inapoi)

Se recombina cind se reintilnesc in splitter

Pentru ca au parcurcurs drumuri optice diferite, semnalul

rezultat este un semnal de interferenta

Fiecare punct contine o informatie

despre fiecare frecventa IR care
vine de la sursa
Spectrul FTIR pentru o solutie de etanol

O-H

C-H

C-0

Observatii:

- o molecula contine legaturi care dau mai multe vibratii posibile > in spectrul IR trebuie sa se regaseasca

mai multe absorbtii care sa defineasca o molecula (nu numai o legatura chimica);

- se pot identifica legaturile specifice ale unei molecule (gruparile functionale) pentru a determina structura;
III PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)
 III PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)

 tehnica utilizata pentru determinarea dimensiunilor nanoparticulelor

procesul de clusterizare a particulelor in suspensie

Se obtin in plus informatii despre
procesul de adsorbtie a anticorpilor pe particule

Principiul de detectie:

proba cu particule in suspensie este iluminata

particulele vor imprastia lumina in toate directiile

pe un ecran situat in vecinatate

 daca particulele ar fi fixe > imaginea de pe ecran ar fi stationara;
vor aparea spoturi luminoase  fiind in miscare browniana > imaginea nu este stationara

proba

Particule in
suspensie

Intensitatea luminoasa
va fluctua in timp
 Din punct de vedere fizic

- Atunci cand un fascicul de lumina traverseaza o solutie cu particule sferice aflate in miscare Browniana,

interactiile cu particulele determina o deplasare Doppler, modificand lungimea de unda initiala

Depinde de marimea particulelor

Este posibila obtinerea distributia de dimensiuni ale sferelor si

sa ai implicit o descriere a miscarii particulelor in mediul
respectiv masurand coeficientul de difuzie al particulelor si
utilizand functia de autocorelatie.

O functie caracteristica de autocorelatie a luminii Particulele sau macromoleculele suspendate intr-un mediu lichid, aflate in
imprastiate - determinate experimental
miscare Browniana determina fluctuatiii ale concentratiei locale a particulelor

apar neomogenitati locale ale indicelui de refractie

Rezulta fluctuatii ale intensitatii luminii imprastiate

Semi-largimea emisiei la semi-inaltime (HWHM) este

proportionala cu coeficientul de difuzie al particulelor D:

Γ = Dk2 unghiul de imprastiere

unde

lungimea de unda a LASER-ului

IV SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA
IV SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

In curent continuu E Sistem analizat I

E=IxR

In curent alternativ
E E0 + ΔE sin(ωt) Sistem analizat I0 + ΔI sin(ωt +θ) Z
E=IxZ

I, EU
I,
θ: –phase
deplasare de faza
shift

timp
time
 Prezentarea rezultatelor masuratorilor de impedanta

Z (iωi) = E (iωi) / I (iωi)

numar complex

Prezentare in coordonate Carteziene: Prezentare in coordonate Polare :

Z (iωi) = Rei + iImi Z (iωi) = =Zejφi
indicele i = 1, 2 ,….n – frecventele din interval

Z= (Rei2 + iImi2)1/2 - modul ;

Se realizeaza o scanare descrescatoare
– de la frecvente mari la frecvente mici – f i = arc tan Imi/Rei - faza.

Grafic in plan complex (Nyquist) Grafice Bode

Set de date 3D
-Im

D3 [ Rei, Imi, ωi] D3 [ ωi, Zi, f i ]

R1 R2 Re
 Avantaje si dezavantaje ale EIS

 Pe de o parte functia impedanta contine toate informatiile pentru un sistem investigat

(daca ipotezele de lucru sunt alese corespunzator).

 Pe de alta parte aceasta informatie trebuie extrasa din datele experimentale,

(identificarea procedurii de analiza a datelor)

Utilizarea spectroscopiei de impedanta (i)

 caracterizarea materialelor si proceselor tehnologice

structura cristalina caracterizarea densitatii de impachetare si

- evaluare rapida pentru un material cu o structura policristalina a
contributiei individuale la conductia electrica sau la polarizare
(efectele regiunilor de contact intergranulare sau a volumului)
distributia de defecte in straturile auto-asamblate
transferul electronilor prin stratul auto-asamblat
de alkanethiol si implicit prin straturile
corespunzatoare de recunoastere moleculara

caracterizarea electrozilor

-potentialul de flat-band, densitatea de sarcina (masuratori Mott-Schottky);

- proprietatile catalitice ale nanoparticulelor metalice

transferul electric in materiale nanocompozite

- contributia starilor electronice de suprafatala transportul electronilor

 caracterizarea dinamica pentru extragerea parametrilor celulelor solare

- concentratia de dopare a junctiunii,

- timpul de viata efectiv;
- efectul straturilor tampon asupra timpului de viata a purtatorilor minoritari;
Utilizarea spectroscopiei de impedanta electrochimica (ii)

 caracterizarea sistemelor electrochimice / fenomenelor fizico-chimice care apar la interfetele electrochimice

- transportul de masa, transferul de sarcina prin interfata sau efectele adsorbtiei;

- parametrii de reactie (relatia intre geometria electrozilor si cinetica la electrod,
1.
monitorizarea incarcarii surprafetei electrozilor datorita speciilor intermediare adsorbite;
- efectele straturilor de interfata in cazul structurilor poroase.
dezvoltarea
de senzori
- mecanismele ne-faradaice
(pierderile ohmice, conductivitatea ionica in membranele cu schimb protonic);
2.
- investigarea integritatii oxidului / straturilor de acoperire;
- ratele de corodare (proprietatile straturilor organice de acoperire in contact cu solutiile corozive

 caracterizarea sistemelor bio-electrochimice

- instrument de detectie in care marcarea nu este necesara (label-free) a modificarii

proprietatilor de interfata prin legarea unor biomolecule incarcate pe suprafata

- analiza hibridizarii AND-ului pe electrozi

 Electrical / Impedance detection
Binding of DNA inside the PSi matrix induces a change in capacitance and conductance.
Mott-Schottky plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The capacitance of the Electrolyte/PS/Si

has been measured as function of DC
potential and the data recorded for different
concentration of DNA in electrolyte solution
are presented. The figure illustrate that the
test structure capacitance plots suffer
modifications by adding different
concentrations of DNA in electrolyte
solution: the flat band potential is shifted
to lower values as DNA immobilization
starts from 0.31V to 0.24V and 0.21V
respectively.

Experimental data
Phosphate buffered saline- PBS) is a buffer solution commonly used in biological research. It is a salty solution containing sodium
chloride, sodium phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate. The buffer helps to maintain a
constant pH.
DNA 1 1 µM /50 ml PBS solution
DNA 2 2 µM/50ml PBS solution
Bode (a, b) and Nyquist (c) plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The Bode phase angle plots (a) reveal that phase angle attained a maximum at the value of -30° at higher
frequency region, which tends to -20° as the concentration of DNA is increased; opposing, in lower
frequencies domain, the maximum is initially around -70° and its value increases to -80° going
concomitantly with a gradual shift to lower frequencies, proving that the interface phenomena became
dominant. The corresponding impedance module plots fig. (b) show a similar behavior, with a more
evident decrease of values in low frequencies domain. The Nyquist graphs presented in fig. (c) indicate
that the data are not well separated above 200 Hz and clear distinct below, with a dominant interface
capacitance.