MICROSCOPIE

Curs 1
2023
Curs
Istoricul, evoluția și aplicațiile microscopiei optice (fotonice)
Istoricul, evoluția și aplicațiile Microscopiei electronice
Microscopia cu lumină polarizată (POL): aplicatii ale observatiilor in lumina polarizata.

Tehnici de realizare a preparatelor (vegetale si animale) pentru observarea la microscopul fotonic;

tehnici de histochimie, imunohistochimie și imunofluorescență în biologia vegetală

Tehnici de preparare a materialelor (vegetale si animale) pentru observarea la microscopul fotonic;

tehnici de histochimie și imunofluorescență în biologia animală.
Tehnici de preluare digitala a imaginilor. Prelucrarea fotomicrografiilor. Tehnici de biometrie și alte
tehnici de cuantificare. Interpretarea fotomicrografiilor.
Microscopul electronic cu baleiaj (SEM) – alcatuire, mod de funcționare și aplicații în biologia vegetală
și animală
Microscopul electronic cu transmisie (TEM) – alcatuire, mod de funcționare și aplicații în biologia
vegetală și animală

Prepararea materialului biologic (de origine vegetală) pentru observare la SEM și TEM

Prepararea materialului biologic (de origine animală) pentru observare la SEM și TEM Tehnici speciale
de preparare a materialelor pentru TEM (crioultramicrotomie, criofractura, imunohistochimia, umbrirea
cu metale). Microscopia electronică modernă de înaltă rezoluție.
Inceputurile microscopiei fotonice sunt legate de Zacharias Janssen, care în
1590 construieste un microscop rudimentar.
 Robert Hooke (1635-1703), primul cercetător care introduce noțiunea
de celulă, în urma observațiilor la microscop a unei secțiuni prin plută.

Hooke a studiat la Universitatea Oxford, unde a fost asistentul fizicianului

englez Robert Boyle. A fost astronom, fizician, filosof, arhitect si inventator.
In 1665 publica lucrarea Micrografia sau unele descrieri fiziologice a celor
mai mici corpuri cu ajutorul sticlelor măritoare cu observarea și analizarea
lor. Aceasta este prima lucrare aparută dupa inventarea microscopului, în
care se descriu structuri văzute la microscop.
 Anton van Leeuwenhoek

Antoine Van Leeuwenhoek (1632-1723) din Delft. Acesta a utilizat un microscop

care marea de 300 de ori, cu care a descris pentru prima data hematiile,
spermatozoizii, bacteriile și a scris lucrarea tainele naturii descoperite cu ajutorul
microscopului, apărută în 1695. Este considerat părintele microscopiei optice.
Marcello Malpighi (1628-1694)
Este considerat părintele anatomiei
microscopice, a anatomiei și histologiei
plantelor, a fiziologiei si embriologiei.
A fost primul cercetător care a
vazut capilarele la animale și a
descoperit legăturile dintre vene și
artere.
Publică Anatome Plantarum în
1675, o carte în care descrie structura
tulpinii, vasele de lemn și de liber,
scoarta tulpinii, structura mugurilor si
rolul lor în apariția frunzelor, structura
florilor, formarea fructelor și semințelor.
Lucrarea sa reprezintă un punct de
cotitură în botanică, deschizând drumul
observațiilor realizate cu ajutorul
microscopului.
Cu ajutorul obsrevațiilor
microscopice, în 1838 este
formulată teoria celulară, de catre
Mathias Schleiden, profesor de
botanică la Jena și de Theodor
Schwann, profesor de zoologie la
Louvain; inițial Schleiden a arătat
că plantele sunt alcătuite din celule,
iar Schwann extinde această teorie
și la organismele animale.
Matthias Jakob Schleiden
Theodor
Schwann
Cu toate perfecționările aduse microscoapelor fotonice nu
s-a putut depăși rezoluția de aproximativ 0,25 micrometri
a acestora – un microscop fotonic nu poate să separe 2
puncte aflate la distanță mai mica de 0,25 µm. Această
limitare a microscoapelor fotonice se datorează lungimii
de unda λ a luminii din spectrul vizibil. Singura posibilitate
de a mări rezoluția microscoapelor fotonice este de a
utiliza limina ultravioletă, cu o lungime de undă mai
redusă (între 10 nm și 400 nm). La acestea rezolutia este
de aproximativ 0,1 µm (1000 Å).
Peste această limită microscoapele fotonice nu mai pot
produce imagini clare.
 Ernst Ruska și Max Knoll

Ernst Ruska și Max Knoll in 1931 au construit primul prototip de microscop

electronic cu transmisie capabil de o marire de 16 de ori, punand bazele
microscopiei electronică.
Peste 2 ani, Ruska construiește un nou microscop electronic care mărea de 14.000
de ori, cu o rezoluție de 500 Å.
Prototipul primului microscop electronic
construit de Ernst Ruska in 1933

Teza de doctorat a lui Ruska a fost

publicată în 1934 și se intitula On a
magnetic objective lens for the electron
microscope. În anul 1986 a primit Premiul
Nobel in Fizică pentru invenția sa.
Primul virus vazut la microscop– Virusul mozaicului tutunului.

TMV , virusul mozaicului

tutunului

Virusul mozaicului tutunului

provoacă apariția unui tipar de pete
maro și uscate pe frunzele de tutun
și, prin urmare, are o importanță
economică majoră. Acesta
infectează și alte culturi, în special
roșiile.
Virusul se răspândește mecanic de
la plantele infectate la frunzele
zgâriate sau deteriorate ale
plantelor sănătoase. Este foarte
stabil în natură și a fost observat în
produsele din tutun chiar și la câțiva
ani după ce frunzele au fost
procesate. Singura măsură de
control agricol cunoscută la acest
moment este distrugerea plantelor
infectate.
Microscoapele electronice cu transmisie sunt de 2 feluri:
- Microscoape electronice cu transmisie convenționale (CTEM), care folosesc
tensiuni de accelerare a electronilor de 200kV;
- Microscoape electronice cu transmisie cu voltaj înalt (HVEM) care folosesc
tensiuni de accelerare a electronilor de 3000 kV.

HVEM
CTEM
Principiul funcționării microscoapelor electronice prin transmisie (TEM, Transmission
Electron Microscope) este foarte asemanator cu cel al microscoapelor optice, folosindu-se
lentile magnetice in locul celor optice, iar locul fotonilor este luat de electroni. Electronii sunt
accelerati in vid, la viteze la care lungimea de unda asociata este egala cu pana la a suta
mia parte din lungimea de unda a luminii vizibile. Imaginile sunt create de fasciculul de
electroni care traverseaza proba si care interactioneaza apoi cu un sistem de detecție (film
fotografic, ecran fluorescent).

La toate tipurile de microscoape electronice electronii generați de un tun

electromagnetic și supuși unei tensiuni de accelerare la alegere sunt focalizați
și dispersați pentru a crea o imagine prin trecerea lor prin câmpuri
electromagnetice si electrostatice. În astfel de câmpuri electronii pot fi determinați
să se comporte asemănător cu fotonii în sistemul de lentile al microscopului
fotonic.
În acest caz câmpurile electrice sau magnetice se comportă față de electroni
precum o lentilă și se numesc lentile electrostatice sau electromagnetice, în
funcție de modul în care sunt construite.
- Lentilele electrostatice sunt formate din discuri metalice suprapuse unele
peste altele; însa funcționarea lor poate produce diverse probleme si nu au fost
utilizate pe scară larga.
- Lentilele electromagnetice sunt reprezentate de un solenoid cu spire
dispuse pe un miez de fier de înaltă rezolutie – o bobina a carei număr de spire
precum si curentul care o strabate determină caracteristicile microscopului.
Microscoapele electronice nu folosesc lumina pentru obținerea imaginilor, ci o sursă
de electroni. Fasciculul de electroni are o lungime de undă care variază, în funcție
de tensiunea de accelerare, de la 0,085 Å la 20 kV până la 0,0028 Å la 4000 kV.
Cu toate ca rezolutia primelor
microscoape electronice era mult
mai slaba decat cea prevazuta
teoretic, tehnica a fost imbunatatita
treptat, ajungand in primii ani sa
depaseasca rezolutia
microscoapelor optice, iar in prezent
sa coboare sub 1Å.
Astfel cercetătorii pot observa
structura intimă a celulei, fiind
posibilă observarea chiar a atomilor
diferitelor elemente (rezolutia
microscoapelor electronice putând
atinge 1 Å= diametrul atomului de
hidrogen). Totusi trebuie precizat
faptul ca asemenea rezoluții înalte
se ating pe materiale cu strutură
cristalină si mai puțin pe materiale
biologice care, fiind fragile, tind să
fie distruse de fasciculul puternic de
electroni necesar pentru obținerea
unei astfel de imagini.
Cu ajutorul tunului de elctroni se obține un
fascicul de electroni care să asigure
iluminarea peparatului. Acesta este produs
de:
- catod - un filament tungsten (de obicei)
cu diametrul de 0,1-0,2 mm, de forma
literei V;
- un inel port-catod, numit cilindrul Wehnelt;
- anodul este un disc metalic cu o
deschidere de 3-5 mm pe unde sunt dirijati
electronii în axul optic al coloanei
microscopului.
 Filament tungsten

Filament din hexaborat

de lantan (LaB6)

Tun de electroni cu emisie de câmp cu

catod de tungsten în formă de ac
Coronavirusurile si microscopia electronica

Prima imagine a unui coronavirus aviar obtinută în Reagan în 1948

Prima imagine a unor coronaviruși umani 229E (2) și B814 (3,4)
obținute de Almeida in 1966
Coronavirusul uman OC43 (imagine din 1984)
Imaginea la TEM a
SARS-CoV-2