Preparate microscopice

Examenul bacteriologic urmareste

evidentierea si identificarea bacteriilor in
produsele patologice.
Bacteriile au dimensiuni de
micrometrice, deci nu pot fi vizualizate
decat la microscop.
 Preparate microscopice
► Sunt de doua feluri:
► Preparat nativ cu germeni vii
► Preparat colorat= frotiu cu germeni omorati.
► Examenul microscopic da indicatii asupra
► prezentei microorganismelor in preparat
► si asupra proprietatilor morfotinctoriale:
► - forma (bacili, coci, spirili)
► - marimea
► - mobilitatea ( in preparatul nativ )
► - existenta eventuala a formatiunilor
► neobligatorii ( cili, capsula, spori
► Asezarii bacteriilor in frotiu ( lant, ciorchine, diplo, tetrade,
etc)
► Proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
► Examenul microscopic direct din produsele
patologice permit in unele infectii stabilirea
diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos,
stafilococ ) si constituie o etapa esentiala in
identificarea bacteriana.
 Preparatul nativ
► Este un preparat ce contine germeni vii
► Ex. microscopic al preparatului nativ se face
prin
examinarea directa intre lama si lamela a unei
suspensii de germeni vii, intr-o picatura de ser
fiziologic, sau mediu de cultura lichid, precum
si a produsului patologic (singe, sediment
urina, lcr).
Examinarea se face cu obiectiv uscat ( 40x).
 Examenul microscopic al unui
preparat nativ
► Esteexaminarea directa intre lama si lamela
a unei suspensii de germeni vii intr-o
picatura de ser fiziologic sau mediu de
cultura lichid sau a produsului patologic
( sange, urina, LCR)
 Efectuarea unui preparat nativ
►O picatura din suspensia bacteriana se pune
pe o lama microscopica cu ajutorul unei
pipete Pasteur si peste picatura se pune o
lamela. Preparatul se examineaza la
microscopul optic, pe fond intunecat sau
prin contrast de faza.,
 Examinarea la microscopul optic
► Se face cu un obiectiv uscat, cu condensatorul
coborat, obtinandu-se un contrast cat mai mare.
► Privind din lateral apropiem obiectivul de preparat
► Privind prin ocular ridicam obiectivul pana apare
imagine in campul microscopic
► Miscand viza micrometrica vom obtine detalii.
► Aceasta examinare permite observarea mobilitatii,
formei si a numarului bacteriilor.
Examen nativ
 Examenul microscopic pe fond
intunecat
► Utilizeaza un condensator special de tip
cardioid care evidentiaza conturul
bacteriilor, corpul fiind luminos.
► Metoda se foloseste la studiul mobilitatii
bacteriene si la evidentierea speciilor greu
de colorat prin metode obisnuite:
Treponema, Leptospira
Examenul microscopic in contrast de
faza
► Foloseste condensator si obiective speciale
cu contrast de faza.
► Evidentiaza detalii morfologice: spori,
capsula
 Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)
► Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor
pot fi studiate mai detailat , pe preparate
fixate si colorate, cu germeni omoriti .
► Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex.
in reactia de umflare a capsulei.
 Timpii de executie a
preparatului colorat
► Timpi pregatitori:
► etalarea = intinderea frotiului
► uscarea
► fixarea ( procedee fizice – prin incalzire si
chimice: cu alcool metilic, etilic, alcool -eter,
acid acetic )
 Timpi terminali
►Colorarea

►Spalarea

►Uscarea
 Etalarea
► Intinderea frotiului
► Se face lame microscopice perfect curate si degresate
► Daca produsul patologic este lichi de pune o picatura pe
lama microscopica si se indinde cu ansa.
► Daca se face ditr-o cultura de pe mediu solid . Se pune pe
lama o picatura de ser fiziologic in care se suspensioneaza
o colonie cu ajutorul ansei bacteriologice.
► Un frotiu corect trebuie sa fie bine intins, subtire, uniform
si trebuie sa lase o margine de de 1-2 cm pana la periferia
lamei.
 Uscarea
► Se
face lent la lasand lama la temperatura
camerei, ferita de praf sau de curenti de aer

 Fixarea
► Se face prin procedee fizice si chimice
 fIXAREA
►Procedeul fizic
► Estecel mai utilizat si consta in incalzire prin
trecerea lamei printr-o flacara, de trei ori,
pana lama se incalzeste la o temperatura
suportabila pe dosul mainii.
 Fixarea
► Procedee chimice

► Frotiuluscat se trateaza cu :
► alcool etilic, metilic
► amestec alcool-acetona
► saruri de metale grele
 Fixare
► Prinfixare microorganismele sunt omorate,
preparatul ne mei fiind infectios
► Adera mai bine la lama
► Creste permeabilitatea peretelui celular
crescand afinitatea fata de coloranti.
 Colorarea
► Se folosesc coloranti organici: acizi, baze
sau coloranti neutrii sub forma de solutii
apoase la care se adauga cantitati mici de
alcool.
► Ex de coloranti: fuxina bazica, violet de
gentiana, albastru de metilen, verde
malachit, verde metil
 Coloratia
► Este un proces fizico-chimic complex in care
colorantul se combina cu componentii celulari
facandu-i vizibili la microscop prin formarea unor
combinatii stabile.
► Se acopera suprafata frotiului fixat cu colorant, se
lasa sa actioneze o periada de timp la cald sau la
rece.
► In urma colorarii obtinem detalii vizibile la
microscop referitor la structura celulara,
dimensiuni, asezare, etc.
 Tipuri de coloratii
► Coloratia simpla foloseste un singur colorant
► Coloratia combinata: colorantii actioneaza
succesiv sau simultan pe anumite elemente
► Coloratii speciale: pun in evidenta elemente
structurale: corpusculi, cili, spori, capsula.
 Spalarea
►Se face cu apa de robinet sau cu apa
distilata pana la indepartarea excesului
de colorant de pe lama.
 Uscarea
► Seface la temperatura camerei, punand
lama in pozitie verticalaintr-un stativ
 Examinarea microscopica a unui
frotiu colorat
► Se face cu obiectivul cu imersie
► Lichiudul de imersie( uleiul de cedru are un indice de
refractie apropiat de cel al sticlei.
► Se ridica condensatorul la maxim
► Se deschide complet diafragam
► Se fixeaza lama pa platina microscopului
► Se pune o picatura de ulei de cedru
► Se coboara obiectivul pana patrunde in uleiul de imersie cu
ajutorul vizei macrometrice, privind din lateral
► Se ridica din viza macrometrica pana apare imaginea,
privind prin ocular
► Din viza micrometrica se clarifica imaginea
 COLORATII SIMPLE

► COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN

► a) Componente
► - solutie albastru de metilen
► b) Prepararea solutiei colorante apoase
► 1. Albastru de metilen
► - albastru de metilen pulbere …………………...1g
► - alcool etilic 96 grade ………………………10 ml
► - apa distilata ……………………………….100 ml
► c) Tehnica coloratiei
► Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
► - se acopera cu solutie albastru de metilen 2-3 min.
► - se spala cu apa de robinet
► - se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
► d) Rezultate
► - Bacteriile apar la examinarea cu imersie de culoare albastra
 Coloratia simpla
► Coloratiacu fuxina tote elementele apar
colorate in rosu
 COLORATII COMBINATE
COLORATIA GRAM
► Tehnica coloratiei
► Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
► se acopera cu sol.Violet de gentiana 1 – 2 min
► se inlatura colorantul si se spala cu apa
► se acopera cu sol. Lugol 2 min
► se inlatura sol. Lugol
► se decoloreaza cu alcool-acetona
► se acopera cu sol.Fucsina diluata 1/10, 30sec-1min
► se spala frotiul cu apa
► se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
► d) Rezultate
► - Bacteriile Gram negative apar la examinarea cu imersie colorate in
rosu
► - Bacteriile Gram pozitive apar la examinarea cu imersie colorate in
violet
 COLORATIA GRAM
► Bacili Garm + bacili Gram -
 COLORATIA GRAM
► Coci gram + Coci gram negativi
 COLORATIA ZIEHL-NEELSEN

► Tehnica coloratiei
► Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel :
► se acopera lama cu fucsina fenicata
► se incalzeste la flacara pina emite vapori, de trei ori
► se mentine 10 min.
► se spala cu apa de robinet
► se decoloreaza cu amestec alcool- acid
► se spala cu apa de robinet
► se acopera cu sol. Albastru de metilen 1-2 min.
► se spala cu apa de robinet
► se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
► d) Rezultate
► - Bacilii acid – alcool rezistenti apar la examinarea cu imersie colorati in
rosu
COLORATIA ZIEHL-NEELSEN
 Coloratii speciale
► Obtinem detalii de structura bacteriana
► Col. Moller pentru spori sporul se coloreaza
in rosu;
 Coloratia Hiss
► Capsulabacteriana se coloreaza in roz iar
corpul bacteriei in violet
Coloratia cu tus de China
Coloratia cu tus de China