Denumirea cursului: Tehnici de cercetare în genetica moleculară

Titular: Prof.dr. Ioan Victor Pop

Durata cursului: 4 ore

Lucrări practice: 4 ore

OBIECTIVELE EDUCATIONALE ALE CURSULUI

Esenţiale – înţelegerea, corelarea şi problematizarea conceptelor/noţiunilor referitoare la:
-1.1.Bazele analizei moleculare a ADN: cunoasterea principiilor izolarii si purificarii ADN
genomic;
-1.2.Amplificarea secventelor de ADN in vederea analizei moleculare – reactia PCR
(polymerase chain reaction): cunoasterea principiilor reactiei PCR, cunoasterea tipurilor de mutatii
ce pot fi detectate cu ajutorul reactiei PCR;
-1.3.Analiza mutatiilor genice. Tehnici de diagnostic molecular: cunoasterea principiului si
aplicatiilor tehnicilor PCR-RFLP, cunoasterea principiului si posibilelor aplicatii ale tehnicii ARMS-
PCR Cunoasterea principiului tehnicilor de secventare a ADN, cunoasterea aplicabilitatii tehnicilor de
secventare a ADN, intelegerea principiului tehnicilor Real-Time PCR si reverstranscriptiei;
-2.1.Citogenetica clasica si cea moleculara. Tehnici citogenetice de inalta rezolutie:
cunoasterea principiilor de baza ale tehnicilor FISH, cunoasterea indicatiilor si a situatiilor concrete,
practice in care se recomanda utilizarea tehnicilor FISH;
-2.3.Tehnicile Standard FISH: cunoasterea tipurilor de sonde utilizate in tehnicile FISH.
Importante – înţelegerea, corelarea şi problematizarea conceptelor/noţiunilor referitoare la:
-1.1.Bazele analizei moleculare a ADN: cunoasterea principiilor prelevarii unor probe biologice
din diverse surse in vederea izolarii ADN genomic, identificarea principalelor surse pentru obtinerea
ADN in vederea analizelor moleculare;
-1.2.Amplificarea secventelor de ADN in vederea analizei moleculare – reactia PCR
(polymerase chain reaction):familiarizarea cu etapele si aparatura de laborator necesare realizarii
tehnicii PCR;
-1.3.Analiza mutatiilor genice. Tehnici de diagnostic molecular: cunoasterea tipurilor de mutatii
si maladii pentru care se poate aplica diagnosticul molecular utilizand tehnicile PCR-RFLP si ARMS-
PCR, familiarizarea cu necesarul si cu modul in care se realizeaza secventarea ADN, cunoasterea
aplicabilitatii practice a tehnicilor de secventare, indicatiile secventarii ADN;
-2.2.Tipuri de metode FISH utilizate in diagnosticul genetic: cunoasterea tipurilor de tehnici
FISH (Standard FISH, M-FISH, CGH);
-2.3.Tehnicile Standard FISH: cunoasterea aplicatiilor tehnicilor FISH in functie de tipul de
anomalie cromosomiala de diagnosticat;
-2.6.Avantajele si dezavantajele utilizarii tehnicilor FISH: cunoasterea avantajelor si a
dezavantajelor utilizarii tehnicilor FISH.
Utile – însuşirea noţiunilor referitoare la:
-1.3.Analiza mutatiilor genice. Tehnici de diagnostic molecular:interpretarea unor rezultate
pentru detectia unor polimorfisme sau mutatii genice prin tehnica PCR-RFLP si ARMS-PCR,
familiarizarea cu necesarul pentru realizarea tehnicilor de investigatie moleculara (PCR, PCR-RFLP),
cunoasterea avantajelor si dezavantajelor tehnicilor PCR-RFLP si ARMS-PCR, interpretarea unor
rezultate pentru detectia unor polimorfisme sau mutatii genice prin tehnica secventarii ADN,
cunoasterea aplicatiilor practice ale tehnicilor Real-Time PCR si reverstranscriptiei;
-2.3.Tehnicile Standard FISH: cunoasterea protocolului general FISH si a necesarului in materie
de costuri si timp, interpretarea unor rezultate obtinute prin analiza cu ajutorul tehnicii FISH.
Facultative – informare opţională referitoare la:
-1.1.Bazele analizei moleculare a ADN: interpretarea calitatii si cantitatii de ADN genomic izolat
pentru analizele moleculare, prin tehnici fotometrice;
-1.2.Amplificarea secventelor de ADN in vederea analizei moleculare – reactia PCR
(polymerase chain reaction): realizarea manoperei pentru reactia PCR si electroforeza ADN in gel de
agaroza, analiza secventelor de ADN de pe cromatogramele obtinute prin electroforeza capilara;
Departamentul nr. 3 – Ştiinţe Moleculare / 6-Apr-12 / Pagina 1
Departamentul nr. 3 - Ştiinţe Moleculare

-2.2.Tipuri de metode FISH utilizate in diagnosticul genetic: principiul si aplicatiile tehnicilor

CGH pentru diagnostic si cercetare.

PREZENTARE SUCCINTA
-1. Metode de analiză moleculară a genelor
-1.1. Bazele analizei moleculare a ADN
-1.1.1. Extractia ADN genomic
-1.1.2. Surse utile pentru extractia ADN genomic in vederea analizei
-1.1.3. Principiile izolarii ADN genomic
-1.1.4. Etapele importante ale obtinerii ADN genomic pornind de la diverse tipuri celulare
-1.1.5. Kit-urile de extractie ale ADN
-1.1.6. Principiile de baza ale evaluarii cantitatii si calitatii ADN extras
-1.1.7. Metode fotometrice de evaluare ale cantitatii si puritatii ADN extras
-1.2. Amplificarea secventelor de ADN in vederea analizei moleculare – reactia PCR
(polymerase chain reaction)
-1.2.1. Definitia si principiul reactiei PCR. PCR simplex si PCR multiplex
-1.2.2. Necesarul pentru realizarea unei amplificari prin reactia PCR
-1.2.3. Etapele de baza ale reactie PCR
-1.2.4. Parametrii reactiilor PCR
-1.2.5. Evaluarea calitatii amplificarii fragmentelor de ADN prin reactia PCR
-1.2.6. Electroforeza in gel de agaroza a fragmentelor de ADN
-1.3. Analiza mutatiilor genice. Tehnici de diagnostic molecular
-1.3.1. Tehnica PCR-RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragments length
polymorphism)
-1.3.1.1. Enzimele de restrictie
-1.3.1.2. Principiul tehnicilor PCR-RFLP si indicatiile acestora
-1.3.1.3. Etapele tehnicilor PCR-RFLP
-1.3.1.4. Interpretarea rezultatelor PCR-RFLP
-1.3.1.5. Avantajele si dezavantajele tehnicii PCR-RFLP
-1.3.2. Tehnicile AS-PCR si variantele acestora (ARMS-PCR, tetra-primer PCR)
-1.3.2.1. Principiul tehnicii ARMS-PCR si utilitate
-1.3.2.2. Avantajele si dezavantajele tehnicii ARMS-PCR
-1.3.3.Secventarea ADN
-1.3.3.1. Principiul tehnicilor de secventare a ADN
-1.3.3.2. Tipurile de tehnici de secventare a ADN
-1.3.3.3. Secventarea ADN prin metoda Sanger
-1.3.3.4. Necesarul si etapele tehnicii de secventare prin metoda autómata
-1.3.3.5.I nterpretarea si analiza de secventa prin analiza cromatogramelor obtinute
prin tehnica de secventare automata a ADN
-1.3.3.6. Utilitatea secventarii ADN
-1.3.3.7. Avantajele si dezavantajele secventarii ADN
-1.3.4. Alte tehnici de diagnostic molecular. Tehnica SSCP (single strand conformation
polymorphism).
-1.3.4.1. Principiul tehnicii SSCP si utilitate
-1.3.5. Tehnici cantitative de analiza a acizilor nucleici
-1.3.5.1. Tehnica RealTime-PCR: principiu si aplicatii in analiza acizilor nucleici si in
diagnosticul molecular
-1.3.6. Analiza moleculara a expresiei genice
-1.3.6.1. Analizele moleculare pornind de la moleculele de ARN mesager
-1.3.6.2. Tehnica de revers-transcriptie: principiu si aplicatii
Departamentul nr. 3 – Ştiinţe Moleculare / 6-Apr-12 / Pagina 2
Departamentul nr. 3 - Ştiinţe Moleculare

-2. Citogenetica moleculara - tehnicile FISH

-2.1.Citogenetica clasica si cea moleculara. Tehnici citogenetice de inalta rezolutie
-2.1.1. Tehnicile FISH (fluorescent in situ hybridisation). Definitie
-2.1.2. Sonde de ADN si marcajul fluorescent
-2.1.3. Principiul tehnicilor FISH
-2.1.4. Tipuri de molecule ce pot fi marcate cu ajutorul tehnicilor FISH
-2.1.5. Rezolutia tehnicilor FISH comparativ cu tehnicile de citogenética clasica
-2.2. Tipuri de metode FISH utilizate in diagnosticul genetic
-2.2.1. Tehnicile FISH Standard
-2.2.2. Tehnicile M-FISH
-2.2.3. Hibridizarea genomita comparativa (CGH)
-2.3. Tehnicile Standard FISH
-2.3.1. Fluoroforii utilizati
-2.3.2. Protocolul general pentru marcajul cromosomial prin tehnica FISH
-2.3.3. Tipuri de sonde utilizate in tehnicile FISH
-2.3.4.Aplicatiile FISH in cercetare si diagnostic
-2.3.5.Marcajul moleculelor de ADN: FISH metafazic si FISH interfazic
-2.4. Tehnicile M-FISH (multicolor FISH)
-2.4.1. Principii ale tehnicilor M-FISH
-2.4.2. Diagnosticul rearanjarilor cromosomiale complexe prin M-FISH
-2.5. Diagnosticul de preimplantare in cazul tehnicilor de reproducere umana asistata
-2.6. Avantajele si dezavantajele utilizarii tehnicilor FISH

BIBLIOGRAFIE OBLIGATORIE:

Genetica Medicala. M.Covic, D. Stefanescu, I. Sandovici. Editura Polirom, Iasi 2004

BIBLIOGRAFIE FACULTATIVA:
http://www.pasteur.fr/recherche/unites/biophyadn/e-fish.html;
http://www.pcrlinks.com/bar/generalities.htm;
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html.

Departamentul nr. 3 – Ştiinţe Moleculare / 6-Apr-12 / Pagina 3