LABORATOR

Medicina de Laborator
specialitate medical din grupul specialitilor paraclinice, care are ca obiect de activitate efectuarea investigaiilor de laborator pe eantioane de produse biologice prelevate de la pacieni, sau din mediul care poate afecta pacienii, n scopul de a contribui la stabilirea diagnosticului, sau la evidenierea dinamicii modificrilor fiziologice i fiziopatologice din organism.
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni!
Are o istorie destul de scurt, de un deceniu, dar a intrat n limbajul medical curent. Investigarea bolilor a crescut n complexitate Locul i rolul major al investigaiei de laborator pentru diagnosticul precoce al unor stri patologice Aplicarea schemelor de diagnostic (algoritmuri simplificate) sunt de un mare ajutor clinicianului.
Uniunea European ne permite s ne pstrm tradiiile, dar ne oblig s respectm regulile europene. Medicul de laborator trebuie recunoscut pe plan european. De la 1 ianuarie 2005, statele membre UE au trebuit s introduc obligatoriu standardele de trasabilitate. Trasabilitate urmrirea realizrii unui test de laborator de la recoltare pn la raportul de analiz.
Prof. univ. dr. Mihai Nechifor Dr. Manole Cojocaru Practica medicinii de laborator mcojocar@cmb.ro
Elemente de baza in interpretarea rezultatelor testelor de laborator

Evaluarea medicala a rezultatelor testelor de laborator include 2 etape:
evaluarea transversala: compararea rezultatelor obtinute cu valorile de referinta, range-ul terapeutic sau limita de decizie clinica; monitorizarea longitudinala: compararea rezultatelor actuale ale pacientului cu cele anterioare. Pentru interpretarea corecta a rezultatelor obtinute la determinarea diversilor analiti, laboratorul este obligat sa comunice in buletinul final valorile de referinta specifice sexului si grupei de varsta din care face parte pacientul testat.
Valorile de referinta Pot proveni din urmatoarele surse: furnizate de producator pentru metoda de lucru respectiva, pe baza unor studii cu caracter statistic literatura de specialitate (carti de referinta in domeniul medicinii de laborator), mai ales in cazul anumitor grupe de varsta (nou-nascuti, varstnici) studii proprii ale laboratorului, (daca acesta are acces la datele clinice ale populatiei testate). Valorile de referinta se aplica in general la 95% din populatia testata, astfel ca va exista mereu un procent redus de subiecti sanatosi la care valorile anumitor analiti sa fie situate in afara intervalului de referinta stabilit.
Pentru a evita confuziile de diagnostic si investigatiile inutile, se recomanda ca interpretarea rezultatelor testelor de laborator sa se faca intotdeauna in contextul clinic al pacientului.
In situatia in care apar valori critice la anumite teste de laborator, care impun o decizie terapeutica de urgenta, laboratorul isi asuma obligatia de a comunica rezultatele medicilor si pacientilor cat mai repede posibil.
Pe langa arsta si sex, este important sa se tina cont de existenta altor factori care pot influenta sau interfera cu rezultatele. - factori biologici de influenta: determina modificari in vivo ale unui analit, independent de metoda utilizata; aceste modificari sunt de regula tranzitorii si influenteaza temporar rezultatul; - factori de interferenta: actioneaza dupa recoltarea probei (in vitro) si conduc la un rezultat care nu corespunde cu nivelul real al analitului in organism (false cresteri sau scaderi).
Factori biologici care pot exercita influente si principalele teste de laborator afectate sunt: Factori de origine etnica - dublul si triplul test de sarcina. Altitudine - CRP creste pana la 65%, Hb si Ht cresc pana la 8%, creste nivelul de acid uric; scade creatinina urinara, clearance-ul la creatinina, estriolul si transferina Ritmul circadian - Cortizolul este crescut in cursul zilei si scade in cursul noptii; Potasiul prezinta o concentratie scazuta dupa-amiaza fata de valorile matinale.
Greutate corporala - persoanele obeze prezinta concentratii mai mari de acid uric, colesterol, LDH, insulina si glucoza postprandiala. Variatii sezoniere - T3 scade cu 20% vara. Alimentatie - dieta hiperproteica determina cresterea ureei si a acidului uric. Dieta bogata in grasimi creste nivelul de colesterol si trigliceride; Inanitia scade nivelul colesterolului, al trigliceridelor,
ureei, T3 si T4 si creste nivelul creatininei si al acidului uric.

Consumul de cafea - acidul vanilmandelic, metanefrinele (se va evita consumul cafelei cu 72 ore inaintea recoltarii). Consumul de alcool - efecte acute (2-4 ore) - scade glicemia si creste acidul uric; efecte cronice Fumatul - efecte acute (1h) - creste nivelul de cortizol. Efecte cronice - creste nr de eritrocite, Hb, Ht, nr de leucocite si neutrofile, colesterolul total si LDL colesterol, Pb, Cd, Cu, CEA si scade nivelul de prolactina si HDL. Efortul fizic - creste CK, AST, ureea, glucoza, albumina, acidul uric, ACTH, cortizolul, hormonul de crestere si scade nivelul de insulina. Stresul emotional - creste nivelul prolactinei, cortizolului, TSH, hormonului de crestere, insulinei, albuminei, fibrinogenului, glucozei si colesterolului.
Interferente medicamentoase Interferentele exercitate de medicamente asupra testelor de laborator trebuie luate in considerare atunci cand se interpreteaza rezultatele.
Variabilele preanalitice legate de modul de recoltare, prelucrare, stocare si transport al probelor Postura La trecerea din clinostatism in ortostatism transvazare a 8% din apa din compartimentul vascular in cel interstitial, intr-un procent de aproximativ crestere de 3-8% a nivelului de proteine serice si a componentelor legate de proteine, daca proba este recoltata imediat dupa un ortostatism prelungit si nu se asteapta cel putin 10 minute de decubit dorsal. Creste concentratia de Hb, nr. de eritrocite, nr.de leucocite, proteine totale, albumina, imunoglobuline, colesterol si calciu. La pacientii cu edeme modificarile sunt si mai pronuntate.
Durata stazei venoase Compresia venoasa exercita aceleasi efecte ca si schimbarile posturale din clino- in ortostatism. Astfel, concentratia proteinelor totale poate sa creasca cu pana la 20% dupa o staza venoasa de 10 minute. Se recomanda ca durata aplicarii garoului sa nu depaseasca 2 minute.
Ultima ingestie de alimente Ingestia de alimente inainte de recoltare determina o crestere a nivelului glucozei, fosforului si bilirubinei, o crestere mai accentuata a potasiului si ALT, precum si o crestere moderata sau usoara a acidului uric, proteinelor totale, calciului si colesterolului. Continutul in grasimi al mesei determina nivelul trigliceridelor.
Proceduri efectuate in scop diagnostic si terapeutic Injectiile intramusculare cu anumite substante (benzodiazepine, clorpromazina, lidocaina, fenobarbital) pot determina cresteri ale CK. Contaminarea probelor de laborator cu solutii perfuzabile reprezinta cel mai frecvent tip de interferenta preanalitica in spital. recoltarea probei de sange nu trebuie sa se faca niciodata proximal de locul perfuziei
se recomanda ca laboratorul sa fie informat despre tipul substantelor administrate si momentul la care s-a efectuat prelevarea probelor.
Recoltarea probelor de pe cateterele intravenoase si intraarteriale: Canula trebuie spalata in prealabil cu ser fiziologic, primii 5 mL de sange trebuie aruncati inainte de recoltarea propriu-zisa a probei de sange. Recoltarea pentru probele de coagulare de pe lateterele contaminate cu heparina este in mod critic influentata, pentru determinarea APTT si a timpului de trombina se recomanda ca o cantitate de sange echivalenta cu dublul volumului cateterului sa fie aruncata inainte de prelevare.
Hemoliza in vitro Cauze - aspirarea puternica a sangelui, in special in cursul punctionarii venelor superficiale si mai ales daca se folosesc ace groase; - obstructia partiala a unui cateter venos sau arterial; ca urmare a acestui fapt aspirarea este
mai intensa daca recoltarea se face cu o seringa; - recoltarea probei cu o seringa si distribuirea sa in mai multe tuburi; - agitarea puternica a tubului; - centrifugarea precoce a probei, inaintea incheierii procesului de coagulare; - centrifugarea probei partial coagulate la pacienti aflati sub tratament cu anticoagulante orale; - presiune pozitiva sau negativa in tuburile de recoltare; - diluarea sangelui cu solutii hipotone; - congelarea-decongelarea sangelui total; - stocarea sau transportul sangelui integral intr-un interval de cateva zile, in conditii ambientale.
Efectele hemolizei pot fi clasificate in functie de mecanismul implicat: - cresterea constituentilor intracelulari in fluidul extracelular; se inregistreaza astfel niveluri ridicate de LDH, potasiu, AST, Fe; - interferenta optica prin culoarea hemoglobinei; gradul interferentei depinde de lungimea de unda la care se face citirea analitului, tipul blank-ului si reactivului; - interferarea constituentilor intracelulari cu reactiile chimice folosite pentru analiza componentelor din ser/plasma: ex.: activitatea peroxidazica a hemoglobinei interfera cu metodele diazo de determinare a bilirubinei si induce
valori fals scazute, iar adenilkinaza eliberata interfera cu determinarea CK.

In laboratoarele Synevo exista urmatoarea procedura de comunicare a rezultatelor la testele de biochimie, in functie de gradul hemolizei: - hemoliza usoara - parametrii afectati sunt CK, K, AST, LDH cu cresterea valorilor acestora. In acest caz nu se va lucra sau nu se va comunica rezultatul pentru LDH; pentru ceilalti parametri se va aplica comentariul - ser usor hemolizat; valorile CK, K si AST ar putea fi influentate. - hemoliza moderata - parametrii afectati sunt K, LDH, AST, CK, Fe - cu cresterea valorilor si cu scaderea valorilor ALP, Bil D. In acest caz nu se va comunica rezultatul acestor parametri. - hemoliza intensa - sunt afectate toate testele biochimice si se recomanda repetarea recoltarii. In cazul testelor de coagulare, probele hemolizate nu vor intra in lucru. Testele de imunochimie sunt evaluate de producator pentru interferentele analitice induse de hemoliza; in prospectele reactivilor este precizat un nivel limita al hemoglobinei serice, care daca este depasit poate induce interferente.
Asistentul medical de laborator Prepara si in anumite cazuri prelucreaza partial probele biologice
Trebuie sa posede cunostinte privind normele de acceptare a probelor, protejarea datelor personale ale pacientului confidentialitate
Protocolul de acceptare a probelor: Primirea probei Verificarea starii probei Verificarea identitatii pacientului Marcarea probei Plasarea probelor si performarea unor procedee preanalitice Transmiterea probelor catre analizare
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni! Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni!
Medicina de laborator nu poate progresa fr informaii permanente. Medicina de laborator a beneficiat de imensul aport adus de varietatea i complexitatea mijloacelor de investigaie. La progresele actuale ale medicinii de laborator a contribuit n mod special bio-medicina
molecular.
Factori predispozanti interni, individuali (varsta, sexul, unele polimorfidme genetice, stress oxidativ, deficiente vitaminice,, inflamatie,, diverse afectiuni endocrine, imunologice, metabolice, tumori, nivel de educatie, etc.) (Factorii genetici)
Susceptibilitate la boala
Factori de mediu (infectii, fumat, noxe, stress etc.)
Alterari subtile, cumulative
Modelul bio-psiho-social
Glosar de termeni Gena

Unitatea ereditatii in organismele vii. Genele poarta instructiuni privind calitatea proteinelor care pot fi exprimate de acestea (proteinele=fenotip) Secventa nucleotidica (structura primara AND codifica informatia genetica, respectiv instructiunile genelor despre calitatea proteinelor (secventa de aminoacizi) Cromatina- materialul genetic eucariot, deosebit de cel procariot; este delimitata de nucleu si este compusa din fibra nucleoproteica AND+ proteine nonhistonice Ereditatea, la eucariote, este definita de doua nivele informationale: nivelul informatiei genetice si
nivelul informatiei epigenetice care determina conformatii ale cromatinei accesibile sau inaccesibile factorilor de transcriere; Expresia genica este functia genei de a transmite informatia genetica (codificata in secventa nucleotidica AND) la o molecula ARNm si ulterior, la o proteina, unde informatia genetica devine secventa de aminoacizi, ce confera o calitate particulara proteinei; expresia genica poate fi activata sau represata in functie de starea transcriptionala a cromatinei. Informatia epigenetica poate modula expresia genica in functie de modificarile biochimice de la nivelul AND si histone.
Materialul genetic
Materialul genetic
Transcriptie - Translatie
Glosar de termeni
Genomica- studiul tuturor genelor unei persoane, a functiei lor de expresie, da si interactia lor cu mediul. Genotipul- informatia genetica interna si transmisibila ereditar
pe care o poarta un individ. Genotipul ramane constant in orice celula a individului, indiferent de tipul de specializare a acesteia.
Glosar de termeni
Nutrigenomica- studioul relatiilor moleculare intre nutritie si expresia genica in anumite celule specializate (tesuturi/organe). Ne ajuta sa intelegem relatiile dintre dieta si stabilitatea genomica (in termenii expresiei corecte a genelor) si patogeneza (expresia inadecvata a genelor). Famacogenomica- studiul raspunsului genomului la un medicament. Genomica ajuta in acest caz prin precizarea polimorfismelor in genele critice, care controleaza relatia cu mediul (nutritia)- deci acre afecteaza procesarea alimentelor purtatoare de compusi activi (precum folatii etc). Inaintea unei prescriptii de medicamente trebuie sa se considere atat profilul polimorfismelor, cat si reactivitatea (rezistenta sau activarea unor gene care conduc la rezistenta) fata de acel medicament. Fenotip- manifestarea fizica, exterioara a unui organism; genotipul este opus- informatia intrinseca, ce codifica fenotipul, calitatea acestyia. La nivel molecula, celula, fenotipul reprezinta proteina, ca expresie a genei.
Glosar de termeni
Proteina- fenotipul, expresia unei gene. Molecula complexa, definita de secventa in amonoacizi, care confera calitatea proteinei (capacitatea sa de a activa ca enzima sau ca molecula structurala, implicata in realizarea fenotipului celular, al specializarii ceulare si deci tisulare/a organelor. Proteomica: studiul, la scala larga, prin metode highthroughput, prin utilizarea de chipuri cu markeri proteici aranjati in stil array, care detecteaza modificari in structura proteinelor, detecteaza proteine noi intr-un material biologic, detecteza functia proteica. Proteomul reprezinta totalitatea proteinelor, corespunzatoare genomului. Totalitatea proteinelor produse de un organism, in toate celulele sale. O boala particulara se poate dezvolta datorita faptului ca anumite proteine nu mai sunt sintetizate, in genotipul individului (celulei) fiind prezenta o mutatie (in secventa AND). Studiile proteomice pot conuce la identificarea de markeri proteomici pentru diagnosticul unei anumite boli Biomarker- substanta, proteina, gena,modificare intr-o gena sau proteina sau metabolism care indica riscul la o anumita boala. Pot fi studiati si utilizati in diagnostic markeri genetici, proteomici, metabolomici etc.
Notiuni de genetica generala

Zigotul contine 23 perechi de cromozomi, fiecare provenind de la cate un
parinte Fiecare gamet care intra in fecundatie contine un genom care reprezinta genotipic un parinte; gametii nu contin perechi de cromozomi (n); fiecare gamet are doar jumatate din genomul celulelor somatice (2n) adica doar 23 cromozomi Ce sunt cromozomii?- particule celulare, vizibile la microscop, ce contin informatia ereditara: genetica si epigenetica (referitoare la calitatea proteinelor care vor defini celulele organelor si referitoare la expresia spatio-temporala a genelor in proteine)
Ce sunt genele
Informatia ereditara este codificata si impachetata in structuri denumite gene. Genele sunt parti ale cromozomilor denumite unitati de transmitere ereditara a caracterelor Genele vor determina controlat producerea de caractere la individul in formare si dezvoltare. In functie de modul de trannsmitere, genele pot fi: dominante (caracterele corespunzatoare vor domina peste caracterele recesive) sau recesive (ex. genele care determina culoarea opchilor: daca tatal are ochi bruneti, iar mama
negri, iar daca gena tatalui este dominanta, atunci copilul va exprima gena tatalui si va avea ochii bruneti.
Gena
Relatia genotip- epigenotip fenotip Definirea specializarii celulare in termeni moleculari epigenetici
Genotip totalitatea genelor, aranjate intr-o secventa unica, specifica individului Fenotip totalitatea proteinelor exprimate de catre gene celule cu specializari diferite vor fi definite de fenotipuri diferite, chiar daca genotipul celular este identic Epigenotipul totalitatea modificarilor biochimice la nivelul AND + proteine histonice si non-histonice modificari de exprimare a genei: Intr-o celula specializata doar anumite gene din cadrul genotipului sunt active, restul sunt silentiate Expresia genica si seturile de gene active/inactive din cadrul genotipului definesc, prin intermediul epigenotipului, fenotipul celular
Relatia genotip-fenotip:
organele diferite ale unui individ sunt formate din tesuturi in cadrul carora celulele prezinta un genotip comun, dar un epigenotip / fenotip caracteristic tesutului specializat Fenotip celular -Tesuturi nervoase specializate Fenotip celular renal Fenotip celular miocardic Fenotip celular pulmonar
Specializarea tesuturilor / organelor se formeaza in decursul proceselor de embriogeneza si citodiferentiere Odata finalizat, paternul de diferentiere se transmite pentru fiecare tesut de organ in parte Alterarea patern-ul de diferentiere patologie
Informatia genetica ramane constanta in decursul vietii si rareori va acumula mutatii, In schimb informatia epigenetica se modifica mereu in decursul proceselor de adaptare la dinamica conditiilor ambientale:
Fenotipul se ajusteaza permanent prin interactiunea cu mediul si induce procese de reparare si regenerare ori de cate ori apar leziuni datorate acestor interactii
Factori predispozanti interni, individuali (Factorii genetici) Susceptibilitate la boala Factori de mediu (infectii, fumat, noxe, stress etc.) Alterari subtile, cumulative
Genotipul celular ramane in general constant in decursul etapelor de dezvoltare; Totusi, se acumuleaza mutatii punctiforme care in mod normal nu perturba dramatic functia celulara/organelor Epigenotipul celulelor, specific tesuturilor specializate din diferite organe se modifica insa substantial in decursul adaptarilor in perioada de imbatranire aproape complet schimbat;
Cum se modifica fenotipul celular in imbatranire?
fenotipul caracteristic celular este modificat prin noile instructiuni de expresie a genelor dobandite in interactiunea genom mediu pot aparea noi seturi de gene activate / inactivate in general sunt afectate urmatoarele gene: genele vitale (housekeeping, ex. genele care controleaza ciclul celular (limiteaza replicarea), genele care controleaza repararea leziunilor AND genele care controleaza adeziunea celulara. In procesul imbatranirii, la nivelul fiecarui tesut specializat apar modificari ale epigenotipului celular in sensul vulnerabilizarii tesutului ( scaderea capacitatii de regenerare si de reparare).
Modificarea epigenotipurilor celulare specifice de tesut are loc treptat, in decursul vietii unui individ, prin interactia permanenta intre genom si mediu Gradul de modificare epigenetica si eficienta sa in stabilizarea genomica depinde de impactul pe care il are genomul cu mediul si de capacitatea genelor vitale de reparare a leziunilor genomice survenite in decursul proceselor de adaptare Epigenomul este interfata dintre genom (gene) si mediu. Alegerea conditiilor ambientale pentru a mentine in buna functionare genele prin intermediul epigenomului sunt deci esentiale.
Creerul se dezvolta intr-un ritm propriu, fiecare etapa fiind definita de un program specific:
1.dezvoltarea din perioada fetala 2.dezvoltarea in perioadele diferite ale vietii (copilarie, adolescenta, perioada adulta si imbatranirea) Dupa nastere, celulele nervoase prezinta un pattern propriu, dinamic,de dezvoltare, pe masura exercitarii functiilor cognitive:
In procesul normal de imbatranire a creerului au loc multiple modificari la nivelul functional, structural, celular si molecular. Celulele nervoase, neuronale, pot sa raspunda la aceste modificari specifice imbatranirii fie in mod adaptativ, rezistand si supravietuind in mod sanatos la noul mediu, modificat, fie pot sa sucombe, alegand calea cascadelor neurodegenerative care conduc la boli precum Alzheimer si Parkinson. Dezvoltarea creierului in decursul vietii s-a realizat printro activitate sustinuta a metabolismului specific acestui organ in sensul realizarii a doua deziderate esentiale : neuroprotectia neuroregenerarea.
Imbatranirea creerului
Mecanismul molecular al acestor procese normale are la baza producerea de factori neuroprotectori si neuroregenerativi, reprezentati prin: -factori neurotrofici -cytokine -expresia proteinelor care promoveaza supravietuirea celulara (precum moleculele-chaperoni, enzimele cu activitate antioxidanta, proteina Bcl-2 si proteinele inhibitoare a procesului apoptotic) -factori cu rol de mentinere a integritatii (stabilitatii) genomice prin diverse mecanisme (precum activitatea telomerazei, a proteinele cu rol reparator ADN, metilarea cromatinei(ADN/histone) si -factori care au capacitatea de a activa calea regenerativa prin care se mobilizeaza celulele stem neuronale sa inlocuiasca neuronii lezati si glia.
Ce determina schimbarea cursului normal al activitatii acestor molecule, in cadrul proceselor neuroprotective si neuroregenerative ? Etapa de dezvoltare care coincide cu imbatranirea este influentata de factorii genetici si epigenetici, care-la randul lor, aduc in context si factorii ambientali.
Astfel : procesul neuroprotectiv endogen este prevalat de anumite mutatii in gene critice, care determina formele familiale, mostenite, de boli neurodegenerative asociate imbatranirii (AD, PD etc.) : APP (proteina precursoare a amiloidului), care cauzeaza AD Synucleina si Parkina, care cauzeaza boala Parkinson (PD) Huntingtina, receptorul de androgen, ataxina,s.a., care determina boli asociate cu repetitiile trinucleotidice (boala Huntington etc)
Procesul neuroprotectiv poate fi influentat de factorii de mediu (asociati cu nutritia- restrictia calorica si suplimentarea cu folati//colina si substante antioxidante) si de modificarea factorilor comportamentali (asociati cu activitatea intelectuala si fizica).
Cai de imbatranire sanatoasa a creerului

Imbatranirea sanatoasa a creierului se poate realiza la nivel molecular prin activarea unui raspuns echilibrat (hormesis ???), in care neuronii suprasolicita calea neuroprotectoare prin cresterea productiei de factori neurotrofici (TFN) si de proteine de stress. Procesul neuroregenerativ, pe de alta parte, este si el activat intensiv : celulele stem neuronale care rezida in creierul adult sunt de asemenea reactive fata de cerintele impuse de modificarile conditiilor ambientale si devin capabile sa inlocuiasca rapid celulele neuronale si gliale pierdute sau disfunctionale, chiar in creierul aflat in procesul imbatranirii. Cercetarile recente, bazate pe abordarea metodelor specifice biologiei moleculare si celulare moderne, au revelat capacitatea remarcabila a celulelor creerului de a fi rezistente la imbolnavire prin adaptarea la conditiile ambientale modificate din timpul procesului imbatranirii.
Cai de imbatranire sanatoasa a creierului

Aceste procese care definesc imbatranirea sanatoasa au fost descrise la persoanele
foarte longevive, care traiesc peste 90 de ani. Creierul acestora a functionat in parametri fiziologici sanatosi pana la adanci batraneti, fara sa se imbolnaveasca. Caile moleculare prin care creierul acestor indivizi reuseste sa se adapteze procesului imbatranirii sunt investigate de specialistii in imbatranirea cerebrala. Ei urmaresc factorii care contribuie la stabilitatea, dar concomitent, si plasticitatea celulelor neuronale, in cursul imbatranirii.
Caile de adaptare a celulelor neuronale la conditiile specifice perioadei de imbatranire

In celulele creierului, ca si in alte organe ale corpului uman, are loc o acumulare progresiva de molecule lezate si o instalare a unui metabolism energetic dezechilibrat. Celulele neuronale si gliale se pot adapta la conditiile adverse din perioada imbatranirii prin : cresterea capacitatii lor de a coopera cu stress-ul, cresterea capacitatii lor de a compensa pierderea sau lezarea celulelor prin producerea de noi celule neuronale si gliale, remodelarea circuitelor neuronale.
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013-
,,Investete n oameni!
Ce cale alternativa exista in cazul in care calea adaptativa nu are succes?

In cazul in care adaptarea nu se realizeaza cu succes, are loc : lezarea celulelor neuronale la nivel molecular si activarea proceselor inflamatoare, care conduc la disfunctia in activitatea esentiala a neuronilorasigurarea activitatii Sinapselor degenerarea neuronala si moartea celulara.
In creierul sanatos exista regiuni diferite sub aspectul pierderii de neuroni: regiuni in care are loc o descrestere foarte slaba sau chiar nu are loc scaderea numarului de neuroni regiuni cu pierderi neuronale evidente, dar care pot fi compensate prin expansiunile arborelui dendritic si prin cresterea sinaptogenezei in neuronii ramasi Ca urmare, numerosi neuroni pot ramane in unele regiuni ale creierului pentru
intreaga viata, pe cand in alte regiuni, precum bulbul olfactiv si girusului dentat al hippocampului, pot cunoaste inlocuirea permanenta a neuronilor dintr-un pachet de cellule progenitoare (stem). Aceasta capacitate regenerative au nor regiuni ale creierului poate persista intreaga viata.
Tintele moleculare in procesul de modificare a fiziologiei neuronale in creerul aflat in procesul de imbatranire In procesul imbatranirii normale pot fi amenintate urmatoarele procese importante in fiziologia neuronilor si in formarea sinapselor caile neuroprotectoare -fosforilarea proteinelor (datorita alterarilor in activitatea kinazelor si fosfatazelor) - cai de intretinere a homeostaziei calciului -cai de intretinere a expresiei genice corecte -caile de control al impachetarii structurilor proteice (proteinelor chaperon) si -caile de control al degradarii proteinelor (prin sistemele proteasom si lizozomale)
sisteme de neurotransmitatori :
Timingul instalarii modificarilor fiziologiei si structurilor neuronale in decursul procesului de imbatranire

In procesul de imbatranire modificarile fiziologice neuronale au loc prin intermediul modificarii urmatoarelor cai metabolice normale: de semnalizare moleculara, de protectie si regenerare neuronala Momentul in care apar modificarile in fiziologia neuronale este situat pe scala de evolutie a procesului neurodegenerativ mai devreme sau mai tarziu, in decursul procesului imbatranirii, cu initierea procesuui neurodegenerativ, in functie de urmatorii factori majori: predispozitia particulara genetica si conditiile ambientale, care afecteaza expresia genica si stabilitatea genomica prin intermediul epigenomului.
La nivel celular au loc modificari ale cailor metabolice celulare specifice functiei neuronale
Modificarile celulare si moleculare care au loc in celula neuronala in decursul imbatranirii promoveaza disfunctia a numeroase cai metabolice si a unor cai de semnalizare : -stress oxidativ marit (producerea de radiucali) -acumularea moleculelor alterate oxidativ (proteine, acizi nucleici si lipide) -deficit de energie ca rezultat al alterarilor in vasculatura cerebrala si in functia mitocondriala - celulele creerului acumuleaza un stress oxidativ si metabolic, trasaturi universale, pentru orice organ, in procesul imbatranirii.
La randul lor, celulele neuronale sufera modificari ale retelei moleculare

In procesul normal de imbatranire sunt afectate urmatoarele molecule: proteine acizilor nucleici lipide In cazul in care se pierde echilibrul fiziologic care garanteaza imbatranirea normala, se instaleaza bolile neurodegenerative asociate imbatranirii: Alzheimer, Parkinson. In decursul evolutiei acestor boli, sunt exacerbate: Modificari in structura si functia proteinelor
Modificari in structura acizilor nucleici: Modificarea oxidativa a bazelor in cadrul ADN/ARN (modificari in informatia genetica sau MUTATII) modificari biochimice la nivelul cromatinei (fibra nucleoproteica ADN/histone) independente de informatia genetica- modificari EPIGENETICE Modificarea lipidelor
Cum regleaza epigenotipul expresia genelor?

Prin intermediul modificarii biochimice a conformatiei cromatinei (ADN+ histone) O conformatie a relaxata a cromatinei face posibila accesarea seturilor de gene de catre factorii de transcriere (TF) activare genica FT semnalizeaza ARN polimeraza pentru initierea procesului de transcriptie Se pot forma astfel conformatii accesibile, cu activarea genica sinteza proteinelor, sau se pot forma conformatii inaccesibile, represive, care determina silentierea genelor si disparitia fenotipului (proteinei).
Important: modificarile biochimice (NU DE STRUCTURA) la nivelul ADN nu sunt mutatii! Ele pot insa sa devina extrem de usor mutatii (in functie de conditiile de reactie catalizata de ADN
metiltransferaza in prezenta SAM) Aceste modificarile biochimice, nestructurale, epigenetice, care au loc la nivelul ADN si histone nu sunt realizate de agenti externi, precum mutagenii cunoscuti: Metilarea ADN, Metilarea histonelor, Acetilarea histonelor, Deacetilarea histonelor etc. Modificarile ewpigenetice sunt realizate prin procese fiziologice, proprii organismului, fiind catalizate de enzime endogene, in reactii catalitice ce se desfasoara in conditii normale, fiziologice (ADN metiltransferaza, histon metilaza, histon acetilaza/deacetilaza etc).
Important:
Ambele informatii genetica si epigenetica - sunt ereditare (se transmit prin diviziunile celulare-mitotice si meiotice) Informatia genetica nu se modifica decat prinmutatii (modificarea secventei nucleotidice); acestea nu se repara si se fixeaza in structura primara a AND, transmitandu-se la generatiile urmatoare; Informatia epigenetica este reversibila si transmisibila; Modificarile epigenetice se pot controla si influenta prin dieta, stil de viata, medicamente etc. Astfel, prin diverse activitati interventionale, epigenomul celular poate fi reprogramat La fel, se poate controla reprogramarea epigenomului in decursul Imbatranirii (se poate
incetinii reprogramarea epigenomului si vulnerabilizarea fata de conditiile ambientale prin dieta (stil de viata, nutritie) si tratamente
Trecerea de la o etapa la alta implica reprogramarea epigenomica (la nivel organismic) sau epigenotipica (la nivel celular) In cadrul fiecarei etape de dezvoltare pot avea loc reprogramari epigenomice datorate interactiei cu mediul (proces permanent de adaptare) Alegerea noastra in ceea ce priveste dieta si tratamentele eventuale trebuie sa tina cont de efectele conditiilor ambientale asupra epigenomului Modificarile epigenomului pot fi transmise la generatiile urmatoare sau se pot reseta in generatia genitorilor pentru a nu fi transmise descendentilor; acest lucru se poate realiza prin abordarea unui stilul de viata (dieta, poluare, organizarea vietii etc) adecvat
Parcurgerea etapelor de dezvoltare este definita de programe epigenomice

Este alegerea noastra in ceea ce priveste o dieta adecvata atat pentru sanatoatea noastra si mai ales pentru sanatatea descendentilor
Informatia epigenetica este ereditara- ea se transmite ca si informatia genetica, in diviziunea celulara, la celulele nou formate.
Modificarile epigenetice se pot transmite atat in mitoza (in decursul citodiferentierii si formarii organelor sau in decursul proceselor de reparare si regenerare), cat si inmeioza (formarea gametilor). Formarea gametilor la viitorii genitori este extrem de importanta. Procesul meiozei, in perioada fetala (specializarea celulelor gametice primordiale-PCG), cu continuare in perioada adolescentei, este influentat dramatic de mediu/stil de viata, dieta, poluare.
In fecundatia gametilor astfel formati in perioada perinatala are loc recombinarea celor doua genomuri (provenite de la genitori), venite cu un anumit grad de stabilitate genomica (mutatii). Se formeaza astfel un nou genotip al descendentului (fatului). De asemenea, are loc o reprogramare intensiva a epigenomului (au loc demetilari/remetilari ADN succesive care pregatesc despecializarea gametilor si formarea celulei ou (zigotului) totipotent. Formarea blastocistului marcheaza finalul acestor ajustari ale epigenotipurilor genitorilor; se initiaza prima specializare celulara in embrionul in formare.
Urmeaza stabilirea pattern-urilor de diferentiere specifica de tesut si etapele de transmitere clonala a acestoar in formarea primelor organe. .
Genomul indivizilor descendenti depinde de reprogramarea epigenetica a gametilor genitorilor in perioada perinatala si de reprogramarea epigenetica din perioada fetala Procesele amintite sunt extrem de importante. Reprogramarea trebuie sa aibe loc precis, controlat, cu tintirea corecta a genelor implicate. O data format pattern-ul de specializare pentru viitoarele tesuturi ale fatului, pattern-urile de expresie a seturilor de gene definitorii pentru fenotipurile celulare vor fi transmise clonal in fiecare celula a tesuturilor/organelor in formare. Fiziologia organelor in decursul veitii unui individ este dependenta de aceste pattern-uri stabilite in perioada fetala, dar si de modificarile epigenomice cu caracter adaptativ, acumulate in confruntarea cu mediul.
In evaluarea conditiei de sanatate a unui individ, indiferent de etapa de dezvoltare, trebuie sa tina cont de mostenirea genetica/epigenetica transmisa de la parinti si deopotriva de modul sau de viata Fragilizarea epigenomica este o componenta majora a bolilor neurodegenerative
Influentele conditiilor ambientale prenatale Nutritia si starea emotionala a mamei Starea de sanatate a mamei Utilizarea de catre mama a drogurilor. Conditiile ambientale in care s-au dezvoltat ambii parinti au determinat o specilizare corecta a gametilor(in perioadele de pubertate la barbati si in plus, in periada fetala a mamei s-a stabilit un imprinting primar, care va influenta procesele de imprinting la descendent-copil)
Mecanisme de reglare genica (activitatii expresiei genice si stabilitatii genomice) prin intermediul metilarii ADN
Modificarea histonelor postranslationala - un alt nivel informational epigenetic

Pattern-uri epigenetice continand modificari histonice
cu rol de represie (a- rosu) si activare (b-verde) genica

Comportamentul, dezvoltarea psihica si chiar bolile neurodegenerative precum depresia, dementa, schizoifrenia- sunt legate de dezvoltarea perinatala a genitorilor si de dezvoltarea fetala
Genetica si epigenetica imbatranirii

Genetica imbatranirii
Imbatranirea proces de dezvoltare normala, o etapa a dezvoltarii organismului, care este controlata de cai metabolice particulare, definite de secvente moleculare de semnalizare si de factori de transcriere
particulari (corespunzatori expresiei unor seturi de gene specifice). Teoria acumularii de erori. Numeroase astfel de cai metabolice specifice procesului imbatranirii au fost descoperite, studiate in organisme model (drojdii, Drosophila, Caernorhabditis elegans) si extrapolate la sistemul mamalian, uman. Numeroase studii au fost realizate direct in sistemul uman.
Procesul imbatranirii este controlat genetic/epigenetic si influentat de conditiile ambientale. Primele abordari ale procesului imbatranirii au fost corelate cu longevitaea si genele care ne-ar putea asigura extinderea cursului vietii, dar intr-un mod sanatos. Descoperirea mutatiilor in genele care influenteaza longevitatea a fost extrem de informativa cu privire la caile metabolice, biochimice si mecanismele moleculare implicate, cu un impact major aspura longevitatii.
Modelele umane in acest context au fost grupurile de centenari. Centenarii, comparativ cu grupurile de tineri, sunt modele utile pentru ca ei nu sunt purtatori de gene legate de bolile asociate cu bolile letale si cu mortalitatea prematura. Studiile tip pedigree au demonstrat o componenta familiala semnificativa, legata de abilitatea de a supravietui pana la varste foarte inaintate.
Studiile recente au indicat astfel un locus critic de pe cromozomul 4 ca fiind asociat cu longevitatea, ceea ce indica existenta a cel putin unei gene care permite extinderea vietii la om. Numeroase laboratoare din lume realizeaza programe complexe de cercetare pe diverse organisme model, pentru a descifra mecanismele genetice, epigenetice, metabolice care stau la baza longevitatii. Prin aceste detalii se pot intelege mecanismele de imbatranire, de instabilizare a genomului, de modificare a expresiei genice si a fenotipurilor celulare particulare in imbatranire.
Cercetarile din domeniul imbatranirii tintesc catre descoperirea medicamentelor, strategiilor de interventie nutritionala, de dieta si stil de viata, capabile sa incetineasca procesul de vulnerabilizare degradarea proceselor vitale, de reparare si regenerare, din timpul periadei de imbatranire. Ele vizeaza astfel caile de evitare a bolilor asociate imbatranirii
Caile metabolice care controleaza procesul imbatranirii

Mutatiile care determina extinderea duratei vietii afecteaza genele care au rol in controlul raspunsului la stress sau controlul sensorilor pentru nutrienti. Astfel, cand hrana este din abundenta si nivelul de stress este scazut, aceste gene determina cresterea si reproducerea. in conditii grele de viata, dimpotriva, activitatea acestor gene se schimba - unele seturi de gene se activeaza aberant, iar altele se silentiaza. Jocul activare/dezactivare genica este orientat in general catre o schimbare globala
fiziologica care sa asigure protectia celulara si intretinerea stabilitatii acesteia. Aceasta modificare fiziologica protejeaza organismul mamalian de stress-ul ambiental si, in acelasi timp, extinde durata vietii.
Genele cheie descoperite pana in prezent si caile metabolice corespunzatoare activitatii acestora codifica proteine cu rol in mecanismele de intretinere si reparare care pot minimiza acumularea de leziuni genetice permanente asociata imbatranirii, precum mutatiile. In general, datele de literatura indica faptul ca pe masura cresterii complexitatii genomice, imactul genelor candidat asupra prelungirii duratei de viata devine mai mic.
In prezent este clar ca nu doar cateva gene influenteaza procesul imbatranirii, ci o retea complexa de gene, care sunt activate sau represate in functie de conditiile ambientale si de mostenirea transmisa de parinti si bunici.
Mai mult, este clara interventia unui nivel ereditar aditional, cel epigenetic, pentru a explica: legatura dintre genom si mediu, si, totodata, posibilitatile de resetare a programelor de expresie genica prin interventii nutritionale sau farmacogenomice.
Daca initial, abordarea unui numar mic de gene a fost insuficienta pentru a releva diversitatea populationala, pe masura descoperirii complexitatii determinismului genetic a evoluat si abordarea actuala, tehnologica; Aceasta s-a ridicat la nivelul high-throughput, in sisteme de aranjamente de tip array, pe chipuri, care necesita o interpretare statistica particulara, de tip genome-wide.
Longevitatea si rezistenta la insulina.

Implicarea proceselor care au ca gena centrala gena care codifica IGF1 (insulin growth like factor 1). Aceasta constatare explica asocierea imbatranirii cu pierderea heomeostazei glucozei (diabetul de tip 2), cu bolile cardio si cerebrovasculare
implicarea unor gene a caror polimorfism este in prezent abordat prin sistemul de interpretare matematica GWAS. In general, familiile care au prezentat o toleranta la glucoza au prezentat si predispozitie pentru longevitate.
Longevitaea si dieta- metabolismul trigliceridelor

Prima gena asociata cu metabolismul trigliceridelor este ApoE (apolipoproteina E). Izoformele ApoE (2,3 si 4) au fost asociate concluziv cu momentul instalarii dementei si bolii Azheimer. (discutia in detaliu, la capitolul gene de susceptibilitate). ApoE2 este asociata cu cresterea duratei vietii si scaderea riscului imbolnavirii de dementa si AD, spre deosebire de forma ApoE 4.
O alta gena a carei izoforma a fost asociata cu longevitatea si riscul scazut al imbolnavirii AD, infarct miocardic, este gena
care codifica proteina transportoare a colesterilesterului (CETP). Ca si ApoE, aceasta are rol important mentinerea homeostazei colesterolului in sistemul nervos central. Plasma sangelui uman contine LDL si HDL. CETP din plasma are rolul de transportor al colesterilesterilor de la HDL, la lipoproteinele bogate in trigliceride, contribuind astfel la scaderea nivelului HDL.
Nivelurile scazute in CTP in plasma au fost corelate cu risc crescut in bolile cardiovasculare. Asocierea ei insa cu boala AD si cu tipurile de MCI nu este insa foarte clara in prezent, desi unele studii au relevat asocierea SNP rs 5882 (Izoleucina-valina in codonul 405) cu o rata scazuta a declinului memoriei si cu un risc scazut de instalare a dementei, inclusiv a AD.
Longevitatea si mediul
Asocierea longevitatii cu semnalele ambientale
Senzorii biologici pentru nutrienti si cei care mediaza reactia la stress sunt implicati in procesul imbatranirii; Ei mediaza extinderea duratei vietii in anumite conditii ambientale si in interactie cu anumite semnale fiziologice IGF1/Insulin pathway Akt (proteinkinaza). Cel mai cunoscut dintre aceste semnale se refera la restrictia dietara, care determina extinderea duratei vietii la numeroase specii, de la drojdii, la primate. Mecanismul implicat a fost corelat cu reducererea ratei de acumulare a leziunilor celulare care are loc in urma metabolismului nutrientilor (radicali liberi). CRAN !
Experimente pe organismul model Drosophila au demosntrat ca restrictia calorica (RC) produce rapid o descrestere a ratei mortalitatii RC contracareaza procesele care duc la imbatranire. Ipoteza actuala se refera la faptul ca raspunsul prin longevitate la RC este controlat de caile metabolice care sesizeaza nivelul de nutrienti; Aceste cai implica enzimele: kinase target of rapamycin (TOR) AMP kinase
sirtuine si caile de semnalizare insulina/insulin-like growth factor (IGF-1)

Alte semnale ambientale care interactioneaza cu genele, deci proteinele care controleaza longevitaea Caldura excesiva Stress-ul oxidativ Temperatura ambientala scazuta Semnalele chemosenzoriale Semnalele termosenzoriale Semnalele sistemului reproductiv Reducerea ratei respiratiei.
Telomerele
Telomerele (secventele AND care constituie capetele cromozomale) se scurteaza cu varsta, pe masura ce sunt activate in procesele de diviziune repetata au fost considerate factori candidat, determinanti ai imbatranirii.
Soarecii transgenici care prezentau telomere mai lungi au trait mai mult timp. Implicarea telormerelor a fost asociata cu susceptibilitatea la tumorigeneza. Restrictia calorica si respiratia redusa au capacitatea de inhibare a tumorigenezei. Acest fapt ar sugera ca alungirea telomerelor nu conduce la marirea duratei vietii prin inducerea unei conditii fiziologice protective, ci prin prevenirea pierderii celulelor stem si a capacitatii lor regenerative.
Cauzele moleculare ale imbatranirii

O data cu imbatranirea are loc declinul heomeostazic si acumularea de leziuni nereparate (scaderea capacitatii de reparare). Leziunile sunt in prezent studiate la nivel macromolecular. Care este cauza initierii formarii leziunilor Un prim candidat leziunile provocate de speciile reactive de oxigen (stress-ul oxidativ) (ROS), generate in procesele oxidative. Deci mutantele cu viata lunga sunt rezistente la stressul oxidativ. Alt candidat declinul stabilitatii genomice modificarea expresiei genice anumite gene critice sunt silentiate sau au activitate redusa: Modelul C elegans - o data cu varsta se inactiveaza numeroase gene. \s-a identificat la toate aceste gene un site comun GATA de legare, care leaga de
asemenea gena critica DAF-16/FOXO., care la randul sau este controlat de un microRNA, cu rol in controlul timingului de dezvoltare
Modelul drojdiilor include sirtuinele care controleaza declinul stabilitatii genomice in imbatranire Modelul mamalian cu varsta, creste nivelul proteinelor semnalizatoare circulanteWnt care ar semnaliza imbatranirea celulelor musculare stem. Care este factorul de control al acestor gene candidat? O explicatie a slabirii controlului este simplu legata de scaderea homeostazei proteinelor, datorita modificarii pattern-ului de expresie genica. Factorii epigenetici ar juca un rol definitoriu in acest tablou
Cai de extindere duratei sanatoase a vietii ?

Inhibarea respiratiei Activarea cailor de reproducere Represia genei care codifica pentru IGF1 Restrictia calorica
Ar putea fi extinsa durata vietii prin modularea activitatii genelor reglatoare ale diferitelor cai amintite?
Ex: mutatia in gena IGF1 produce longevitate la cainii de talie mica, iar mutatiile in genele care controleaza respiratia produce longevitate la animalele de talie mare Evolutia organismelor eucariote a demonstrat faptul ca natura a selectionat pentru fiecare specie in parte o anumita durata de viata, variabila la specii diferite. Inca nu se cunosc caile de selectie naturala in acest sens si nici genele implicate
Perspective de interventie pentru viata umana ?

Pe baza studiilor intreprinse pe modele animale s-a ajuns la diferite solutii precum: Variante cu longevitate evidenta care prezinta mutatii FOXO la oameni Tratamentul cu rapamicina (inhibitor al TOR) poate extinde durata vietii la soareci
Asigurarea
stabilitatii genomice/m etilomului in functie de aportul nutritional si stil de viata

FDA nu recunoaste imbatranirea drept o indicatie (sau o conditrie care trebuie tratata) medicamentele sunt aprobate doar daca ele influenteaza procesul de imbolnavire asociat cu imbatranirea (precum rapamicina) Medicamente care afecteaza nivelul lamininei Medicamente care ataca proteina transportoare de colesterilester Medicamente care interfera cu caile metabolice in care se implica IGF-1
Agenti de activare a unor gene precum apolipoproteina AI si de crestere a nivelului HDL concomitent cu reducereanivelului LDL Activarea enzimelor P450, cu rol de mentinere a
homeostazei colesterolului- care influenteaza negativ progresia bolii aterosclorotice O problema legata de utilizarea medicamentelor este efectul posibil negativ al acestora (longevitatea este corelata si cu sensorii de stress si de nutrienti)
Tratamente care tintesc receptozomul

Receptorul 5-HT4 (5-HT4 R) se exprima atat in tesuturile periferice, cat si in sistemul nervos central; Este implicat in functiile cognitive, in neuroprotectie si in nutritia neuronala. Poate initia mecanismul de semnalizare in cadrul unui complex denumit receptosom. Actualmente tinta in cercetarea pentru noi tratamente ale deficitului cognitiv in AD. Receptosomul moduleaza procesarea APP promovand eliberarea de fragmente peptidice solubile, nereactive, incapabile sa agrege in placi amioide efect neuroprotector. Studiile se realizeaza prin abordarea soarecilor transgenici deficienti in 5-HT4R sau APP
Boala Alzheimer boala neurodegenerativa progresiva Afecteaza15% din persoanele de 65+ ani si 50% din cele peste 85 ani. Criza Alzheimer! Are etiologie multifactoriala: Mutatii genetice Variatii genetice si epigenetice Influenta factorilor ambientali susceptibilitate
Genetica si epigenetica bolii Alzheimer

Caracteristici ale bolii AD: afectarea functiei neuronale prin formarea placilor amiloide (extracelulare) si a panglicilor neurofibrilare (intracelulare)
Neuron Manunchiuri neurofibrilare Placa amiloida
Normal Alzheimer
Genetica bolii AD
Au fost testate peste 40 de gene candidat pentru boala AD si nici una dintre acestea nu a fost in
mod clar stabilita ca factor primar de risc pentru majoritatea cazurilor AD. Acest fapt indica in mod clar natura complexa/poligenica/multifactoriala a acestei boli. Caracterizarea si clasificarea bolilor complexe necesita urmatorii pasi de cercetare: 1. identificarea factorilor genetici etiologici 2. identificarea polimorfismelor care reflecta variatiile normale in populatii de indivizi si/sau polimorfismele de tip SNP (single nucleotide polymorphism) de susceptibilitate 3. caracterizarea factorilor ambientali care interactioneaza cu factorii genetici si epigenetici 4. caracterizarea fenomenelor epigenetice asociate cu heterogenitatea dementei si patogeneza 5. identificarea fenocopiilor si a conditiilor medicale care influenteaza, agraveaza sau accelereaza expresia fenotipica a dementei.
Tipuri de transmitere ereditara autozomala dominanta (AD) si recesiva autozomala

Genetica si epigenetica bolii Alzheimer

Studii epigedemiologice si moleculare Alzheimer are boala
etiologie multipla (mutatii genetice si variatii genetice care induc susceptibilitatea). Diagnosticul clinic reclama : Baterii de teste clinice si psihometrice adecvate, inalt senzitive (NINCDS/ADRDA and DSMIV) Markeri biochimici si moleculari de mare rezolutie Criterii imagistice ultraperformante
Genele care codifica proteinele defecte implicate in formarea placilor betaamiloidice si a neurofibrilelor
APP, TAU, PSEN 1 si 2, BACE- beta-site amyloid beta-A4 precursor protein- cleaving enzyme (11q23.3)- BACE 1, BACE2, betasecretaza, memapsina-2
se numesc gene de risc

Genele critice si repartitia lor
cromozomala
Cromozomii purtatori ai genelor critice in AD

Biomarkeri
Exista o serie de astfel de markeri propusi si altii in studiu O serie de parametri legati de: Mecanisme reglate de controlul ciclului de diviziune celulara stimulatori sau inhibitoare Producerea de radicalii liberi, Orice potential biomarker trebuie sa aiba o serie de trasaturi capabile sa raspunda espectatiei clinice Sa poata identifica boala in stadiile cat mai incipiente
Markerii unei boli pot fi identificati in masura in care sunt cunoscute mecanismele patologice ale bolii
Boala Alzheimer este caracterizata prin pierderea selectiva
de neuroni in hipocamp, lobii temporal si frontal Placile senile si manunchiurile de neurofibrile (NFT), sunt markeri recunoscuti, dar insuficienti
Biomarkeri legati de cauza centrala a AD

Amiloidoza cerebrala A (142 & shorter peptides) cauza centrala a proceselor neurodegenerative in AD A se depoziteaza in SNC trasatura esentiala a bolii indicator patologic = biomarker Nivelele serice de Abeta Autoanticorpi anti-Abeta Biomarker Candidadti pentru noi medicamente
O alta trasatura esentiala a unui biomarker sensibilitatea la modificari in evolutia bolii (progresia MCI-AD) = biomarkeri predictivi Protocoale neuroimagistice (biomarkeri imagistici) in curs de elaborare:
the Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) Sunt scumpi si de utilitate restransa, cercetare) Interesul cade pe biomarkeri biochimici si moleculari: analiza unor gene proteine in sange, saliva, LCR diagnostic precoce. Ray si colab. Au propus 18 proteine plasmatice cu putere de diagnostic precoce si predictiv pentru AD.
Biomarkeri proteomici
Ipoteza amiloidozei cerebrale depozitele de amyloid- (A) in particular oligomeri A ( A42 and cu lant chiar mai scurt) biomarker important pentru neurodegenerescenta [13]. Nu doar A, ci totalitatea elementelor genetice si proteinice dereglate biomarkeri candidat: amyloid precursor protein (APP), tau, presenilin 1/2 and ApoE [1416]. Profiling-ul transcriptional al genelor implicate in sinteza
acestor proteine
biomarkeri candidat.
Proteinele implicate in AD
Biomarkeri proteomici
A: proteina considerata patologica si marker pentru boala Alzheimer (AD)?
Formarea si depozitarea de amiloid caracterizeaza si alte patologii neurodegenerative: Down's syndrome, angiopatia cerebrala amiloida, boala CreutzfeldJacob, polineuropatiile amiloide familiale etc. Studiul particularitatilor depozitelor amiloidice poate conduce la noi biomarkeri cu mare putere de detectie (diagnostic diferential).
Metabolismul app este de fapt evenimentul central al patogenezei AD si implica activitatea mai multor proteine
Amyloid- deriva din APP codificata pe chromozomul 21 [26]. Interesant, APP are capacitatea de a creste supravietuirea celulei si de a
preveni acumularea intracelulara de calciu moartea euronilor [27,28]. Dar rezultatul final al clivajului APP sunt cateva variante de A, care au particularitatea de a agrega efecte toxice pentru celula [29]. A poate de asemenea activa apoptoza, sau colapsul microtubulilor neuronali care duce la fosforilarea Tau Intrebare: Ce determina acumularea si agregarea A?
Rezultatele screening-ului nivelului Abeta la pacientii AD; poate fi considarat acest marker ca fiind adecvat AD Raportari stiintifice pacientii cu AD au nivele serice de anticorpi anti-A [30,31]. Alte studii However, nivelul anticorpilor anti-A poate fi semnificativ crescut in AD [32]. Masurarea imunochimica a plasmatic poate fi influentata de cateva variabile, ca de pilda: legarea de alte proteine [33,34] Tendinta inalta de agregarea a A42 [35 Prezentaq anticorpilor anti-A [36].
Atentia s-a indreptat spre masurarea autoanticorpilor anti-A plasmatici si din LCR , atat ca potential treatment cat si ca biomarker pentru AD.
Corelarea biomarkerului Abeta cu aspecte imunologice

Chiar daca titrul de anticorpi secretati impotriva unui antigen este semnificativ crescut, detectia cu metoda ELISA este doar partiala (doar o anumita fractiune din totalul de anticorpi poate fi detectata) Noua metodologie procedeaza la detectia dupa disocierea de antigen. [40,41]. Studiile de ultima ora demonstreaza ca gratie acestei metode este posibila detectia (precoce) a proceselor neurodegenerative incipiente. [42]
Interpretarea rezultatelor analizelor Abeta si a factorilor imunologici asociati

In cursul fazei presimptomatice a AD, corespunzatoare acumularii formei sale solubile in creier, nivelele de A42 sunt in medie crecute fata de normal[43].
Formarea placilor de amiloid si agregarea progresiva a A42 duce la scaderea nivelelor sale plasmatice ceea ce face imposibila diagnosticarea astfel. Asadar nivelele ploasmatice ale A reflecta si metabolismul sau in creier. Antigenul A mascheaza deci detectia autoanticorpului A, iar masurarea dupa disociere creste sensibilitatea metodei.
Fosforilarea proteinei TAU: posibila cauza si marker pentru moartea celulelor neuronale?
Forma fosforilata a proteinei derfineste NFTs [23,4547]. Altereaza dinamica neurofiblilara normala in neuron si duce la disfunctii neuronale [48,49]. Hiperfosforilarea aberanta a Tau e guvernata de cyclindependent kinases (CDKs), [5053]. CDK2 and CDK5, Cdc-kinases si MAP2 kinases sunt crescute in AD de o maniera topografica pentru Tau fosforilat. Dar CDKs au o mare sensibilitate la reglarea prin factorii de crestere. Activarea lor arata ca neuronii pot beneficia din interventiile terapeutice bazate pe factori de crestere (in studiu) [60].
Markeri genetici stabiliti in prezent

pentru diagnosticul AD
ApoE (grupul ADNI): Peste 160 mutatiii in 3 loci genetici raspund de multe din cazurile de dementa familiala cu debut precoce (65 de nai) chromosome 14, presenilin-1; chromosome 1, presenilin-2; chromosome 21, APP. Dar aceste forme cu debut precoce raspund doar de 12% din cazurile de meneta Alzheimer.
Gena PSEN
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Mutatii
in Investete n oameni! gena care codifica presenilina PSEN1 si PSEN2

Tratamente cu inhibitori ai secretazelor, inhibitori de formare a agregatelor si disruptori fibrilari si cu anticorpi specifici
Procesarea alterata a proteinei APP datorita mutatiilor specifice bolii AD
Gena APP
Proteinele implicate in procesarea normala si anormala a APP

Mecanism de implicare a secretazelor (BACE) in progresia bolii lui Alzheimer

Nucleu
Citoplasma
Membrana celulara Boala Alzheimer
A? APP Enzima BACE1 BACE1 ARNm Gena BACE1 OligomerA? Gena contrasens BACE1
Proteina Tau
Fosforilarea proteinei Tau si formarea paglicilor interneurale

Reprezentarea structurilor formatiunilor fibrilare si placii

Genele PSEN 1 si 2, legate tot de formele cu debut precoce, localizate pe . cromozomii 1 and 14 [62]. Sunt implicate in procesarea si semnalizarea Notch Expresia crescuta de Presenilin oprirea ciclului celular ihn faza G1 si este potentata de mutatia PSEN2 (N141I) Concentratia crescuta de presenilina in mediul neuronal duce la stress oxidativ, deranjarea balantei intracelulare a calciului etc. moartea neuronala [69,70].
Gene de risc sau susceptibilitate- ApoE
In ceea ce priveste forma sporadica a bolii Alzheimer, factorul genetic de risc cel mai important este alela ApoE 4 allele. Mareste de 2- 3 ori riscul declansarii bolii Totusi, alela ApoE 4 nu este necesara si nici suficienta. De fapt, 50% din riscul mostenit de a face boala este inca necunoscut. Dar asocierea genotipului ApoE cu declansarea AD sporadic e un indicator potential ca boala e legata de metabolismul lipidic si dieta. Rolul ApoE a fost determinat si in aparitia bolilor cardiovasculare.
O serie de studii privind longevitatea umana au raportat ca frecventa alelei ApoE 4 este mai scazuta la grupele de varsta mai batrane, prin comparatie cu cele tinere sau de varsta medie Gena este polimorfica. Exista 3 forme majore ale ApoE 3 (Cys112/Arg158), 4 (Arg112/Arg158) and 2 (Cys112/Cys158) raspund de variabilitatea de la un individ la altul a metabolismului lipidic la subiectii sanatosi . Acest polimorfism, odata descifrat, poate conduce la noi terapii si noi markeri.
Identificarea unor noi markeri pe baza abordarilor GWAS/microarray si a altor tinte tisulare in creier
Recent, Potkin et al., utilizand atrofia la nivelul hipocampului ca baza de referinta, a identificat gene de risc candidat pentru forma sporadica a AD la 381 de pacienti [77]. Rezultatele au indicat ApoE o noua gena de risc in membrana mitocondriala - TOMM40, de cam 2 ori mai frecventa la pacienti fata de martori. De asemenea, au fost identificate 21 de gene sau zone cromozomiale purtatoare a cel putin unui polimorfism nucleotidic unic (SNP) tot atatea noi directii de cercetare in domeniul markerilor genetici. Este vorba de genele candidat EFNA5, CAND1, MAGI2, ARSB and PRUNE2, implicate in reglarea degradarii proteinelor, apoptoza, moartea neuronala si dezvoltare [77].
Concluzii privind relevanta markerilor genetici

Factorii genetici sunt extrem de utili ca parte in bateria de parametri de detectie a bolii Alzheimer Se tinde spre biomarkeri complecsi, multifactoriali
Biomarkeri asociati cu metabolismul oxidativ (ROS)

Radicalii liberi joaca rol major in patogeneza bolii Alzheimer [78]. Un numar semnificativ crescut de mitocondrii in AD, in exact acei neuroni care sunt marcati de anormalitati de functionare [80]. In AD ciclul celular neuronal este intrerupt sau disfunctional, si apare o faza de staza caracterizata prin exces de mitocondrii sursa potentiala de procese oxidative / radicali liberi in exces asalt patologic cronic asupra neuronilor dishomeostazia intracelulara a calciului [81].
Stress-ul oxidativ si biomarkeri biochimici posibili

Debalansarea proceselor oxidative induce o cascada de alte evenimente nefaste la nivelul neuronului in AD. Activarea p38 MAPK , fosforilarea tau phosphorylation, MEK, ERK1/2, cyclins, si inhibitorii acestora (i.e., p16INK4a)
Expresia p21Ras este elevata in fazele precoce ale bolii Activarea si acumularea acestor compusi legati de metabolismul oxidativ este in stare sa conduca la noi biomarkeri.
Concluzii si perspective privind markerii biologici ( proteomici, genetici, biochimici)

AD rezulta din jocul complex al factorilor genetici, de mediu si de imbatranire care afecteaza cai metabolice, reglaje epigenetice, raspunsul la stress, etc. Spectrul biomarker-ilor candidat include o gama larga de indicatori genetici, modificari proteice si biochimice, markeri imagistici. Desi inca nu exista un tratament curativ pentru demente si in special boala Alzheimer, progresul conceptual si tehnologic indica perspective promitatoare.
Proiect cofinanat n Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni!
Abordari practice de studiu genomic

Genomica studiaza intregul genom relatia dintre genotip si fenotipurile (proteinele) care constituie expresia tuturor
genelor dintr-un genotip individual. Studiile includ investigatiile de cartare, identificare de gene, secventiere si analiza functionala Genomica este asociata cu studiile farmacogenomice si chimice de dezvoltare de noi compusi utilizabili in tratamente
Diagnosticul molecular
Numeroase modele experimentale utilizate in investigatiile care au fost posibile in decursul a cca un secol, au condus la rezultate interesante, privind mecanismul molecular si procesul dinamic, progresiv, al bolii AD. Astazi este binecunoscut faptul ca boala AD este asociata cu imbatranirea, instalarea ei fiind frecventa dupa implinirea varstei de 65 de ani. Cu toate acestea, sunt diagnosticate tot mai numeroase cazuri cu instalare timpurie a bolii in jurul varstei de 40 de ani, pana la 65 de ani, ceea ce a implicat o investigatie detaliata a factorilor genetici si epigenetici de risc si asocierea acestora cu conditiile familiale si ambientale.
Diagnosticul molecular
O data cu aceste descoperiri, s-a initiat o abordare noua a patogeniei, in general si a bolii AD in special, si anume prin
implicarea aspectului de personalizare si preventie, alaturi de cel de susceptibilitate si de risc. Recent, abordarile epigenetice asociate cu procesele de citodiferentiere in dezvoltarea normala si patologica au evidentiat un aspect neglijat, dar extrem de important al factorilor de transmitere transgenerationala a efectelor conditiilor ambientale asupra generatiilor ce urmeaza genitorilor expusi unor agenti chimici, biologici, de stress. Aceasta impune evident introducerea unor noi termeni educationali, asociati cu informarea si responsabilizarea.
Cariotiparea conventionala a cromozomilor unei celule umane somatice (2n=46); celulele sunt diploide, fiecare cromozom din perechile de cromozomi 1-23 este mostenit de la un parinte (genitor)
Proiect cofinanat n Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni! Proiect cofinanat n Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013,,Investete n oameni!
Abordari actuale proteomice

Vizeaza utilizarea metodelor high-through-put prin utilizarea chipurilor cu aranjamente de proteine marcate (array) in vederea studiului functiilor proteinelor si identificarea
unor proteine noi intr-un material biologic prin spectrometrie de masa; Detectia se poate realiza prin metode chimice sau imunochimice
Metode si tehnici de proteomica

actualmente se disting prin capacitatea de automatizare, computerizare, miniaturizare, dispunere a sondelor in aranjamente de tip array-pe chipuri
Metode si tehnici proteomice si imunochimice

Identificarea proteinelor exprimate diferential prin electroforeza bidimensionala (2D) a probelor; Identificarea proteinelor se ralizeaza prin analiza imaginilor electroforetice. Ulterior, proteinele pot fi analizate prin spectrometrie de masa dupa ce sunt decupate din gel si fragmentate prin tratamentul cu cu tripsina. B, Proteinele pot fi separate prin chipuri de afinitate
Proiect cofinanat n Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 - 2013-
Investigatia genetica Cand riscul de boala este evident, trebuie sa ne indreptam catre masurile cuvenite pentru intarzierea /ameliorarea evolutiei bolii detectarea cauzelor genetice este salutara Daca riscul este prezumat, markerii moleculari (de ordin genetic), in asociere cu cei imagistici si testele psihometrice se impun Legat de profilaxie cunoasterea susceptibilitatii poate fi si ea salutara Preceptele si normele legate de etica !

LABORATOR

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

LABORATOR

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Medicina de Laborator

Elemente de baza in interpretarea rezultatelor testelor de laborator

ureei, T3 si T4 si creste nivelul creatininei si al acidului uric.

valori fals scazute, iar adenilkinaza eliberata interfera cu determinarea CK.

Alterari subtile, cumulative

Glosar de termeni Gena

Notiuni de genetica generala

Cum se modifica fenotipul celular in imbatranire?

Cai de imbatranire sanatoasa a creerului

Cai de imbatranire sanatoasa a creierului

Caile de adaptare a celulelor neuronale la conditiile specifice perioadei de imbatranire

Ce cale alternativa exista in cazul in care calea adaptativa nu are succes?

Timingul instalarii modificarilor fiziologiei si structurilor neuronale in decursul procesului de imbatranire

La randul lor, celulele neuronale sufera modificari ale retelei moleculare

Cum regleaza epigenotipul expresia genelor?

Parcurgerea etapelor de dezvoltare este definita de programe epigenomice

Modificarea histonelor postranslationala - un alt nivel informational epigenetic

cu rol de represie (a- rosu) si activare (b-verde) genica

Genetica si epigenetica imbatranirii

Caile metabolice care controleaza procesul imbatranirii

Longevitatea si rezistenta la insulina.

Longevitaea si dieta- metabolismul trigliceridelor

Asocierea longevitatii cu semnalele ambientale

sirtuine si caile de semnalizare insulina/insulin-like growth factor (IGF-1)

Cauzele moleculare ale imbatranirii

Cai de extindere duratei sanatoase a vietii ?

Perspective de interventie pentru viata umana ?

stabilitatii genomice/m etilomului in functie de aportul nutritional si stil de viata

Tratamente care tintesc receptozomul

Genetica si epigenetica bolii Alzheimer

Tipuri de transmitere ereditara autozomala dominanta (AD) si recesiva autozomala

Genetica si epigenetica bolii Alzheimer

se numesc gene de risc

Genele critice si repartitia lor

Cromozomii purtatori ai genelor critice in AD

Biomarkeri legati de cauza centrala a AD

Corelarea biomarkerului Abeta cu aspecte imunologice

Interpretarea rezultatelor analizelor Abeta si a factorilor imunologici asociati

Markeri genetici stabiliti in prezent

in Investete n oameni! gena care codifica presenilina PSEN1 si PSEN2

Procesarea alterata a proteinei APP datorita mutatiilor specifice bolii AD

Proteinele implicate in procesarea normala si anormala a APP

Mecanism de implicare a secretazelor (BACE) in progresia bolii lui Alzheimer

Fosforilarea proteinei Tau si formarea paglicilor interneurale

Reprezentarea structurilor formatiunilor fibrilare si placii

Gene de risc sau susceptibilitate- ApoE

Concluzii privind relevanta markerilor genetici

Biomarkeri asociati cu metabolismul oxidativ (ROS)

Stress-ul oxidativ si biomarkeri biochimici posibili

Concluzii si perspective privind markerii biologici ( proteomici, genetici, biochimici)

Abordari practice de studiu genomic

Abordari actuale proteomice

Metode si tehnici de proteomica

Metode si tehnici proteomice si imunochimice

S-ar putea să vă placă și