Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic", după cum procesul de bază în
tehnologia chimică este „procesul chimic". Spaţiul în care se desfăşoară o reacţie sau un proces
chimic se numeşte „reactor chimic". In mod asemănător, spaţiul în care se desfăşoară un proces
biologic se numeşte bioreactor.
Deşi procesul de bază din tehnologia de biosinteză este „procesul biologic", el aparţine, totuşi,
domeniului ingineriei biochimice, care se ocupă de studiul proceselor de fermentaţie aerobă şi
anaerobă, al reacţiilor enzimatice, precum şi de procese specifice industriei fermentative, cum ar fi:
sterilizarea,pasteurizarea,liofilizarea(procedeu de conservare a unor produse biologice, alimente,
medicamente etc., constând din sublimarea apei cuajutorul vidului din produsele în prealabil congel
ate), uscarea prin atomizare (metodă de uscare constand în pulverizarea soluțiilor sau a suspensiilor
într-un curent de aer cald), izolarea şi purificarea produselor extrase din mediile biologice.
În bioreactor, transformarea materiilor prime este realizată de sistemul enzimatic al
microorganismelor vii, al celulelor animale şi vegetale sau de enzimele izolate din acestea. Reuşita
experimentului biotehnologie depinde în cea mai mare măsură de condiţiile optime de creştere a
microorganismelor create în bioreactor. Celulele se luptă continuu cu modificările din mediul
înconjurător, astfel încât să obţină şi să-şi menţină condiţiile optime de creştere. într-un bioreactor,
această tendinţă a celulelor este asistată, este controlată în mod continuu. Reactorul trebuie să
asigure aprovizionarea continuă a celulelor cu mijloacele necesare creşterii sau producerii de
metaboliţi, asigurând pe cât este posibil valorile optime pentru pH, temperatură, concentraţia
substratului, concentraţiile în săruri minerale, factorii de creştere şi pentru concentraţia în oxigen.
În legătură cu reactorul în care trebuie să aibă loc procesul biologic sau biochimic, apar
următoarele probleme importante:
care este cel mai bun reactor pentru o transformare biochimică dată;
cum se calculează mărimea şi volumul interior util, alte elemente constructive al
bioreactorului;
care sunt condiţiile optime de operare, astfel încât bioreactorul să realizeze performanţele
dorite.
Fenomenele care au loc în bioreactor au un caracter complex, datorită interdependenţei
fenomenelor de transfer cu cele biochimice. Analiza procesului trebuie să ia în considerare, pe lângă
reacţiile biochimice propriu-zise, şi fenomenele fizice cu care acestea interacţionează şi anume:
curgerea, transferul de masă şi transferul de căldură, prezente în orice reactor industrial. Descrierea
cantitativă a acestor fenomene furnizează ecuaţiile cu ajutorul cărora bioreactorul poate fi analizat,
optimizat, dimensionat, reglat.
Pentru a micşora riscul în procesul de realizare la scară industrială a unui proces
biotehnologic stabilit în laborator, este necesară construirea unei instalaţii pilot care să furnizeze
informaţii intermediare şi foarte utile pentru proiectul industrial; trecerea de la model la producţie
poate fi adesea uşurată cu ajutorul teoriei similitudinii. Aceasta stabileşte criterii care permit
calcularea mărimilor fizice ale sistemului la scară mare, bazat pe rezultatele obţinute în modelul
1
experimental, la scară mică. Pentru fiecare proces elementar, factorii determinanţi pot fi incluşi într-
un număr caracteristic, denumit criteriu de similitudine; acesta trebuie să rămână constant pentru ca
procesul la nivel industrial să se desfăşoare în mod similar cu procesele de laborator şi pilot. Dacă
această similitudine este asigurată, atunci, rezultatele care s-au obţinut în laborator sau pilot pot fi
utilizate pentru proiectarea reactorului industrial.
Înainte de alegerea modului de operare (discontinuu, continuu, semicontinuu), a tipului, a
mărimii şi a condiţiilor de operare, este necesară o alegere preliminară a tipului de reactor în
funcţie de microorganismul utilizat, mediul de cultură şi de caracteristicile procesului
biochimic. Alegerea tipului de bioreactor se efectuează în momentul în care bioprocesul se află încă
în faza de cercetare, de obicei în perioada de experimentare la nivel pilot.
În cazul acestui tip de operare avem regimul de circulaţie amestecare perfectă, caracteristică
fiind în această situaţie uniformitatea valorilor concentraţiei, temperaturii în spaţiul bioreactorului
şi, în general, a tuturor parametrilor care influenţează bioprocesul.
Operarea în sistem semicontinuu („extended culture operation"). În acest caz, reactorul
este astfel operat încât concentraţia substratului limitativ este păstrată constantă prin aprovizionarea
sa continuă („fed batch"). Se notează SC şi se reprezintă grafic astfel:
2
omogenitate, iar în cazul reactorului D (cu deplasare) se consideră o curgere tip piston.
heterogene: unde:
L-L: lichid - lichid- monofazice
L-S: lichid-solid - multifazice
G - L - S: gaz - lichid – solid - multifazice
In sistemele omogene, compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă pe tot parcursul
bioprocesului. în sistemele heterogene, în mediul de fermentaţie există gradiente de celule sau de
substrat. în sistemul omogen, în orice moment, microorganismele din diferite zone ale sistemului au
aceeaşi stare fiziologică (acelaşi stadiu de dezvoltare). în sistemul heterogen, microorganismele din
diferite zone ale sistemului sunt expuse la diferite condiţii de mediu şi, în consecinţă, vor avea
diferite stări fiziologice (adică se vor afla în diferite stadii de dezvoltare).
Sistemele de operare continuă sunt prezentate în figura urmatoare
Un alt criteriu care stă la baza clasificării bioreactoarelor este regimul termic
Pentru reactoarele chimice, se pot practica următoarele regimuri:
- izoterm: au loc schimburi de căldură cu exteriorul, temperatura rămânând constantă;
- adiabat: nu au loc schimburi de căldură cu exteriorul;
- neizoterm-neadiabat: au loc schimburi de căldură cu exteriorul, iar temperatura în reactor nu este
constantă;
- programat: se modifică regimul termic, astfel încât să se atingă un optim dorit;
-autoterm: reactorul se susţine singur din punct de vedere termic.
Reacţiile chimice pot fi exoterme, cu degajare de căldură (ΔHR < 0) sau endoterme, cu absorbţie de
căldură din mediul exterior (ΔHR> 0). Reacţiile chimice exoterme pot fi conduse în oricare din
regimurile termice specificate, pe când cele endoterme nu pot fi operate autoterm.
3
Reacţiile biologice sunt exoterme, indiferent de microorganismul utilizat, de condiţiile de lucru sau
de produşii obţinuţi.
Deşi cantitatea de căldură degajată în urma proceselor biologice este mică în comparaţie cu cea
degajată în procesele chimice, nu trebuie neglijată deoarece materialul biologic (microorganisme,
enzime) este foarte sensibil la variaţiile de temperatură.
CARACTERIZAREA BIOREACTOARELOR
1. Bioreactorul discontinuu
Bioreactorul discontinuu este caracterizat prin amestecarea ideală a mediului de cultură şi prin
operarea în şarje: se încarcă componentele mediului, se inoculează, iar după un interval de timp
determinat se descarcă mediul de fermentaţie conţinând produşii de biosinteză.
2. Bioreactorul continuu
În cazul cultivării continue, prelungirea fazei de creştere exponenţială un timp nedefinit se
realizează prin adăugarea continuă în reactor a unei soluţii de mediu proaspăt cu un debit
volumetric şi eliminarea continuă a biomasei cu acelaşi debit, astfel încât volumul biomasei din
fermentator să rămână constant.
Pentru stabilirea ecuaţiei ce generează dezvoltarea microorganismelor, trebuie să se ţină seama
de faptul că variaţia concentraţiei biomasei este datorată existenţei a două fenomene antagoniste:
-creşterea numărului microorganismelor datorită dezvoltării populaţiei
-scăderea cantităţii de microorganisme datorită eliminării lor din sistem.
4
3. Bioreactorul cu recirculare externă
In unele cazuri, mediul de fermentaţie de la ieşirea din bioreactor este supus unei operaţii de
separare (prin centrifugare, filtrare, sedimentare), iar concentratul conţinând biomasa se recirculă
parţial în bioreactor.
Ecuaţiile ce guvernează acest proces se bazează pe aplicarea bilanţurilor de materiale pentru
biomasă şi substrat.
Notăm cu r raportul de recirculare şi presupunem aceeaşi concentraţie a substratului şi a
produsului în debitul de alimentare şi în cel de evacuare.
Biomasă intrată + Biomasă existentă + Biomasă generată = Biomasă rămasă + Biomasă ieşită.
5
Reprezentarea schematică a reactorului cu deplasare.
Operarea bioreactoarelor în culturi extinse (cu adaosuri)
În afara modalităţilor de operare a bioreactoarelor, expuse anterior, în practica biotehnologică se
foloseşte cu succes şi tehnica adăugării în bioreactor a unuia sau a mai multor substraturi, în timpul
cultivării, fără eliminare de biomasă (fermentaţie cu adaosuri), numită şi cultură extinsă sau operare
în sistem semicontinuu.
Acest tip de cultivare se situează între cultivarea „în şarjă" şi cea continuă. Caracteristicile celor trei
tipuri de operare:
în şarjă: concentraţia substratului scade;
continuu: concentraţia substratului este constantă;
semicontinuu: concentraţia substratului se menţine constantă o perioadă, după care scade.
Avantajele sistemului de operare semicontinuu sunt următoarele:
-prin alimentarea mediului în timpul cultivării se obţin rezultate superioare în productivitate faţă de
sistemul discontinuu;
-în cazul în care se utilizează nutrienţi cu proprietăţi inhibitoare (metanol, etanol, acid acetic), prin
menţinerea concentraţiei acestora între anumite limite se poate obţine o scurtare a perioadei de
latenta şi micşorarea efectului inhibitor al substratului;
-este posibilă obţinerea unor concentraţii mai mari de biomasă (circa 50 g/L) prin adăugarea de
substrat.
CONFIGURAŢIA BIOREACTOARELOR. TIPURI CONSTRUCTIVE
Bioreactorul este „inima" oricărei fermentaţii sau bioconversii enzimatice. Configuraţia şi
construcţia unui bioreactor se realizează pe baza unor principii de inginerie bine fundamentate
ştiinţific. Alegerea tipului de bioreactor este în strânsă legătură cu tipul bioprocesului ce urmează a
se desfăşura în el. Acest lucru presupune luarea unor decizii importante referitoare la următoarele
aspecte:
-configuraţia bioreactorului: cu agitare mecanică sau un vas cu aerare fără agitare?
-mărimea bioreactorului: ce dimensiune a bioreactorului este necesară pentru a asigura
producţia rentabilă a produsului?
-condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului: p H , temperatură, concentraţia
oxigenului dizolvat;
-sistemul de operare respectiv şi dacă bioreactorul va funcţiona în sistem discontinuu sau
în sistem continuu? Va fi bioreactorul cuplat în serie cu alte bioreactoare sau va fi singur?
6
Decizia luată în legătură cu problemele enunţate anterior va avea un impact deosebit asupra
performanţei ulterioare a bioprocesului.
Bioreactoarele cilindrice cu sau fără agitare sunt cel mai des utilizate în biotehnologie.
După natura proceselor biotehnologice, reactoarele pot fi clasificate în:
- reactoare biologice: în care se desfăşoară un proces de fermentaţie (cu biomasă);
- reactoare biochimice: în care se desfăşoară procesele enzimatice.
Reactoarele biologice pot fi pentru fermentaţii aerobe sau anaerobe. Reactoarele biochimice pot fi:
cu enzime libere, cu enzime imobilizate şicu fază solidă.
Reactoare pentru fermentaţii aerobe. După modul de introducere a energiei necesare amestecării fazei
lichide (substrat + microorganisme) şi dispersării fazei gazoase (aer), reactoarele aerobe se pot diviza în
trei categorii:
cu amestecare mecanică
cu pompă de recirculare
cu aer comprimat
ALEGEREA BIOREACTOARELOR
Alegerea bioreactorului potrivit pentru un anumit proces biotehnologic se realizează în funcţie de
o serie de factori predeterminaţi cum ar fi: natura microorganismului folosit, proprietăţile mediului de
cultură, parametrii biochimici ai procesului, amplasamentul bioreactorului.
Caracteristici determinate de natura microorganismului folosit în bioproces. Modul de operare al
unui reactor depinde în mod esenţial de stabilitatea tulpinii productive. De exemplu, numai tulpinile care
sunt suficient de stabile pot fi utilizate în operarea continuă. Condiţiile de operare sunt afectate în mod
hotărâtor fiind complet diferite dacă microorganismul este aerob sau anaerob.
O caracteristică a mediului importantă, care implică alegerea unui anumit tip de bioreactor, este
spumarea în timpul cultivării. Formarea de spumă conduce de cele mai multe ori la blocarea ieşirii
aerului, inundarea filtrelor de aer, scăderea volumului de mediu în bioreactor, infecţia mediului de cultură
şi, deci, compromiterea procesului de biosinteză.
Există mai multe metode pentru prevenirea fenomenului de spumare:
-conducerea procesului astfel încât să nu se formeze spumă;; în acest caz concentraţia oxigenului nu
mai este un factor limitativ şi nu este necesară mărirea debitului de aer care conduce la spumare excesivă.
-adăugarea de antispumanţi, care schimbă coalescenţa mediului. Agentul antispumant se acumulează
la interfaţa gaz-lichid şi împiedică formarea spumei.
Antispumanţii utilizaţi în industria de biosinteze sunt:
-uleiuri naturale: de soia, de floarea-soarelui;
-uleiuri sintetice, care pot fi de natură siliconică sau polimeri organici;
-mijloace mecanice: agitatoare cu turaţie mare, şicane, tuburi interioare.
Spumarea poate fi combătută şi prin alegerea tipului de bioreactor potrivit care să permită o circulaţie
rapidă a lichidului fără să formeze spumă (bioreactor cu „draft" interior).
7
REZUMAT:
Elaborarea şi industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze:
laborator, pilot, industrială.
Faza de laborator
1. Izolarea şi selecţia
• Izolarea din medii diferite (apă, sol, alte substrate) sau cumpărarea tulpinii producătoare
• Cultivarea pe medii adecvate
• Obţinerea culturilor pure
• Omologarea culturilor
• Teste de identificare a compusului de interes (calitative şi cantitative)
2. Întreţinerea tulpinilor producătoare
• Caracterizarea tulpinilor: criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice toxicologice.
• Tulpina caracterizată se înregistrează într-o colecţie de microorganisme sub un număr de
identificare.
• Uneori se aplică procedee de selecţie naturală sau artificială (mutageneză) în scopul oţinerii de
tulpini înalt producătoare.
• Păstrarea culturilor stoc la frigider.
3. Cultura de inocul
• Inocul este o cultură microbiană în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător şi în
anumite condiţii specifice de dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare).
• Transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză, în condiţii aseptice, după o perioadă de
dezvoltare bine stabilită pentru fiecare tip de microorganism.
Faza industrială
• Procesul tehnologic are loc în bioreactorul ales conform scopului urmărit.
• Toţi prametri optimizaţi în fazele de laborator şi pilot sunt urmăriţi în faza induistrială, însă la altă
scară.
- În sistem submers
- În culturi de suprafaţă
Sistemul submers
• Mediul de cultură este lichid, agitat şi aerat.
• Procesul poate fi: discontinuu, semicontinuu, continuu
Culturile de suprafaţă
• Cultivarea microorganismelor se realizeză la suprafaţa unui mediu solid sau semisolid.
• Dacă se ţine seama de complexitatea fazelor, bioreactoarele se clasifică în:
1. Omogene (L-L)
2. Heterogene (L-S), (G-L-S)
Unde:
L-L: monofazice
L-S: bifazice
G-L-S: multifazice
În sistem omogen
• Compoziţia mediului de biosinteză este uniformă pe tot parcursul procesului.
• În orice moment microorganismele din diferite zone ale sistemului au aceeaşi stare fiziologică
(acelaşi stadiu de dezvoltare).
În sistem heterogen
• În mediul de cultură există gradiente de celule sau de substrat.
• Microorganismele din diferite zone sunt expuse la diferite condiţii de mediu şi, în consecinţă, vor
avea diferite stări fiziologice (stadii diferite de dezvoltare).
Reacţiile chimice
• Exoterme (cu degajare de căldură): reacţiile biologice
• Endoterme (cu absorbţie de căldură din mediul înconjurător).
• R. exoterme pot fi conduse în oricare din regimurile termice specificate
• R. endoterme nu pot fi operate autonom.
Caracterizarea bioreactoarelor
1. Bioreactorul discontinuu
• Se caracterizează prin amestecarea ideală a mediului de cultură şi prin operarea în şarje.
• Se încarcă componentele mediului, iar după un anumit timp determinat, se descarcă mediul ce
conţine produşii de biosinteză.
2. Bioreactorul continuu
• Se adaugă continuu în reactor un volum determinat de mediu proaspăt
• Se elimină continuu un volum egal de biomasă, astfel încât volumul biomasei din bioreactor să
rămână constant.
• Se prelungeşte indefinit faza de creştere exponenţială.
• Trebuie avută în vedere menţinerea cantităţii de biomasă la valorile optime.
Chemostatul
• Tehnica cultivării constă în reglarea concentraţiei biomasei, prin intermediul concentraţiei
substratului (care este limitativ)
10
Substrat alimentat + Substrat existent = Substrat consumat + Substrat ieşit + Substrat rămas
• La diluţii mici (timpi de staţionare mari) concentraţia de biomasă de la ieşire este practic
insensibilă la variaţia diluţiei (critică).
• La diluţii mari, concentraţia de biomasă scade accentuat cu creşterea diluţiei, datorită duratelor de
staţionare mici, celulele nu se pot multiplica şi doar o mică cantitate de substrat este consumată.
• Pe măsură ce concentraţia substratului limitativ se măreşte, creşte şi concentraţia de biomasă din
reactor.
Turbidistatul
În cazul creşterii celulelor în exces de neutrienţi, se poate realiza reglarea procesului pe principiul
turbidistatului, care permite folosirea unor diluţii apropiate de diluţia critică.
• Măsurarea densităţii celulare este realizată prin intermediul densităţii optice (turbidităţii) şi se
reglează prin modificarea debitelor de alimentare (evacuare), deci a diluţiei.
• Tubidistatul oferă posibilitatea urmăririi comportării culturii în prezenţa unui exces de nutrienţi.
• Operarea la diluţii apropiate de diluţia critică permite maximizarea productivităţii.
• Acest sistem nu asigură, însă, suficientă stabilitate fazei staţionare, fiind necesare modificări mari
ale debitelor pentru a obţine menţinerea concentraţiei.
Bioreactorul în care mediul de biosinteză de la ieşirea din bioreactor este supus unei operaţii de
separare (prin centrifugare, filtrare, sedimentare), iar concentratul conţinând biomasa se recirculă parţial în
bioreactor.
Configuraţia bioreactoarelor
Tipuri constructive
Criterii de alegere:
• Configuraţia (cu agitare mecanică, sau un vas cu aerare fără agitare).
• Mărimea reactorului pentru rentabilitate.
• Condiţiile bioprocesului (temperatură, pH, etc).
• Sistemul de operare (continuu sau discontinuu).
11
• Reactoare biochimice (procese enzimatice).
-cu enzime libere,imobilizate şi cu fază solidă.
12
1. Bioreactoare cu agitare mecanică
• Cele mai utilizate.
• Amestecarea şi dispersia bulelor de aer se asigură prin agitare mecanică.
• Doar 70-80% din volumul reactorului este umplut cu lichid, ceea ce permite degajarea bulelor în
partea superioară, unde se instalează un spărgător de spumă.
• Este prevăzut cu un sistem de răcire (serpentină internă, manta de răcire etc).
•
Circulaţia lichidului în bioreactor cu agitare mecanică cu agitator tip elice (stânga) şi turbină deschisă
(dreapta)
13
3. Bioreactoare cu aer comprimat
3.1 Bioreactoare tip coloană cu bule
• Nu există sistem de agitare mecanică
• Agitarea se face prin barbotare de aer (consumă energie mai puţină).
• Se utilizează în industria berii, vinului, tratarea apelor reziduale.
• Sunt mai ieftin de realizat
• Transferul de masă şi energie satisfăcător.
Bioreactoare air lift (a,b-cu o singură regiune aerată, c-cu circulaţie externă)
14
4. Bioreactoare cu dializă
Motivele utilizării membranelor de dializă:
• Sunt un mijloc eficient pentru îndepărtarea eficientă a inhibitorilor sau a produselor toxice
rezultate din fermentaţie.
• Cultura microbiană poate fi alimentată cu substrat prin membrană.
• Se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarece substratul este separat de
microorganism şi nu îl inhibă.
Principiul dializei
Dializa: procesul prin care o soluţie trece printr-o membrană semipermeabilă de la o concentraţie mai
mare la o concentraţie mai mică, până este atins echilibrul.
15