UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢĂ AGRICOLĂ ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Bota ADRIAN GHEORGHE

PROIECT DE DIPLOMĂ

Îndrumători științifici:
Prof. Dr. Daniel DEZMIREAN
Drd. Adriana URCAN

Cluj-Napoca
2017
 UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE SI BIOTEHNOLOGII

Departamentul II D.I
Disciplina de Apicultură și Sericicultură

Adrian Gheorghe BOTA

PROIECT DE DIPLOMĂ
Potențialul biologic activ al unor elemente compoziționale
din lăptișorul de matcă

Îndrumători științifici:
Prof. Dr. Daniel DEZMIREAN
Drd. Adriana URCAN

Cluj-Napoca
2017
 Potențialul biologic activ al unor elemente compoziționale
din lăptișorul de matcă
Autor: Adrian Gheorghe BOTA

Îndrumători ștințifici: Prof. Dr. Daniel DEZMIREAN,

Drd. Adriana URCAN

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară, Str. Mănăştur, Nr. 3-5, 400372, Cluj-
Napoca, România;

Adresa de e-mail botaadrian94@gmail.com

REZUMAT

Lăptişorul de matcă este un produs de secreție, de culoare alb-galbenă, al glandelor

hipofaringiene ale albinelor doici. Rolul său în familia de albine este binecunoscut în
diferențierea castelor, dezvoltarea și reproducția reginelor.
Determinările fizico-chimice ale lăptişorului de matcă fac posibilă o valorificare a
acestuia prin stabilirea criteriilor de calitate atât din punct de vedere nutritiv cât şi terapeutic.
Identificarea şi cuantificarea compuşilor glucidici din cele patru probe luate în studiu s-a fǎcut în
vederea determinǎrii calitǎţii şi autenticitǎţii acestora.
Proteinele reprezintă o componentă cu o importanță deosebită pentru lăptișorul de matcă,
deoarece reprezintă fracțiunea majoritară a acestui produs. Aşadar, analiza proteinelor din
lăptişorul de matcă este importantă pentru a contura unele dintre rolurile nutritive și funcționale
ale lǎptişorului de matcǎ.
Identificarea şi cuantificarea acidului 10-HDA în proba de lǎptişor de matcă reprezintă
markerul de calitate a acestui produs apicol. Prin determinarea aminoacizilor cu ajutorul
cromatografiei lichide cuplată cu un detector spectrometru de masă (LC-MS) au fost identificați
un număr de 31 de aminoacizi din care opt sunt aminoacizi esențiali.

Cuvinte cheie: Lăptișor de matcă, 10-HDA, proteine, aminoacizi

Biologically active potential of elements in the royal jelly
Author: Adrian Gheorghe BOTA

Scientific Coordinators: Prof. Dr. Daniel DEZMIREAN,

Drd. Adriana URCAN

University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Mănăştur st. 3-5, 400372,

Cluj-Napoca, România;

Address: botaadrian94@gmail.com

ABSTRACT
 CUPRINS

Contents
CAPITOLUL I........................................................................................................................................................ 5

COMPOZIŢIA FIZICO-CHIMICĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ..................................................................................5

1.1. COMPOZIȚIE ȘI CRITERII DE CALITATE A LĂPTIȘORULUI DE MATCĂ...............................................................................5

1.1.1. Carbohidrați.........................................................................................................................................7
1.1.2. Proteine................................................................................................................................................7
1.1.3. Aminoacizi............................................................................................................................................8
1.1.4. Lipide....................................................................................................................................................8
1.1.5. Minerale...............................................................................................................................................9
1.1.6. Vitamine...............................................................................................................................................9

CAPITOLUL II..................................................................................................................................................... 10

CARACTERIZAREA LĂPTIȘORULUI DE MATCĂ...................................................................................................... 11

2.1. CONŢINUTUL ÎN PROTEINE AL LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ.............................................................................................11

2.2. PROPRIETĂŢI BIOLOGICE ALE PROTEINELOR DIN LĂPTIŞORUL DE MATCĂ............................................................................11
2.3. PROPRIETĂŢILE STRUCTURALE ALE LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ..........................................................................................12
2.4. PROPRIETĂŢILE FIZIOLOGICE ALE PROTEINELOR DIN LĂPTIŞORUL DE MATCĂ.................................................................13
2.5. AUTENTICITATEA LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ..........................................................................................................15
2.6. PROSPEȚIMEA LĂPTIȘORULUI DE MATCĂ.............................................................................................................15
2.7. FALSIFICAREA LĂPTIȘORULUI DE MATCĂ..............................................................................................................16

CAPITOLUL III.................................................................................................................................................... 17
MATERIALUL BIOLOGIC..................................................................................................................................... 17

3.1. ANALIZE FIZICO – CHIMICE....................................................................................................................................17

3.1.1. Determinarea conţinutului de apǎ............................................................................................................18
3.1.2. Determinarea conţinutului de lipide totale...............................................................................................19
3.1.2. Deterninarea proteinelor totale:...............................................................................................................20
3.2. ANALIZE CROMATOGRAFICE...........................................................................................................................22
3.2.1. Determinarea glucidelor............................................................................................................................22
3.2.2. Determinarea acidului 10-HDA din lăptişorul de matcǎ............................................................................25
3.2.3. Determinarea aminoacizilor liberi.............................................................................................................29

1
 INTRODUCERE
Apicultura este știința care de la începuturile civilizației și până în prezent continuă să
reprezinte o provocare pentru cei ce încearcă să-i deslușească tainele. Apicultorii sau cercetătorii,
au fost și continuă să fie preocupați de destinele acestei lumi, diferită de cea în care trăim noi.
Apicultura este o ramura a agriculturii care studiază biologia și tehnologia creșterii și
exploatării albinelor, în scopul obținerii de producții apicole și a sporirii producției de semințe la
plantele agricole entomofile. Datorită particularităților biologice specifice, albinele furnizează
omului importante produse, iar prin acțiunea de polenizare încrucișată a plantelor entomofile
asigură însemnate sporuri de producție la multe culturi agricole (Dezmirean, 2013).
Colonia de albine melifere, un superorganism alcătuit din celule individuale care sunt de
fapt însăşi albinele melifere, este reflectată şi în mecanismele cu ajutorul cărora culegătoarele
culeg, procesează şi conservă nectarul şi polenul şi asigură hrana puietului. Proteinele şi
peptidele sintetizate de către albinele melifere în glandele cefalice, joacă un rol important în
procese ca hrănirea şi protejarea puietului împotriva agenţilor patogeni.
În ultimii ani s-a observat o creștere a interesului consumatorilor, dar și al industriei
alimentare, pentru alimente sănatoase și modurile în care acestea ar putea să ajute la menținrea
sănătății. Printre alimentele care dețin un potențial benefic asupra sănătății sunt cele care provin
din stupul de albine mai precis mierea, propolipsul și lăptișorul de matcă.
Lăptișorul de matcă este o secreție vâscoasă și lăptoasă provenită din glandele
hperfaringiene și mandibulare ale albinelor lucrătoare (Apis mellifera) și este folosit pentru a
hrăni larvele (Isidorova și colab , 2009). Matca este hrănită cu lăptișor de matcă pe toată durata
vieții, în timp ce albinele lucrătoare sunt hrănite cu lăptișor de matcă doar în primele trei zile
(Simuth, 2001 ; Srisuparbh și colab., 2003)
Datorită aceastei diferenţieri şi a faptului că albinele melifere hrănesc matca cu lăptişor
de matcă pe parcursul întregii ei vieţi, matca are o durată de viaţă lungă. Mătcile trăiesc 4 până la
5 ani, lucrătoarele doar 3-4 săptămâni. Acest fenomen a stat la baza ideii că lăptişorul de matcă
ar putea fi sursa longevităţii oamenilor. Deşi aceasta este doar o ipoteză, descoperirile ştiinţifice
recente sugerează că mai ales proteinele conţinute în lăptişorul de matcă ar acţiona ca factor de
revitalizare în nutriţia oamenilor. Proteinele secretate de către albinele melifere în produsele lor
au diferite funcţii în crearea unor condiţii optime de dezvoltare a coloniei de albine melifere.
Glandele hipofaringiene, mandibulare şi salivare reprezintă sursa celor mai importante proteine
ale albinelor melifere.
Mai multe studii biologice și chimice privind activitatea lăptișorului de matca au fost
realizate. Date fiind proprietățile biologice excepționale pe care lăptișorul de matcă le are, acesta
2
a devenit considerabil utilizat și comercializat în mai multe domenii cum ar fi în industria
farmaceutică, industria alimentară și în fabricarea cosmesticelor. Lăptişorul de matcă este un
sistem complex, conţinând proteine, apă, zaharuri, lipide, minerale, aminoacizi, vitamine,
enzime, hormoni, polifenoli, acizi oraganici, ATP și cataboliții săi (Takenaka, 1982; Šimúth,
2001).
De asemenea calitatea şi autenticitatea lǎptişorului de matcǎ sunt douǎ premise care îi
intereseazǎ atât pe apicultorii cât şi consumatorii. Parametri de calitate clasici nu mai sunt
suficienţi în contextul actual pentru a garanta calitatea, siguranţa şi originea produselor apicole.
În acest sens, proteinele din lǎptişorul de matcǎ sunt constituenţii specifici ai acestui produs, iar
caracterizarea lor este esenţialǎ pentru a defini calitatea lǎptişorului de matcǎ.
Studiul proteinelor aparţine de domeniul proteomicii, ştiinţǎ care se ocupǎ cu a
caracteriza un set de proteine (denumit proteom) codificate de cǎtre genomul uni anumit
organism.

Tema aleasă este una de actualitate datorită accentual tot mai mare pus în ultima perioada
de către apiterapeuți, cercetători, dar și de către consumatori pe autenticitatea produselor apicole.
Pe langa 10 HDA, proteinele din compoziția lăptișorului de matcă ar putea reprezenta un marker
de autenticitate al acestui produs.

În cadrul aceestei lucrări s-a urmărit studierea compozitiei fizico-chimice a diferitelor

probe de lăptișor de matcă comercializat în România, precum și a profilului glucidic și al
aminoacizilor. De asemenea s-a urmarit și determinarea marker-ului de autentitcitate al acestui
produs și anume acidul 10-hidroxi-2-decenoic (10-HDA).

Obiective
Obiectivele urmǎrite în această lucrare sunt urmǎtoarele:

 Cercetǎri privind compoziţia fizico-chimicǎ a lǎptişorului de matcǎ prin

deteminarea umidității a lipidelor totale prin metoda Soxhlet și a proteinei totale
prin metoda Kjeldahl.

 Cercetǎri privind identificarea şi cuantificarea a acidului 10-hidroxi-2-decenoic

din lǎptişorul de matcǎ prin tehnica de Cromatografie Lichidǎ de Înaltǎ
Performanţǎ (HPLC-PDA)
 Cercetǎri privind identificarea şi cuantificarea glucidelor din lǎptişorul de matcǎ
prin tehnica de Cromatografie Lichidǎ de Înaltǎ Performanţǎ cu detecţie în Indice
de Refracţie (HPLC-IR).

 Cercetări privind conținutul în aminoacizi liberi prin tehnica de Cromatografie

Lichidă cuplată cu Spectrometrie de Masă ( LC-MS)

 Evidențierea diferențelor la nivel compozițional în cadrul celor patru categorii de

lăptişor de matcă – electroforeza.
 CAPITOLUL I

COMPOZIŢIA FIZICO-CHIMICĂ A LĂPTIŞORULUI DE MATCĂ

1.1. Compoziție și criterii de calitate a lăptișorului de matcă

Lăptișorul de matcă este o substanță vâscoasă parțial solubilă în apă cu o densitate de 1,1
g/ml, culoarea este alb-galbenă, mirosul este înțepător, gustul fiind dulce-acrișor. Caracteriticile
senzoriale pe care lăptișorul de matcă le are joacă un rol important în determinarea calității
acestuia. Lăptișorul de matcă vechi care nu a fost corespunzător depozitat tinde să fie mai închis
la culoare și are un gust neplăcut. Pentru calitatea optimă lăptișorul de matca ar trebui să fie
depozitat la o temperatura scăzută. Vâscozitatea lăptișorului de matcă variază în funcție de
cantitatea de apă și vechime devenind mai vâscos când este depozitat la temperatura camerei sau
în frigider la 5°C.

Fig.1.1. Lăptișor de matcă

(Sursa: http://healthywithhoney.com/royal-jelly-and-fertility/)
Vâscozitatea crescută este corelată cu creșterea particulelor de nitrogen insobubile din
apă, împreună cu o reducere a nitrogenului solubil și a aminoacizilor liberi. Aceste schimbări
sunt provocate de activitatea enzimatică și interacțiunile dintre bucățile de lipide și proteine.
Laptișorul de matcă este parțial solubilă în apă și foarte solubil în acizii, (pH 3,4-4,5)
(Lercker, 2003). Nu există standarde internaționale în ceea ce privește lăptișorul de matcă. Cu
toate acestea câteva țări cum sunt Brazilia, Bulgaria, Japonia și Elveția au stabilit câteva
standarde naționale.
 În tabelul de mai jos este prezentată compoziția lăptișorului de matcă proaspăt și liofilizat
(Sabatini și colab., 2009). Datele provin de la diferiți cercetători, din diferite țări, care sunt sub
anumite reglementări, dar pentru stabilirea standardelor generale este nevoie de mai multe
investigații. A fost dovedit că depozitarea lăptișorului de matcă în condiții de îngheț previne
descompunerea proteinelor biologice a lăptișorului de matcă, din acest motiv acesta ar trebui
congelat de îndata ce este colectat (Li și colab.,2007).

Caracteristicile fizico-chimice ale lăptișorului de matcă

Tabelul 1.1

Component Proaspăt Liofilizat

Apă 60–70 <5

Lipide 3–8 8–19

10-HAD >1.4 >3.5

Proteine 9–18 27–41

Fructoză 3–13 –

Glucoză 4–8 –

Sucroză 0.5–2.0 –

Cenușă 0.8–3.0 2–5

pH 3.4–4.5 3.4–4.5

Aciditate 3.0–6.0 –

(Sursa: Sabatini și colab.2009)

Analiza probelor de lăptișor de matcă din diferite zone geografice arată faptul ca nu
există nici o diferență în ceeea ce privește distingerea unui produs de altul. Este afirmat faptul că
conditiile de mediu nu afecteaza în mod semnificativ principalele component (Sabatini și colab.,
2009).
 Fig.1.2. Compoziția medie a lăptișorului de matcă
(Sursa:Caboni și colab., 2004; Lercker și colab., 1992; Scarselli și colab., 2005; Simúth și colab.,
2004; Zhang și colab., 2012).

1.1.1. Carbohidrați
Ocupă aproximativ 18% din materia uscată a lăptișorului de matcă. Principalele zaharuri
sunt reprezentate de către monozaharidele fructoză și glucoză În funcție de perioada de păstrare
glucoza ajunge să reprezinte între 50-70% din totalul zaharurilor (Chen, 1995). Împreună cu
glucoza, fructoza reprezintă aproximativ 90% din totalul zaharurilor. Sucroza este și ea prezentă,
dar în cantități foarte mici (Lercker și colab 1986). Este de asemenea posibil să găsim
oligozaharide cum sunt maltoză, gentiobioză, izomaltoză, dar toate acestea în concentrații foarte
mici. (Sabatini, 2009).

1.1.2. Proteine
Proteinele reprezintă între 13-18% din materia uscată a lăptișorului de matcă mai mult de
80% din proteinle lăptișorului de matcă sunt proteine solubile (MRJPS) (Simuth, 2001).
Cele opt proteine majore prezente în lăptișorul de matcă sunt (MRJP1, MRJP2, MRJP3,
MRJP4, MRJP5, MRJP6, MRJP7, MRJP8) (Albert și colab 2004). Proteinele MRJP din
lăptișorul de matcă sunt considerate a fi un factor major responsabil pentru dezvoltările
fiziologice ale reginei. Proteina MRJPs include numeroși aminoacizi cum sunt ovalbumina și
cazeina (Schmitzova și colab., 1998).
1.1.3. Aminoacizi

Reprezintă aproape 2,3% din componentele azotate existente în lăptișorul de matcă.

Lăptișorul de matcă conține aproximativ de 29 de aminoacizi și derivați ai acestora cei mai
importanți fiind acidul aspartic și acidul glutamic. Aminoacizii liberi cel mai bine reprezentați
sunt prolina și lizina (Mateescu , 2011)

Fig.1.3. Aminoacizii din proteinele lăptișoruluii de matcă

(Sursa: Boselli, 2003; Lercker, 2003; Pilar, 2002.)

1.1.4. Lipide
Lipidele sunt prezente între 3-6% în substanța uscată a lăptișorului de matcă (Melliou și
Chinou, 2005; Nabas și colab, 2014). Aproximativ 90% din lipide sunt constituite din acizi
grași restul sunt lipide neutre, steroizi, hidrocarburi și fenoli (Ramadan și Al-Ghamdi, 2012).
Acizii grași conținuți de lăptișorul de matcă au între 8-10 atomi de carbon de obicei acizi grași
hidroxi ori acizi hidrocarboxilici spre deosebire de acizii organici, majoritatea fiind de origine
animală și vegetală (Kodai și colab., 2007).
Principalul acid gras este 10-hidroxi-2-decenoic (10-HDA) (Terada și colab., 2011),
este un acid gras nesaturat care pare să fie implicat în activitatea antibacteriană a lăptișorului de
matcă (Bloodworth și colab., 1995; Nagai și Inoue, 2005). Alți acizi grași din lăptișorul de
matcă sunt: acidul oleic, olenic, palmitic, miristic, linoleic, stearic.
Acidul 10-hidroxi-2-decenoic (10-HDA)
10-HDA prezintă de astfel un rol biologic în dezvoltarea strategiilor coloniei (Wu și
colab., 1991). Mai mult de atât 10-HDA a fost acceptat ca și marker al calității și prospețimii
lăptișorului de matcă (Antinelli și colab., 2003; Ferioli și colab., 2007). De asemenea acidul
 octanoic se prezintă în cantitate mai mică decât 10-HDA pare să acopere mai mult decât o
funcție nutrițională; recent studiile au arătat că acidul octanoic este implicat în acțiunea
hidrofobă a botcii împotriva Varroa (Nazzi și colab.,2009).
Acidul 10-hidroxi-2-decenoic este o substanţă prezentă doar în lăptişorul de matcă
proaspăt şi conţinutul său se înregistrează în jurul valorii de 1,4-2,0 %, astfel prezenţa acestuia
poate constitui un marker pentru diferenţierea lăptişorului de celelalte produse ale stupului
(Bloodworth şi colab., 1995). Deoarece acidul 10-HDA prezintă efecte biologice, anti-
bacteriene, anti-tumorale, anti-virale, anti-fungice şi de prelungire a duratei de viață, se utilizează
des în produsele alimentare sau cosmetice.

1.1.5. Minerale
Mineralele reprezintă aproximativ 1% din compoziția lăptișorului de matcă proaspăt și 2-
3% din lăptișorul liofilizat. Dintre cele mai importante minerale identificate în lăptișorul de
matcă amintim: potasiul, calciul, sodiul, fierul, cuprul, magneziul. Conținutul de cenușă din
lăptișorul de matcă proaspăt reprezintă 0,8-1,5 (Garcia și colab., 2007). Ipotezele privind
prezența acestor metale s-a axat asupra factorilor din afara coloniei (mediul, achiziționarea de
produse alimentare, perioada de producție) precum și a unor factori interni (factorii biologici
legați de albine) (Bogdanov, 2012; Matsuka, 1993; Sabatini și colab., 2009).

1.1.6. Vitamine
În lăptișorul de matcă se găsesc vitaminele B1, B2, B6, B5 (cantități mari), B8, B9, PP și
în cantități foarte mici vitamina C. Vitaminele liposolubile, cum ar fi vitaminele A, D, E și K
sunt și ele prezente în lăptișorul de matcă (Li și Chen, 2003; Morita și colab, 2012). Conținutul
de vitamine din lăptișorul de matcă provine din polenul colectat de către albinele lucrătoare
(Biondi și colab., 2003; Chen și Chen, 1995)
Conținutul în vitamine al lăptișorului de matcă în µg/g de greutate proaspătă
Tabelul 1.2
Riboflavină

pantotenic

Acid folic
Piridoxină

Niacină

Inozitol
Tiamină

Biotină

Vitamina
Acid

Minimum 1,44 5 159 1,0 48 0,130 80 1,1

Maximum
6,70 25 265 48 88 0,530 350 19,8

(Sursa: Vecchi și colab., 1998)

 CAPITOLUL II

CARACTERIZAREA LĂPTIȘORULUI DE MATCĂ

2.1. Conţinutul în proteine al lăptişorului de matcă

Proteinele sunt compuşi alcătuiţi din elemente chimice precum hidrogenul, carbonul,
azotul, oxigenul şi sulful. Aminoacizii sunt unitățile de bază ale proteinelor, acestea fiind
polimeri liniari ai aminoacizilor. Grupurile aminoacizilor formează legături peptidice prin reacţii
de condensare.
Calitatea proteinelor din diferite surse naturale depinde de conţinutul în aminoacizi
esenţiali, iar proteinele din lǎptişorul de matcǎ conţin un numǎr semnificativ de aminoacizi
esenţiali.
Majoritatea sunt proteine hidrosolubile care fac parte din clasa Major royal jelly proteins,
denumite şi MRJPs (Simuth, 2001, Buttstedt şi colab., 2013). Proteina MRJPs include
numeroși aminoacizi cum sunt ovalbumina și cazeina (Schmitzova și colab., 1998). Familia
proteinelor MRJP care este cunoscută ca fiind una dintre cele mai solubile proteine până la 31%
solubilitate , și are opt membrii MRJPs1-8 (Albert și Klaudiny, 2004; Drapeau și colab, 2006 ;
Schonleben și colab, 2007).
Proteinele care fac parte din familia MRJPs sunt alcătuite din 400 până la 578 de
aminoacizi, iar majoritatea au în componenţă aminoacizi esenţiali precum arginina, lizina, valina,
histidina, leucina, izoleucina, metionina, fenilalanina, treonina şi triptofanul ( Groot, 1953).

MRJP1 este o glicoproteinǎ slab acidǎ care formeazǎ complecşi oligomerici (Bilikova şi
colab., 2002; Kimura şi colab., 2003; Simuth, 2001). MRJP2, MRJP3 şi MRJP5 sunt
glicoproteine bazice cu mase moleculare diferite datorate individualităţii la nivel de ADN al
albinelor (Albert şi colab., 1999a, Li şi colab., 2007; Schönleben şi colab., 2007; Tamura şi
colab., 2009). MRJP 7 şi MRJP 8 sunt specifice veninului de albine, acestea fiind rar regǎsite în
lǎptişorul de matcǎ (Blank şi colab., 2012). MRJPs pot fi identificate în cantităţi reduse şi în alte
produse ale stupului, cum ar fi mierea şi polenul cu care au venit în contact albinele lucrătoare
(Bílikova şi Simuth, 2010).

2.2. Proprietăţi biologice ale proteinelor din lăptişorul de matcă

MRJP1 a fost prima proteină identificată în lăptișorul de matcă (Hanes şi colab., 1992).
Roialisina, cum mai este denumită clasa de MRJP1, este o proteină care se găseşte în lăptişorul
de matcă şi are un rol important în diferenţierea pe caste a albinelor (Fujiwara şi colab., 1990).
De asemenea, această proteină are un potenţial antibacterian asupra bacteriilor Gram pozitive,
asupra patogenilor specifici albinelor. (Ibarra-Herrera şi colab., 2014).
Existǎ câteva studii care aratǎ cǎ proteinele MRJP sunt prezente şi în celulele creierului
albinelor (Hojo şi colab., 2010), posibil ca aceste proteine să deţină şi funcţii importante
implicate în fiziologia albinelor, nu doar în faza de dezvoltare a larvelor.
Proteinele hidrosolubile din lǎptişorul de matcǎ sunt implicate în înmulțirea celulară (Kamakura
şi colab., 2001; Kamakura şi Sakaki, 2006; Tamura şi colab., 2009) dintre care Major royal
jelly protein 1 (MRJP1), care se regǎseşte din abundenţǎ în lǎptişorul de matcǎ, prezintǎ
activitatea de proliferare celularǎ chiar şi la temperaturi înalte (Moriyama şi colab., 2015).
Proteinele implicate în metabolismul glucidelor au fost de asemenea identificate în lăptişorul de
matcă. Acestea sunt glucoz-oxidaza, α-glucozidaza şi glucoz-dehidrogenaza. (Kamakura şi
Sakaki, 2006).
Efectul antialergic a fost distribuit clasei de proteine MRJP3 (Okamoto şi colab., 2003,
Simúth şi colab., 2004). Activitatea antibacteriană a MRJP3 şi a peptidelor cu activitate
antibacteriană, a fost pusă în evidenţă în urma studierii efectului infectării cu bacterii patogene a
larvelor de albine (Evans, 2004; Scharlaken şi colab., 2008). Lăptişorul de matcă proaspăt
recoltat este un mediu nefavorabil creşterii bacteriene datorită atȃt activităţii inhibitorie a
proteinelor, cȃt şi datorită altor compuşi precum acizii organici (în special 10-HDA), peptidele cu
efect antibacterian, aminoacizilor liberi, flavonoidelor prezente în lăptişorul de matcă datorită
polenului şi propolisului cu care lăptişorul de matcă a venit în contact.
Până în prezent, studiile efectuate au explicat unele dintre funcţiile claselor de proteine
MRJP 1-3, însǎ nu se cunoaşte nimic despre funcţiile claselor MRJP 4-8. Expresia acestei familii
de proteine este diferenţiatǎ la nivel de indivizi în cadrul genului Apis. Aşadar, caracterizarea
biochimicǎ a proteinelor din lǎptişorul de matcǎ este esenţialǎ pentru a arătǎ importanţa
compuşilor proteici din lǎptişorul de matcǎ în calitate de compuşi biologic activi.

2.3. Proprietăţile structurale ale lăptişorului de matcă

În general lăptişorul de matcă este definit ca o emulsie. Investigarea lăptişorului de matcă
proaspăt cu microscopul electronic de scanare (SEM) a relevat trăsăturile sale structurale unice
(Šimuth, 2001). Examinarea cu SEM a arătat că în unele zone stratul de lăptişor de matcă
conţine particule sferice globulare relativ mari (Fig.2.1). Dimensiunea lor a variat de la 20 la 80
µm. Aceste „globule“ erau conectate între ele printr-un sistem de canale-filamente. Diametrul
filamentelor este de aproximativ 2 µm, iar lungimea variabilă. O mărire şi mai mare a unui
globul a arătat filamente care iradeau de la suprafaţa ca o scoică a globulei. A fost emisă idea că
structura fină a lăptişorului de matcă este generată de glandele hipofaringiene ale albinei
melifere.

Fig.2.1 – Vizualizare SEM a particulelor globulare tipice ale lăptişorului de matcă natural
(Sursa: Simúth și colab., 2004)

2.4. Proprietăţile fiziologice ale proteinelor din lăptişorul de matcă

Pot fi făcute câteva generalizări referitoare la propritetăţile fiziologice ale proteinelor
majore din lăptişorul de matcă. Evidenţele comportamentale atât de sugestive nu ne indică în
mod direct dacă proteinele majore din lăptişorul de matcă au aceleaşi funcţii în stadiul timpuriu
şi în cel târziu al dezvoltării larvare. Studierea scindării proteinei din lăptişorul de matcă în
intestinul mediu al larvei (Tsao și Shuel, 1968) a arătat că unele proteine din lăptişorul de matcă
au putut trece prin epiteliul intestinului fără să fi suferit vreo schimbare. Conţinutul ridicat de
aminoacizi esenţiali le-a predestinat rolul lor nutriţional în cadrul coloniei de albine.
Componentele bioactive ale lăptişorului de matcă nu au fost complet evaluate, dar oricum
studii recente in vitro demonstrează că unele proteine majore ale lăptişorului de matcă
influenţează procese fiziologice foarte importante. Peptidele bioactive din lăptişorul de matcă şi
din proteinele majore ale acestuia ar trebui luate în calcul ca potenţiali modulatori ai diferitelor
procese reglatoare din organism. Relaţia dintre activitate şi structură şi mecanismul prin care
proteinele majore din lăptişorul de matcă îşi exercită efectele lor imunomodulatoare nu au fost
încă stabilite. Totuşi rezultatele obţinute cu proteinele 350 kDa şi 55 kDa din lăptişorul de matcă
sugerează că proteinele majore ale lăptişorului de matcă ar putea afecta procese celulare
importante.
Estimarea structurilor chimice ale proteinelor majore bioactive din lăptişorul de matcă
este primul pas spre descoperirea mecanismului molecular al activităţilor lor fiziologice în
sinergie cu alte componente bioactive ale lăptişorului de matcă.
Din punctul de vedere al activitătii fiziologice, poziţia dominantă este deţinută de
proteinele albuminoidelor cele mai abundente în lăptişorul de matcă: apalbumina-α acidă
(Šimuth, 2001) şi apalbumina-β bazică (Bilikova și colab., 1999), care apar şi în creierul albinei
melifere (Kimura și colab., 1995; Kucharski și Maleszka, 2002). Aceste descoperiri ca şi
similarităţile dintre sistemul imun al insectelor şi al mamiferelor (Dushay și colab., 1966; Imler
și Hoffmann, 2001; Baud și Karin, 2001) au arătat că proteinele din lăptişorul de matcă ar
putea fi factorul care este implicat în reglarea proceselor fiziologice importante. Datele
referitoare la proprietăţile fiziologice ale proteinelor din lăptişorul de matcă, precum stimularea
proliferării monocitelor umane (Kimura și colab., 1995), sau proprietăţile imunomodulatoare
ale lăptişorului de matcă (Šver și colab., 1996), suprimarea reacţiilor alergice (Oka și colab.,
2001), sau activitatea antihipertensivă a peptidelor bioactive din lăptişorul de matcă (Matsui și
colab., 2002) lărgesc potenţialul aplicării acestuia în farmaceutică şi indică funcţia lor naturală în
evoluţia albinei melifere, unde pot juca un rol de inducere a mecanismului de apărare în timpul
dezvoltării larvare. Dacă această presupunere este corectă, atunci proteinele din lăptişorul de
matcă ar putea induce producerea de bioreglatori de tipul citokinei, care au o funcţie importantă
în cadrul sistemului imunitar, al proceselor inflamatorii, şi ar putea să participe şi la controlul
proliferării, diferenţierii şi apoptozei celulelor.
Proteinele şi peptidele din lăptişorul de matcă pot participa la mecanismul defensiv al
albinei melifere împotriva agenţilor patogeni printr-o inactivare directă a microorganismelor
apărute în produsele apicole, ca şi prin inducerea de citokine cu participare la reglarea transcrierii
proteinelor şi peptidelor defensive.
 2.5. Autenticitatea lăptişorului de matcă
Shen (2015) a propus ca marker de autenticitate a lǎptişorului de matcǎ MRJP1 (proteinǎ
denumitǎ de cǎtre acest grup ca apalbumina1) folosind metoda ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay), o metoda sensibilǎ şi uşor de folosit pentru determinarea autenticitǎţii
lǎptişorului. În prezent acidul 10-hidroxi-2-decenoic (10-HDA) care se găsește numai în
lăptișorul de matcă, a fost utilizat drept criteriu de autenticitate al lăptișorul de matcă.
Autenticitatea produsului poate fi măsurată prin determinarea acizilor grași a compoziției
lăptișorului de matcă (Howe și colab.,1985). Cantitatea de polen la fel și a cerii, și a particulelor
de larve ar trebui să fie minime.

2.6. Prospețimea lăptișorului de matcă

Lăptișorul de matcă se poate degrada sau deteriora și pierde valoarea comercială în cele
din urmă, atunci când este depozitată impropriu, prin urmare ar trebui depozitat la 4-8°C sau la
congelator pentru a garanta buna calitate (Chen și colab., 1995). Anumiți indicii de calitate și
prospețime cum ar fi furozina (Messia și colab., 2005), superoxid dismutaza,oxidaza glucozică
și proteina 57-kDa au fost propuși.
Lăptişorul de matcă este un produs valoros care îşi pierde proprietăţile terapeutice pe
parcursul păstrării motiv pentru care familia de MRJPs este considerată un potenţial indicator de
prospeţime datorită corelaţiei dintre degradarea acestor compuşi de-a lungul păstrării şi condiţiile
de păstrare (Shen şi colab., 2015). MRJP1 a fost propus ca marker de prospeţime de cǎtre
Kamakura (2001) care a observat degradarea acestei proteine în funcţie de perioada şi condiţiile
de temperaturǎ ale pǎstrǎrii. Li (2008) a analizat efectul diferitelor condiţii de pǎstrare asupra
MRJPs şi a concluzionat cǎ MRJP5 reprezintǎ un indicator al prospeţimii lǎptişorului de matcǎ,
aceastǎ clasǎ de proteine fiind cea mai sensibilǎ la pǎstrare (fiind absentǎ dupa un an de pǎstrare
la temperatura camerei). Recent, un studiu aparţinȃnd lui Shen şi colab. (2015) a demonstrat de
asemenea că MRJP1 poate fi un bun indicator de prospeţime (şi de autenticitate) pentru
lăptişorul de matcă.
Totuşi, chiar şi după un an de păstrare la temperatura camerei, MRJP1-3 pot fi încă
detectate, deşi forma monomerică a MRJP 1 se degradează mai rapid decȃt forma oligomerică.
Aceste rezultate conduc la concluzia că stabilitatea proteinelor este dependentă de structura lor,
studierea stabilităţii specifice acestora fiind necesară.
 2.7. Falsificarea lăptișorului de matcă
Substanțele utilizate în falsificarea lăptișorului de matcă pot imita produsul natural numai
din punct de vedere organoleptic, compoziția chimică fiind greu de falsificat. Falsificarea cu praf
de larve (apilarnil); în această situație, concentrația apei în amestec este mai mare decât a
lăptișorului de matcă pur, proteinele sunt mai puține decât limita inferioră din lăptișorul de matcă
și pH-ul este mai mare de 4,5. Cel mai important criteriu de calitate în falsificarea lăptișorului de
matcă este 10-HDA. Cu toate acestea limitele raportate în literatura de specialitate ale
compoziției sunt foarte variate. Conținutul 10-HDA scade odată cu depozitarea lăptișorului de
matcă (Antinelli și colab., 2003). Această scădere este mai mare în mierea care conține lăptișor
de matcă (Matsui., 1988). Falsificarea cu iaurt mai mult de 25% , albuș de ou, apă și amidon din
porumb cu siguranță poate fi detectată prin creșterea umidității, diminuarea lipidelor, proteinelor
și 10-HDA precum și insolubilitatea în mediu alcalin (Garcia-Amoedo.,2007). În plus analiza
microscopică a sedimentului din lăptișorul de matcă aplicată după principiile de bază ale
melisopalinologiei (Louveaux și colab .,1978) și în identificarea particulară a polenului pe care
îl conține și fac posibilă definirea originii geografice al produsului. Identificarea polenului este
ușurată de faptul că numai câteva țări produc lăptișor de matcă, iar specialiștii sunt capabili să
formuleze caracteristicile respective ale asociațiilor de polen. Un alt parametru promițător ale
valorii autenticității ale lăptișorului de matcă este prezența apalbuminei (Simuth și colab.,2004).
 CAPITOLUL III

MATERIALUL BIOLOGIC
Materialul biologic studiat în cadrul acestei lucrări a fost alcătuit din patru probe lăptișor
de matcă. Aceste probe au fost obținute din comerț (CasaBio) în anul 2015, având ca și țară de
proveniență Romania. Probele au fost depozitate în congelator la temperatura de – 20 ° C până în
momentul efectuării analizelor.
Cercetările au fost efectuate în cadrul Laboratorului de Controlul Calității Produselor
Apicole (APHIS) al Disciplinei de Tehnologia Produselor Apicole și Sericicole din cadrul
Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară Cluj-Napoca. Metodele aplicate au fost
preluate din literatura de specialitate și au fost supuse modificărilor impuse de matricea luată în
studiu (polen și păstură), precum și de aparatura existentă în dotarea laboratorului.
Cercetările efectuate au urmărit determinarea autenticității prin determinarea profilului
proteic, glucidic și lipidic pentru probele de lăptișor de matcă luate în lucru.

Fig.3.1. Lăptișorul de matcă (imagine originală)

3.1. Analize fizico – chimice

Cu ajutorul analizelor fizico-chimice efectuate pe probele de lǎptişor de matcǎ s-a realizat

o caracterizare primarǎ pentru determinarea conținutului de apă, a conţinutului de lipide totale și
determinarea conținutului în proteină totală. Prin determinarea acestor parametrii se doreşte o
caracterizare primarǎ a probelor luate în studiu care sǎ reflecte un prim pas în stabilirea unor
markeri de calitate a acestui produs.
3.1.1. Determinarea conţinutului de apǎ
Determinarea conţinutului de apă (umidităţii) s-a efectuat prin metoda gravimetrică:
uscare la etuvă la o temperatură de 105°C (Popescu şi Meica, 1997).
O cantitate de 1g din fiecare probǎ a fost cântaritǎ pe o sticlǎ de ceas, iar apoi introdusǎ în
etuvă cu recirculare la o temperaturǎ de 105°C, timp de 4 ore. Dupǎ acest interval de timp
sticlele de ceas cu probele au fost pǎstrate în exicator pânǎ când acestea au ajuns la o temperatură
constantă. Probele au fost cântǎrite, dupǎ care procedeul a fost reluat pânǎ în momentul când
diferenţa dintre douǎ cântăriri consecutive nu a depǎşit limita de 5 mg. Rezultatele au fost
exprimate procentual ca şi medie a trei determinari independente ± deviaţia standard.

Rezultatele care s-au obţinut pentru lǎptișorului de matcǎ se pot observa în graficul de
mai jos.

Fig.3.2. Conţinutul de apǎ (umiditatea) al probelor de lǎptișor de matcǎ

Rezultatele obţinute pentru acest parametru se încadreazǎ între limitele menţionate în

literatura de specialitate.
Standardul de calitate propus de Sabatini şi colab (2009), prezintă faptul că lǎptişorul de
matcǎ, poate conţine un procent de umiditate care se încadrează între 60-70%.
Rezultatul conţinutului de apǎ al probei de lǎptişor de matcǎ se poate observa și în
graficul de mai sus prezintând o valoare medie de 66.09 ± 0.03%.
Literatura de specialitate menționează că Luis Henrique Garcia-Amoedo e Ligia
Bicudo de Almeida-Muradian (2007) obţine o medie de 63.17±1.98% pe un eşantion de 7
probe de lǎptişor de matcǎ din Brazilia, ceea ce se situeazǎ sub media obţinutǎ la probele
analizată în acest studiu.
 Cunoaşterea conţinutului de apǎ reprezintă un criteriu important pentru exprimarea
ulterioarǎ a rezultatelor, la substanţa uscatǎ.

3.1.2. Determinarea conţinutului de lipide totale

Dintre parametrii chimici ai lăptişorului de matcă una dintre cele mai importante
componente este reprezentată de fracțiunea lipidică, acesta fiind constituită din acizi organici
care sunt mono- si dicarboxilici.
Metoda utilizatǎ pentru determinarea conţinutului de lipide totale a fost adaptatǎ
aparatului Soxhlet automatcuplat cu un multistat Gerhard, din dotarea laboratorului Aphis.

Fig.3.3. Extracţia lipidelor din lăptişorul de matcă, cu ajutorul aparatului Soxhlet automat.
Sursa: Fotografie originală
S-au cântarit 2 grame probǎ pe o hârtie de filtru care a fost uscatǎ în prealabil. Probele au
fost introduse în cartusul extractorului Soxhlet (Fig.3.2.). În paharele extractorului au fost
introduse 2 pietre de fierbere, după care s-au cântărit, iar apoi s-au adăugat 90 ml dietil eter. În
vederea unei bune funcţionǎrii aparatul Soxhelt a fost setat dupǎ urmǎtorii parametrii:
 temperatura de extracţie 135°C,
 timp de extractie la cald 2 ore și 30 minute,
 spălarea cartușului 1 oră,
 evaporarea solventului în curent de aer 35 minute.
Dupǎ terminarea extracţiei paharele au fost introduse în etuvă cu recirculare la
temperatura de 60°C timp de 30 minute pentru eliminarea urmelor de solvent, după care au fost
introduse în exicator pentru a ajunge la temperatura constantă. Baloanele au fost cântarite la
diferite intervale de timp pânǎ când diferenţa dintre două cântǎriri consecutive nu a depǎsit limita
de 5mg. Rezultatele au fost exprimate procentual ca şi medie a trei determinari independente ±
deviaţia standard.

Rezultatele obţinute în urma determinǎrii conţinutului de lipide din probele de lǎptişor de

matcǎ se pot observa în urmǎtorul grafic.

Fig.3.4. Determinarea conţinutului de lipide din lǎptişorul de matcǎ

În litertura de specialitate conţinutul de lipide al lăptişorului de matcă se înregistreză între

valorile de 3-8% (Sabatini și colab., 2009). Probele luată în studiu prezintă o valoare medie de
4.88 ±0.09% ceea ce înseamnă că se încadrează în acest interval.

Valoarea medie obținută pentru conținutul de lipide de către Garcia-Amoedo și

Almeida-Muradian (2007) este de 3.28±0.78% pentru lăptișorul de matcă din Brazilia, ceea ce
se situează sub media obținută la probele analizate ăn acest studiu.

3.1.2. Deterninarea proteinelor totale:

Pentru determinarea proteinelor s-a folosit metoda Kjeldahl,care constă în determinarea
conţinutului de azot din proba ce se analizează şi convertirea lui în echivalent proteină prin
multiplicarea cu factorul 6,25 (adică unei cantităţi de 6,25 g proteină îi corespunde 1g azot).
(Popescu şi Meica, 1997).
Dozarea azotului prin metoda Kjeldahl cuprinte următoarele etape:
- mineralizarea (digestia): proba de analizat se mineralizează cu acid sulfuric concentrat
în prezenţa unui catalizator, astfel azotul organic existent în probă este transformat în azot
amoniacal.
 - distilarea: este etapa prin care se tratează sulfatul de amoniu rezultat la mineralizare cu
o soluţie concentrată de hidroxid de sodiu, astfel punându-se în libertate amoniacul.
- titratea: se captează amoniacul într-o cantitate cunoscută de acid sulfuric astfel
determinându-se cantitatea de azot din proba de analizat (Lujerdean şi Varga, 2002).
Pregatirea probei:
Se cântăreste 1g probă direct în containere speciale de cântărire care au fost introduse în fiolele
sistemului de digestie (Buchi Digesion Unit K-424 cuplat cu Buchi Scrubber B-414). În fiole s-a
adăugat 25ml acid sulfuric concetrat 95-97% şi tabletele Kjeldahl, digestia durând aproximativ 2,5h.
Distilarea s-a efectuat cu o unitate de distilare Büchi, KjelFlex K-360. La fiecare determinare
s-a utilizat 50ml H2O: 90ml NaOH: 60 ml H3BO3.
Titrate a fost realizată cu ajutorul unui titrator automat, TitroLine easy (Schott), utilizându-se
acid sulfuric de concentraţie 0.25M, până la un pH de 4.65.

Fig.3.5. Sistemul de digestie Büchi Digesion Unit K-424 cuplat cu Buchi Scrubber B-414 și
unitatea de distilare Büchi, KjelFlex K-360 utilizat la determinarea proteinei totale
Sursa: Fotografie originală
Rezultatele obţinute în urma determinǎrii conţinutului de proteină totală din probele de
lǎptişor de matcǎ se pot observa în urmǎtorul grafic.
 Fig.3.6. Conținutul în proteină al probelor de laptişor de matcă

Proteinele reprezintă o componentă cu o importanță deosebită pentru lăptișorul de matcă.

Sabatini și colab., 2009, stabilesc pentru lăptişorului de matcă valori cuprinse între 9-18 %,
astfel că pentru probele luate în studu s-a obţinut o valoare medie de 13.22±0.11% ceea ce
înseamnă că probele se situează în limitele propuse.

Pentru acest parametru Garcia-Amoedo și Almeida-Muradian (2007) obțin o medie de

13.12%±0.46 pentru lăptișorul de matcă din Brazilia, ceea ce se situează puțin sub media
obținută la probele analizate ăn acest studiu.

Influenţa originii botanice asupra conţinutului de proteinǎ se poate observa în rezultatele

obținute. O astfel de variație a conținutului în proteină este influențată de factorii biologici,
ecologici și geografici din timpul producției, precum și de manipularea și condițiile de depozitare
a lăptișorului.

3.2. ANALIZE CROMATOGRAFICE

3.2.1. Determinarea glucidelor

Glucidele sunt substanţe cu funcţiuni mixte, ce conţin în molecula lor grupări carbonilice
şi grupări hidroxilice (Socaciu, 2003).
Pentru determinarea glucidelor s-a folosit metoda (HPLC) Cromatografie lichidă de înaltă
Performanță, din cadrul Laboratorului Aphis(Fig. 3.7.) optimizând metoda descrisă de (G. Sesta,
2006).
 Cele trei zaharuri principale şi anume fructoza, glucoza, zaharoza, dar totodată și
identificarea turanozei, erlozei, melezitoza și maltoza prezente în cantități mici în compoziţia
lăptișorului de matcă, se pot identifica cu metoda HPLC care este o metodă calitativă și
cantitativă de înaltă precizie.
Turanoza, erloza, melezitoza și maltoza reprezintă un indicator în cazul unei posibile
alterări.(Serra Bonvehi,1991).
Analiza cromatografică este una similară celei de identificare a zaharurilor din mierea de
albine, doar cǎ pregatirea probelor de lǎptişor de matcă, larvă de matcă şi apilarnil este una mai
complexă din cauza compoziţiei lor care includ proteine şi lipide. Proba se dizolvǎ în amestec
apa: metanol, în proportie de 3:1 dupǎ precipitarea proteinelor cu reactiv Carrez şi extracţia
lipidelor cu diclormetan (Bogdanov, 1997).
Analiza HPLC a glucidelor din matricile menționate s-a realizat pe o coloană din oţel
inoxidabil Amino modificată Alltima Amino 100Ã. Diametrul coloanei cromatograficea fost 4.6
mm, lungime 250 mm, dimensiunea particulelor 5 μm. Temperatura din interiorul coloanei a fost
menținutǎ la 30°C. Volumul de injecție a fost de 10 μl, iar debitul ales a fost de 1ml/min.

Fig.3.7. Determinarea glucidelor cu ajutorul cromatografului lichid de înaltǎ performanţǎ

(HPLC-IR)
Sursa: Fotografie originală

Pregǎtirea probelor. Se cântareşte 1g probǎ peste care se adaugă 3 ml de amestec apǎ :

metanol în proporție de 3 : 1 într-un balon cotat de 5 ml dupǎ care se omogenizeazǎ, se adaugǎ
0.1ml Carrez I, se vortexeazǎ, apoi se adauga 0.1ml Carrez II, se vortexează din nou, iar apoi se
aduce la semn cu apă:metanol. Soluţia astfel obţinută se transferă în eprubete pentru a fi
centrifugată, timp de 30 min la o turaţie de 4000rpm. Dupǎ centrifugare, supernatantul rezultat
este recoltat într-o eprubetǎ şi este pre-spǎlat cu diclormetan timp de 2-3minute. Ulterior se
disting douǎ straturi, dintre care se recoltează cel superior care este apoi pre-spălat din nou cu
diclormetan. Aceasta operație este repetatǎ de 3 ori.
Soluţia astfel obţinută se filtrează print-un filtru de seringă Millipore cu dimensiunea
porilor de 0.45 μm, iar filtrantul se colectează în vial-uri ce se vor păstra la frigider până la
analiza efectivă. Faza mobilă este o soluţie de acetonitril HPLC şi apă ultapură v/v (80/20).
În graficul de mai jos se poate observa cromatograma HPLC a standardelor utilizate
pentru identificate glucidelor prezente în laptișorul de matcă.

30000
Fructoza

25000
Absorbanta ( mAU)

20000 Glucoza

15000 Zaharoza

10000 Turanoza

Maltoza
Trehaloza
5000
Izomaltoza

Melezitoza

0 10 20 30 40 50
Timp de retentie ( min)

Fig.3.8. Cromatograma HPLC –IR – Standard mix 9 glucide

Prin metoda HPLC avem posibilitatea efectuarii unei determinǎri foarte exacte din punct de
vedere cantitativ în ceea ce priveşte profilul glucidic al probelor luate în studiu.

Rezultatele obţinute la probele de lǎptisor de matcă sunt prezentate în tabelul 3.1.

În tabelul 3.1 se poate observa că în probele de lăptişor de matcă analizate s-au identificat
cele trei glucide majoritare: fructoza, glucoza, zaharoza și trei dintre glucidele minoritare
turanoză, maltoză, erloză. Dupǎ cum se poate observa trehaloza nu este prezentǎ în probele de
laptişor de matcă.

Concentraţia glucidelor (%) în proba de lăptişor de matcă determinate prin metoda

HPLC –IR

Tabelul 3.1

Proba Fructoz Glucoz Zaharoz Turanoz Maltoză Erloză

ă ă ă ă
P1 5,68 6,42 2,03 0,23 0,43 0,27
P2 5,57 6,00 1,99 0,25 0,48 0,27
P3 5,54 5,55 2,05 0,30 0,48 0,21
P4 5,70 6,39 1,40 0,24 0,44 1,15

Sabatini și colab., 2009 însumând valorile celor trei glucide majoritare prezintă o valoare
cuprinsă între 7-18%. În probele luate în studiu valoarea celor trei glucide majoritare este
cuprinsă între aceaste valoari, având o medie de 13.88%.
Pentru identificarea unei posibile falsificări cu miere sau zahăr a laptişorului de matcă este
foarte important cuantificarea zaharurilor existente în probă, deoarece acestea ne oferă şi
informaţii în vederea determinǎrii autenticitǎţii probelor atât din punct de vedere cantitativ cât şi
calitativ.
În multe cazuri cele douǎ monozaharide glucoza şi fructoza reprezintǎ împreunǎ pânǎ la 80%
din zaharurile existente în lǎptişorul de matcǎ, celelalte glucide fiind prezente, dar în cantitǎţi
mult mai mici.
Profilul glucidc general și valorile obținute la probele de lăptișor de matcă analizate, au fost
apropiate cu cele obținute la nivel European.

3.2.2. Determinarea acidului 10-HDA din lăptişorul de matcǎ

Determinările pentru acest parametru s-au efectuat utilizatând metoda cromatograficǎ
HPLC care a fost preluatǎ dupǎ Liu şi colab., (2008), cu unele modificări.

Acidul 10-hidroxi-2-decenoic reprezintă un marker de calitate al lăptișorului de matcă și

are o valoare cuprinsă între 1,5% -2,0%.
 Fig.3.9. Structura moleculara a acidului 10-hidroxi-2-decenoic

Sursa:http://www.abcam.com/ps/Products/144/ab144050/Images/Royal-Jelly-acid-ab144050-
ChemicalStructure-1.jpg

Analiza HPLC în vederea identificarii acidului 10-HDA în probele luate în studiu a fost
realizatǎ cu ajutorul unui sistem cromatografic SHIMADZU, model LC – 10AD VP (Fig.14.),
prevazut cu:

 degazor,
 doua pompe,
 autosampler,
 cuptor termostatat,
 controler,
 detector cu şir de diode.
Separarea cromatograficǎ s-a realizat pe o coloanǎ cu fazǎ invernǎ LC-18 supelcosil
prevǎzutǎ cu o precoloanǎ. Diametrul coloanei cromatografice a fost 4.6mm, lungime 250mm,
dimensiunea particulelor 5μm. Temperatura în interiorul coloanei a fost menţinutǎ la 40°C cu
ajutorul unui cuptor cu termostatare.

Fig.3.10. Determinarea acidului 10-HDA cu ajutorul cromatografului lichid de înaltǎ

performanţǎ (HPLC-PDA)
Sursa: Fotografie originală
 Identificarea semnalelor obţinute în fiecare cromatogramǎ, s-a realizat utilizând ca şi
compus de referinta acidul 10-HDA, care a fost injectat în sistemul cromatografic dupǎ
protocolul descris anterior.
Faza mobilă e constituită din soluţie metanol: apǎ de pH 2.5 (60:40 v/v).
Condiţiile HPLC stabilite au fost:
 rata de curgere 0,8 ml/min,
 temperatura coloanei 40 °C,
 volumul de injecţie 20 µl
 detecţia la 210 nm.
Curba de calibrare pentru 10-HDA s-a realizat din 8 concentraţii cuprinse în intervalul
0,2 – 200 µg/ml, având coeficientul R2 = 0,99998.

400000

350000

300000
Absorbanta (mAU)

250000

200000 10 HDA - Standard

150000

100000

50000

-50000
0 5 10 15 20 25 30
Timp de retentie (min)

Fig.3.11. Cromatogramă standardului 10 HDA

 Pregatirea probei:15mg probă s-a cântǎrit într-un balon cotat de 50ml peste care s-a
adaugat 30ml fazǎ mobilǎ dupǎ care timp de 30 minute s-a sonicat, apoi a urmat centrifugarea
10min la 4000rpm și filtrarea cu un filtru de 0,22 µm.
Întrucât pregătirea probei este foarte simplă, formată dintr-o succesiune scurtă de
operaţii (cântărire, dizolvare, injectare HPLC), nu apar pierderi ale compusului de interes. Astfel,
nu este necesară corectarea rezultatelor obţinute cu procentul de recuperare. S-au făcut injecţii
ale unor probe şi apoi probe fortificate cu standard de 10-HDA. S-a obţinut o ratǎ de recuperare
R% = 99.28%.

Procentul de recuperare: R% = x100

Unde: C1 – concentraţia de analit măsurată în proba modificată;

C2 – concentraţia de analit măsurată în proba nemodificată;

C – concentraţia de analit adăugată probei.

Rezultatele determinării 10-HDA la cele patru probe luate în studiu sunt prezentate în
graficul de mai jos. Fiecare probă s-a analizat în triplicat.

Fig.3.12. Conţinutul de 10-HDA al probelor de lǎptişor de matcǎ

 Sabatini și colab., 2009 pentru conținutul de 10-HDA ne prezintă o valoare peste 1,4%
fără a se da un maxim.
Conţinutul de 10-HDA din proba de lǎptişor de matcǎ luată în studiu prezintă o valoare
medie de 2.39±0.03 %.
Garcia Amoedo şi Almeida Muradian, (2007) au obţinut pentru lǎptişorul de matcǎ din
Brazilia valori cuprinse între 1.58-3.39%.
Probele luate în studiu prezintă o medie care se încadrează în studiile de literature și
putem afirma că între cel patru probe de lăptișor de matcă analizate nu există o diferenţă
semnificativă.

3.2.3. Determinarea aminoacizilor liberi

Pentru determinarea aminoacizilor liberi din lăptișorul de matcă s-a utilizat tehnica
cromatografiei lichide cuplată cu un detector spectrometru de masă (LC-MS) cunoscut atât
pentru selectivitatea cât și pentru senzitivitatea ridicată. Separarea şi cuantificarea aminoacizilor
s-a realizat cu ajutorul unui LC-MS Shimadzu (Japonia), dotat cu sursa de ionizare electrospray
și modul de operare pozitiv.

Fig.3.13. Determinarea aminoacizilor cu ajutorul cromatografiei lichide cuplată cu un

detector spectrometru de masă (LC-MS)
Sursa : Fotografie originală

Parametrii operaţionali ai metodei de lucru au fost :

-coloana cromatografică: EZ:faast AAA-MS, 250x3.0mm
 - faze mobile: format de amoniu 10mM în apă (A) și format de amoniu 10mM în
metanol (B)
- debit: 0.3ml/min
- temperatură coloană: 35ºC
- sursa ionică: electrospray (ESI)
- mod de operare: pozitiv
- volum de injecție: 1µL
- tensiune detector: 1.7KV
- timp achiziție: 33min
Un număr de 31 aminoacizi liberi au fost identificaţi în matricile studiate, prin metoda
standardului intern: arginina (ARG), glutamina (GLN), serina (SER), asparagina (ASN), prolina-
hidroxiprolina (PHP), 3-metil-histidina (3-MHIS), 1-metil-histidina (1-MHIS), 4-hidroxiprolina
(HYP), glicina (GLY), glicina-prolina (GPR), treonina (THR), alanine (ALA), acidul gama-
aminobutiric (GABA), sarcosina (SAR), acidul beta-aminoisobutiric (βAIBA), acidul alfa-
aminobutiric (ABA), ornitina (ORN), metionina (MET), prolina (PRO), lisina (LYS), acidul
aspartic (ASP), histidina (HIS), valina (VAL), acidul glutamic (GLU), triptofan (TRP), leucina
(LEU), fenilalanina (PHE), isoleucina (ILE), cistationina (CTH), cistina (C-C) şi tirosina (TYR).
Extracția și purificarea aminoacizilor liberi din cele patru probe luate în studiu s-a realizat
după modul de pregătire a probei descris în kit-ul EZ:faast Phenomenex.

Fig. 3.14. Cromatografia soluției standard de aminoacizi liberi

 Pregătirea probei: 0.5g probă s-a dizolvat în 10ml apă cu 25% acetonitril. Amestecul a
fost sonicat 15 minute, apoi s-a centrifugat 10 min la 5000rpm. 25 µl supernatant au fost trecuți
prin kit urmând urmatorii pașii: extractia în fază solidă, derivatizarea și extracția lichid-lichid. În
matricile studiate au fost identificați un număr de 31 aminoacizi, iar aminoacizii esențiali și
anume metionina (MET), histidina (HIS), valina (VAL), leucina (LEU), fenilalanina (PHE),
isoleucina (ILE), lisina (LYS), treonina (THR) au fost prezenți și cuantificați în diferite
concentrații în toate cele trei matrici luate în studiu.

Tabelul 3.2.
Cuprinde concentrațiile de aminoacizi liberi găsite în marticile luate în studiu,
exprimate în mg/100g.

Matrice
P1 P2 P3 P4
Aminoacid
Arginina 30,01 32,05 37,53 29,18
(ARG)
Glutamina 216,80 171,37 142,51 198,81
(GLN)
Serina 3,11 3,70 4,22 2,48
(SER)
Aspargina 3,77 4,80 3,80 2,74
(ASN)
Prolina- 0,00 0,00 0,00 0,00
Hidroxiprolina
(PHP)
3-metil histidina 0,36 0,44 0,17 0,04
(3-MHIS)
1-metil-histidina 0,40 0,45 0,40 0,32
(1-MHIS)
4-hidroxiprolina 2,45 2,79 2,88 1,65
(HYP)
Glicina 3,10 2,71 4,31 3,09
(GLY)
Glicina-prolina (dipeptida) 0,00 0,00 0,00 0,00
(GPR)
Treonina 1,54 1,75 2,11 2,11
(THR)
Alanina 41,84 41,36 49,68 33,48
(ALA)
Acid gama-aminobutiric 17,12 18,74 15,17 8,63
(GABA)
Sarcosina 1,43 0,97 2,71 1,11
(SAR)
 Acid beta-aminoisobutiric 2,02 4,37 2,48 0,98
(βAIBA)
Acid alfa-aminobutiric 0,97 3,81 1,11 0,28
(ABA)
Ornitina 2,90 3,50 5,36 3,92
(ORN)
Metionina 0,10 0,10 0,11 0,10
(MET)
Prolina 201,50 193,64 227,97 185,11
(PRO)
Lizina 210,74 233,73 282,47 272,75
(LYS)
Acid aspartic 24,02 25,54 31,55 25,16
(ASP)
Histidina 9,81 9,92 13,70 8,33
(HIS)
Valina 3,47 3,49 3,86 3,21
(VAL)
Acid glutamic 56,73 65,42 87,16 72,79
(GLU)
Triptofan (TRP) 0,00 0,00 0,00 0,00

Leucina 1,81 1,76 2,78 1,87

(LEU)
Fenilalanina 8,59 8,46 10,02 5,21
(PHE)
Izoleucina 1,50 1,51 2,15 1,78
(ILE)
Cistationina
0,00 0,00 0,00 0,00
(CTH)
Cistina
0,00 0,00 0,00 0,00
(C-C)
Tirozina 3,07 3,37 3,92 2,36
(TYR)
Total aminoacizi 849,28 839,91 940,26 867,65

Total aminoacizi esențiali 237,56 260,72 317,2 295,36

Aminoacidul cu ponderea cea mai mare în probele de lăptișor de matcă luate în studiu a
fost lizina ( LYS), care este un aminoacid esențial, având o valoare de 282.47 mg/100g .
Putem observa că valoarea minimă a fost pentru 3-metil histidina (3-MHIS), având o
concentrație de doar 0,4 mg/100g .
 Fig.3.14. Totalul aminoacizilor din cele patru probe de lăptisor de matcă luate în studiu

Însumând toți aminoacizii putem observa din graficul de mai sus că în proba 3 s-a
înregistrat cea mai mare concentrație de aminoacizi și anume 940.26 mg/100g.
Conţinutul în aminoacizi al probelor de lăptișor de matcă luate în studiu au prezentat
valori cuprinse între 839.91 mg/100g (P2) și 940.26 mg/100g (P3), media fiind de 874.27
mg/100g.
În matricea studiată au fost identificați un număr de opt aminoacizi esențiali
(metionina(MET), histidina (HIS), valina (VAL), leucina (LEU), fenilalanina (PHE), isoleucina
(ILE), lisina (LYS), treonina (THR)).
Însumând toți aminoacizii esențiali putem observa că proba 3 prezintă cea mai mare
valoare și anume 317.2 mg/100g.
 Fig.3.15. Aminoacizii esențiali din probele studiate

Fig.3.16. Totatul aminoacizilor esențiali din probele studiate

În ceea ce privește conținutul în aminoacizi esențiali al probelor de lăptișor de matcă
studiate, acestea se încadrează în intervalul 237.56 (P1) - 317.2 (P3) mg/100g, cu o medie de
277,71 mg/100g.
O astfel de variație a conținutului în aminoacizi este influențată de originea florală,
factorii biologici, ecologiciși geografici din timpul producției, precum și de manipularea și
condițiile de depozitare a lăptișărului de matcă.
Electroforeza extratelor proteice

Electroforeza are ca principiu migrarea proteinelor în cȃmp electric în funcţie de masa lor
molecularǎ şi sarcina electricǎ a moleculelor proteice. Electroforeza separǎ proteinele în funcţie
de masa lor molecularǎ, iar detecţia proteinelor are loc prin colorarea lor cu substanţe chimice
precum Coomasie Blue.

Gel electroforeza în poliacrilamidǎ este o metodǎ electroforeticǎ des utilizatǎ.

Electroforeza în poliacrilamidǎ este bazatǎ pe migrarea proteinelor într-un gel de poliacrilamidǎ.
Proteinele sunt dizolvate într-un solvent care conţine un detergent, numit dodecil sulfat de sodiu,
care se va lega de regiunile hidrofobe ale proteinelor denaturându-le şi eliberând lanţul
polipeptidic care se va încǎrca negativ. Migrarea proteinelor în gelul de poliacrilamidǎ va
depinde atât de câmpul electric cât şi de dimensiunea moleculelor proteice, astfel moleculele mai
mici vor migra mai rapid.

Pentru purificarea proteinelor este nevoie de :

 20 mM citrat de Na pH 4.0 (pH-ul se ajusteaza cu acid citric)
 50 mM buffer fosfat Na (NaH2PO4/Na2HPO4) pH 7 ( pt pH se foloseste acid fosforic sau
hidroxid de sodiu)
 0.2 M acetat de Na, 20% ethanol

Pentru electroforeză este nevoie de următoarele soluții:

Running gel buffer: 3 M Tris, 0.4 % SDS ( dodecil sulfat de sodiu), pH 8.85
Stacking gel buffer: 0.5 M Tris, 0.4 % SDS; pH 6.8
Running gel buffer: 250 mM Tris, 1 % SDS, 1.87 M Glycin
Sample buffer: 100 mM Tris, 4.8% SDS; 16% glicerol, 0.1 % albastru de bromfenol , 100 mM
mercaptoetanol
10% APS: 1 g APS (perfulfat de amoniu) în 10 ml apă.
Coomasie stain: 25 % isopropanol, 10 % acid acetic, 0.05 % Coomasie R-250.

Înainte de preparea gelului se ansamblează plăcile de sticlă. Între aceste plăci se interpun
2 distanţatori. Se fixează sistemul pe dispozitivul de separare şi se verifică etanşeitatea acestuia.
În cazul în care sistemul este etanş se prepară amestecul de polimerizare şi în final se adaugă
APS şi TEMED, care sunt responsabili de reacția de polimerizare.
 Se pipetează rapid amestecul între plăcile de sticlă până la o distanţă de 1,5 cm de partea
superioară a sandwich-ului (partea albastra a gelului din imagine). Se adaugă câteva picături de
n-butanol sau izopropanol cu scopul de a obţine o suprafaţa dreaptă după polimerizare (30-60
min). Dupa ce running gel a polimerizat, se îndepărtează alcoolul şi se spală partea de sus a
gelului polimerizat cu apă distilată (2-3 ori) după care se îndepărtează resturile rămase de apă cu
o hârtie de filtru. Se aşează pieptenele în partea de sus a sandwich-ului după care se toarnă
stacking gel (gel de concentrare) astfel incât să nu apară bule de aer la partea inferioară a
acestuia. Se lasă gelul la polimerizat timp de 20-30 min. După polimerizarea gelului se
îndepărtează pieptenele cu grijă şi se spală locaşurile (sample wells) cu apă distilată (2-3 ori).
Gelul polimerizat (format din running gel si stacking gel) este aşezat în camera de electroforeză.
Se adaugă soluţia tampon pentru electroforeză (1x Running gel buffer) în ambele rezervoare ale
dispozitivului.

La fiecare proba de proteine se adauga 5 μl de sample buffer și se pipeetaza în locaşurile

numite sample wells. Migrarea proteinelor în gel se face în bufferul Running gel buffer, la 175
V pentru aproximativ 1 ora. La sfârşitul separării se opreşte sursa de alimentare, se deconectează
cablurile, se scoate sandwich-ul din dispozitiv, se îndepărtează distanţatoarele şi se ia gelul dintre
plăci.

Pentru vizualizarea benzilor de proteine se foloseste Coomasie stain. Gelul se imerseaza

in solutia de Coomasie stain pentru cel putin 4 ore, iar dupa aceasta perioada de timp se
decoloreaza cu apa.

Rezultatele analizei cu ajutorul gel electroforezei în SDS-poliacrilamidǎ a proteinelor din

probele de lǎptişorul de matcǎ luate în studiu sunt prezentate în figura de mai jos.
Fig.3.17 Analiza cu ajutorul gel electroforezei în SDS-poliacrilamidǎ a proteinelor din lǎptişorul de
matcǎ. 1= extractul proteic dupǎ dializa şi centrifugare, 2=extractul proteic dupǎ dializǎ,
3=extractul proteic înainte de dializǎ, 4= proteine totale, M= marker molecular

În urma analizei SDS-PAGE a rezultat cǎ prin procesul de purificare MRJP1 a fost

obţinut sub formǎ de oligomer şi monomer (Fig. 3.17). Abilitatea de a forma oligomeri a MRJP1
poate fi esenţialǎ din punct de vedere biologic luând în considerare cǎ funcţiile anumitor proteine
sunt dependente de forma monomericǎ sau oligomericǎ a acestora.
 CONCLUZII

În urma determinărilor parametrilor fizico-chimici ale probelor de lăptișor de matcă studiate se

desprind următoarele concluzii:

 Lăptișorul de matcă are un conținut mediu de apă de 66.09%, valoarea fiind similară
celor descrise în literatura de specialitate.

 Conținutul mediu de lipide al probelor de lăptișor de matcă studiate a fost de 4.88% și

variază în limite largi, dar nu depășește maximul de 8% prevăzut în literatură.

 Profilul proteic al fiecărei probe de lăptișor reprezintă amprenta caracteristică a polenului

consumat de către albine și indirect a speciei florale.

 Conținutul de proteine totale la probele studiate prezintă valori similar literaturii de

speialitate, având o medie de 13.22%

 Determinările fizico-chimice ale lăptişorului de matcă fac posibilă o valorificare a

acestuia prin stabilirea criteriilor de calitate atât din punct de vedere nutritiv cât şi
terapeutic.

În urma determinărilor cromatografice ale probelor de lăptișor de matcă studiate se desprind

următoarele concluzii:

 Identificarea şi cuantificarea compuşilor glucidici din matricea luată în studiu s-a

fǎcut în vederea determinǎrii calitǎţii şi autenticitǎţii acestora.

 Caracterizarea profilului glucidic prin tehnici de cromatografie lichidǎ de înaltǎ

performanţǎ a permis identificarea a șase compuşi glucidici dintre care predominant
glucoza, fructoza şi zaharoza.

 În ceea ce privește profilul glucidic putem observa că în proba de laptişor de matcă

analizată au fost identificate cele trei glucide majoritare: fructoza, glucoza, zaharoza
și trei dintre glucidele minoritare turanoză, maltoză, erloză.

 Identificarea şi cuantificarea acidului 10-HDA în toate probele de lǎptişor de matcă

luate în studiu indică autenticitatea acestui produs.
 Prin determinarea aminoacizilor cu ajutorul cromatografiei lichide cuplată cu un
detector spectrometru de masă (LC-MS) și au fost identificați un număr de 31 de
aminoacizi din care opt sunt aminoacizi esențiali.

 Însumând toți aminoacizii esențiali putem observa că proba 3 a prezentat cel mai
mare conținut în aminoacizi esențiai si anume, 317.2 mg/100g.

 Lizina este aminoacidul care s-a regasit în cantitatea cea mai mare în probele de
lăptisor, având o concentrație de 282.47 mg/100g.
 BIBLIOGRAFIE

1. Albert, S., & Klaudiny, J. (2004). The MRJP/YELLOW protein family of Apis mellifera:
Identification of new members in the EST library. Journal of Insect Physiology, 50, 51–59
2. Albert, S., Bhattacharya, D., Klaudiny, J., Schmitzov´a, J. & ˇSim´uth, J. (1999a). The family
of major royal jelly proteins and its evolution. Journal ofMolecular Evolution 49, 290–297
3. Antinelli, J.F., Zeggane, S., Davico, R., Rognone, C., Faucon, J.P., Lizzani, L., 2003.
Evaluation of (E)-10-hydroxydec-2-enoic acid as a freshness parameter for Royal Jelly. Food
Chem. 80, 85–89, http://dx.doi.org/10.1016/S0308- 8146(02)00243-1.
4. Augusta Lujerdean, Andrea Varga, 2002, Biochimie descriptivă, Ed.Napoca Star, Cluj-Napoca
5. Baud V., Karin M. (2001) Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends
in Cell Biology 11, 372-377
6. Bíliková K., Hanes J., Nordhoff E., Saenger W., Klaudiny J., Šimúth J. (2002) Apisimin, a
new serine valin-rich peptide from honeybee (Apis mellifera L.) royal jelly: purification and
molecular characterization. FEBS Letters 528, 125-129
7. Bíliková K., Klaudiny J., Šimúth J. (1999) Characterization of the basic major royal jelly
protein MRJP2 of honeybee (Apis mellifera L.) and its preparation by heterologous expression in
E.coli. Biológia, Bratislava 54, 733-739
8. Bíliková K., Wu G., Šimúth J. (2001) Isolation of peptide fraction from honeybee royal jelly as
antifaulbrood factor. Apidologie 32, 275- 283
9. Biondi, C., Bedini, G., Felicioli, A., 2003. Gelatina reale: metodologia proposta per la
determinazione dell’origine geografica e della qualità. Apitalia 526, 32–37
10. Blank, S., Bantleon, F. I., McIntyre, M., Ollert, M. & Spillner, E. (2012). The major royal
jelly proteins 8 and 9 (Api m 11) are glycosylated components of Apis mellifera venom with
allergenic potential beyond carbohydrate-based reactivity. Clinical and Experimental Allergy 42,
976–985.
11. Bloodworth, B.C., Harn, C.S., Hock, C.T., Boon, Y.O., 1995. Liquid chromatographic
determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid content of commercial products containing
Royal Jelly. J. AOAC Int. 78 (4), 1019–1023
12. Bogdanov S., Martin P., Lüllmann C. (1997a) Harmonised methods of the European Honey
Commission. Determination of hydroxymethylfurfural after White, Apidologie (extra issue), 25–
27.
13. Bogdanov, S., 2012. Royal Jelly, Bee brood: composition, health, medicine: a review. Bee Prod.
Sci., 1–32
14. Boselli, E; Caboni, M. F., Sabatini, A, G., Marcazzan, G, L., Lercker, G., Determination and
changes of free amino acids in royal jelly during storage, Apidologie, 2003, 34, 1-7 13
15. Buttstedt, A., Moritz, R., & Erler, S. (2013). Origin and function of the major royal jelly
proteins of the honeybee ( Apis mellifera ) as members of the yellow gene family. Biol Rev,
89(2), 255-269.
16. Caboni, M.F., Sabatini, A.G., Lercker, G., 2004. La gelatina reale: origine, proprietà e
composizione. APOidea 1, 72–79.
17. Calvarese, S., Forti, A. F., Scortichini, G., & Diletti, G. (2006). Chloramphenicol in royal jelly:
Analytical aspects and occurrence in Italian imports. Apidologie, 37, 673–678
18. Carmen Socaciu, 2003, Chimia Alimentelor , editura AcademicPres, Cluj-Napoca;
19. Chen, I.C., Chen, S.Y., 1995. Changes in protein components and storage stability of Royal
Jelly under various conditions. Food Chem. 54 (2), 195–200
20. Dezmirean D. S., 2013, Curs de biotehnologii în apicultură şi sericicultură, Ed. AcademicPress,
Cluj-Napoca.
21. Drapeau, M. D., Albert, S., Kucharski, R., Prusko, C., & Maleszka, R. (2006). Evolution of
the yellow/major royal jelly protein family and the emergence of social behavior in honey bees.
Genome Research, 16, 1385–1394.
22. Evans, J. (2004). Transcriptional immune responses by honey bee larvae during invasion by the
bacterial pathogen, Paenibacillus larvae. Journal Of Invertebrate Pathology, 85(2), 105-111.
23. Ferioli, F., Marcazzan, G.L., Caboni, M.F., 2007. Determination of (E)-10-hydroxy-2-decenoic
acid content in pure Royal Jelly: a comparison between a new CZE method and HPLC. J. Sep.
Sci. 30, 1061–1069, http://dx.doi. org/10.1002/jssc.200600416
24. Fujiwara S., Imai J., Fujiwara J., Yaeshima T., Kawashima T., Kobayashi K. (1990) A potent
antibacterial protein in royal jelly. J. Biol. Chem. 265, 11333-113337
25. Garcia-Amoedo L. H., L. B. Almeida- Muradian, 2007, Physicochemical composition of pure
and adulterated royal jelly. Quimica Nova 30(2):257-259.
26. Hanes, J. and J. Simuth, 1992, Identification and partial characterization of the major royal jelly
protein of the honey-bee (Apis mellifera L.), Journal of Apicultural Research, 31, 22-26.
27. Hojo, M., Kagami, T., Sasaki, T., Nakamura, J. & Sasaki, M. (2010). Reduced expression of
major royal jelly protein 1 gene in the mushroom bodies of worker honeybees with reduced
learning ability. Apidologie 41, 194–202.
28. Howe, S. R., Dimick, P. S., & Benton, A. W. (1985). Composition of freshly harvested and
commercial royal jelly. Journal of Apicultural Research, 24, 52–61
29. Ibarra-Herrera, C.C., Torres-Acosta, M.A., Mendoza-Ochoa, G.I., Aguilar-Yanez, J.M., and
Rito-Palomares, M. (2014) Recovery of major royal jelly protein 1 expressed in Pichia pastoris
in aqueous two-phase systems. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 89, 941-947.
30. Ilieşiu N. V., 1991, Apilarnil, Editura Apimondia, Bucuresti.
31. Isidorova, V. A., Czyzewskaa, U., Isidorovab, A. G., & Bakier, S. (2009). Gas chromatographic
and mass spectrometric characterization of the organic acids extracted from some preparations
containing lyophilized royal jelly. Journal of Chromatography. B, 877, 3776–3780
32. Kamakura, M. & Sakaki, T. (2006). A hypopharyngeal gland protein of the worker honeybee
Apis mellifera L. enhances proliferation of primary-cultured rat hepatocytes and suppresses
apoptosis in the absence of serum. Protein Expression and Purification 45, 307–314.
33. KAMAKURA, M., FUKUDA, T., FUKUSHIMA, M., & YONEKURA, M. (2001). Storage-
dependent Degradation of 57-kDa Protein in Royal Jelly: a Possible Marker for Freshness.
Bioscience, Biotechnology And Biochemistry, 65(2), 277-284
34. Kimura Y., Washino N., Yonekura M. (1995) N-linked sugar chains of 350 kDa royal jelly
glycoprotein. Biosci. Biotech. Biochem. 59, 507-509
35. Kodai, T., Umebayashi, K., Nakatani, T., Ishiyama, K., Noda, N., 2007. Compositions of
Royal Jelly II. Organic acid glycosides and sterols of the Royal Jelly of honeybees (Apis
mellifera). Chem. Pharm. Bull. 55, 1528–1531.
36. Lavinia I. Bărnułiu, Liviu Al. MĂRGHITAŞ, Daniel S. Dezmirean, Otilia BOBIŞ, Cristina
M. Mihai, Crenguța Pavel 2011 Antimicrobial Compounds of Royal Jelly 68 1843-536X.
37. Lercker, G. (2003). La gelatina reale: Composizione, autenticita` ed adulterazione. In Atti del
Convegno ‘‘Strategie per la valorizzazione dei prodotti dell’alveare’’. Universita` degli Studi del
Molise; Campobasso; pp. 67–81.
38. Lercker, G., Caboni, M.F., Vecchi, M.A., Sabatini, A.G., Nanetti, A., 1992. Caratterizzazione
dei principali constituenti della gelatina reale. Apicoltura 8, 11–21
39. Lercker, G., Savioli, S., Vecchi, M. A., Sabtini, A. G., Nanetti, A., & Piana, L. (1986).
Carbohydrate determination of royal jelly by high resolution gas chromatography (HRGC). Food
Chemistry, 19, 255–264.
40. Li, J., Wang, T., Zhang, Z., & Pan, Y. (2007). Proteomic analysis of royal jelly from three
strains of western honeybees (Apis mellifera). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55,
8411–8422
41. Li, J.K., Chen, S.L., 2003. Royal Jelly and human health. Am. Bee J. 143, 398–402.
42. Liu J-R, Y. C. Yang, L. S. Shi, C. Peng, 2008, Antioxidant Properties of Royal Jelly Associated
wite Larval Age and Time of Harvest. J Agric Food Chem,56:11447-52.
43. Louveaux, J., Maurizio, A., & Vorwohl, G. (1978). Methods of melissopalynology. Bee World,
59, 139–157.
44. Luis Henrique Garcia-Amoedo e Ligia Bicudo de Almeida-Muradian. (2007)
Physicochemical composition of pure and adulterated royal jelly, Quim. Nova, 30, 2, 257-259.
45. Matescu Cristina, 2011 Apiterapia sau cum sa folosim produsele stupului pentru sănătate,
Editura Fiat Lux, București.
46. Matsui, M. (1988). Decreasing effect of honey on hydroxy acids in royal jelly products.
Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 29, 297–300 (in Japanese).
47. Matsuka, M., & Nakamura, J. (1990). Oxytetracycline residues in honey and royal jelly.
Journal of Apicultural Research, 29, 112–117
48. Matsuka, M., 1993. Content of benzoic acid in Royal Jelly and propolis. Honeybee Sci. 14 (2),
79–80.
49. Mărghitaş L. A., 2005, Albinele şi produsele lor, Ed. Cres, Bucureşti.
50. Melliou, E., Chinou, I., 2005. Chemistry and bioactivity of Royal Jelly from Greece. J. Agric.
Food Chem. 53, 8987–8992, http://dx.doi.org/10.1021/jf051550p.
51. Messia, M. C., Caboni, M. F., & Marconi, E. (2005). Storage stability assessment of
freezedried royal jelly by furosine determination. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53,
4440–4443
52. Morita, H., Ikeda, T., Kajita, K., Fujioka, K., Mori, I., Okada, H., Uno, Y., Ishizuka, T.,
2012. Effect of Royal Jelly ingestion for six months on healthy volunteers. Nutr. J. 11, 77,
http://dx.doi.org/10.1186/1475-2891-11-77
53. Moriyama, T., Ito, A., Omote, S., Miura, Y., & Tsumoto, H. (2015). Heat Resistant
Characteristics of Major Royal Jelly Protein 1 (MRJP1) Oligomer. PLOS ONE, 10(5), e0119169.
54. Nabas, Z.M.O.Y., Haddadin, M.S.Y., Nazer, I.K., 2014. The influence of Royal Jelly addition
on the growth and production of short chain fatty acids of two different bacterial species isolated
from infants in Jordan. Pak. J. Nutr. 13, 43–49, http://dx.doi.org/10.3923/pjn.2014.43.49
55. Nagai, T., Inoue, R., 2005. Preparation and the functional properties of water extract and alkaline
extract of Royal Jelly. Food Chem. 84, 181–186, http://dx. doi.org/10.1016/S0308-
8146(03)00198-5
56. Nazzi, F., Bortolomeazzi, R., Della Vedova, G., Del Piccolo, F., Annoscia, D., Milani, N.,
2009. Octanoic acid confers to Royal Jelly varroa-repellent properties. Naturwissenschaften 96
(2), 309–314, http://dx.doi.org/10.1007/s00114-008- 0470-0
57. Oka H., Emori Y., Kobayashi N., Hayashi Y., Nomoto K. (2001) Supression of allergic
reactions by royal jelly in association with the restoration of macrophage function and
improvement of Th1/Th2 cells responses. International Immunopharmacology 1, 521-532
58. Okamoto, I., Taniguchi, Y., Kunikata, T., Kohno, K., Iwaki, K., Ikeda, M., & Kurimoto, M.
(2003). Major royal jelly protein 3 modulates immune responses in vitro and in vivo. Life
Sciences, 73(16), 2029-2045.
59. Popescu N., S. Meica, 1997, Produsele apicole şi analiza lor chimică. Ed. Diacon Coresi,
Bucureşti.
60. Ramadan, M.F., Al-Ghamdi, A., 2012. Bioactive compounds and health-promoting properties of
Royal Jelly: a review. J. Funct. Foods 4, 39–52, http://dx.doi.org/ 10.1016/j.jff.2011.12.007
61. Rawhi M. A. Abdalla, 2012 Totul despre APITERAPIE, Editura ALL, București.
62. Sabatini Anna Gloria, G. L. Marcazzan, M. F. Caboni , S. Bogdanov, Ligia Bicudo de
Almeida-Muradiana, 2009, Quality and standardisation of Royal Jelly, Journal of ApiProduct
and ApiMedical Science 1(1): 1-6.
63. Scarselli, R., Donadio, E., Giuffrida, M.G., Fortunato, D., Conti, A., Balestreri 2005. Toward
Royal Jelly proteome. Proteomics 5, 769–776, http://dx.doi.org/10.1002/pmic.20040114.
64. Scharlaken, B., de Graaf, D., Goossens, K., Peelman, L., & Jacobs, F. (2008). Differential
gene expression in the honeybee head after a bacterial challenge. Developmental & Comparative
Immunology, 32(8), 883-889
65. Schmitzová J., Klaudiny J., Albert Š., Schröder W., Schreckengost W., Hanes J., Šimúth J.
(1998) A family of major royal jelly proteins of the honeybee Apis mellifera L. Cell Mol. Life.
Sci. 54, 1020-1030
66. Schonleben, S., Sickmann, A., Mueller, M. J., & Reinders, J. (2007). Proteome analysis of
Apis mellifera royal jelly. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 389, 1087–1093
67. Serra Bonvehi J. (1991) Study of adulteration of royal jelly with other honey bee products and
water, Prod. Sanidad Anim. 6, 99–111
68. Shen, L., Liu, D., Li, M., Jin, F., Din, M., Parnell, L.D., Lai, C.Q., 2012. Mechanism of action
of recombinant Acc-Royalisin from Royal Jelly of Asian honeybee against gram-positive
bacteria. PLoS One 7, 10, http://dx.doi.org/10.1371/ journal.pone.0047194
69. Simuth, J. (2001). Some properties of the main protein of honeybee (Apis mellifera) royal jelly.
Apidologie, 32, 69–80.
70. Simuth, J., Bilikova, K., Kovacova, E., Kuzmova, Z., & Schroder, W. (2004).
Immunochemical approach to detection of adulteration in honey: Physiologically active royal
jelly protein stimulating TNF-alpha release is a regular component of honey. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 52, 2154–2158.
71. Srisuparbh, D., Klinbunga, S., Wongsiri, S., & Sittipraneed, S. (2003). Isolation and
characterization of major royal jelly cDNAs and proteins of the honey bee (Apis cerana). Journal
of Biochemistry and Molecular Biology, 36, 572–579.
72. Takenaka T. (1982) Chemical composition of royal jelly. Honeybee Sci. 3, 69-74
73. Tamura, S., Amano, S., Kono, T., Kondoh, J., Yamaguchi, K., & Kobayashi, S. et al. (2009).
Molecular characteristics and physiological functions of major royal jelly protein 1 oligomer.
Proteomics, 9(24), 5534-5543.
74. Terada, Y., Narukawa, M., Watanabe, T., 2011. Specific hydroxy fatty acids in Royal Jelly
activate TRPA1. J. Agric. Food Chem. 59, 2627–2635, http://dx.doi.org/10. 1021/jf1041646
75. Tonks A., Cooper R. A., Price P. C., Molan P. C., Jones K. P. (2001) Stimulation of TNFα-
release in monocytes by honey. Cytokine 14, 240-242
76. Tsao W., Shuel R. W. (1968) Breakdown of royal jelly protein in the midgut of the larval
honeybee. J. Apic. Res. 7 119-128
77. VECCHI, M A; SABATINI, A G; NANETTI, A; MARCAZZAN, G L; ROSSO, G;
BENFENATI, L; QUARANTOTTO, G (1993) Sali minerali nel nutrimento larvale di api
regine e operaie (Apis mellifera ligustica Spinola). Apicoltura 8: 39-54.Royal Jelly and Bee
Brood: Harvest, Composition, Quality (PDF Download Available). Available
from:https://www.researchgate.net/publication/304012318_Royal_Jelly_and_Bee_Brood_Harves
t_Composition_Quality [accessed Jun 1, 2017].
78. Wu, G., Li, Y., Liu, G., 1991. The immunoregulative effect of Royal Jellyacid, 778. Zhongguo
Yaoke Daxue Xuebao 22, 117–118.
79. Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395
80. Zhoua, J., Zhoua, J., Xue, X., Zhang, J., Chen, F., Li, Y., Wu, L., Li, C., & Mi, J . (2009).
Hydrophilic interaction chromatography/ tandem mass spectrometry for the determination of
melamine in royal jelly and royal jelly lyophilized powder. Journal of Chromatography. B, 877,
4164–4170.
81. ***-http://www.casabio.ro/laptisor-de-matca-apilarnil/eco-laptisor-de-matca-romanesc-casabio-
10gr.html )