Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
2
PARTEA I
STUDIU
BIBLIOGRAFIC
3
1. Date actuale privind proprietăţile morfobiologice ale speciei Fusobacterium
necrophorum şi infecţiile pe care le poate determina
Genul Fusobacterium grupează mai mult de 20 de specii, dintre care pentru medicina
veterinară importanţă prezintă specia Fusobacterium necrophorum.
Primele izolări şi descrieri au fost făcute de Bang (1890, 1981) şi Schmorl (1891).
În anul 1923 Knorr îl propune ca gen pentru a încadra bacteriile Gram negative
anaerobe, cu extremităţile efilate, iar Prevot, în 1938, propune genul Sphaerophorus
pentru încadrarea germenilor Gram negativi, anaerobi, polimorfi, nefuziformi, cu aspect
frecvent filamentos. (76, 82)
În perioada 1962-1972, cele două genuri sunt unificate, păstrându-se denumirea de
Fusobacterium.
De la primele cercetări şi până astăzi pentru specia Fusobacterium necrophorum
au fost făcute mai multe descrieri şi a fost cunoscută sub mai multe denumiri.
În 1903, Jensen semnalează pentru denumirea microorganismului sinonimele:
Bacillus necrophorum (Fugge), Streptothrix cuniculi (Schmorl), Streptothrix
necrophorum (Kitt). În plus faţă de denumirile semnalate de Jensen, Cesari în 1924 mai
adaugă altele: Bacillus necrosus (Jensen), Corynebacterium necrophorum (Lechmann şi
Neumann).
În 1957, Wilson şi Niles îl numesc Fusiformis necrophorum, în timp ce Prevot în
„Manual de Classification des Bacteries Anaerobies" propune denumirea de
Sphaerophorus necrophorus pentru tulpinile izolate din infecţiile umane.
Majoritatea autorilor consideră că bacilul necrozei a fost observat pentru prima
oară în anul 1884 de către Friederich Loffler, în leziunile viţeilor cu difterie de unde a şi
fost izolat. (78, 83)
Jensen susţine că R. Koch, în lucrarea „Yur Untersuchung von Patchognen
Organismen", descrie şi prezintă în două figuri aspectele unui microorganism izolat din
ulcer cornean al unei oi bolnave de variolă care prezintă o asemănare atât de mare cu
bacilul necrozei, încât identitatea lor cu aceasta nu poate fi confundată.
La noi în ţară profesorul Stamatin precizează că, în 1877 Damann, descrie o boală
a viţeilor caracterizată prin apariţia de ulcere şi necroze întinse la nivelul cavităţii bucale
şi nazale, cu formarea de abcese şi necroze în pulmon, motiv pentru care, probabil,
4
Katitch consideră că bacilul necrozei a fost descoperit de Damann în 1884, şi bine studiat
de Loffler. (citat de 79)
În 1981 Greorg Schmorl descrie prezenţa bacilului necrozei la iepure.
În 1934 Beveridge izolează bacilul necrozei din abcesele ficatului de la bovine şi
din infecţiile maxilare de la canguri, iar Marsh şi Thunnicliff îl găsesc prezent în număr
mare şi ca microorganism predominant la numeroase oi cu leziuni podale.
Iniţial specia a fost divizată în două subspecii:
♦ Fusobacterium necrophorum subspecia necrophorum;
♦ Fusobacterium necrophorum subspecia fundiliforme.
După remanierile taxonomice efectuate în 1990, subspecia necrophorum este divizată în
trei biovaruri:
♦ Fusobacterium necrophorum biovar A (hemaglutinant şi hemolizant) care intervine în
producerea pododermatitei infecţioase în asocieri cu Dichelobacter nodosus;
♦ Fusobacterium necrophorum biovar B (nehemaglutinant, dar hemolizant) care
provoacă abcese şi necroze în organele interne, pe piele şi mucoase, la diferite specii de
animale;
♦ Fusobacterium necrophorum biovar C (nehemaglutinant şi nehemolizant) care este
nepatogen şi care ar constitui o specie nouă (Fusobacterium pseudonecrophorum).
După reconsiderarea nomenclaturii acestei bacterii din anii 1990 şi 1991, Comisia
Internaţională de Sistematică Bacteriană a stabilit în cadrul speciei Fusobacterium
necropforum existenţa a două subspecii:
♦ Fusobacterium necrophorum subspecia necrophorum, care încadrează toate tulpinile
ce au aparţinut fostului biotip A;
♦ Fusobacterium necrophorum subspecia fundiliforme, care încadrează tulpinile ce au
aparţinut fostului biotip B.
Pentru subspecia pseudonecrophorum a fost creată o specie nouă denumită F.
pseudonecrophorum, constituită din tulpini care au aparţinut fostului biotip C.
În 1903, Baley şi Love prin cercetările efectuate au făcut ca aceeaşi comisie să
admită sinonimia dintre Fusobacterium pseudonecrophorum şi F. varium, astfel încât, în
prezent, în cadrul speciei Fusobacterium necrophorum sunt recunoscute doar două
subspecii: subspecia necrophorum şi subspecia fundiliforme, ambele încriminate în
determinarea necrobacilozei. (8, 14,15)
5
Printre numeroşi cercetători români care şi-au adus contribuţii în acest domeniu, se
numără: Gluhovschi şi col. (1949), Cealan şi col. (1956), Volintir şi col.(1960),
Ungureanu (1965), Ţogoe (1977), etc.
Bacilul necrozei este un epifit al organismului animal. Sediul obişnuit al său este tubul
digestiv şi mucoasa bucală şi genitală a ierbivorelor şi omului.
Existenţa bacilului necrozei în afara organismului animal nu trebuie însă exclusă.
În 1938 Tunnicliff, (citat de 77) ocupându-se de pododermatita oilor, face si o serie
de investigaţii privând existenţa, dar mai ales rezistenţa bacilului necrozei în sol şi
bălegar. Pe baza rezultatelor obţinute, autorul conchide ca acest microorganism nu poate
fi considerat o bacterie telurică, contagiul realizându-se numai prin contactul direct dintre
oile sănătoase şi cele bolnave.
Spre deosebire de Tunnicliff, Kobernikm 1954 afirmă că a izolat bacilul necrozei din
podzolul de pădure si din mlaştini, chiar la 60 de zile de la contaminarea lui cu material
patologic, în condiţii artificiale. Acelaşi autor constată că în solurile artificial
contaminate şi apoi acoperite cu fecale de cal, microorganismul rămâne în stare vie timp
de 75 de zile.
În anul 1963, Fievez nu reuşeşte, din 18 probe de sol recoltate de pe păşuni, să
izoleze nici o tulpină de Fusobacterium necrophorum, iar din 12 probe de bălegar, în
descompunere, izolează o singură tulpină.
Acelaşi Fievez izolează din 26 de probe de materii fecale recoltate de la bovine, 5
tulpini de Fusobacterium necrophorum, iar din 31 probe recoltate de la porc reuşeşte să
izoleze 10 tulpini. Din cele 19 probe de fecale de găină şi 35 probe de fecale de
porumbel, autorul nu izolează nici o tulpină de bacii al necrozei, iar din cele 17 probe de
conţinut ruminal recoltat de la bovine izolează o singură tulpină de Fusobacterium
necrophorum.
De asemenea, autorul izolează deseori bacilul necrozei din amestecul de bălegar şi
pământ care se depozitează în spaţiul interdigital al bovinelor şi în copita calului. (6, 21)
6
1.3 Principalele caracteristici morfobiologice ale speciei Fusobacterium
necrophorum
Deşi a fost descris de mult timp (1884 F. Lofler), Fusobacterium necrophorum ridică
şi astăzi numeroase probleme în patologia veterinară datorită biologiei ei complexe şi
dificultăţilor de izolare în cultura pură, din leziunile deschise ce conţin o flora bacteriană
variată. (80, 84)
Polimorfismul bacteriei demonstrează plasticitatea şi capacitatea ei de a se adapta mai
bine la diverse medii biologice.
Primele date cu privire la morfologia bacilului necrozei au fost furnizate de către
Schmorl care în 1891 descrie bacteria, semnalând existenţa unor forme scurte, pe care le
considera mobile, şi a unor forme filamentoase cu o lungime ce atingea uneori chiar
100µ.
El observă că, în urma colorării cu albastru de metilen, mai ales filamentele, reţin în
mod neuniform colorantul.
Cathala este primul care descrie la Fusobacterium necrophorum prezenţa formelor
streptobacilare, iar Phamhunchi semnalează prezenţa formelor sferice în culturile din
mediile lichide.
Jonsen şi Thjotta (1984) desemnează bacilul necrozei cu numele de Fusobacterium
necrophorum şi îl caracterizează ca fiind un germen extrem de polimorf, predominând
însă forma de filamente. În lungimea filamentelor se găsesc formaţii globuloase mari.
Bacteria este imobilă, necapsulată şi nesporulată.
Cea mai completă descriere morfologica a fost făcuta de către Fievez în 1963.
Referindu-se la aspectul morfologic al bacteriei în cultură, autorul subliniază că celulele
de Fusobacterium necrophorum prezintă un aspect mai uniform atunci când sunt
cultivate pe medii solide, pe când în mediile lichide polimorfismul este mult mai
accentuat.
Toate tulpinile studiate de autor se prezentau sub formă de bacili gram negativi,
imobili, nesporulaţi, neramificaţi, lipsiţi de capsulă şi foarte polimorfi.
În cadrul speciei autorul deosebeşte două tipuri morfologice:
7
tulpinile care formează în cultură bacili scurţi, lungi şi filamente, în proporţii
variabile, care prezintă granulaţii metacromatice abundente şi constante, prezenţa
formelor sferice fiind mai rară şi numai dacă incubaţia este prelungită;
tulpinile care formează în culturi bacili de lungimi variabile, obişnuit mai scurţi,
lipsiţi de granulaţii metacromatice, însoţiţi deseori de forme ovoide colorate
bipolar. Nici un autor, cu excepţia lui Schmorl, nu considera ca Fusobacterium
necrophorum prezintă cili.
În condiţii optime de mediu culturile ating dezvoltarea maximă după 2-4 zile de
incubaţie la 37C.
La noi în ţară, Ţogoe (81), recomandă ca mediile speciale, mediul Rosenow cisteinat
şi mediul VL glucozat 2% medii utilizate pentru cultivare. Mediul VL (viande-levure) de
bază are următoarele compoziţii:
8
> peptona tripsică..........................................10g;
> clorură de sodiu..........................................5g;
> extract de carne..........................................3g;
> extract de drojdie........................................5g;
> clorhidrat de cisteină...................................4g;
> agar pudră..................................................0,6g;
> apă de robinet............................................1000ml.
Mod de preparare:
Se dizolvă peptona, clorura de sodiu, extractul carne şi extractul de drojdie prin fierbere,
se ajustează pH-ul la 7,2-7,4 se aduce din nou la temperatura de fierbere şi apoi se adaugă
clorhidratul de cisteină şi agarul. Se repartizează în tuburi şi se sterilizează la 120C timp
de 20 minute. Plecând de la acest mediu se poate prepara:
9
4. Mediul cu ou pentru evidenţierea producţiei de lecitinază:
• mediul VL de bază................1000ml;
• glucoză.........................................2g;
• agar............................................20g;
Cesari preciza în 1924, că după dezvoltarea în medii lichide care conţin glucoza,
bacilul necrozei produce o cantitate apreciabilă de gaz.
Beveridge, Lahelle, Prevot, Beerens, constată că anumite tulpini se dezvoltă numai
la partea inferioară a mediului sub forma unui sediment flocos, restul mediului rămânând
12
limpede. Cultivate pe medii lichide se constată că unele tulpini produc un sediment
floconos, iar altele tulbură uniform mediul.
În mediul VL glucozat lichid, dezvoltarea germenilor este abundentă, din mediu
se ridică la suprafaţă numeroase bule de gaz care formează un guler gros de spumă albă.
Bulionul se tulbură puternic, germenii se depun în partea inferioară a tubului şi
formează un depozit floconos, alb-murdar. Uneori, dezvoltarea este atât de abundentă
încât depozitul de germeni se ridică până la jumătate din volumul mediului.
În mediul VL lichid, cu adaos de ser normal de cal, Fusobacterium necrophorum
se dezvoltă în 18-24 ore cu producţie de gaz. După 48 ore de incubaţie la suprafaţa
mediului se formează o peliculă fină, culturile emanând un miros dezagreabil.
În 1965 Fievez studiind caracterele culturale în medii lichide demonstrează că
toate tulpinile care nu tulbură bulionul aparţin tipului cultural B, iar cele care îl tulbură
uniform aparţin tipului A, AB sau C.
13
are un diametru egal sau chiar dublu diametrului coloniei. Dacă incubaţia este prelungită
coloniile prezintă un reflex albăstrui metalic sclipitor.
Coloniile de tip B foarte bombate, aproape sferice, gălbui, cu conturul mai regulat
cu diametrul de 1-2mm şi mai aderente la mediu. Dezvoltarea lor este mai lentă, iar zona
de hemoliză este mai puţin intensă ca la tipul „A", uneori limitându-se la suprafaţa
ocupată de colonie. Coloniile se ridica în totalitate de pe suprafaţa mediului şi au o
consistenţă mai mare decât cele de tipul I.
Zona de hemoliză este de 1-2mm dar se măreşte pe măsura timpului de incubaţie.
Atât tulpinile proaspăt izolate din procese patologice de la animale cât şi cele
păstrate în colecţie pot forma colonii cu aspect intermediar între cele două tipuri descrise.
Miyazoto în 1978 demonstrează ca atât tulpinile „A" cat şi „B" posedă fimbrii.
(citat de 47)
15
În cadrul structurii sale se deosebesc, după cum este bine cunoscut la o celulă, de
la exterior către interior, următoarele componente:
învelişul celular
La bacilul necrozei învelişul celular este constituit din perete celular şi membrana
citoplasmatică.
Peretele celular, situat în partea externă a celulei apare în majoritatea
microfotografiilor uşor ondulat. Numeroşi autori semnalează la alte specii Gram negative
anaerobe, aspecte asemănătoare şi consideră că acestea se datorează unei consistenţe mai
puţin dense a straturilor exterioare.
Peretele celular are în totalitate o grosime de aproximativ 210 daltoni şi este
constituit dintr-o alternanţă de straturi electronoopace şi electronotransparente inegale ca
grosime.
Ultrastructura peretelui celular al bacilului necrozei pare să fie foarte
asemănătoare cu cea a celulei E. coli, la care De Petris (citat de 16) deosebeşte:
un strat extern triplu stratificat (membrana L), probabil de natură
lipoproteică sau lipozaharidică, gros de 50-55 daltoni, constituit din două
straturi electrodense de 15-20d, separate de un spaţiu transparent de aceeaşi
grosime;
stratul G, situat imediat sub cel extern, electronoopac, gros de 50-55
daltoni, omogen sau alcătuit din elemente globulare, probabil de natură
proteică, de forma turtită cu diametrul longitudinal de 120-140 daltoni şi
grosimea de 50-55 daltoni
stratul M electronotransparent, gros de 40-45 daltoni, care separă peretele
celular de membrana citoplasmatică şi este constituit din mucopeptide.
Lucrările de microscopie electronică care combină studiile electronomicroscopice
cu studiile prin raze X admit ipoteza conform căreia peretele celular al
enterobacteriaceelor are în general o grosime de 144 daltoni şi este constituit din
mucopeptide, care vin în contact direct cu membrana citoplasmatică, iar cel de-al doilea
de 92 daltoni lăţime, mai puţin rigid decât primul, constituit din lipozaharide şi
lipoproteine.
16
Fig. 1
Structura învelişurilor la Sphaerophorus necrophorus
(P = perete celular Mc = membrana citoplasmatică C = citoplasmă)
Conţintul celulei
17
dispoziţie ce depind de stadiul fiziologic al celulei. Insulele par a fi constituite dintr-o
împletitură de fibre fine.
a. Proprietăţi proteolitice
c. Activitatea glucidolitică
19
şi de asemenea, nu se poate stabili o corelaţie directă între originea animală sau umană a
tulpinilor şi fermentarea glucidelor.
În general, Fusobacterium necrophorum metabolizează glucoza, maltoza, lactoza,
galactoza, zaharoza, levuloza, manoza, sorboza. (2, 25, 27, 60, 71, 74, 77)
Glucidul cel mai atacat este maltoza, iar cel mai puţin atacat zaharoza.
d. Producţia de indol
Este constantă la tulpinile hemolitice şi variabilă la cele nehemolitice. (61, 71, 73)
g. Activitate hemaglutinantă
20
totalitate şi totdeauna numai de tulpinile de tip „A" şi „AB", în timp ce tulpinile de tip
„B" dau rezultate negative, iar cele de tip „C" se comportă variabil.
Ţogoe pe baza studiilor privând comportamentul faţă de globulele roşii de pasăre,
arată că toate tulpinile care determină aglutinare, produc în mediul lichid turbiditate
uniformă, iar pe agar colonii aparţinând tipului cultural I.
1.7 Patogenitate
22
Langworth în 1977 a demonstrat că Fusobacterium necrophorum elaborează un
principiu toxic care acţionează în special asupra fagocitelor, favorizând grefarea bacilului
necrozei şi a altor microorganisme la nivelul ţesuturilor. (49)
Prin tehnici de imunoelectroforeză, Fievez demonstrează că tulpinile umane şi
animale de Fusobacterium necrophorum de tip „A" produc o exotoxină identică, capabilă
să omoare şoarecele, să hemolizeze globulele roşii şi să tulbure suspensia de gălbenuş de
ou. Aceste trei proprietăţi sunt determinate de două grupe de substanţe termolabile
(fracţiunile B) evidenţiabile prin tehnicile de electroforeză, susceptibile de a fi
neutralizate cu antiseruri preparate prin imunizarea iepurilor. Tulpinile umane şi animale
de tip „B" produc fracţiunea B şi niciodată fracţiunea A autorul consideră că fracţiunea A
este responsabilă în cea mai mare măsură de puterea toxică pe care o manifestă bacteria
atât „în vitro"cât şi „în vivo"asupra globulelor roşii şi suspensiilor de gălbenuş de ou.
Cercetând proprietăţile hemaglutinante ale bacilului necrozei, Fievez face o serie
de constatări foarte interesante dovedind că la Fusobacterium necrophorum
hemaglutininele nu pot fi izolate, fiind inseparabile de structurile celulelor bacteriene.
De asemenea, el dovedeşte că există o corelaţie directă între prezenţa
hemaglutininelor, patogenitatea pentru animale de laborator şi puterea hemolitică a
bacteriei.
Ţogoe, (80) examinând efectul toxic al filtratelor şi extractelor culturilor de
Fusobacterium necrophorum ajunge la următoarele concluzii:
supernatantul culturilor de Fusobacterium necrophorum conţine substanţe
capabile să producă liza globulelor roşii de găina şi să opacifieze suspensia
de gălbenuş de ou;
substanţele toxice specifice, existente în supematant, pot fi concentrate prin
precipitare cu sulfat de amoniu;
supernatantul culturilor obţinute din tulpini de tip I conţin o cantitate mai
mare de exotoxină decât cele aparţinând tipului cultural II;
substanţele toxice din supernatantul concentrat produc moartea şoarecelui
alb, prin injectarea intraperitoneală şi intravenoasă;
caracterul termolabil al substanţelor toxice din supematant s-a demonstrat
prin încălzire la 100C timp de 10 minute, observându-se că după încălzire,
acţiunea toxică a supernatantelor dispare;
toxinele au acţiune hemolitică şi lecitinazică.
23
Aşa cum se constată, specia Fusobacterium necrophorum elaborează în cursul
metabolismului său o serie de substanţe cu acţiune toxică (1, 39, 43, 46), ce justifică
acţiunea ei patogenă, dar cu toate acestea factorii predispozanţi intervin în etiopatogenia
infecţiilor într-o oarecare măsură mult mai mare comparativ cu alte infecţii. Dintre
aceştia, cei mai importanţi sunt: umiditatea aşternutului, lipsa de igienă a ongloanelor şi,
cu un caracter mai general, toate deficienţele de igienă corporală şi a adăposturilor.
28
PARTEA II-a
CERCETĂRI
PERSONALE
29
2.1. Material şi metodă
2.1.1. Materiale
2.1.1.1. Probe prelucrate
Tabelul 1
Gruparea probelor de material necrotic recoltat în scopul izolării speciei
Fusobacterium necrophorum în funcţie de localizarea procesului infecțios
Drept anterior 4
Drept posterior 23
Stâng posterior 19
Total probe 52
30
1. Mediul VL lichid
Compoziţie chimică:
- peptonă tripsică................l0g
- clorură de sodiu.................5g
- extract de carne..................3g
- extract de levuri.................5g
- glucoza..............................2g
- clorhidrat de cisteină.......0,4g
- apă distilată...............l000ml
pH7,2
Mod de preparare:
În apă distilată se solubilizează, prin fierbere, toate ingredientele, se ajustează pH-
ul la valoarea 7,2 - 7,4, după care se supune fierberii. Se filtrează prin vată şi se
repartizează, câte 10 ml, în eprubete curate şi uscate. Se înfundă cu dopuri şi se
sterilizează prin autoclavare, la 112°C, timp de 20 minute.
2. Agar VL
La 1000 ml bulion VL, preparat ca la punctul 1, se adaugă 20g agar fibre. După
solubilizarea agarului, prin fierbere, se filtrează prin vată, se repartizează, câte 12ml, în
eprubete şi se sterilizează prin autoclavare, la 112°C, timp de 20 minute.
Mod de preparare:
În apă distilată se solubilizează, prin fierbere, toate ingredientele, cu excepţia
agarului, se ajustează ph-ul la valoarea 7,4, după care în mediul cald se introduc fibrele
de agar mărunţite, se solubilizează prin fierbere, se filtrează prin vată. Se repartizează în
baloane Erlenmayer, în cantitate de l000 ml şi se sterilizează prin autoclavare la 112°C,
timp de 30 minute.
În momentul folosirii, mediul se topeşte, în baie de apă, se răceşte la 45-50°C şi se
amestecă cu l00 ml dintr-o soluţie, încălzită la 50°C, cu următoarea compoziţie:
- verde briliant................0,04g %o;
- azidă de sodiu.................0,6g %o.
După omogenizare, la amestecul obţinut se mai adaugă sânge de cal, în
concentraţie finală de 3 %, după care se repartizează în plăci Petri.
32
Mod de preparare:
În apă distilată se solubilizează prin fierbere toate ingredientele, cu excepţia
agarului fibre. Se ajustează pH-ul la valoarea 7,4, după care se adaugă agarul şi se
solubilizează prin fierbere. Se filtrează prin vată şi se repartizează în baloane Erlenmayer,
câte 100 ml/balon. Se sterilizează prin autoclavare, la 112°C, timp de 30 minute.
În momentul folosirii se topeşte mediul în baie cu apă, se răceşte la 45-50°C şi se
amestecă cu 10 ml emulsie de gălbenuş de ou, obţinută după cum urmează: oul de găină
proaspăt, se spală cu detergent sub jet de apă călduţă, se introduce pentru 5 minute în
alcool sanitar, iar după uscarea cochiliei se separă gălbenuşul de albuş. Gălbenuşul se
introduce într-un balon Erlenmayer steril, în care se găsesc perle de sticlă. Se adaugă 25
ml soluţie fiziologică sterilă şi se omogenizează.
Amestecul obţinut se repartizează în plăci Petri.
6. Hematii de găină
7. Lapte turnesolat
Lapte proaspăt muls, degresat prin centrifugare, 100 ml, la care se adaugă 0,08g
clorhidrat de cisteină şi soluţie apoasă de turnesol 10%, până se obţine o culoare violet
deschis. Laptele se repartizează în eprubete Wasserman şi se sterilizează prin fierbere, de
3 ori consecutiv. Ia interval m 24 ore. Mediul astfel obţinut se păstrează la frigider până
la utilizare. îninte de folosire, se regenerează prin fierbere în baie cu apă.
33
8. Agar pentru evidenţierea producţiei de hidrogen sulfurat
- bulion VL ...............100 ml
- sulfat feros...................0,02g
- hiposulfit de sodiu.................0,03g
- agar VL fierbinte...............5 ml
- bulion VL ...................100 ml
- glucoză............................0,2g
- nitrat de sodiu..................0,5g
34
2.1.2. Tehnica de lucru
Fig. 1.
Chiuretă din sârmă inoxidabilă pt recoltarea probelor
35
2.1.2.2. Pregătirea probei în vederea prelucrării
În laborator, proba recoltată era descărcată într-un mojar steril. Peste aceasta se
adăugau 1-2 ml de bulion VL regenerat şi răcit, astfel încât, după mojarare să se obţină o
suspensie omogenă, de consistenţa smântânei.
Fig.2.
Pregătirea probei în vederea prelucrării
Din suspensia obţinută se executau mai multe frotiuri, care după uscare şi fixare
erau menţinute la temperatura laboratorului în vederea colorării prin metoda Gram şi cu
albastru de metilen.
Concomitent se realizau, folosind pipeta Pasteur, însămânţări în bulion VL
glucozat 0,2%, care în prealabil a fost regenerat prin fierbere şi răcit, precum şi
însămânţări cu acul de însamânţare, pe surpafaţa agarului VL cu sânge de cal, verde
briliant şi azidă de sodiu, folosind pentru fiecare probă cel puţin 2 plăci Petri. Pentru
unele probe au fost deasemenea efectuate, după aceiaşi tehnică şi însămânţări pe agar VL
cu emulsie de gălbenuş de ou.
Mediile însămânţate, după individualizare, indiferent de tipul lor, erau incubate în
condiţii de anaerobioză, la 37°C, timp de 48-72 ore şi examinate zilnic.
36
Pentru oţinerea anaerobiozei, în cazul mediilor însămânţate în suprafaţă, s-a folosit
procedeul cu piragalol alcalin, conform următoarei tehnici: extemporaneum se prepară
amestecul reducător constituit din 5 g pământ de infuzori, l g piragalol şi 1g carbonat de
potasiu. După omogenizare prin mojarare, din amestec se depuneau aproximativ 2 g într-
un pliculeţ confecţionat din hârtie de filtru, care după închidere, era fixat pe capacul
plăcii însămânţate prin intermediul unor fâşii de leucoplast, apoi placa ce conţinea mediul
de cultură însămânţat, era răsturnată peste pliculeţul cu amestec reducător, iar marginile
plăcii erau închise ermetic cu ajutorul parafinei topite (vezi figura 3)
37
Coloniile prezumtiv considerate a aparţine speciei Fusobacterium necrophorum
erau transplantate, sub lupă, cu acul de însamânţare, în bulion VL glucozat 0,2%, cu
adaus de ser de cal 1%.
Culturile obţinute, erau verificate, privind puritatea, prin examen bacterioscopic,
folosind metoda de colorare Gram şi apoi supuse operaţiei de identificare.
38
39
40
Rezultate şi discuţii
Caractere morfologice
41
Toate tulpinile studiate au fost Gram negative, necapsulogene, nesporogene,
neciliate, fără un mod caracteristic de grupare atât în frotiurile din materialul patologic
cât şi în cele din culturi.
La examenul frotiurulor colorate prin metoda Gram, mai ales când acestea erau
efectuate din materialul necrotic, formele filamentoase se colorau neuniform, având
aspectul "şinelor de cale ferată" (zone intens colorate ce alternează cu zone necolorate)
Fig.4.
Frotiu din cultură de F. necrophorum în bulion VL, coloraţie Gram
Caractere culturale
43
Caractere biochimice
Rezultat
Dezvoltarea pe agar VL cu
0
2. sânge, verde briliant şi azidă de 36 00 0
0
sodiu,în anaerobioză
0
3. Producţia de indol 36 00 0
0
Hemoliză adevărată ce depăşea 0
4. 32 4
diametrul coloniei 0
5. Producţie de H2S 36 00 0 0
1
6. Hidroliza gelatinei 0 0 36
100
1
7. Reducerea nitratilor în nitriti 0 0 36
100
8. Aglutinarea hematiilor de găină 32 4
44
Pe baza rezultatelor obţinute, în conformitate cu datele de literatură şi cu
precizările din "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" se poate aprecia că din
cele 36 tulpini de Fusobacterium necrophorum examinate, 32 au aparţinut subspeciei
necrophorum, iar 4 subspeciei funduliforme.
45
Concluzii
În perioada ianuarie 2011 - mai 2013 au fost recoltate şi prelucrate, prin examene
bacteriologice complexe, 52 de probe material necroticopurulent de la bovine cu leziuni
de pododermatită infecţioasă, în scopul izolării şi identificării speciei Fusobacterium
necrophorum. Ansamblul investigaţiilor întreprinse permit formularea următoarelor
concluzii:
3. Specia Fusobacterium necrophorum a fost izolată în cultură pură din 24 din cele
52 probe de material prelucrate.
47
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Amoako KK., Goto Y., Misawa N., Xu DL., Shinjo T., 1997 - Interactions
between Fusobacterium necrophorum hemolysin, erythrocytes and erythrocyte
membranes. FEMS Microbiology Letters. 150(l):101-6.
2. Amoako KK., Goto Y., Shinjo T., 1993 - Comparison of extracellular enzymes
of Fusobacterium necrophorum, subsp. necrophorum and Fusobacterium
necrophorum subsp. funduliforme. J clin. Microbiol., 31,2244.
3. Amoako KK., Goto Y., Misawa N., Xu DL., Shinjo T., 1998- The erythrocyte
receptor for Fusobacterium necrophorum hemolysin: hosphatidylcholine as a
possible candidate. FEMS Microbiology Letters. 168(l):65-70, Nov 1.
4. Băieş I., Băieş A, Popovici A, Mircescu Gh., Leancu M., Creţeanu C, 1956-
Observaţii asupra tratamentului necrobacilozei ovine. Probi, vet, 1,29
5. Bekana M., Jonsson P., Ekman T., Kindahl H., 1994- Intrauterine bacterial
findings in postpartum cows with retained fetalmembranes. Zentralblatt fur
Veterinarmedizin-Reihe A. 41(9):663-70
7. Bercea L, Mardari, Al., Moga Manzat R., Pop M., Popoviciu A, 1981- Bolile
infecţioase ale animalelor, Bucureşti, EDP,
8. Gîrcă, E.D., 2010 – Clinical aspects of some podal diseases in bovine from
different breeding szsem, vol. 53 (12), Medicină Veterinară, partea a 3-a, Lucrările
simpozionului “Progress and Perspectives in Veterinary Medicine” Iaşi, 10-11
iunie 2010, Ed. Ion Ionescu de la Brad, p.703-707.
11. Celan B., Haroviuc S., 1958 - Cu privire la şchiopul oilor. Probi. zoot. şi vet, 8,
56.
12. Coman Em., Chivu H., Brebeanu M., 1967 - Contribuţii la studiul
necrobacilozei cutanate a porcilor. Rev. Zoot. şi Med. Vet., 8, 62.
13. H.Cook NB., Cutler KL., 1995 - Treatment and outcome of a severe form offoul-
in-the-foot. Veterinary Record. 136 (1): 19-20.
14. Fifis T., Costopoulos C, Vaughan JA., 1996 - Evidence for phospholipase B
activity in Fusobacterium necrophorum cultures and its association with
hemolysin /leucocidin activities. Veterinary Microbiology. 49(3-4):219-33.
16. Garcia MM., Becker SA., Brooks BW., Berg JN., Finegold SM., 1992 -
Ultrastructure and molecular characterizaţion of Fusobacterium necrophorum
biovars. Canadian Journal of Veterinary Medicine. 56(4):318-25,
17. Hermansson K. Perry MB. Altman E. Brisson JR. Garcia MM., 1993 -
Structural studies of the O-antigenic polysaccharide of Fusobacterium
necrophorum. European Journal of Biochemistry. 212(3):801-9.
49
19. Huzum V., Adăscăliţei V., 1982 - Eficacitatea unor medicamente folosite in
combaterea necrobacilozei ovine. Rev. de creştere a anim., 4, 48.
20. Itoh H., Motoi Y., Haritani M., Kobayashi M., Tamura K., Takase K.,
Oikawa S., 1997 - Immunohistochemical localization of alpha l-acid glycoprotein
in liver tissues of bovine fetuses, newborn calves and sick or healthy adult cattle.
American Journal of Veterinary Research. 58(7):725-8.
21. Jang SS., Hirsh DC, 1994 - Characterization, distribution and microbiological
associations of Fusobacterium spp. in clinical specimens of animal origin. Journal
of Clinical Microbiology. 32(2):384-7.
22. Kameyama Y., Kanoe M., Kai K., 1992 - Enzyme-linked immunosorbent assay
for the detection of Fusobacterium necrophorum antibody in bovine sera.
Microbios. 70(282):23-30.
23. Kanoe M., Hirabayashi T., Matsuoka Y., Inoue M., Uraoka Y., Taguchi S.,
Motoyoshi S., 1996 - Use of enzyme-linked-immunosorbent assay for detection of
IgG and IgM antibodies to Fusobacterium necrophorum in cattle. Microbios.
87(353):257-62.
24. Kanoe M., Toyoda Y., Shibata H., Nasu T., 1999 - Fusobacterium necrophorum
haemolysin stimulates motility of ileal longitudinal smoothmuscle of the guinea-
pig. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13(5):547-54.
50
27. Madsen M., Aalbaek B., Hansen JW., 1992 - Comparative bacteriological
studies on summer mastitis in grazing cattle and pyogenes mastitis in stabled
cattle in Denmark. Veterinary Microbiology. 32(1 ):81-8.
28. Mateos E., Piriz S., Valle J., Hurtado M., Vadillo S., 1997 - Minimum
inhibitory concentrations for selected antimicrobial agents against Fusobacterium
necrophorum isolated from hepatic abscesses in cattle and sheep. [Review] [24
refsj Journal of Veterinary Pharmacology & Therapeutics. 20(l):21-3.
29. Moga Mânzat R., 2001 - Boli infecţioase ale animalelor — Bacterioze. Ed.
Brumar, Timişoara.
30. Moga Mânzat R., Moldovan M., Vintilă Cornelia, 1984 - Pododermatitele
infecţioase ale rumegătoarelor. Ed. Ceres, Bucureşti.
31. Moldovan M., Moga Mânzat R., Boite S., Domnica Tătaru, 1986 - Bacteroides
nodosus isolated from cows with interdigital dermatitis. Lucr. Şt. LA. Timişoara,
XXI, 99.
32. Morgenstein AA., Citron DM., Finegold SM., 1981 - New medium selective for
Fusobacterium species and differential for Fusobacterium necrophorum. Journal
of Clinical Macrobiology. 13(4):666-69.
33. Motoi Y., Itoh H., Tamura K., Miyamoto T., Oohashi T., Nagasawa, 1992 - S.,
Correlation of serum concentration of alpha 1-acid glycoprotein with lymphocyte
blastogenesis and development of experimentally induced or naturally acquired
hepatic abscesses in cattle. American Journal of Veterinary Research. 53(4):574-
9.
34. Nagaraja TG., Beharka AB., Chengappa MM., Carroll LH., Raun AP.,
Laudert SB., Parrott JC, 1999 - Bacterial flora of liver abscesses infeedlot cattle
fed tylosin or no tylosin. Journal of Animal Science. 77(4):973-8.
51
35. Nagaraja TG., Chengappa MM., 1998 - Liver abscesses infeedlot cattle: a
review. [Review] [139 refs] Journal of Animal Science. 76(l):287-98.
36. Nagaraja TG., Sun Y., Wallace N., Kemp KE., Parrott CJ., 1999 - Effects of
tylosin on concentrations of Fusobactreium necrophorum and fermentation
products in the rumen of cattle fed a high-concentrate diet. American Journal of
Veterinary Research. 60 (9): 1061-5.
37. Narayanan S., Nagaraja TG., Okwumabua O., Staats J., Chengappa MM.,
Oberst RD., 1997 - Ribotyping to compare Fusobacterium necrophorum isolates
from bovine liver abscesses, ruminal walls, and ruminal contents. Applied &
Environmental Microbiology. 63 (12):4671-8.
38. Narayanan S., Stewart GC, Chengappa MM., Willard L, Shuman W.,
Wilkerson M., Nagaraja TG., 2002 - Fusobacterium necrophorum leukotoxinin
induces activation and apoptosis of bovine leukocytes. Infection & Immunity. 70
(8): 4609-20.
39. Narayanan SK, Nagaraja TG., Chengappa MM., Stewart GC, 2001 - Cloning,
equencing and expression of the leukotoxin gene from Fusobacterium
necrophorum. Infection & Immunity. 69 (9):5447-55.
40. Narongwanichgarn W., Kawaguchi E., Misawa N., Goto Y., Haga T., Shinjo
T. 2001 - Differentiation of Fusobacterium necrophorum subspecies from bovine
pathological lesions by RAPD-PCR. Veterinary Microbiology. 82(4):383-8.
41. Okada Y., Kanoe M., Okamoto K., Sakamoto K., Yaguchi Y., Watanabe, T.
2000 - Effects of Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum on
extracellular matrix of tissue-cultured bovine kidney cell. Microbios. 106 Suppl
2:89-95.
42. Okamoto K., Kanoe M., Watanabe T., 2001 - Collagenolytic activity of a cell
wall preparation from Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum.
Microbios. 106 Suppl 2:89-95.
52
43. Okwumabua O., Tan Z., Staats J., Oberst RD., Chengappa MM., Nagaraja
TG. 1996 - Ribotyping to differentiate Fusobacterium necrophorum subsp.
necrophorum and Fusobacterium necrophorum subsp. Funduliforme isolated
from bovine ruminai contents and liver abscesses. Applied & Environmental
Microbiology. 62(2):469-72.
44. Onet E., Cristea I., Cociu Al., 1982 - Studiu despre pododermatite. Rev. de
creşterea animalelor, p.4,53.
46. Papuc C, Pop A., Togoe I., Nicolae Şt, Şerban M., 1977 - Proprietăţile chimice
si biologice ale lipopolizaharidului la Fusobacterium necrophorum izolat de la
bovine cu necrobaciloză interdigitală. Al 7-lea Congres Naţional de Medicină
Veterinară, Voineasa.
47. Papuc C, Pop A.,Ţogoe I., Şerban M., Cornila N, Diaconescu L, 1998 -
Purificarea si caracterizarea biochimică a protidelor fimbriale provenite de la
Fusobacterium necrophorum. Simpozionul "Contribuţia cercetării ştiinţifice la
progresul medicinei veterinare", Bucureşti, pag 95.
48. Papuc C, Pop A., Ţogoe I., Şerban M., Cornila N, Diaconescu L, 1997-1998 -
Izolarea şi separarea a două fosfolipaze extracelulare provenite de la
Fusobacterium necrophorum. Lucr. şt. USAMV Bucureşti, seria C, XL-XLI, 99.
49. Papuc C, Pop A., Ţogoe I., Şerban M., 1995 - Phospholipase activity of
hemolysins produced by Fusobacterium necrophorum. Rev. Rom. Biochimie,
32,67.
50. Papuc C, Ţogoe I., Pop A., Şerban M., 1997 - Izolarea si separarea a doua
fosfolipaze extracelulare provenite de la Fusobacterium necrophorum. Lucr. Şt.
U.S.A.M.V., Bucureşti, seria C, vol. XXXX.
53
51. Papuc C, Ţogoe L, Pop A., Şerban M., 1993 - Caracteristici biochimice ale
unor toxine sintetizate de Fusobacterium necrophorum. Sesiunea şt. U.S.A.M.V.
Bucureşti.
52. Papuc C, Ţogoe I., Pop A., Şerban M., 1997 - Caracterizarea biochimică a
fosfolipazei A2 separată din supernatantul de cultură provenit de la
Fusobacterium necrophorum. St. Cercet. Biochim. 40,1-2,9-16.
54. Perianu T., 2011 - Bolile infecţioase ale animalelor: Bacterioze, Vol. I, Ediţia III,
Iaşi, Ed. Universitas XXI, laşi.
55. Popovici I., Stamatin L, 1968 - Boli infecţioase ale animalelor domestice. Ed.
Didactică şi pedagogică, Bucureşti.
56. Răducănescu H., Valeria Bica-Popii, 1989 - Bacteriologie veterinară. Ed. Ceres,
Bucureşti.
57. Răputean Gh., Răputean S., 1999 - Bacteriologie specială veterinară. Tipo
Agronomia, Cluj-Napoca.
59. Sabo J., Hudac A., Fendtova E., 1988 - Ecology of anaerobic nonsporulating
bacteria in relation to digital dermatitis in cattle. Vet. Med., 33, 265-272.
60. Saginala S., Nagaraja TG., Lechtenberg KF., Chengappa MM., Kemp KE.,
Hine PM., 1997 - Effect of Fusobacterium necrophorum leukotoxoid vaccine on
54
susceptibility to experimental induced liver abscesses in cattle. Journal of Animal
Science. 75(4): 1160-6.
61. Saginala S., Nagaraja TG., Tan ZL., Lechtenberg KF., Chengappa MM.,
Hifie PM., 1996 - The serum neutralizing antibody response in cattle to
Fusobacterium necrophorum leukotoxoid and possible protection against
experimental induced hepatic abscesses. Veterinary Research Communications.
20(6):493-504.
62. Saginala S., Nagaraja TG., Tan ZL., Lechtenberg KF., Chengappa MM.,
Kemp KE., Hine PM., 1996 - Serum neutralizing antibody response and
protection against experimental induced liver abscesses in steers vaccinated with
Fusobacterium necrophorum. American Journal of Veterinary Research.
57(4):483-8.
63. Secaşiu V., Duma D., Stoica Gh., Sâmpetru C, 1980 - Lucr. Simp. "Probleme
de ameliorare, tehnologie, creştere şi patologie la taurine". Cluj Napoca, 235,
Mai 16-17.
64. Shibahara T., Akiba T., Maeda T., Ogata T., Honda R., Ishikawa Y., Kadota
K., 2002 - Immunohistochemical and ultrastructural identification of
Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum in bovine fatal necrotizing
glossitis. Journal of Veterinary Medical Science, 64(6):523-6.
65. Smith G.R., Barton S.A., Wallace L.M., 1991 - A sensitive method for isolating
Fusobacterium necrophorum from faeces. Epidemiology and infection, 102-2,311-
317.
69. Takayama Y., Kanoe M., Maeda K., Okada Y., Ka K., 2000 - Adherence of
Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum to ruminal cells derived from
bovine rumenitis. Letters in Applied Microbiology, 30(4):308-11.
70. Tan ZL, Lechtenberg KF., Nagaraja TG., Chengappa MM., Brandt RT. Jr.,
1994 - Serum neutralizing antibodies against Fusobacterium necrophorum
leukotoxin in cattle with experimentally induced or naturally developed
hepatic abscesses. Journal of Animal Science, 72(2):502-8.
71. Tan ZL, Nagaraja TG., Chengappa MM., 1996 - Fusobacterium necrophorum
infections: virulence factors, phatogenic mechanism and control measures.
[Revie][156refs], Veterinary Research Communications, 20(2):113-40.
72. Tan ZL., Nagaraja TG., Chengappa MM., 1994 - Selective enumeration of
Fusobacterium necrophorum from the bovine rumen. Applied & Environmental
Microbiology, 60(4): 1387-9.
73. Tan ZL., Nagaraja TG., Chengappa MM., Smith JS., 1994 - Biological and
biochemical characterization of Fusobacterium necrophorum leukotoxin.
American Journal of Veterinary Research, 55(4):515-21.
74. Tan ZL., Nagaraja TG., Chengappa MM., Staats JJ., 1994 - Purification and
quantification of Fusobacterium necrophorum leukotoxin by using monoclonal
antibodies. Veterinary Microbiology, 42(2-3): 121-33.
75. Tan ZL., Nagaraja TG., Chengappa MMi., 1994 - Biochemical and biological
characterization of ruminal Fusobacterium necrophorum. FEMS Microbiology
Letters, 120(l-2):81-6.
56
76. Ţogoe I., 1972 - Studiu privind metodele de izolare a speciei Fusobacterium
necrophorum. Lucr. Şt., IANB, seria C, col. XVII, pag. 95 – 98.
78. Ţogoe I., 1978 - Studii privind biologia speciei Fusobacterium necrophorum.
Proprietăţile biochimice la 53 tulpini de Fusobacterium necrophorum. Unele date
experimentale privind factorii patogenităţii speciei Fusobacterium necrophorum.
Lucr. Şt. IANB Bucureşti, seria C,18/19, pag 83 - 87, pag 89 -93..
79. Ţogoe I., 2001 - Infecţii produse de bacterii din genul Fusobacterium
necrophorum. U.S.A.M.V. Bucureşti, pag. 292 - 307,.
80. Ţogoe I., Şerban M., Papuc C, Pop A., 1992 - Izolarea şi purificarea exotoxinei
eliberate de Fusobacterium necrophorum. Scien. Work. Symp. "Problems of
animal pathology", Timişoara, pag. 69
81. Ţogoe I., Şerban M., Papuc C, Pop A., 1992 - Aspecte privind compoziţia
biochimică a secreţiilor toxice sintetizate în medii de cultură lichide de către
Fusobacterium necrophorum. Scien. Work. Symp. "Problems of animal
pathology", Timişoara, pag. 70.
82. Ţogoe I., Matei M., Carasava M., 1994 - Metode de obţinere şi de purificare a
exotoxinelor de Fusobacterium necrophorum şi posibilităţi de utilizare a acestora
în inducerea imunităţii la animale. Al ll-lea Simpozion Inter. „Biotehnologiile azi
si mâine” Bucureşti,
83. Ţogoe I., Bârză H., Miclăuş I., 1996 - Prevalence of Fusobacterium
necrophorum subsp. necrophorum in necrotic wounds of Cows feet, and the
features of strains isolated. Veterinary bulletin, Volume 66, no. 12, pag 1209 =
1210
57
84. Ungureanu Şt., 1965 - Observaţii asupra unei enzootii de necrobaciloză cu
localizări interne. Rev. de Zoot. Şi Med. Vet., 4, 63,
85. Volintir V., Prejbeanu G., Grindeanu H., 1960 - Necrobaciloza genitală la oi.
Probi. Zoot. Şi Vet., 3, 63
86. Yamaguchi M., Kanoe M., Kai K., Okada Y., 1999 - Actin degradation
concomitant with Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum adhesion to
bovine portal cells. Microbios. 98(390):87-94
87. Yeruham L, Elad D., Yakobson B., Machnai B., Perl S., 1998 - Case report:
necrotic glossitis and sinusitis in a cow caused apparently by a Fusobacterium
necrophorum like microorganism. Berliner und Munchener Tierarztliche
Wochenschrift. 111(6):211-3
88. Zarnea G., 1994 - Tratat de microbiologie generală, vol. V, Ed. Academiei
Române
58