COMPONENTE I METODE DE PREPARARE A MEDIILOR DE CULTUR Mediile de cultur adecvate creterii in vitro a meristemelor sau a variatelor tipuri de explante

vegetale, esuturi i celule, sunt lichide, avnd la baz o soluie apoas, cuprinznd: ap sruri minerale substane organice: zaharoz, vitamine i substane regulatori de cretere sau fitohormoni, cu sau fr ageni gelificani. Aceast soluie apoas, atunci cnd anumite tipuri de culturi cum ar fi i cultura de meristeme! impun acest lucru, poate fi solidificat. "olidificarea # care este o gelificare a mediului se face cu a$utorul unui produs extras din algele roii, un polizaharid, numit agar%agar& pentru a fi amestecat cu celelalte componente ale mediului agarul trebuie lichefiat la temperatura de peste '()*. +n afar de agar%agar, exist i alte feluri de substane gelificante, cum sunt: agregatele monocristaline de celuloz i biogelurile silicagelul sau gelurile de poliacrilamid. +n prepararea mediilor de cultur se va ine seama de urmtoarele: % ,n prepararea mediului de baz abreviat M-!, fiecare component ,n parte fie ea soluie stoc, fie ingredient solid! se adaug ealonat, ,ntr%o anumit cantitate de ap bidistilat, cantitatea apreciat arbitrar, proporional cu volumul final al soluiei& % se va respecta ,ntocmai ordinea de adugare a ingredientelor conform reetei mediului de cultur, nepermindu%se nici o abatere, ,ntruct poate apare fenomenul de precipitare, care duce la obinerea unor medii de cultur incompatibile cu meninerea viabilitii vitroculturilor& % ,naintea autoclavrii mediilor p.%ul mediului se va ma$ora cu (,/%(,0 uniti, tiind c are loc, de regul scderea valorii acestuia ,n timpul sterilizrii datorit pierderilor de ap din medii. 1umrul unitilor vor varia ,n funcie de tipul autoclavului din dotare, fiind mai mare pentru autoclavele cu ,nclzire mai lent, respectiv mai mic pentru cele care necesit un timp mai scurt pentru a a$unge la parametrii prestabilii pentru sterilizare& % unii autori recomand reglarea p.%lui dup adugarea agarului, ,n timp ce alii preconizeaz stabilirea p.%lui prealabil inducerii agarului ,n mediu. 2oii autorii sunt de acord ,n ceea ce privete faptul c p.%ul se regleaz prealabil autoclavrii. Adugarea regulatorilor de cretere i a agarului modific p.%ul mediului. Agarul se solidific la temperaturi sub '3 (*& % agarul se adaug mediului de cultur dup introducerea celorlalte ingrediente& pentru solubilizarea agarului se procedeaz la topirea lui, fie prin introducerea recipientului cu mediu ,ntr%o baie de ap, agitnd coninutul din cnd ,n cnd, fie prin autoclavarea agarului ,ntr%o anumit cantitate de ap ca soluie separat apreciat ,n funcie de volumul final al soluiei! sau ,mpreun cu ingredientele anorganice, dup care ,n boxa steril este ,ncorporat ,n restul amestecului de ingrediente organice, sterilizate prin diferite procedee. Mediul agarizat, cu agarul lichefiat la cca. 3( (*! se repartizeaz rapid ,n recipiente de cultur omogeniznd tot timpul amestecul i la nevoie ,nclzindu%l!, pentru a pre,ntmpina solidificarea acestuia. 4a p. prea acid sau la autoclavare incorect la temperaturi de peste /0/ (*! agarul rmne ,n stare lichid i mediul de cultur este nefolosibil, ne mai putnd fi nici recondiionat. % pentru repartizarea mediului ,n vase se folosete un repartitor. 5ac avem de repartizat cantiti mai mari de mediu se pstreaz recipientul respectiv pe baia de ap. 5up autoclavare, p.%ul mediului se schimb, de asemenea p.%ul se modific ,n cursul perioadei de cultivare a explantelor. % dup repartizarea mediilor de cultur ,n flacoanele de experien se va trece imediat la autoclavarea acestora la /0/ (* / atm.!, timp de /3%0( minute. % adugarea regulatorilor de cretere, att cantitativ ct i calitativ se va face ,n funcie de procesul fiziologic urmrit. "e recomand respectarea tuturor indicaiilor autorilor iar modificarea unor reete se va face observnd ,ndeaproape 6comparativ6 schimbrile intervenite la nivelul inoculilor, precum i evoluia esuturilor pe mediile nou concepute. 7entru a se obine un anumit mediu de cultur, se utilizeaz soluii concentrate din produse care intr ,n compoziia acestuia, soluii%mum din care se ia o anumit cantitate ce se dilueaz, dup necesitii. Aceste soluii concentrate se mai numesc soluii%stoc, care se pot prepara, pentru uurin, soluii%stoc simple care nu cuprind dect un singur constituent, sau soluii%stoc complexe care conin mai muli constitueni i care intr ,n toate mediile speciale, adecvate din punct de vedere al compoziiei chimice, cultivrii 8in vitro9 a unui numr mare de specii de plante. "oluiile%stoc se pstreaz ,n frigidere i apoi, sunt diluate, ,n momentul preparrii mediilor finale, ,n funcie de necesar. +n funcie de necesiti se pot prepara soluii%stoc dup diferite reete., de ex. se poate prepara separat:

o soluie%stoc ce cuprinde toate srurile minerale din lista macroelementelor, cu excepia *a*l0 compus higroscopic! sau a srurilor de calciu, pentru a se evita formarea de precipitate. Aceasta este concentrat de /( x i se adaug mediului final, ,n momentul preparrii acestuia. b! o soluie%stoc cuprinznd microelemente /((( x concentrat!. c! o soluie%stoc cuprinznd :e;52A 3 x concentrat!. d! o soluie%stoc cuprinznd vitamine, ,n amestec: acid nicotinic, tiamina .*l i piridoxina .*l, cu excepia mezo%inozitolului, care va fi adugat sub form de pulbere sau dizolvat aparte i introdus ,n soluia final ,n momentul preparrii mediului de cultur. 7entru regulatorii de cretere se recomand utilizarea soluiilor%stoc, preparate separat din fiecare regulator de cretere ,ntr%o concentraie de (,/g<l sau (,/ mg<ml. 2otul se conserv la frigider. =eeta de mediu de cultur, cel mai des utilizat ,n biotehnologia vegetal, este urmtoarea: Regulatorii de cretere # sunt compui ce aparin diferitelor categorii de substane organice, fie sunt fitohormoni sintetici ex. A>A!, fie sunt compui care mimeaz efectul fitohormonilor. Aceste substane sunt utilizate ,n concentraii foarte mici de ordinul a (,(/ mg<l pn la /( mg<l i au rol esenial ,n multiplicarea, creterea i diferenierea celular. ;i pot fi ,mprii ,n 3 mari categorii, dintre care ? grupri mari sunt mai importante i anume: a. Auxinele% acioneaz asupra membranei celulare, mrindu%i plasticitatea i permeabilitatea, favoriznd absorbia apei i a substanelor minerale, stimuleaz procesele de morfogenez i formarea rdcinilor adventive. 7rincipalii reprezentani ai auxinelor sunt: A>A % sau acidul ?%indolilacetic sau acidul beta%indolilacetic& A>A % este o auxin natural care poate fi obinut i prin sinteza chimic. A>A ,n timp, se degradeaz la lumin i ca atare, pe termen lung se conserv flacoane din sticl colorat& aceast auxin este chimic inactiv la '%@A*, ,n maxim B zile. A1A % sau acidul alfa%naftilacetic, este un produs de sintez, slab ,n mediu apos i la autoclavare. A>- % sau acidul indolilbutiric % este o auxin de sintez foarte activ i foarte stabil chimic. 0,'%5 sau acidul 0,' diclorfenoxiacetic este un produs de sintez, foarte puternic activ ca auxina i este aproape insolubil ,n ap. 2oate auxinele au efecte puternic rizogene. . Citoc!ininele # sunt fitohormoni care deriv de la adenin. ;le au un rol foarte important ,n multiplicarea celulelor vegetale, alturi de auxine, raportul acestora constituind balana hormonal. *itochininele, spre deosebire de auxine, au efecte caulogene, respectiv prezena lor ,n mediile de cultur faciliteaz caulogeneza. *itochininele au ca reprezentani principali urmtorii compui: chinetina sau @ furfurilaminopurina % o citochinin mai puin activ ,n raport cu celelalte citochinine. zeatina, citochinin natural, stabil ,n mediul apos i la autoclavare. 0 >7 sau izopentiladenina izopentiladenozina! o citochinin de sintez care, ca i zeatina, este foarte activ ,n desfurarea i susinerea caulogenezei. -A7 sau -A % benzilaminopurina sau benziladenina % este o citochinin de sintez, deosebit de activ, dar care, de cele mai multe ori, cauzeaz vitrificarea plantulelor generate 8in vitro9. -A% este un compus stabil la autoclavare. fidiazuronul % o citochinin de curnd descoperit i cu efecte caulogenoi embriogene remarcabile, superioare celorlalte citochinine. c. "i erelinele # sunt fitohormoni care au rol fiziologic complex. ;le sunt variate i au reprezentani ,n diferite grupe filogenetice& dar, ,n culturile in vitro ele sunt mai puin utilizate. CA? este un produs natural care se degradeaz rapid ,n soluii apoase i la autoclavare. "e pstreaz scurt timp ,n frigider. "e pregtete o mic cantitate de soluie%stoc, aproximativ /( ml, ,n momentul preparrii mediului de cultur.

a!