BIOTEHNOLOGIE Lucrarea nr. 4 PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR n prepararea mediilor de cultur e !

a "ine eama de urmtoarele# $ %n prepararea mediului de &a' (a&re!iat M)*+ ,iecare component %n parte (,ie ea olu"ie toc+ ,ie in-redient olid* e adau- e.alonat+ %ntr$o anumit cantitate de ap &idi tilat+ cantitatea apreciat ar&itrar+ propor"ional cu !olumul ,inal al olu"iei/ $ e !a re pecta %ntocmai ordinea de adu-are a in-redientelor con,orm re"etei mediului de cultur+ nepermi"0ndu$ e nici o a&atere+ %ntruc0t poate apare ,enomenul de precipitare+ care duce la o&"inerea unor medii de cultur incompati&ile cu men"inerea !ia&ilit"ii !itroculturilor/ $ %naintea autocla!rii mediilor p1$ul mediului e !a ma2ora cu 3+4$3+5 unit"i+ .tiind c are loc+ de re-ul cderea !alorii ace tuia %n timpul terili'rii datorit pierderilor de ap din medii. 6umrul unit"ilor !or !aria %n ,unc"ie de tipul autocla!ului din dotare+ ,iind mai mare pentru autocla!ele cu %ncl'ire mai lent+ re pecti! mai mic pentru cele care nece it un timp mai curt pentru a a2un-e la parametrii pre ta&ili"i pentru terili'are/ $ unii autori recomand re-larea p1$lui dup adu-area a-arului+ %n timp ce al"ii preconi'ea' ta&ilirea p1$lui preala&il inducerii a-arului %n mediu. To"ii autorii unt de acord %n ceea ce pri!e.te ,aptul c p1$ul e re-lea' preala&il autocla!rii. Adu-area re-ulatorilor de cre.tere .i a a-arului modi,ic p1$ul mediului. A-arul e olidi,ic la temperaturi u& 47 3C/ $ a-arul e adau- mediului de cultur dup introducerea celorlalte in-rediente/ pentru olu&ili'area a-arului e procedea' la topirea lui+ ,ie prin introducerea recipientului cu mediu %ntr$o &aie de ap+ a-it0nd con"inutul din c0nd %n c0nd+ ,ie prin autocla!area a-arului %ntr$o anumit cantitate de ap ca olu"ie eparat (apreciat %n ,unc"ie de !olumul ,inal al olu"iei* au %mpreun cu in-redientele anor-anice+ dup care %n &o8a teril e te %ncorporat %n re tul ame tecului de in-rediente or-anice+ terili'ate prin di,erite procedee. Mediul a-ari'at+ cu a-arul lic9e,iat (la cca. 73 3C* e reparti'ea' rapid %n recipiente de cultur (omo-eni'0nd tot timpul ame tecul .i la ne!oie %ncl'indu$l*+ pentru a pre0nt0mpina olidi,icarea ace tuia. La p1 prea acid au la autocla!are incorect (la temperaturi de pe te 454 3C* a-arul rm0ne %n tare lic9id .i mediul de cultur e te ne,olo i&il+ ne mai put0nd ,i nici recondi"ionat. $ pentru reparti'area mediului %n !a e e ,olo e.te un repartitor. Dac a!em de reparti'at cantit"i mai mari de mediu e p trea' recipientul re pecti! pe &aia de ap. Dup autocla!are+ p1$ul mediului e c9im&+ de a emenea p1$ul e modi,ic %n cur ul perioadei de culti!are a e8plantelor. $ dup reparti'area mediilor de cultur %n ,lacoanele de e8perien" e !a trece imediat la autocla!area ace tora la 454 3C (4 atm.*+ timp de 47$53 minute. $ adu-area re-ulatorilor de cre.tere+ at0t cantitati! c0t .i calitati! e !a ,ace %n ,unc"ie de proce ul ,i'iolo-ic urmrit.
4

:e recomand re pectarea tuturor indica"iilor autorilor iar modi,icarea unor re"ete e !a ,ace o& er!0nd %ndeaproape ;comparati!; c9im&rile inter!enite la ni!elul inoculilor+ precum .i e!olu"ia "e uturilor pe mediile nou concepute. A ep i'area mediilor de cultur au numai a 9ormonilor+ e poate ,ace utili'0nd ,iltre Millipor au nuci ,iltrante+ &acteriolo-ice (cu plac poroa de ticl* 3+5 <m. n ace t ca'+ mediul cu a-ar e autocla!ea' eparat .i e adau- apoi olu"iilor terili'ate prin ,iltrare+ %n condi"ii per,ecte de a ep ie (incint au &o8 teril*/ e omo-eni'ea' olu"ia+ reparti'0nd mediul %n recipiente de cultur+ care %n preala&il !or ,i terili'ate. :e poate proceda la autocla!area ame tecului de ruri a 'a9aro'ei+ me'oino'itolul .i a a-arului+ iar prin ,iltrare e terili'ea' adao ul de 9ormoni .i de !itamine .i e8tracte naturale (in ta&ile la temperaturi ridicate*. A t,el de opera"iuni pot ,i ,cute %n condi"ii &une %n &o8a cu ,lu8 laminar de aer teril. Inocularea e8plantelor e !a ,ace dup rcirea mediilor de cultur. Cerin"ele nutriti!e ale celulelor culti!ate u& ,orm de u pen ii celulare au culturi de protopla.ti+ unt %n -eneral acelea.i cu cele de la cultura e8plantelor ti ulare/ la cultura de celule .i de protopla.ti e utili'ea' medii lic9ide .i ,rec!ent %n loc de 'a9aro' (mai ale %n culturile de protopla.ti* e ,olo e.te -luco'a+ ca ur de car&on or-anic. =ia&ilitatea protopla.tilor depinde de condi"iile %n care a ,o t reali'at li'a mem&ranelor celulare. Mediile de cultur lic9ide e ,olo e c .i %n cultura de "e uturi. n ace t ca' tre&uie luate m uri peciale pentru a i-urarea aerrii olu"iilor nutriti!e .i re pecti! a "e uturilor inoculate pentru ,acilitarea c9im&ului -a'o + %n !ederea acce ului o8i-enului la celule. A t,el+ e ,olo e c ,lacoane de cultur de con truc"ie pecial au e ,olo e c &ar&otoare de aer teril. Mediile lic9ide unt aerate prin in talarea ,lacoanelor cu inoculi pe di po'iti!e care a-it olu"iile nutriti!e %n plan ori'ontal au %n plan !ertical. Mediile lic9ide pot ,i !alori,icate .i prin ,olo irea unor pun"i care men"in "e utul dea upra lic9idului+ dar care $i a i-ure o core pun'toare alimentare cu nutrien"i+ ap .i 9ormoni. Protocormii de or9idee pot ,i men"inu"i u&mer a"i %n mediu de cultur (lic9id*+ ,r a nece ita m uri peciale de aerare au a-itare. Re"ete de medii de cultur+ utili'ate mai de %n &iote9nolo-ia !e-etal# 1. Mediul MURASHIGE-SKOOG (abreviat MS) (1 !")# (dup >am&or- .i ?etter $4@A7* A. :olu"ia de MACROELEMENTE :toc I ( e p trea' la ,ri-ider*#
INGRE$IENTE 6146OB C6OB CaCl5 F 515O M-:O4 F A15O C15PO4 %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l ,M 4D73 53+D 4@33 4E+E 443 B+3 BA3 4+7 4A3 4+57 5 S&lu)ie STO% de 1. / (&'(e'trat01l ,011... ,l

4D+7 4@+3
B+A 4+A

4D733 4@333
BA33 4A33

e prepar eparat olu"ia toc 12 011.. ,l

B. :olu"ie de MICROELEMENTE :toc II ( e p trea' la %n con-elator*#

INGRE$IENTE 1B)OB Mn:O4 F 415O Gn:O4 F A15O 6a5MoO4 F 515O Cu:O4 F 715O CoCl5 F D15O CI %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l M D+5 433 55+B 433 E+D B3 3+57 4+3 3+357 3+4 3+357 3+4 3+EB 7 S&lu)ia STO% de 1... / (&'(e'trat,011... ,l ,011.. ,l D533 D53 55B33 55B3 ED33 ED3 573 57 57 5+7 57 5+7
e prepar eparat ol. toc 32 ,011..,l

%. :olu"ia de FeEDTA 43 m-Hl I :toc III ( e p trea' %n ticle &rune la ,ri-ider* :e prepar eparat olu"ia toc#
INGRE$IENTE Je:O4 F A15O 6a5EDTA %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al5A+E m-Hl BA+B m-Hl %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia STO% 7+7A -Hl A+47 -Hl

$. :olu"ie de VITAMINE I :toc I= ( e p trea' la con-elator*#

INGRE$IENTE Acid nicotinic Pirido8in 1Cl Tiamin 1Cl Me'o$ino'itol %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l 3+7 3+7 3+4 433 S&lu)ia STO% de 1... / (&'(e'trat,011.. ,l 73 73 43 43333

E. :olu"ie de AMINOACIZI: >licina 5 m-Hl (poate ,i preparat eparat au poate ,i adu-at la olu"ia toc de !itamine*. 4. :olu"ii de REGULATORI DE CRETERE ( e p trea' la ,ri-ider*#
INGRE$IENTE AIA C9inetin %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l 4$B3 3+34$43 S&lu)ia STO% ,011.. ,l 73+3 54+7

G. GA1AROG H. DIJCO )ACTO$A>AR

B3 -Hl 43 -Hl

Modul de preparare a soluiei i!ale: La E33 ml ap &idi tilat e adau-# 433 ml olu"ie toc I (macroelemente*+ 4 ml olu"ie toc II (microelemente*+ 7 ml olu"ie toc III (JeEDTA*+ 4 ml olu"ie toc I= (!itamine*+ 4 ml olu"ie toc = (aminoaci'i*. :e !or adu-a apoi re-ulatori de cre.tere+ 'a9aro'a+ e introduce a-arul+ iar %n ,inal e a2u tea' p1$ul .i e aduce totul la 4333 ml.
B

". Mediul GAMBORG 5i (&lab. (B2) (1 !6)# (dup >am&or- .i ?etter $4@A7* A. :olu"ia de MACROELEMENTE :toc I ( e p trea' la ,ri-ider*#
INGRE$IENTE 6a15PO4 F 15O C6OB (614*5:O4 M-:O4 F A15O CaCl5 F 515O %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l ,M 473 4+4 5733 57+3 4B4 4+3 573 4+3 473 4+3 S&lu)ie STO% de 1. / (&'(e'trat01l ,011... ,l 4+7 4733 57+3 57333 4+B 4B43 5+7 5733
e prepar eparat ol. toc 32 ,011.. ,l

B. :olu"ie de MICROELEMENTE :toc II ( e p trea' la %n con-elator*#

INGRE$IENTE 1B)OB Mn:O4 F 415O Gn:O4 F A15O 6a5MoO4 F 515O Cu:O4 F 715O CoCl5 F D15O CI %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l 7M B+3 73+3 43+3 D3+3 5+3 A+3 3+57 4+3 3+357 3+4 3+357 3+4 3+A7 4+7 S&lu)ia STO% de 1... / (&'(e'trat,011... ,l ,011.. ,l B333 B33 43333 4333 5333 533 573 57 57 5+7 57 5+7
e prepar eparat ol. toc 32 ,011..,l

%. :olu"ia de FeEDTA 43 m-Hl :toc III+ idem mediul MS. $. :olu"ie de VITAMINE :toc I= ( e p trea' la con-elator*#
INGRE$IENTE Acid nicotinic Pirido8in 1Cl Tiamin 1Cl Me'o$ino'itol %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l 4+3 4+3 43+3 433+3 S&lu)ia STO% de 1... / (&'(e'trat,011.. ,l 433 433 4333 43333

4. :olu"ii toc de REGULATORI DE CRETERE ( e p trea' la ,ri-ider*#

INGRE$IENTE C9inetin AIA %&'(e'tra)ia *' +&lu)ia '&r,al,01l 3+4 3+4 I 4+3 S&lu)ia STO% ,011.. ,l 54+7 73+3

F Me'o$ino'itolul poate ,i %ncorporat %n tocul de olu"ie cu !itamine au poate ,i adu-at+ %n ,orm cri tali'at+ %n momentul preparrii mediului.

end.