M ETODE DE PR ODUCER E PE CALE FER M EN TATIV A GLICERO LULUI

METODE DE PRODUCERE PE CALE FERMENTATIV A GLICEROLULUI

Drd. ing. Iulia IONI, Universitatea Dunrea de Jos, Galai
Absolvent a Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos Galai, promoia 2003. Preparator la Facultatea de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos, Galai. Doctorand, cu specializarea industrii fermentative. Participare la cursurile colii de Var resund Suedia i Danemarca, 2002, specializarea inginerie metabolic

REZUMAT Glicerolul, un compus des utilizat n industriile alimentar, cosmetic , farmaceutic i n industria tutunului, este obinut de cele mai multe ori pe cale chimic , dar poate fi ob inut i cu ajutorul microorganismelor. n acest studiu sunt prezentate microorganismele productoare, surse industriale de carbon, aspecte economice, bazele metabolice ale producerii glicerolului de ctre drojdii i cteva din strategiile de optimizare prin inginerie genetic a randamentului de glicerol obinut pe cale fermentativ. ABSTRACT Glycerol, a very used compound in food industry, cosmetics, pharmaceutical products and tobacco, can be obtained by chemical methods or by using microorganisms. This study presents production microorganisms, industrial carbon sources, economic aspects, metabolic basis of glycerol production in yeast and ways to optimize its production through genetic engineering.

Cu excep ia perioadelor de rzboi, producerea glicerolului prin fermentaie nu a fost economic competitiv cu alte metode. Cele mai mari dezavantaje ale procesului fermentativ au fost randamentul sczut de glicerol obinut din carbohidrai i dificult ile la recuperarea acestuia din lichidul de fermentaie. n ultimii ani, descoperirile fcute n domeniul biotehnologiei au determinat un interes crescut pentru obinerea compuilor chimici folosind carbohidrai uor regenerabili. Un exemplu de produs care poate fi obinut cu ajutorul chimiei ecologice este glicerolul. Date generale . Denumirea de glicerol i are originile n cuvntul grecesc glykeros, care se traduce prin dulce. A fost obinut pentru prima dat prin extracie dintr-un amestec de oxid de plumb i ulei de m sline, de Scheele, n 1779, care l-a numit principiul dulce al untului. n 1815, Chevreuil l-a inclus n categoria alcoolilor, iar n 1823 a artat ntr-o lucrare a sa c glicerolul este prezent n to i compuii uleio i. Glicerolul este un compus alcoolic, fr culoare, f r miros, cu gust dulce i consisten siropoas. Denumirea de glicerol se aplic doar compusului chimic pur 1,2,3- propantriol, iar cea de glicerin se refer la compusul comercial, care conine peste 95% glicerol. Glicerolul apare n mod obinuit n combinaii, sub form de gliceride, n toate grsimile de origine animal i vegetal. Producia anual de peste 600 000 tone glicerol Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

este realizat mai ales prin recuperarea acestuia ca produs secundar de la saponificarea grsimilor n timpul obinerii spunurilor. Poate fi obinut i la esterificarea grsimilor cu metanol pentru realizarea esterilor metilici. Exist i varianta producerii glicerolului prin fermentaie microbian , utiliznd un substrat glucidic. Microorganisme productoare de glicerol. Glicerolul este un metabolit produs de multe organisme, inclusiv bacterii, drojdii, mucegaiuri i alge (tabelul 1). ntruct glicerolul are adesea rolul unui osmolit, contracarnd presiunea osmotic, microorganismele osmofile prezint un interes deosebit pentru producerea glicerolului. Cercet rile s-au axat pe drojdia de panificaie, Saccharomyces cerevisiae, datorit avantajelor pe care le implic: a . glicerolul este un produs secundar al metabolismului fermentativ al drojdiei; b . glicerolul este un compus cu aciune benefic n vin i, de aceea, productorii de vin sprijin aciunile ce au ca scop optimizarea procesului de obinere microbian a acestuia; c. glicerolul este un produs nedorit la obinerea etanolului distilat, astfel nct i productorii de etanol sunt interesai de cunoaterea mai detaliat a metabolismului fermentativ al drojdiei. Surse industriale de carbon. Producia industrial de glicerol prin fermentaie necesit materii prime ieftine pentru a fi o metod competitiv. Sursele de carbon studiate, altele dect glucoza, sunt prezentate n tabelul 2.

75

 TIIN A I ING IN ERIA ALIM EN TELOR

Tabelul 1. Microorganisme produc toare de glicerol [1] Grupa de microorganisme Drojdii Specii importante de produc tori Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces ellipsoideus Saccharomyces rouxii Saccharomyces uvarum Kluyveromyces bulgaricus Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus Hanseniaspora guilliermondii Kloeckera apiculata Debaryomyces mogii Rhizopus nigricans Rhizopus javanicus Aspergillus niger Penicillum italicum Dunaliella viridis Trypanosoma cruzi Crithidia fasciculata Bacillus subtilis Bacillus coli

Mucegaiuri

Alge Bacterii

Tabelul 2. Surse industriale de carbon utilizate la obinerea glicerolului [1] Surse de carbon Melas din sfecl de zahr Suc de grepfrut Amidon Xiloz Zer Metanol Microorganisme produc toare S. cerevisiae A. niger P. italicum R. nigricans S. cerevisiae R. javanicus K. marxianus Candida boidinii

Tabelul 3. Preurile de producie i de vnzare ale glicerolului Pre producie 0,33 $ kg 1 Pre vnzare 0,22 $ kg -1 1,95 $ kg -1 1,40 $ kg -1 2,30 $ kg -1 Anul 1920 1987 2000 2002 Ref erina [1] [8] [7, 8] [8]

Aspecte economice. Costurile de producie i cele de vnzare sunt secrete de firm , astfel nct n publicaiile de specialitate apar mai multe preuri (tabelul 3). ntruct glicerolul este obinut de obicei ca produs secundar de la obinerea acizilor grai, a esterilor i alcoolului, preurile de producie sunt foarte sensibile la schimbrile cererilor pieei chimice. De asemenea, preul glicerolului variaz o dat cu preul uleiului de cocos i al petrolului, materiile prime din care se obine glicerolul [5]. Bazele metabolice ale produceri glice rolului de c tre drojdii. n figura 1 este prezentat o schem simplificat a metabolismului la Saccharomyces cerevisiae. 1. Glicerolul este consumator al excesului de NADH produs prin reacii anabolice n condiii de anaerobioz . n timpul fermentaiei alcoolice, motivul cel mai important al producerii glicerolului este men inerea echilibrului redox. Chiar dac producerea etanolului, care asigur reoxidarea NADH-ului format la oxidarea gliceraldehidei 3-fosfoglicerice, este un proces redox echilibrat, apare un exces de NADH la producerea de biomas. Glicerolul este produs pentru a consuma excesul de NADH i poate fi considerat o valv redox. 2. Glicerolul reacioneaz ca un osmolit, contracarnd o presiune osmotic extern mare n timpul stresului ap rut la concentra ii mari de sare. Multe organisme folosesc osmolii pentru a men ine o concentraie osmotic intracelular mai mare dect cea din mediul extern. Acumularea intracelular a osmoliilor compatibili cu proteinele i structura membranelor permit restabilirea echilibrului osmotic fr afectarea funciilor celulei. Pentru drojdii i mucegaiuri glicerolul este un osmolit important. Acumularea intracelular a unor cantiti mari de glicerol n timpul stresului osmotic se datoreaz fie producerii lui n cantitate mare, fie reten iei acestuia n celul [7]. Optimizarea produce rii glice rolului. Costul producerii a 1 mol de glicerol este de 0,5 mol glucoz, 1 mol NADH i 1 mol ATP. Indiferent de strategia de optimizare adoptat , acest cost trebuie pltit. Direciile de mbun t ire a procesului de obinere a glicerolului au avut cteva puncte de plecare diferite (fig. 2).

Cantitate mare de glicerol obinut din glucoz Redirecionarea indirect a fluxului de carbon prin modificarea echilibrului NADH Modificarea producerii NADH-ului Influenarea direct a fluxului de carbon de glicerol Interferen n metoda de semnalizare a necesarului

Modificarea consumului de NADH de alt enzim dect GPD

Fig. 1. Strategii de mbun tire a randamentului de glicerol obinut pe cale fermentativ .

76

Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

M ETODE DE PR ODUCER E PE CALE FER M EN TATIV A GLICERO LULUI

Legend : 1-TPI (triozfosfat izomeraz); 2-GPD (glicerolfosfat dehidrogenaz); 3-G PP (glicerol fosfataz); 4-G PM (fosfoglicerat mutaz); 5-PDC (piruvat decarboxilaz); 6-ADH (alcool dehidrogenaz) Fig. 2. Schema simplificat a metabolismului la Saccharomyces cerevisiae [7].

1. Strategia indirect: ncearc s stabileasc condiii n care producerea NADH-ului s fie maxim; redistribuirea fluxului de carbon este cauzat de necesitatea regenerrii NAD-ului i determin o producie ridicat de glicerol. 2. Strategia direct : are la baz interferen a direct cu fluxul de carbon: prin blocarea reaciei de izomerizare dintre DHAP i GAP, sau Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

prin inhibarea ultimei p r i a glicolizei. Echilibrul redox este astfel modificat, ceea ce determin o redistribuire a produilor de fermentaie pentru a obine NADH-ul necesar. Aceast strategie poate fi realizat prin: activarea genelor rspunztoare pentru enzimele din calea de producere a glicerolului (GPD); dezactivarea genelor care controleaz activitatea enzimelor precum ADH.

77

 TIIN A I ING IN ERIA ALIM EN TELOR

Pentru m rirea produciei de glicerol este necesar o cantitate mai mare de NADH, care poate fi obinut la formarea compuilor oxidai (acizi carboxilici). n condiii de stres osmotic, cile de semnalare sunt r spunztoare pentru reducerea fluxului de carbon i NADH, ca r spuns la necesarul de glicerol al celulei. Aceste strategii pot fi puse n practic folosind: ingineria genetic; controlul fiziologic; o combinaie ntre ingineria genetic i controlul fiziologic. Vom prezenta n continuare metodele de optimizare folosind ingineria genetic. care activitatea PDC era de doar 19% din cea a tulpinilor slbatice. La tulpinile mutante s-a obinut un randament de 5 ori mai mare n condiii de anaerobioz. Cantitatea de produi secundari de reacie s-a modificat, piruvatul fiind n cantitate mult mai mare, n timp ce cantitatea de biomas i de etanol a sczut. ADH (alcooldehidrogenaza). La Saccharomyces cerevisiae exist 3 gene care codific activitatea acestei enzime: adh1 , adh2 , adh3. Proteina codificat de adh1 este probabil enzima rspunztoare pentru reducerea citosolic n anaerobioz a acetaldehidei la etanol. O activitate mai sczut a acestei izoenzime se traduce printr-o producie m rit de glicerol.

1. CALEA GLICOLITIC
TPI (triozfosfatizomeraz). S-a demonstrat c o activitate sczut a acestei enzime inhib complet creterea pe mediu cu glucoz ca singur surs de carbon. La mutan ii f r gena tpi 1 , acumularea intracelular de DHAP ar putea fi mpiedicat dac NADH-ul generat n timpul glicolizei de ctre GPD ar fi utilizat pentru transformarea DHAP n glicerol. Overkamp i Pronk prezint ipoteza conform creia mutan ii crora le lipsete gena tpi 1 , prezint o cretere defectuoas din cauza reoxidrii mitocondriale a NADH-ului, f cndu-l s nu mai fie disponibil pentru reducerea DHAP-ului. Pentru a testa veridicitatea acestei ipoteze se apeleaz la un mutant cvadruplu, tpi1 nde1 nde2 gut2 . Genele care lipsesc acestor mutan i codific informaia rspunztoare de oxidarea mitocondrial a NADH-ului citosolic de la Saccharomyces cerevisiae. Mutantul cvadruplu a crescut pe glucoz ca unic surs de carbon i a format glicerol. Creterea lui a fost inhibat la concentraii mari de glucoz n mediu, cauza fiind represia exercitat de glucoz asupra enzimelor respiratorii, ntruct la acest mutant descompunerea piruvatului n anaerobioz este esen ial pentru sinteza ATP-ului i pentru cretere [4]. GPM (fosfoglice romutaz ). n absen a acestei enzime creterea pe mediu cu glucoz este imposibil, ntruct dac lipsete gluconeogeneza nu are loc creterea n aerobioz pe etanol, la fel cum nici creterea pe un mediu care con ine glucoz i etanol nu este posibil din cauza represiei respiraiei la concentraii prea mari de glucoz (efectul Crabtree). Michnik i Salmon au cutat o tulpin la care gena gpm1 s fie represat, care permite utilizarea etanolului n condiii de aerobioz, chiar dac este prezent glucoza. T ulpinile izolate au avut randamente foarte mari de glicerol raportate la glucoz, de circa 74% din randamentul teoretic; etanolul a fost i el consumat pentru a asigura NADH-ul i ATP-ul necesar producerii glicerolului. PDC (piruvat decarboxilaz ). Nevoight i Stahl au studiat tulpini mutante de Saccharomyces cerevisiae la

2. CALEA DE FORMARE A GLICEROLULUI

GPD (glice rofosfat dehidrogenaz ). Aceasta pare a fi o enzim limitativ pentru producerea glicerolului la Saccharomyces cerevisiae. S-a obinut o cantitate de 4 ori mai mare de glicerol prin activarea genei gpd 1, n defavoarea producerii de etanol. Astfel, randamentul de biomas i etanol a sczut, n timp ce randamentul form rii de piruvat, acetat, acetaldehid i civa ali compui a crescut. O activare i mai puternic a genei gpd 1 a fost realizat de Nevoight i Stahl, care au raportat o cretere de 6,5 ori a randamentului de producere a glicerolului. n mod surprinztor, o activare a genelor gpp 1 sau gpp 2 a determinat o m rire de 50 de ori a activit ii GPP, dar nu a avut un efect vizibil asupra randamentului de glicerol.

3. ME TABOLISMUL OXIDATIV
Dehidrogenazele externe NADH dependente. Glicerolul este adesea considerat un produs final al unei ci metabolice desfurate n anaerobioz, cu toate c pot fi obinute randamente mari de glicerol i n condiii de aerobioz. Overkamp a condus experimente n chemostat, n prezen a oxigenului, cu tulpini de Saccharomyces cerevisiae la care genele nde1 i nde2 ce codific dehidrogenaza mitocondrial extern NADH dependent au fost ndep rtate. Astfel, NADH-ul generat n citosol nu a mai putut fi oxidat de ctre dehidrogenaze i era de ateptat un randament crescut de NAD+ citosolic regenerat, datorit nevoii de NAD+ regenerat. Pn la o anumit valoare a vitezei de diluie formarea glicerolului era la un nivel foarte sczut, sugernd prezen a activitii genei gut2 , responsabil de calea metabolic ce include activitatea GPD mitocondriale. La viteze de diluie mai mari, randamentul glicerolului a crescut. Peste limita critic a diluiei glicerolului, randamentul a sczut din Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

78

M ETODE DE PR ODUCER E PE CALE FER M EN TATIV A GLICERO LULUI

]cauza form rii etanolului, care a consumat NADH-ul citosolic [7]. Strategii viitoare. T ulpina mutant adaptat la glucoz tpi1 nde1 nde2 gut2 este un punct bun de pornire pentru studiul factorilor implicai n cinetica producerii glicerolului i optimizarea concentraiilor de glicerol obinute. Totui, din punct de vedere tiin ific, cea mai mare provocare este obinerea unor randamente de peste 1 mol glicerol/mol glucoz [7]. Au fost realizate cultiv ri n aer liber folosind alga Dunaliella viridis, datorit poten ialului su de transformare a energiei solare n glicerol. Productivitatea obinut a fost de 8g glicerol/m2 /zi la cultivarea de scurt durat, n timp ce la cultivarea pe termen lung s-au obinut doar 4g glicerol/m 2 /zi [7]. Exist un grup de susin tori ai ideii conform creia se poate construi o fabric n care, prin modificarea unor parametri ai fermentaiei, precum presiunea osmotic, p H-ul, temperatura i inoculul de drojdie, se pot produce att glicerol ct i etanol [3].

BIBLIOGRAFIE
1. Kirk- Othmer. Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 12, New York, 1994. 2. Michnick S. Modulation of Glycerol and Ethanol Yields During Alcoholic Fermentation in Saccharomyces cerevisiae Strains Overexpressed or Disrupted for GPD 1 Encoding Glycerol 3Phosphate Dehydrogenase. Yeast, vol. 13, pp. 783-793, 1997. 3. Munene C. Effects of altering fermentation parameters on glycerol and bioethanol production from cane molasses . Journal of the Science of Food and Agriculture 82, pp. 309-314, 2002. 4. Overkamp K. Metabolic Engineering of Glycerol Production in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, June, 2002. 5. Remize F. Glycerol Export and Glycerol- 3 phosphate Dehydrogenase, but Not Glycerol Phosphatase Are Rate Limiting for Glycerol Production in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering 3, pp. 301-312, 2001. 6. Sahoo D. An investigation on glycerol biosynthesis by an osmophilic yeast in a bioreactor . P rocess Biochemistry 36, pp. 839846, 2001. 7. Taherzadeh M. Strategies for enhancing fermentative production of glycerol- a review. Enzyme and Microbial Technology 31, pp. 53-66, 2002. 8. * * * , Chemical Market Reporter , 1987-2002.

N CURS DE APARIIE N EDITURA AGIR

Constantin Banu (coordonator) PRINCIPIILE CONSERVRII ALIMENT ELOR

Format 170 x 240 mm, 420 pag.

Lucrarea, realizat pe baza unei document ri vaste i la un nivel tiinific ridicat, aduce la cunotina studenilor de la facultile de profil, a cadrelor didactice i a specialitilor din producie i din organele de control n domeniul alimentar cele mai noi realiz ri n privina conservrii alimentelor, chi ar dac unele sunt nc n stadiul de pilot. Cartea este structurat n 30 de capitole i conine un bogat mat erial ilustrativ, inclusiv date tabelate. Lucrarea este realizat de cadre didactice de la Universitatea Dunrea de Jos din Galai i de la Universitatea Tehnic a Moldovei din Chiinu.

Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

79