4.

MATERIAL I METODE DE CERCETARE

4.1. MATERIAL DE CERCETARE
Experimentele s-au realizat pe frunze proaspete de Aloe vera, determinndu-se cantitatea clorofilelor i carotenilor, vitaminelor C, B 6, P, proteinelor, precum i activitatea unor enzime: polifenoloxidaza, peroxidaza, catalaza i dehidrogenaza.

4.2. METODE DE CERCETARE

4.2.1. DETERMINAREA CANTITATIV A CLOROFILELOR I CAROTENILOR Principiul metodei de determinare a pigmenilor fotosintetici Clorofilele i carotenii sunt pigmenii principali a i cloroplastelor din frunzele plantelor verzi. Coninutul acestor pigmeni n aparatul fotosintetic al frunzelor depinde de starea fiziologic a plantelor, de natura lor genetic, etc. n aceste condiii, cantitatea de pigmeni este un indicator biochimic care poate caracteriza particularitile de vrst i genetice ale plantelor, precum i reacia plantelor la condiiile de cretere. Analiza cantitativ a pigmenilor include extracia lor din frunzele plantelor cu ajutorul solvenilor i determinarea spectrofotometric. O trstur caracteristic a pigmenilor vegetali este capacitatea lor de a absorbi razele luminoase cu o anumit lungime de und. Dac printr -o soluie clar a amestecului de clorofile i caroteni se trece un fascicol luminos monocromatic, n urma absorbiei de ctre substanele din soluie, intensitatea luminii va scdea. Aceast scdere depinde de numrul de molecule n calea razelor de lumin i de capacitatea lor de a absorbi lumina cu lungimea de und dat. De aceea, capacitatea energiei luminoase absorbit de ctre substana din soluie, depinde de natura i concentraia substanei respective, de grosimea stratului de soluie i lungimea de und a razelor de lumin. Dac n soluie sunt cteva substane, atunci la lungimea de und dat, extincia (E) amestecului este egal cu suma extinciilor componenilor din amestec: E=E1 + E2 + E3 + =a1c1d + a2c2d+

45

n cazul a doi componeni cu diferite maxime de absorbie i cu concentraiile c a i c b mol (g/l), extincia amestecului, E, la o grosime a stratului de soluie d=1cm va fi: E=a ca + bcb unde a i b sunt coeficieni molari de absorbie ai celor dou substane la lungimea de und . Pentru alt lungime de und avem o expresie asemntoare: E= a ca + b cb unde a i b = coeficieni specifici de absorbie ai celor doi exponeni la . Rezolvnd sistemul celor dou ecuaii putem calcula valorile pentru ca i cb. Dup aceast metod se msoar la nceput absorbia clorofilelor a i b coninute n extract, n do meniul rou al spectrului, unde carotenii nu absorb aproape deloc. Apoi se determin absorbia carotenilor n regiunea albastr a spectrului, unde clorofilele au acelai coeficient. Din valorile obinute se calculeaz concentraia clorofilelor a i b i coninutul carotenilor n extract, folosind formulele deduse din ecuaiile de mai sus, care se bazeaz pe Legea Lambert-Ber. Reactivii utilizai: - aceton 90%, rcit; Modul de lucru: O cantitate determinat de frunze de plant tiat mrunt se tritureaz n mojar cu nisip de cuar (sticl pisat). n calitate de extractant se utilizeaz aceton rcit sub +4C. Extracia probei se repet de cteva ori cu acelai volum de aceton. Extractele obinute se adun ntr -o eprubet. Extracia se poate aprecia ca fiind aproape complet atunci cnd reziduul capt o culoare spre gri. Extractele reunite se centrifugheaz sau se filtreaz pe hartie de filtru cantitativ pentru precipitate fine (band albastr). Filtratul se completeaz cu aceton la un volum determinat. Determinarea spectrofotometric a pigmenilor din extract Un volum din extractul filtrat se introduce n cuva de 1 cm a spectrofotometrului Spekol i se citesc extinciile extractului la 662nm (pentru clorofila a), la 644nm (pentru clorofila b) i la 440,5nm (pentru caroteni), fa de cuva cu solvent.

46

Calculul rezultatelor: Concentraia clorofilelor a i b n extractul acetonic se calculeaz cu ajutorul formulelor: ca = 9,784E662 0,99E644 cb = 21,426E644 4,65E662 Coninutul carotenilor n acelai extract se afl dup relaia: cc = 4,695E440,5 0,268(ca + cb) Conform formulelor de mai sus, concentraiile pigmenilor determinate sunt exprimate n mg/l. Pentru calcularea coninutului procentual (cp=mg%) n materialul cercetat se are n vedere cantitatea de frunze luat n lucru: cp = aV100/p mg% unde: a - concentraia pigmentului, mg/ml; V- volumul final al extractului dup filtrare; p - masa frunzelor verzi luate pentru analiz (g) ; cp = ca (cb sau cc) / 1000 V / 0,1 100 = ca V cpa = ca V cpb = cb V cpc = cc V n final se calculeaz rapoartele ca /cb i cc / ca + cb.

4.2.2. DOZAREA CANTITATIV A CAROTENILOR Principiul metodei de determinare a carotenilor Materialul vegetal se tritureaz cu un amestec de sulfat de sodiu anhidru i oxid de calciu, care rein substanele colorate n afar de caroteni . Pentru a preveni descompunerea carotenilor n mediu acid se adaug la amestec carbonat de sodium anhidru. Carotenii din amestecul triturat se extrag cu aceton i eter de petrol sau benzin. n extractul obinut se determin colorimetric, direct sau dup o prealabil purificare cromatografic pe coloan cu oxid de aluminiu coninutul de carotene n materialul analizat ( Artenie i colab., 2008). Reactivii utilizai: - aceton, hexan, sulfat de sodiu anhidru, oxid de calciu, carbonat de calciu anhidru, eter de petrol, fosfat dicalcic, soluie etalon de dicromat de potasiu. Se dizolv 72 mg de dicromat de

47

potasiu n 100 ml ap distilat- extincia acestei soluii corespunde unui coninut de 0,00416 mg caroten n 1 ml. Modul de lucru: O prob de 0,1-10 g ( n funcie de coninutul presupus de caroteni ) din materialul vegetal proaspt , n prealabil , mrunit , se tritureaz ntr -un mojar cu o cantitate dubl n greutate de nisip de cuar , pn la completa dispariie a elementelor structurale vegetale i obinerea unui amestec omogen. ntruct carotenii sunt instabili la pH acid , n timpul mojarrii se adaug un vrf de spatul de carbonat de sodiu a nhidru pentru neutralizarea acizilor. De asemenea , se adaug o cantitate de sulfat de sodiu anhidru aproximativ egal cu aceea a probei cntrite cu scopul de a fixa apa din materialul vegetal i o cantitate echivalent de oxid de calciu, pentru reinerea clorofilei i xantofilei . n mojar se pipeteaz 5 -20 ml de aceton i se continu mojararea nct cteva minute . Apoi coninutul mojarului se trece cantitativ ntr -un pahar Berzelius de 50 ml sau ntr-o eprubet , splnd mojarul de mai multe ori cu cantiti mici de aceton . Dup ce materialul se las timp de 15-20 minute n contact cu acetone , se vars extractul acetonic , prin decantare , ntr-o plnie de separare. Se repet extracia materialului din pahar sau eprubet , cu cantiti mici de aceton de 4-10 ori , pn cnd acetona folosit n acest scop rmne incolor. Extractul acetonic din plnia de separare se amestec cu 10 -20 ml de eter de petrol . Acetona din amestec se ndeprteaz cu ap distilat . n acest scop se introduce n plnia de separare 10-20 ml de ap distilat i se agit uor. Se ateapt cteva minute pn cnd are loc separarea distinct a dou straturi de lichide. Stratul inferior aposo-acetonic se elimin din plnie cu atenie. Se repet splarea extractului din plnie cu ap nc de 3-4 ori. Ca rezultat carotenii trec complet n stratul de eter de petrol. Soluia eteric de caroteni se usuc de urmele de ap prin amestecare cu 1 -5 g de sulfat de sodiu anhidru , urmat de filtrare. La filtratul obinut se adaug 0,5 -1 g de fosfat dicalcic pentru izolarea clorofilei i xantofilei. Soluia de caroten se filtreaz i se completeaz la volum cunoscut cu eter de petrol. Dozarea colorimetric direct a carotenilor n soluia eteric se realizeaz prin msurarea intensitii culorii soluiei eterice de carotene obinut n modul descris mai sus , se poate efectua la spectrofotometru , folosind lungimea de und de 450 nm , iar pentru compensaie eterul de petrol. Pentru calcularea coninutului de caroten n probe se msoar n aceleai extincia soluiei etalon de dicromat de potasiu.
48

Calculul rezultatelor: Cantitatea carotenilor n materialul vegetal cercetat se calculeaz dup formula urmtoare: mg caroten %= E1 x a x v x 100 / E2 x p unde: E1 - extincia probei de cercetat ; E2 - extincia soluiei etalon ( 0, 982 ); a- numrul mg caroten ntr-un ml soluie etalon ( 0,00416 mg dac s-a lucrat cu soluia de dicromat de potasiu ) ; v - volumul soluiei de caroten ( ml ) ; p - greutatea materialului luat pentru analiz;

4.2.3. DOZAREA CANTITATIV A VITAMINEI C Vitamina C a fost extras cu ajutorul unei soluii de HCl, iar pentru dozarea cantitativ a acesteia s-a utilizat iodatul de potasiu ( KIO3). Reactivii utilizati: - soluii de HCl 1% i 2%, soluia de amidon 0,5 %, soluia de KIO3 N/10 i soluia de KI 1%. Modul de lucru: Pentru determinarea vitaminei C s-a cntrit 10 g de material vegetal, apoi proba a fost mojarat n prezen de HCl 1%, dup care a fost filtrat sau centrifugat. Ulterior, s-a masurat volumul obtinut in urma filtrarii. Pentru dozarea acodului ascorbic s-a utilizat 5 ml din acest extract, ce s-a introdus ntrun pahar Erlenmeyer, mpreun cu 0,5 ml soluie KI 1%, 2 ml amidon 0,5% i 2 ml ap distilat. Dup agitare, amestecul obinut s-a diluat cu ap distilat pn la un volum final de 15 ml (5,5 ml ap distilat) i s-a titrat cu soluia de KIO3 N/10, pn s-a obinut o coloraie albastr. n paralel cu proba de analizat, s-a realizat o prob martor compus din: 0,5 ml soluie KI 1%, 2 ml soluie amidon 0,5%, 1 ml soluie de HCl 2% i ap distilat, pn la un volum final de 15 ml (11,5 ml ap distilat). i acest prob martor este titrat n final cu soluie de KIO 3 N/10. Calculul rezultatelor: Pentru a calcula cantitatea de acid ascorbic s-a utilizat formula: X=( a-b) f c 0,088 100 / d g unde: x- cantitatea de acid ascorbic exprimat n mg% ; a- volumul de soluie de KIO3 N/10, utilizat pentru titrarea probei cu extract vegetal;
49

b- volumul de soluie de KIO3 N/10, utilizat pentru titrarea probei martor (ml); f- factorul soluiei de KIO3 N/10 ( 0,98); c- volumul iniial de extract realizat cu ajutorul HCl (ml) ; d- volumul de extract luat pentru titrare ( 5 ml); g- cantitatea de material din care a fost obinut extractul (10 g material vegetal);

4.2.4. DOZAREA CANTITATIV A VITAMINEI B6 Dozarea vitaminei B6 s-a realizat prin reacia de culoare cu reactivul Folin-Cioclteu. Metoda const n proprietatea piridoxinei de a da o coloraie albastr n prezena unui mediu alcalin (carbonat de sodiu ) i a reactivului Folin-Cioclteu. Reactivii utilizai: - reactivul Folin-Cioclteu; - soluia de carbonat de sodiu 20%; Modul de lucru: Pentru obinerea extractului vegetal s-a cntrit o cantitate de 3 g din materialul vegetal apoi s-a mojarat pn la obinerea unei paste omogene. Omogenatul obinut a fost apoi preluat ntr-un pahar Berzelius cu 13 ml ap distilat, dup care se las n repaus 20 de minute , apoi se centrifugheaz sau se filtreaz (Cojocaru i colab., 2001). Calculul rezultatelor: Pentru determinarea vitaminei B6 s-a pipetat ntr-un pahar conic 1 ml extract vegetal i s-a titrat cu reactivul Folin- Cioclteu pn la apariia unei coloraii a lbastre. Coninutul n vitamin B6 al materialului vegetal se calculeaz dup formula: X= 100 V1 V / a V2 unde: x- coninutul n vitamin B6 ( n mg/100g); V-volumul total al extractului vegetal (ml); a- masa materialului vegetal luat n lucru (g); V1- volumul soluiei de reactiv Folin Cioclteu consumat la titrare (ml) ; V2- volumul soluiei titrate (ml) ;

4.2.5. DOZAREA CANTITATIV A VITAMINEI P Pentru dozarea vitaminei P s-a ales metoda de titrare permanganometr ic, aceasta bazndu-se pe capacitatea vitaminei de a se oxida sub aciunea KMnO4.
50

n calitate de indicator s-a utilizat indigo-carmin care reacioneaz cu excesul de permanganat de K, dup oxidarea complet a vitaminei P (Cojocaru i colab., 2001). Reactivii utilizati: - soluie de KMnO4 , 0,05 N ; - soluie alcoolic de indigo -carmin 0,01%; Modul de lucru: Pentru determinarea vitaminei P s-a cntrit cte 5 g de material vegetal. Proba a fost mojarat i introdus n 50 ml de ap distilat la fierbere, ntr-un pahar Berzelius, timp de 2 minute. Paharul a fost apoi rcit cu ap de la robinet, iar coninutul acestuia a fost filtrat. Soluia obinut a fost adus la un volum de 100 ml cu ap distilat, dup care s -au luat 20 ml filtrat i sau introdus ntr-un pahar Erlenmeyer mpreun cu 10 picturi de indigo -carmin. n final s-a titrat cu soluie de KMnO4 0,05 N, pn la apariia unei culori galbene stabile n timp. n urma titrrii se citete cantitate de KMnO4 consumat. Calculul rezultatelor: Pentru a afla coninutul n vitamina (in mg) a unei cantitati de 100 g material vegetal analizat s-a aplicat urmtoarea formul: X= 3,2 A F 510/100,1100=160A unde: A-volumul soluiei de KMnO4 consumat la titrare ( ml ); F- factorul soluiei de KMnO4 stabilit n ziua determinrii;

4.2.6. DOZAREA ACTIVITII POLIFENOLOXIDAZEI Polifenoloxidaza sau o-difenoloxidaza (tirozinaza), joac un rol important n respiraia plantelor, cataliznd reacia de oxidare aerob a polifenolilor i derivailor acestora, c u formarea chinonelor corespunztoare. n procesul de respiraie chinonele sunt reduse de enzimele flavinice. La determinarea activitii acestor enzime trebuie s se in cont de faptul c, pentru crearea condiiilor ce ar mpiedica reacionarea fenolilor endogeni cu proteinele i enzimele, trebuie ca la primele etape de omogenizare s se adauge poliamid n raport de 1:1 ( raportat la masa materialului). Reactivii utilizai: -soluie tampon fosfat 1/15 M, pH 7,4 (9,073 g KH2PO4 se aduc la 1000 ml; 11,612 g K2HPO4 se aduc la 1000 ml). Cele dou soluii se amstec prin titrare pn la pH -ul dorit; -pirocatechin 0,05 M (0,1376 g la 25 ml) ;
51

Modul de lucru: O cantitate de 100-200 mg de material vegetal proaspt se mojareaz, mpreun cu 100 200 mg poliamid, n tampon fosfat, pH 7,4 i apoi se transfer ntr -un balon cotat de 25 ml. Se aduce la semn cu acelai tampon fosfat (acelai folosit la extracie) i 0,5 ml soluie de pirocatechin. Imediat dup adugarea substratului se pornete cronometrul. Se citete absorbana din 20 n 20 secunde, timp de 2 minute la lungimea de und de 240 nm. Citirile la spectrofotometru se fac fa de un control n care s -au introdus aceleai componente, cu excepia pirocatechinei care a fost nlocuit cu ap distilat. Calculul rezultatelor: Activitatea polifenoloxidazic se exprim n uniti convenionale (UC) pe gram de material vegetal i pe minut. Se calculeaz dup formula: Activitatea= (D2-D1)x 60 x v1 x v2/ (t2-t1) x v1 x g unde: D1- densitatea optic a primei msuri; D2- densitatea optic a ultimei msuri; t1- timpul primei msuri; t2- timpul ultimei msuri; v- volumul total al extractului enzimatic; v1- volumul de supernatant luat pentru msurare; v2- volumul total cuprins n cuva de citit; 60- coeficientul de trecere de la secunde la minute;

4.2.7.

DETERMINAREA

ACTIVITII

PEROXIDAZEI

PRIN

METODA

CU ORTO DIANISIDIN Determinarea activitii peroxidazei se bazeaz pe msurarea densitii op tice a produsului de oxidare a orto- dianisidinei cu ajutorul apei oxigenate, sub aciunea enzimei. Reactivii utilizai: - soluie tampon fosfat 0,4M, cu pH 5,9; - soluie de orto-dianisidin 1% n alcool etilic 96%; - soluie substrat n tampon fosfat; - soluie de ap oxigenat 0,05%; - soluie de acid sulfuric 50%;

52

Modul de lucru: a) extracia enzimei: 0,5 g material de analizat se mojareaz cu 10 ml tampon fosfat i se centrifugheaz 15 minute la 3000 G, supernatantul rezultat fiind folosit drept surs de enzim. b) determinarea propriu-zis: Reactivi (ml) Supernatant Orto-dianisidin tamponat Ap distilat H2SO4 Supernatant H2O2 Termostatare 5 minute la 200C H2SO4 Fotocolorimetrare la 540 nm 5 Proba 0,5 3 1,3 0,2 Martor 3 1,3 5 0,5 0,2

Calculul rezultatelor: Pentru a calcula activitatea enzimatic exprimat n uniti peroxidazice per gram de material biologic, se utilizeaz formula: U. P. / gram minut = ( E 10 10) / (0,0128 1000 5 v p) unde: E - extincia probei; 0,0128 - valoarea extinciei micromolare; v - volumul extractului peroxidazic n ml, luat pentru determinare; p - cantitatea de esut luat n lucru.

4.2.8. DETERMINAREA ACTIVITII DEHIDROGENAZELOR n proba de material biologic de analizat se adaug carbonat de calciu pentru neutralizarea acizilor care se formeaz n cursul incubrii i soluie de TTC care servete ca acceptor de hidrogen transferat de dehidrogenaze. Donorii de hidrogen sunt substane organice preexistente n materialul biologic sau/i glucoza. n prob nu se adaug toluen sau alt antiseptic deoarece activitatea dehidrogenazic se datoreaz microflorei vii care este capabil de proliferare.
53

n cursul incubrii TTC incolor se reduce sub aciunea hidrogenului transferat de dehidrogenaze la formazan care este de culoare roie. Formazanul se extrage cu solveni organici (etanol, metanol, aceton) i se determin spectrofotometric, intensitatea coloraiei fiind proporional cu activitatea dehidrogenazelor. Reactivii utilizai: - CaCO3 sicc., fin pulverizat; - soluie TTC 3%; - soluie glucoz 3%; - soluie de acid succinic; - soluie de acid malic; - soluie de acid -cetoglutaric; - soluie de acid izocitric; - soluie etalon formazan: ntr-un balon cotat de 50 ml se introduc 0,5 ml soluie TTC 3% si cca. 0,5g Zn pulverizat pentru reducerea TTC la formazan. Balonul se nchide i se menine la ntuneric timp de 2 5 zile. Dup acest interval de timp se introduce n balon, pn la semn, etanol sau aceton pentru dizolvarea formazanului. Cei 50 ml soluie corespund la 15 mg TTC, ceea ce nseamn c aceast soluie conine 13,44 mg formazan. Modul de lucru: La 15 g material biologic de analizat, mojarat cu sticla pisat se adaug 0,15 mg CaCO3, se amestec bine i se repartizeaz n patru eprubete. La determinarea activitii dehidrogenazei actuale, n materialul biologic nu se adaug substane organice drept donori de hidrogen. n consecin substanele organice preexistente n plant vor servi ca donori de hidrogen. Pentru determinare se va lucra cu do u eprubete coninnd cte 3 g material biologic de analizat amestecat cu CaCO3. n una din eprubete se introduc 0,5 ml soluie TTC i ap distilat fiart i rcit. Cantitatea de ap trebuie sa fie suficient pentru a satura materialul biologic i a forma un strat subire de lichid pe suprafaa amestecului de reacie. Se noteaz volumul necesar de ap (V) (de obicei sunt necesari 1 1,75 ml ap). n a doua eprubet, care servete drept martor, se introduc 3 g material biologic de analizat amestecat cu CaCO3 i 0,5 + V ml ap distilat fiart i rcit. Pentru determinarea activitii dehidrogenazei poteniale, peste probele de material biologic se adaug glucoz care, alturi de substan ele organice preexistente n acesta, va servi ca donor de hidrogen. n mod similar, s-au preparat o serie de probe utiliznd n calitate de substrat acidul malic, izocitric, cetoglutaric si succinic (Cojocaru, D. i colab., 2007).
54

Dup pregtirea amestecurilor de reacie toate eprubetele se nchid cu dopuri de plut i se introduc la incubat timp de 24 ore. Dup incubare n fiecare eprubet se introduce etanol sau aceton, n doze succesive de 8 - 10 ml. Lichidul se filtreaz, se completeaz la volum cunoscut i se determin intensitatea coloraiei la spectrofotometru, la lungimea de und de 485 nm. Echivalenele n formazan ale extinciilor se citesc de pe curba de etalonare.

4.2.9. DOZAREA ACTIVITII CATALAZEI Principiul metodei Apa oxigenat rmas nedescompus dup un anumit timp de incubaie cu catalaza, oxideaz iodura de potasiu conform reaciei: H2O2 + 2KI + H2SO4 2H2O + K2SO4 + I2 Iodul pus n libertate este titrat cu o soluie de tiosulfat de sodiu de concentraie cunoscut, n prezena amidonului ca indicator: I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 n paralel cu proba se realizeaz i un martor cu enzim inactiv de la inceputul incubaiei. Dinferena ntre numrul ml de tiosulfat de sodiu consumat la titrarea apei oxigenate n martor i numarul ml de tiosulfat de sodiu consumat la titrarea apei oxigenate rmas nedescompus n prob reflect activitatea catalazei din materialul cercetat. Reactivii utilizai: - soluie de tiosulfat disodic 0,1 M; - soluie tampon de fosfai de sodiu 0,2 M cu pH 7; - soluie tampon de fosfai de sodiu 0,06 M cu pH 7; - soluie de ap oxigenat 3%; - soluie de acid sulfuric 10%; - soluie de iodur de potasiu 15%; - soluie de molibdat de amoniu 1% ; - soluie de amidon 1%; - soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N; - soluie de tiosulfat de sodiu 0,02 N; Modul de lucru: Se cntrete 0,5 g de material vegetal fin omogenizat i se extrage cu 5 ml soluie de fosfat disodic 0,1 M, ntr-o eprubet d centrifug, timp de 60 de minute agitnd din 10 n 10
55

minute cu ajutorul unei baghete de sticl. Coninutul eprubetei se centrifugheaz timp de 15 minute la 3000 rpm. Supernatantul separat servete drept enzim (Cojocaru D. i colab., 2001). n dou flacoane conice cu gtul larg de 100 ml se msoar cte 6 ml soluie tampon fosfai de sodiu 0,05 M cu pH7. n cel de-al doilea flacon care va reprezenta proba se pipeteaz cte 0,1-2 ml extract enzimatic, iar n primul flacon care va servi drept martor se introduce acelai volum de ap distilat, echivalent cu cel de extract enzimatic luat n lucru. n ambele flacoane se adaug cte 0,2 ml soluie de ap oxigenat 3%. Dup agitarea coninutului, flacoanele se las n repaus la temperatura de 20 grade Celsius exact 5 minute din momentul pipetrii apei oxigenate. Aciunea catalazei asupra apei oxigenate se ntrerupe prin introducerea n f iecare flacon a cte 5 ml acid sulfuric 10%, apoi se adaug cte 5 ml soluie de KI 15% i o pictur de molibdat de amoniu 1 % i coninutul flacoanelor se agit cu atenie. Iodul eliberat n urma reaciei dintre apa oxigenat nedescomus enzimatic i io dura de potasiu se titreaz cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,02 N pn la culoarea galben-pai. n acest moment se adaug 2-3 picturi de amidon 1% i se continu titrarea pn cnd culoarea aprut la adgarea amidonului dispare complet. Cantitatea de ap oxigenat descompus sub aciunea catalazei se afl dup diferena ntre rezultatele titrrii martorului i probei. Calculul rezultatelor: Ca unitate de activitate a catalazei se consider acea cantitate de enzim care descompune ntr-un minut un micro mol de ap oxigenat (0,034 mg). ntruct la 1 ml soluie de tiosulfat de sodiu 0,02 N corespund 0,34 mg ap oxigenat, rezult c la numrul de ml soluie de tiosulfat reprezentnd diferena dintre titrarea martorului (V) i probei (v) vor corespunde x mg H2O2: X = (V-v) x F x 0,34 unde: V- numrul ml de soluie de tiosulfat de sodiu consumat la titrarea martorului; v - numrul ml soluie de tiosulfat de sodiu consumat la titrarea probei; F - factorul soluiei de tiosulfat de sodiu m; Cantitatea de ap oxigenat descompus n timp de 1 minut de catalaza dintr -un gram de material vegetal se calculeaz cu ajutorul formulei: X1 = (V-v) x F x 0,34 x 5 / 5 x p x n unde: p - greutatea materialului vegetal n grame; n - ml de extract enzimatic luai pentru determinare ;
56

Dac o unitate catalazic descompune un micromol de ap oxigenat ntr -un minut, atunci A uniti catalazice vor scinda X1 mg H2O2/min, de unde rezult c numrul de uniti catalazice/min/g se calculeaz cu formula: A = X1/ 0,034 = (V-v) x F x 0,34 x 5 / 5 x p x n x 0,034 = [ (V-v) x F / p x n ] x 10

4.2.10.

DOZAREA

CANTITATIV

PROTEINELOR

VEGETALE

SOLUBILE PRIN METODA BRADFORD

Pentru a avea o imagine complet asupra cantitilor de proteine ce exist n diversel e medii biologice, de-a lungul timpului s-au pus la punct diverse metode de dozare a cantitilor de proteine. Metodele de dozare a proteinelor se bazeaz pe spectrofotometrie. Sunt folosite att metode ce folosesc radiaii cu lungimi de und din domeniul vizibil ct i din ultraviolet. La baza acestor metode de dozare st Legea Bouguer-Lambert-Beer care guverneaz fenomenele de absorbie a radiaiei electromagnetice la strbaterea unui strat omogen de substan. Dei exist cteva substane ce dau o uoar interferen, colorantul are o afinitate n general bun pentru diversele tipuri de proteine purificate i astfel metoda este strict cantitativ. Metoda mai poate fi ntlnit i sub denumirea de metoda BIO-RAD dup numele firmei care comercializeaz cele mai rspndite kit-uri folosite la determinarea proteinelor prin acest procedeu. Reactivii utilizai: -colorant SERVA BLUE G 250; -0,05mg/ml (50g/ml) albumin seric bovin (ASB) (5 mg ASB la 100 ml); -alcool etilic 96%; -acid fosforic 89%; sau kit-ul BIO-RAD cu reactivi gata preparai; Modul de lucru: 1. Prepararea soluiilor a. Soluia colorant BRADFORD - se prepar prin dizolvarea a 10 mg colorant SERVA BRILLIANT BLUE G 250 n 10 ml etanol 96%, se adaug apoi 9,8 ml acid fosforic 89% i se completeaz la semn (100 ml) cu H2O bidistilat. Se va stoca la frigider fiind stabil cteva sptmni cu precizarea ca att imediat dup preparare ct mai ales dup o stocare mai mult sau mai puin ndelungat poate fi necesar o filtrare prin hrtie de filtru cantitativ (recomandat Whatman nr.1). b. Soluie albumin seric bovin (ASB) 5 mg% - se prepar prin dizolvarea a 5 mg albumin seric bovin n 100 ml ap bidistilat. Se recomand precauie la agitarea
57

balonului cotat n care se prepar soluia pentru a nu se crea spum ce mpiedic prepararea volumului exact de soluie (este dificil de adus la semn). 2. Analiza propriu-zis se pipeteaz soluia proteic (maximum 500 l) n eprubet; se adaug tampon de experien pn la volumul de 500 l; se adaug 1,5 ml soluie de lucru Bradford i se amestec; citire la =595 nm dup cel puin 5 min. dar mai nainte de 1 or (recomandabil ntr-un interval de maximum 25 minute de la adugarea colorantului), fa de controlul reactivilor care se face n acelai mod ca i proba cu excepia adugrii soluiei proteice care este nlocuit cu tamponul de experien. 3. Trasarea curbei etalon o curb etalon cu probe de concentraie cunoscut pregtit n paralel cu probele

necunoscute este esenial pentru aprecierea concentraiei proteinei. De asemenea, probele se vor executa n mai multe exemplare pentru o mai bun omogenitate a rezultatelor (recomandabil ar fi cinci exemplare). Folosirea aceleai cuve pentru citirea probelor implic necesitatea citirii nti a probelor cu concentraia mai mic i apoi a probelor cu concentraia mai mare, aceasta pentru a reduce erorile cauzate de rmnerea complexului colorat pe pereii cuvei, ca rezultat al incompletei scurgeri. se recomand adugarea treptat a colorantului peste probe deoarece complexul colorat se formeaz secvenial (culoarea se dezvolt continuu). Probele se vor citi respectnd ordinea n care au fost fcute. Fiecare analiz a unei noi proteine va fi nsoit de trasarea unei noi curbe etalon. precauii trebuiesc avute n vedere pentru a ne ncadra n intervalul de liniaritate depirea acestuia putnd duce la apariia unor erori mari. pentru trasarea curbei se vor folosi mediile valorilor obinute pentru fiecare concentraie. curba etalon pentru aceast metod rmne liniar n domeniu l valorilor: 2,5g i 15g de ASB. Dac extincia probei necunoscute este n afara acestor limite atunci eroarea va fi foarte mare. Alt consecin a intervalului de liniaritate este aceea c pentru trasarea curbei accentul mai mare trebuie pus pe punctele din interiorul intervalului de liniaritate i mai puin pe punctele extreme. Este de asemenea posibil exprimarea cantitii de ASB msurat de-a lungul axei X sub form de concentraie.

58

4. Comentarii Culoarea este complet dezvoltat dup 5 min., dar precipitarea ncepe dup 10-15 min., n special n cazul concentraiilor proteice mari, datorndu-se tendinei proteinelor de a precipita n mediu acid. Dac probele sunt citite ntr-un interval de 10 min. fa de standarde erorile datorate pierderii culorii vor fi sub 2%. Se recomand folosirea cuvelor din sticl deoarece colorantul ader foarte bine. Acestea se pot spla cu metanol, apoi cu detergent concentrat, apoi cu ap i aceton sau prin nmuiere cu HCl concentrat peste noapte. Dac extincia probei este peste intervalul de liniaritate se va dilua proba n mod corespunztor i se va dilua i controlul n acelai raport (dar nu mai mare volumul de 5 ml) sau mai bine se va reface analiza folosind o soluie diluat de analizat i se va ine seama de gradul de diluie. Rezultatele analizei variaz funcie de proteina pur folosit la trasarea curbei etalon i vor fi mai bune folosind pentru curb chiar proteina de dozat dac aceasta este disponibil ca reactiv. ASB este cel mai comun standard proteic, dei s-a artat de mai multe ori c rspunsul ASB este atipic. Ovalbumina reprezint un standard mai bun. Soluiile proteice vechi duc la reducerea absorbanei. Metoda BRADFORD poate fi, de asemenea utilizat pentru proteine imobilizate pe coloane sau imobilizate pe membrane.

59