Curs 11 Acizi nucleici

Tipuri de acizi nucleici Componeni structurali ai acizilor nucleici Structra primar covalent a acizilor nucleici Conformaia moleculei de ADN Denaturarea i renaturarea ADN Hidroliza ADN Organizarea superioar a ADN
Structura teriar ADN Cromozomii eucariotelor Distribuie ADN

Ce sunt acizii nucleici ?

Sunt produi de policondensare a nucleotidelor;

Pstreaz i mijlocesc transferul de informaie

genetic n lumea vie.

Dogma central a biologiei moleculare

ADN conine informaia genetic sub forma unor secvene de nucleotide
Replicare
Transcriere Traducere

ADN

ARNm

Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este transferat celulelor fiice.

Tipuri de acizi nucleici

ADN ARN
ARNm, ARNt, ARNr, ARN de mici dimensiuni, miARN, siARN

 ADN
stocheaz o cantitate mare de informaie cu privire la biosinteza proteinelor

informaia poate fi accesat imediat

 ARN :
mesager: transfer informaia din nucleu n citosol n form de secven de nucleotide de transport: face legtura ntre ARNm i aminoacizi; Ribozomal: intr n structura ribozomilor (complexe ribonucleoproteice, sediul biosintezei proteice); de mici dimensiuni: rol n excizia intronilor

Componenii structurali ai acizilor nucleici

Pentoza sub forma ciclic b-furanozic
Acidul fosforic (H3PO4) Bazele azotate: purine i pirimidine

Riboza i dezoxiriboza sub forma ciclic b-furanozic

HC H H
H

O OH OH
OH

HC H H C C

O OH OH
H

C C C

OH OH O OH
H OH

C C
C

H H

HOH2 C

HO CH2 C
OH

HO CH2 C

OH -D ribofuranoz

OH

H2C

OH D-Riboza

Baze azotate
6 1N 2 N 3 4 Purin 5 7 N 8 NH 9 4 3N 2 5 6 N 1 Pirimidin

Tautomeria lactam lactim a bazelor azotate

Formele lactam sunt mai stabile
O C NH forma lactam OH C N forma lactim

Tautomerie imino-amino
NH2 N C forma amino NH NH C forma imino

Purine

Adenina Guanina

Pirimidine
OH N HO HN HO O N OH CH 3 HN O CH 3

N O NH Lactim Lactam Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) NH2 N HO N Lactim

N O NH Lactim Lactam Timina (5-metil-uracil) NH2 N

NH Lactam

Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)

Legtura N-glicozidic numerotare atomi ????

Nucleozide (ribo- i dezoxiribonucleozide)

Ribonucleozidele
NH2 N N HO H2 C N 9 N O N O NH NH2 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH OH Adenozin (A) NH2 N 1 5` O N HO H2 C O 4` 1` 3` 2` Citidin (C) OH OH 1 N O Uridin (U) OH OH

OH OH

Guanozin (G) O NH O

HO H2 C

Dezoxiribonucleozidele
NH2 N N HO H2 C N 9 N O N 9 5` N N HO H2 C O 1` 4` 2` 3` OH H Dezoxiadenozin (dA) NH2 N O 5` HO H2 C O 1` 4` 3` 2` OH H Dezoxicitidin (dC) 1 N O NH NH2

HO

H Dezoxiguanozin (dG) O

H3 C 1 N O

NH O

HO H2 C

OH H Dezoxitimidin (dT)

Nucleotidele
Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
NH2 O O- P OO b O P OO O P OO 5` O 4` 1` 2` 3` OH X AMP (adenozinmonofosfat) ADP (adenozindifosfat) ATP (adenozintrifosfat) N N N X=H Dezoxiriboz X=OH Riboz N Adenin Adenozin sau Dezoxiadenozin (nucleozide)

Proprietile nucleotidelor i nucleozidelor

sunt stabile n mediu bazic Solubilitatea nucleotidelor n ap este mai mare dect a nucleozidelor Nucleotidele prezint absorban maxim la 260 nm, la pH = 7

Conformaia nucleotidelor i nucleozidelor

Determinat de:- flexibilitatea ribozei

PO
4`

5`

2`

PO Baz
1`

5` 4`

3`

O
3`

Baz
1`

. 7,0 A

PO

C-2` endo "South"

. 5,9 A

PO C-3` endo "North"

2`

-n funcie de orientarea bazelor azotate fa de legtura N-glicozidic conformerii anti i syn

Nucleotide naturale libere

Rolurile lor n esuturi:
-compui macroergici (ATP, GTP); -acceptori de fosfat n fosforilarea oxidativ (ADP); -efectori alosterici ai activitii enzimelor;

-componeni structurali ai coenzimei FAD

NH2 N O CH 2 H3C N N NH H3C N O
lumicrom lumiflavin riboflavin (H) (H) (H) (H) flavin adenin dinucleotid (FAD) (OH) adenozin 5`-monofosfat (AMP)

N N

O P O
-

CH CH CH CH 2 O OH OH OH

P O O
-

O H2 C

N O

O OH OH
adenozin

flavin adenin mononucleotid (FMN)

 componeni structurali ai coenzimelor NAD+, NADP+

CONH 2

COOH

CONH 2 O

O P O O

H2 C O
-

N O

N Acidul nicotinic (niacina)

N Amida acidului nicotinic (niacinamida)

NH2 OH OH
-

N N

P O O

N N

H2 C

OH O R
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)

(R = H formeaz NAD+ ; R = -PO3H2 formeaz NADP+)

mesageri secunzi (AMPc i GMPc);

 donori ai gruprilor metil

Metilxantinele
(compui naturali cu proprieti farmacologice)
O HN 1
3 7

O H3 C O N N CH 3

CH 3 N N Cofeina (1,3,7-trimetilxantina)

N NH NH Xantina (2,6-dioxipurina)

O H3 C N N CH 3 N HN O NH Teofilina (1,3-dimetilxantina) O N CH 3 O

CH 3 N N Teobromina (3,7-dimetilxantina)

Analogi structurali sintetici ai

bazelor azotate, nucleozidelor i nucleotidelor

Inhib sinteza ADN Sunt folosii n chimioterapie

O F N 5 O HO H2 C O SH 2` OH N3 OH Azidotimidina 5-Iodo-2`-deoxiuridin H2 N N 6 N N NH HN N 5 O I N SH 6 N 9 NH

O NH 5-Fluorouracil HO H2 C T imin O

N 6-Mercaptopurina

6-Tioguanina

O HN O HO H2 C O N 6N O HO H2 C N

NH2

O HN 6 N
8N

CH 3 N N S N 6 NO2 N
8

N O HO

H2 N

NH

8-Azaguanina HO N 6 9 N NH

OH OH 6-Azauridin

OH Arabinozil citozin

N Alopurinol

NH N Azatioprin

Structura primar covalent a acizilor nucleici

Nucleozidele legate fosfat diesteric formeaz: -oligonucleotide -polinucleotide Polinucleotidul ARN conine:
b-Riboz i A, G, C, U

Polinucleotidul ADN conine:

b-Dezoxiriboz i A, G, C, T

N
O O
-

NH
G

P
O
-

5`

5` GCA 3`
NH2

N
O
3`

NH2

X
O O C O
-

N CH 2
3`

P
O

N
O

NH2
X O

N
A O

NH

P
O
-

CH 2

N
O

3` 3`

OH

 Cine determin diversitatea polinucleotidelor ???

Polaritatea catenei
5`

O CH 2 5` 3` B1 B1 3` P B2 B2 5` P B3 B3 5` O 5`

3`

P
5` 3` 3`

P
5`
3`

3` O

3` CH 2 O

5`

Conformaia moleculei de ADN; tipuri de conformaii

Structura secundar de dublu-helix a ADN

a fost propus de

Watson i Crick

-analiza cromatografic
n toate tipurile de ADN numrul de baze purinice este egal cu

cel de baze pirimidinice

A+G=T+C

-difracia razelor X, efectuat pe cristale de ADN

existena a dou perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare de 34 i una mic de 3,4 .

Dou catene antiparalele (una cu polaritate 5-3 i cealalt antiparalel cu polaritatea 3-5) complementare nu identice
formeaz o dubl helice cu orientare dreapt
O H2 C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O O Dezoxicitidin CH 2 O H O H2 C O N O H O Dezoxiadenozin O Dezoxitimidin H2 C O N A N H N T N H O N N H O N H N C N H O N O H N H

 Dublul helix cu conformaiile

A B Z

Caracteristici structurale ADN forma B

2 catene complementare NU identice, formeaz o scar n spiral cu 10 trepte; Scheletul extern al dublului helix:
cicluri de riboz legate fosfat diesteric,
ionizat i ncrcat negativ la pH fiziologic;

Bazele azotate, sunt orientate spre interior i perpendicular pe axul helixului.

ADN forma B
3,4 ; 34 ; 20

Polaritatea catenei
5`

O CH 2 5` 3` B1 B1 3` P B2 B2 5` P B3 B3 5` O 5`

3`

P
5` 3` 3`

P
5`
3`

3` O

3` CH 2 O

5`

O H2 C O N O H Dezoxiguanozin H G N N H O N H N N O H N

C N O

H O

Dezoxicitidin CH 2 O

H O H2 C O N
HO

N A N

N N

O H N T N O O H2 C Dezoxitimidin

Formele structurale A i Z ale ADN

Conformaia de tip A, mai compact : - dubl helice dreapt; -pasul helicei este de 28 ; - numrul de baze per tur 11; -predomin conformerii anty.

 Conformaia de tip Z: -corespunde la o helice stng; -12 perechi de baze per tur; -pasul helicei aproximativ 57 ; -ntr-o succesiune GC dezoxinucleotidul guaninei adopt conformaia syn iar cel al citozinei pe cea anti, ceea ce face ca lanul s evolueze n zig-zag ntre cele dou conformaii. In vitro, structura Z modific interaciunile ADNproteine, importante n replicare, transcriere, repararea leziunilor ADN.

Denaturarea ADN

Ruperea legturilor de hidrogen i a interaciunilor van der Waals dintre catenele moleculei ADN aflate n soluie.

Renaturare ADN

Denaturare ADN

Ce factori influeneaz denaturarea ?

creterea temperaturii (topire);
la valori extreme de pH
(molecula de ADN este stabil la pH-uri cuprinse ntre 4 i 10);

modificarea triei ionice;

prezena formaldehidei ;

Proprieti fizice ale ADN care se modific prin denaturare

scade vscozitatea;
crete absorbana la 260 nm.

Efectul hipercrom
Prin denaturarea ADN-ului, creste capacitatea de absorbtie a acestuia la l=260 nm.

Compoziia ADN n baze azotate influeneaz temperatura de topire

Hipercromicitate (l=260)

1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0 70 80

100

Denaturare (%)

G:C A:T

A:T G:C

75 50 25 0

Tm

90

100

Renaturare
Refacerea duplexului ADN prin legarea catenelor complementare Renaturarea depinde de: -temperatur; -concentraia catenelor complementare. Renaturarea este proces folosit n tehnica hibridrii -determinarea poziiei intronilor n molecula ADN -evidenierea deleiilor cromozomiale.

Curs 5
Hidroliza acizilor nucleici Distribuie ADN Structura teriar ADN Cromozomii eucariotelor Tipuri ARN, roluri

Hidroliza acizilor nucleici

Chimic sau Enzimatic ADN este rezistent la hidroliza bazic ARN este hidrolizat n mediu bazic
O H2C
5` O O O 5`

O H2C
2` O
-

O
2`

3`

B1

5` O O O
-

3`

H2C
B1 5` O

3`

2`
2-

B1

+ H2O

PO3

OH

+ OH B2 OH
5` 3` 2`

OH B2 OH
5`

B2 OH

Hidroliza enzimatic
Nucleaze: -exonucleaze (ADN polimerazele I i III) -endonucleaze endonucleaze de restricie (restrictaze) evideniate la bacterii recunosc secvene nucleotidice numite palindroame taie ADN dublu catenar nemetilat la resturile de A sau C

Enzima Secvena recunoscut BamH I 5`-G GATCC-3` BglII EcoR I 5`-A GATCT-3`
5`-G 5`-GAT 5`-A 5`-GTT 5`-CAG 5`-T

Sursa Bacillus amyloliquefaciens H Bacillus globigii Escherichia coli RY13

5`-G AATTC-3`

EcoRV

5`-GAT ATC-3`

Escherichia coli B946

Haemophilus influenzae Rd Thermus aquaticus

Hind III 5`-A AGCTT-3` Taq I 5`-T CGA-3`

5`---AAGCTT---3` 3`---TTCGAA---5` Hind III 5`---A 3`---TTCGA 5`

5`

5`---TGGCCA---3` 3`---ACCGGT---5` Bal I

5`---GAGCTC---3` 3`---CTCGAG---5` Sst I 5`---GAGCT3` C---3` 3`---C 3`TCGAG ---5`

AGCTT---3` A ---5`

5`---TGG 3`---ACC

CCA---3` GGT---5`

Formare ADN recombinant

ADN1 5`---GAATTC---3` 3`---CTTAAG---5` EcoRI 5`---G 3`---CTTAA AATTC---3` G---5` 5` 3` 5` 3` ADN2 GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G 3` 5` 3` 5`

Renaturarea fragmentelor ADN si sudarea lor de ctre ADN-ligaz 5`---GAATTC 3`---CTTAAG 3` 5` 5` 3` GAATTC---3` CTTAAG---5`

Molecule de ADN recombinant

Separarea fragmentelor ADN rezultate din aciunea enzimelor de restricie

Electroforaza pe gel de poliacrilamid pentru fragmente <500 perechi de baze Electroforaza pe gel de agaroz pentru fragmentele cu dimensiuni mai mari

Hri de restricie

Cursul 12 Distribuia i dimensiunile ADN Structura superhelicoidal a ADN Replicare Mutaii Repararea mutaiilor

Distribuia i dimensiunile ADN

ADN are form liniar sau circular

Moleculele ADN dintr-o celul alctuiesc cromozomii acelei celule.

 Ce sunt genele ? secvene nucleotidice care conin informaia cu privire la sinteza unui singur lan polipeptidic sau a unei singure molecule de ARNr sau ARNt

Genom = totalitatea genelor din cromozomii unei celule.

Dimensiunile ADN
La procariote,
ADN circular = un cromozom cu

4 x 106 p.b.

E. coli ADN ~ 1,6 mm diametrul celulei ~ 2 mm

La om: cel mai scurt cromozom 34 x 106 cel mai lung 263 x 106

p.b.

Lungimea moleculelor ADN dintr-o singur celul uman este de ~ 2 m

Distribuie ADN
La procariote:
-ADN cromozomial

Plasmide (ADN extracromozomial, circular)

-molecule mici care trec uor prin membrana celulei gazd -conin o cantitate redus de informaie genetic -conin gene care specific proteine, ce confer bacteriei rezistent la antibiotice -se autoreplic extrem de rapid i autonom fa de ADN cromozomial.

La eucariote
ADN se afl n nucleu.
1% din ADN celular total se afl n mitocondrii i este circular 5-10% din ADN este codificator pentru proteine i ARN

Genele sunt formate din exoni i introni (discontinuitatea

genelor); excepie histone i interferon

 Dup gradul de repetare al secvenelor nucleotidice:

60% din ADN celular sunt secvene ADN nerepetitive, unice; codific proteine 20% din ADN sunt secvene cu grad mediu de repetare (zecisute copii/celul); codific ARNr, ARNt, histone

10% din ADN cu grad foarte mare de repetare (mii de copii/celul); se afl n centromere i telomere;
au rol structural n cromozomi

Structura superhelicoidal a ADN

Suprarsucirea moleculei ADN n jurul axei proprii

Suprarsuciri spre stnga (superhelix negativ)

Suprarsuciri spre dreapta (superhelix pozitiv)

Helix circular normal

Desrsucirea unei spire

Legare capete

ADN circular cu suprarsucire pozitiv spre dreapta

ADN normal ADN partial desrsucit

Axa de suprarsucire

Axa de suprarsucire

Topoizomerazele
Topoizomeraza I, nu necesit ATP
Topoizomeraza I Tyr OH P Incizie si legare la enzim Topoizomeraza I Tyr 5` O P OH 3` Rotirea captului 3` Topoizomeraza I Tyr 5` O P OH 3` Enzima Disocierea enzimei P

Giraza (Topoizomeraza II)

Necesit ATP i face incizii n ambele catene; introduce suprarsuciri negative

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

ADN suprarsucit

 Topoizomerazele I i II menin n celulele vii un grad potrivit de superhelicitate negativ.

antibiotice care inhib ADN-giraza suprim creterea i dezvoltarea bacterian:

acid nalidixic (negram) derivaii si fluorurai (norfloxacin, ciprofloxacin),

Cromozomii eucariotelor
Cromatina (cromozomii interfazici)=material amorf prezent n nucleu n interfaz; conine ADN, proteine, ARN

Cromozomii sunt complexe ADN-proteine rezultate prin condensarea cromatinei n timpul mitozei
Fiecare cromozom conine o molecul ADN liniar Nr. Cromozomilor variaz de la o specie la alta (celulele somatice umane conin 46 cromozomi; 23 perechi)

 Histonele = proteine bazice

interacioneaz ionic cu anionii fosfat din

ADN

Sunt 5 tipuri de histone

Histone bogate n lizin: H 2 A i H 2B Histone bogate n arginin: H 3 i H 4 care intr n structura nucleozomului Histone de legtur H1 care leag nucleozomii ntre ei.

Nucleozomii = unitatea de baz a cromatinei

grad de compactare pentru ADN egal cu 7 Cilindru: 11x11x5,5 nm 140 pb se rsucesc de 2 ori n jurul octamerului histonic

Miezul nucleozomului ADN de legtur

(H2A, H2B, H3, H4)2

ADN Histona H1

Solenoizii asigur o scurtare de 40 de ori a formei B a ADN

Protein nuclear Fibra de 30 nm

Cromozom

ADN

Octamerul histonic Histone + ADN

Histona H1

ADN

Caracteristicile structurale ale ARN

Structura primar: H3PO4 b-riboz, A,G,U,C
se leag covalent ribonucleozidtrisfosfai

Structura secundar ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare

Bucl cu baze nemperechiate

Segment cu baze complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel de G diferit de cel n C

 Rolurile diferitelor tipuri de ARN

 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime.

-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S

ARNr

-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic

-reprezint ~80% din ARN celular total.

Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor
Ribozomii = complexe ribonucleoproteice

ARNr + proteine
-proteinele: au roluri catalitice sau sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm i aminoacil~ARNt la ribozomi

Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i

ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri: -situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid; -situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan polipeptidic; -situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt liber.

Ribozom 70 S

ARNt
E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt
Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

Structura ARNt (solubil sau adaptor) conine ntre 75 i 90 ribonucleotide; raportul A+G/U+C este apropiat de 1; prezint o conformaie n foaie de trifoi are cel mai mare coninut de baze minore
(baze azotate modificate structural prin: metilri, tiolri, hidrogenri, dup sinteza ARNt)

Situs de legare aminoacid

a)

3`

CCA

Brat T C

b)

5` 3`

5` Perechi de baze complementare Bratul DHU Bratul DHU Brat T C

Bratul variabil Bucla anticodon Anticodon Bratul anticodon

O NH HO H2 C N
O

O H3C NH N O O HN HO H2 C

O NH O O

HO H2 C

OH OH Dihidrouridin (DHU)

OH OH Ribotimidin (T) S NH N O N O

OH OH Pseudouridin O NH N

HO H2 C

N O

HO H2 C

HO OH 4-Tiouridin

OH OH Inozin

Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i

i transport, la ribozomi, sub forma

complexelor aminoacil~ARNt

 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de pe ARNm prin

recunoaterea codon-anticodon, pe baza complementaritii bazelor

3` A ~ aa1
C C

3` A ~ aa2
C C

5`

5`

Anticodon 3` C C G 5`

Anticodon 3` A G U 5`

GGC 5` Codon 1

UCA Codon 2 3`

ARNm

ARNm
Structur

-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri sau template (necodificatoare). -ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic. ADN 5` - G C A T T A T G C - 3` 3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN

5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite

codoni este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot
este poligenic sau policistronic; ntre gena transcris, ARNm i protein exist o relaie de colinearitate

ARNm eucariot
este monogenic; nu este relaie de colinearitate: gen-ARNm-polipeptid gena pentru sinteza ARNm cuprinde exoni (expressed regions) i introni (intervening sequences); ARNm matur care trec n citoplasm este prelucrat prin excizia intronilor; ARNm eucariot are o via de ordinul orelor, n timp ce ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3 minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni (small nuclear RNA)

Este bogat n uridin (U1, U2, U4, U5, U6). se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

prin asociere cu proteine, genereaz ribonucleoproteine (small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP ( denumite snurps), cu rol n: -excizia intronilor din ARNm transcript primar; -controlul traducerii.