ANTIBIOTICE

Antibioticele sunt substante chimice produse de microorganisme sau obtinute prin sinteza sau semisinteza care, in doze foarte mici, inhiba dezvoltarea microorganismelor patogene. Dupa descoperirea microbilor de catre L. Pasteur (186 !, s"a observat ca anumite specii microbiene se apara de alte specii prin producerea unor substante chimice nocive. Acest fenomen a fost denumit antibioza, iar substantele chimice rezultate din metabolismul celulelor vii poarta denumirea de antibiotic. #n 188$ %.&abes semnaleaza la randul sau, actiunea inhibanta a unor substante produse de microorganisme, sugerand posibilitatea utilizarii acestora in scop terapeutic. Primul antibiotic " Penicilina " a fost descoperit in 1'(' de catre )leming. *estele asupra actiunii terapeutice ale Penicilnei sunt realizate de catre )lore+ si ,hain abia in 1'-."1'-1, fiind primul antibiotic utilizat in tratamentul uman. / alta mare descoperire in domeniu apartine lui 0a1sman, care in 1'-- descopera Streptomicina , compus ce ofera tratamentul tuberculozei, fiind activa impotriva bacilului declansator si anume Mycobacterium tuberculozis. #n 1'$."1'$2 sunt izolate Oxitetraciclina si Tetraciclina apoi in1'6. Rifampicina. Dezvoltarea chimiei instrumentale a permis determinarea structurii produselor naturale astfel ca apar, primele produsele de semisinteza Penicilinele de semisinteza, apoi cele ce se obtin prin sinteza totala. 3umarul foarte mare de antibiotice cunoscute (naturale sau sintetice!, a pus problema clasificarii acestor produse. 4"au propus mai multe criterii de clasificare, dupa cum urmeaza5 a! functie de natura microorganismului producator sunt antibiotice produse de 5 bacterii (Gramicidina, Bacitracina, Polimixinele etc.! actinomicete ( Streptomicina, Neomicina, anamicina etc.! fungii ( Penicilina, Grizeoful!ina etc.! b! functie de structura chimica sunt compusi cu structura alifatica, aromatica, heterociclica etc. c! functie de biogeneza pot fi produse derivate din aminoacizi ( Penicilinele!, din unitati acetat (Grizeoful!ina!, din glucide (Streptomicina! etc. d! functie de actiunea farmacologica antibioticele se clasifica in antibacteriene, antifungice, antivirotice, antituberculoase etc. 1

Principalele clase de antibiotice

Antibioticele se grupeaza in sase categorii principale, clasificare bazata pe structura lor chimica, la care se adauga o categorie definita ca 6alte antibiotice7. ,ele sase clase importante sunt5 Antibioticele "lactamice (penicilinele si cefalosporinele!, sunt produse la un nivel de 1."(.1t8an (an de referinta 1'8$!9 pretul Penicilinei : este de ($"2.;81g9 e<ista peste $. de firme producatoare. *etraciclinele sunt produse de 2."-. de firme la un volum de $"1. 1t8an. Pretul o<itetraciclinei este de ($"2.;81g. =acrolidele, al caror cel mai important si cunoscut reprezentant este eritromicina, se produc la un volum de 2"$ 1t8an, de catre (."2. firme producatoare9 pretul eritromicinei este de 1.."1(.; 81g. Peptide si glicopeptide (bacitracin, colistin, enram+cin, gramicidin, nisin, pol+mi<in, and thiopeptin! productie de ("2 1t8an, de catre 1."(. firme producatoare9 pretul bacitracinei este de 1$;81g. Aminoglicozide (streptomicina, neomicina, 1anamicina, gentamicina etc! se produc la un volum de 1" ( 1t8an, de (."2. firme9 pretul streptomicinei este de 2.;81g. Polieterii se produc la un volum de 2"$ 1t8an de 1."(. producatori. Alte antibiotice (amphotericin, anticancer (inclusiv bleom+cin, daunorubicin, do<orubicin, epirubicin, and mitom+cin!, blasticidin, clindam+cin, c+closerine, flavom+cin, griseofulvina, novobiocin, n+statin, pimaricin, pleuromutilin, p+rrolnitrin, rifampicina, spectinom+cina, vancom+cin, viom+cin si virginiam+cin! se produc in cantitate de 1"( 1t8an.

PENICILINELE
Penicilinele fac parte, alaturi de cefalosporine din categoria antibioticelor >"lactamice, care se obtin din activitatea unor clase de fungii5 Penicillium cryso"enum, P.notatum, #sper"illus ni"er, #. "i"anteus. Penicilinele au o structura biciclica, tiazolidin">"lactamica. )unctie de radicalul amidic se deosebesc diferitele tipuri, cei mai cunoscuti reprezentanti fiind Penicilina : (benzil"penicilina!, respectiv Penicilina % (feno<imetil"penicilina!.

Penicilina G electrofili si sunt inactivate de penicilinaza, respectiv acilaza.

Penicilina $

=a?oritatea produselor de biosinteza sunt sensibile la atacul agentilor o<idanti, nucleofili si Penicilinele au o actiune bacteriostatica si bactericida, provocand tulburari de nutritie si de metabolism celular, fiind active impotriva germenilor gram (@!. Mecanismul biosintezei Desi penicilinele au fost primele antibiotice descoperite, mecanismul biosintezei nu este pe deplin elucidat. #n molecula lor se gasesc trei compusi de baza5 L"valina, L" cisteina si un acid substituit, iar in miceliul de P.cryso"enum a fost identificata o tripeptida5 A" aminoadipil"cisteinil"valina. ,a urmare, au fost emise doua ipoteze referitoare la biosinteza penicilinelor, care presupun formarea din glucoza a celor doi aminoacizi (valina si cisteina!. ,onform unei teorii, aminoacizii formeaza impreuna cu acidul B"aminoadipic tripeptida identificata, care, printr"o serie de tranformari ulterioare onduce la formarea acidului 6"amino"penicilanic, din care diferitii reprezentanti se obtin prin amidare in prezenta precursorului specific. ,ealalta teorie considera ca aminoacizii sufera o serie de transformari chimice, formand acidul 6"amino"penicilanic, din care penicinele se obtin prin reactie cu precursorul specific. Te%nolo"ia de obtinere a penicilinelor de biosinteza este comuna, in mare parte, tuturor antibioticelor de biosinteza. ,ompozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza. &iosinteza unei molecule comple<e, cum este penicilina, necesita un flu< de energie din e<terior9 procesul de biosinteza a penicilinei fiind unul endoterm, se poate realiza numai daca se desfasoara simultan si 3

procesul de o<idare a hidratilor de carbon, care constituie principala sursa de energie. Acest proces de o<idare elibereaza insa o cantitate de energie mai mare decat cea necesara biosintezei propriu"zise, ceea ce face ca in ansamblu, procesul sa aibe un caracter e<oterm. (#n perioada de crestere se elibereaza spre e<terior o cantitate de 16.. 1C8mol glucoza consumata, iar in perioada de producere a penicilinei doar 66 1C8 litru mediu!. ,um viteza de consum a hidratilor de carbon are loc in ordinea glucazaDacid lacticDlactoza, rezulta ca in faza de crestere a masei celulare se consuma glucoza, iar in perioada de formare a penicilinei lactoza. Prin urmare, mediul de cultura trebuie sa asigure necesarul de glucoza si lactoza pentru desfasurarea normala a intregului proces. 3ecesarul de azot este asigurat prin adaos de azot organic, provenit din e<tract de porumb, la care sepoate adauga e<tract de dro?die, caseina, srot de soia, respectiv saruri de amoniu. Prezenta sarurilor minerale este vitala in perioada de crestere a masei celulare, deoarece ele afecteaza direct permeabilitatea membranei celulare si echilibrul ionic si activeaza sistemele enzimatice. 3ecesarul de microelemente pentru sinteza penicilinei :, in mg8 litru mediu, este5 Elementul F =g P )e 4 )aza de crestere celulara -. 8 8. ..( . )aza de sinteza a penicilinei -. 8 (.. 1..

Diri?area procesului de biosinteza spre o anumita penicilina se face cu a?utorul unor substante, care constituie catena laterala a structurii amidice si poata denumirea de precursori. Precursorii se adauga in portiuni, deoarece in concentratii mai mari de ..1"1.(G devin to<ice pentru microorganismele producatoare. Procesul de fermentatie se realizeaza la temperatura de (6H1 .,, in fermentatoare cilindrice, verticale, echipate cu agitatoare turbina sau elice, dispozitive sparge"val, termocuple, filtru individual de sterilizare pentru aerul tehnologic si dispozitiv de transvazare aseptica. %olumele fermentatoarelor (inoculator, intermediar, regim! cresc in raport zecimal (e<. .,$ m2, $ m2, $. m2!. *emperatura de (6H1., este o temperatura de compromis, deoarece nu corespunde nici vitezei ma<ime de crestere, care este de 2..,, si nici vitezei ma<ime de productie de antibiotic, care este (-.,. PI"ul mediului afecteaza viteza reactiilor enzimatice, respectiv permeabilitatea membranei celulare si se mnetine in intervalul 6,-" .

Procesul de biosinteza a penicilinei fiind aerob, alimentarea cu o<igen este unul din factorii decisivi, iar dizolvarea acestuia trebuie realizata cu o viteza care sa asigure necesarul de o<igen corespunzator vitezei ma<ime de crestere. #n vederea intensificarii dizolvarii o<igenului in mediul de cultura, se recomanda barbotarea aerului concomitent cu agitarea mediului. %iteza de dizolvare a o<igenului creste cu turatia agitatorului, dar aceasta nu poate depasi anumite limite, deoarece apare pericolul deteriorarii mecanice a biomasei. ,riteriul care caracterizeaza intensitatea agitarii este timpul de amestecare, definit ca timpul in care se realizeaza egalizarea concentratiei in toata masa de lichid din fermentator. ,unoasterea timpului de amestecare permite programarea regimului de amestecare in functie de acumularea de biomasa, creandu"se conditii pentru o fermentatie optima. Aerul utilizat trebuie sa fie perfect steril, sterilizarea se face prin filtrare pe material fibros. )ermentatia dureaza 1(."1($ de ore si se considera terminata atunci cand continutul de zahar scade la .,(".,6G, iar cea de penicilina atinge valori de 1"1,8G. Principalii parametri ai procesului de fermentatie sunt5 Faza Temp., Agitare, !ebit aer, Presi#ne,ata !#rata, 0 C rot min. l l " min $ #noculator (6H1J, ( . 1,. 1,("1,2 2."-. #ntermediar (6H1J, 1 . 1"1,( 1,("1,2 (."-. Kegim (6H1J, 1(. .,6"1 1,("1,2 '."1(. 3ecesarul principalelor materii prime si utilitati pentru producerea unui 1g de Penicilina : este5 %aterii prime Iidrati de carbon :rasime vegetala sau animala E<tract de porumb ,ompusi anorganici Ac.fenilacetic(precursor! Cons#m 1,( t 6. 1g . 1g ((. 1g 1.. 1g &tilitati Energie electrica Abur tehnologic sterilizare! Aer ptr. fermentatie Apa de racire Cons#m 1.,8 :C (ptr. -1 m2 $..... m2 '.. m2

)iltrarea solutiei rezultate dupa fermentatie se realizeaza usor datorita caracterului fibros al miceliului rezultat si se face pe filtre de vid cu tambur. )iltratul obtinut se raceste la 2"$J, si se depoziteaza in rezervoare intermediare in vederea prelucrarii. 4epararea si purificarea penicilinei 4epararea penicilinelor din filtratul apos se realizeaza prin e<tractie cu solventi, fiind studiati o mare varietate de solventi (ciclohe<an, metil", respectiv dimetil" ciclohe<an, metil, etil"cetone, metil, izobutil"cetona, dimetilformamida, acetat de amil, acetat de butil, eter etilic, cloroform, tetraclorura de carbon, dicloretan, toluen!, dintre care rezultatele cele mai bune

s"au obtinut cu acetat de butil. Din studiul echilibrului de faze la e<tractia penicilinei cu acetat de butil s"a constatat ca5 #n solvent organic trec numai moleculele de penicilina nedisociate, adica e<tractia este moleculara, fapt care impune realizarea acesteia in mediu puternic acid9 #ntre moleculele de penicilina acid nu se formeaza asociatii moleculare in conditiile e<tractiei9 #n solvent organic penicilinele nu disociaza. #n aceste conditii, echilibrul de faza la e<tractia penicilinei in acetat de butil depinde numai de temperatura si pI, iar distributia intre faza apoasa si solvent este descrisa de coeficientii de repartitie F. si F, definiti prin ecuatiile5
.

cs L 9 ca

cs 9 ca

unde5 " F. M coeficientul de repartitie a penicilinei nedisociate9 F M coeficientul total de repartitie9 cs M concentratia penicilinei in solvent9 caN M concentratia penicilinei nedisociate in faza apoasa9 ca M concentratia totala a penicilinei in faza apoasa. Deoarece e<tractia penicilinei in solvent este o e<tratie moleculara, care se desfasoara in mediu puternic acid, in care penicilinele sufera procese de degradare, timpul de e<tractie trebuie redus la minim. Acest lucru impune alegerea unor utila?e de e<tratie care sa realizeze contactarea fazelor si separarea lor in cateva secunde. Aceste cerinte sunt indeplinite de e<tratoarele centrifugale, orizontale sau verticale (Podbielnia1, respectiv LuOesta!. *impul de contact scurt si o temperatura redusa de operare (."$.,! asigura realizarea unor randamente de ." $G in faza de e<tratie. Practic separarea penicilinelor se realizeaza in trei stadii5 #n primul stadiu are loc trecerea penicilinei din solutia nativa in acetat de butil la pI de ("(,$ (acidularea se realizeaza cu o solutie de acid sulfuric -"$G!, folosind un raport volumetric solutie apoasa8acetat de butil de 2819 #n stadiul al doilea are loc trecerea penicilinei din acetat de butil in solutia apoasa de fosfat monosodic -G, la pI de " ,(, folosind un raport volumetric dintre faze acetat de butil8 solutie apoasa de 2819 #n stadiul al treilea are loc trecerea penicilinei din faza apoasa in acetat de butil, in conditii similare primei e<tractii. #n final se obtine o solutie de penicilina in acetat de butil, care se raceste la M1. P "1(.,, temperatura la care apa din acetatul e butil ingheata si se separa prin filtrare sub presiune. Dupa filtrare, solutia de penicilina se trateaza cu acetat de sodiu sau potasiu, cand precipita sarea de 6

penicilina, care se filtreaza, se aduce in vasul de spalare cu butanol. Dupa spalare si filtrare, urmele de butanol se elimina prin spalarea precipitatului de pe filtru cu cloroform. Penicilina : se usuca in strat fluidizat la $."6..,. *ehnici mai recente recomanda realizarea e<tractiei penicilinei in acetat de butil intr"o singura faza. Precipitarea penicilinei se face sub forma de sare prin tratarea solutiei organice cu acetat de sodiu sau potasiu. Penicilina sare separata prin filtrare se dizolva in apa, se purifica cu carbune activ, dupa care se anhidrizeaza prin distilarea apei sub forma de azeotrop cu butanol, la vid de -"6 mm Ig. Produsul solid obtinut se caracterizeaza prin puritate avansata si activitate biologica conforma normelor farmacologice. Penicilina % se obtine prin aceeasi tehnologie, doar ca la fermentatie se foloseste ca precursor acid feno<iacetic, iar e<tractia se face in doua faze, posibil datorita solubilitatii foarte scazute a penicilinei % in apa. Dupa ree<tractie in apa si acidulare cu acid sulfuric diluat, produsul precipitat se filtreaza, se purifica de solvent si se usuca la 2$"-.., sub un vid de 1.."(.. mm Ig. #n ambele cazuri rezulta cantitati mari de butanol impurificat in principal cu acetat de butil si apa. Kegenerarea butanolului se face prin distilare si rectificare in regim discontinuu, semicontinuu sau continuu. #n prima faza se realizeaza o distilare la '("'- ., pentru indepartarea impuritatilor cu punct de fierbere ridicate, se decanteaza o parte din apa, dupa care amestecul se preincalzeste si se trimite in coloana de rectificare, de unde rezulta butanol regenerat, care se recircula in proces.

4,IE=A &L/, A #34*ALA*#E# DE )A&K#,AKE A PE3#,#L#3E# E<tract de porumb Iidrati de carbon 4aruri nutritive Penicillium crysogenum

PREPARARE MEDIU DE CULTURA

INOCULATOR STERILIZARE INTERMEDIAR Hidrati d !ar"#$ E%&'(at#r A$ti)*&%a$t Pr !&r)#r REGIM +ILTRARE RACIRE,-.5-C/ A! tat d "&ti' )#'2di'2H2SO4 E0TRACTIE ,*H 12 . 222/ REE0TRACTiE ,*H17.722/

A"&r

Ma)a ! '&'ara

+a3a a*#a)a

A*a )#'2di'2NaH2PO4 A! tat d "&ti' r 3id&a' A! tat d "&ti' )#'2di'2H2SO4

E0TRACTIE II ,*H12 . 222/ RACIRE,.1-.12-C/

+a3a a*#a)a

S#'2a'!##'i!a d CH3COO6,Na/ PRECIPITARE

+ILTRARE +ILTRARE

A*a )&" 4#r%a d (5 ata SPALARE !& 7&OH8 CHC'3 +ILTRARE USCARE

S#'9 $ti r 3id&a'i PENICILINA - sare de K sau Na

!eri'ati ai penicilinei ( M datorita eliminarii rapide din organism a penicilinei :, mentinerea concentratiei terapeutice in organism (de .,.2 Q.l.8ml! nu se poate realiza decat prin administrarea ritmica, la intervale de timp. Acest lucru a impus obtinerea unor derivati ai penicilinei : cu remanenta mare in organism, care asigura cu o singura doza o concentratie terapeutica utila pentru denumite peniciline retard9 M dintre acestea cele mai importante sunt5 PK/,A#3PE3#,#L#3A5 seara Penicilinei :. cu procaina cristalizata cu 1 I(/
COO S C6H5 CH2 C O O NH N CH3 CH3 COO NH2 : : H2O CH2 CH2 NH ,C2H5/2

M1- zile. Produsele au fost

&E3RA*#3 PE3#,#L#3A (=oldamin!, Pencilina : M sare cu 3,3N M dibenzil etilendiamina

S C6H5 CH2 C O O NH N

CH3 CH3 COO

:

; H2N CH2 C6H5

; CH2 CH2 NH2 CH2 C6H5

,LE=#R/LPE3#,#L#3A (=egacilina! sare cu clemizolul " (1 p"clorbenzil! M ( (pirodilmetil! M benzimidazol!

S NH N O

C6H5

CH2 C O

65

CH3 CH3 COO :

NH CH2 N N H2C C6H5

<

Penicilinele retard, fiind imiscibile (insolubile! in apa, se administreaza sub forma de suspensii in?ectabileM acest lucru impune ca procedeul de cristalizare sa fie astfel diri?at incat sa se obtina cristale foarte fine M cu dimensiuni cuprinse intre $M1$. S, de preferinta -.M6.S. La d D 1$. S se formeaza suspensii nein?ectabile iar la d D $ S se formeaza solutii foarte vascoase care nu pot fi trase in seringi. =icrocristalizarea se poate face cu ?et de aer sub presiune prin agitarea energica, sau recristalizarea din solventi la anumite temperaturi. Procedeele de microcristalizare constituie secretul fabricarii penicilinelor retard.

1-