Examenul microbiologic al sputei

Examenul microbiologic al sputei

SCOP SI DOMENIU DE APLICARE
Scopul acestei analize este e a etermina in timpul cel mai scurt posibil! agentii
etiologici ai in"ectiilor tractului respirator in"erior si a "ace posibile inter#entii terapeutice
rapie si e"iciente asupra pacientilor$ Intrucat nu exista un test unic e etectare a tuturor
agentilor etiologici! proceura escrisa in cele e mai %os! reprezinta un complex e
te&nici! examene si teste prin care se urmareste atingerea! intr'un gra cat mai riicat ! a
scopului enuntat$
AC(IUNI PRE)A(I(OARE
Recoltarea sputei si aspiratului tra&eo bronsic
Examinarea sputei expectorate este materialul principal pentru eterminarea cauzelor
pneumoniiilor bacteriene$ Secretiile tractului respirator in"erior! pot "i contaminate cu
secretiile tractului respirator superior! in special cu sali#a! can se "olosesc te&nici e
recoltare in#azi#e$ Din aceasta cauza! sputa este printre probele cel mai putin rele#ante
primite pentru examinare prin culturi in laboratoarele e microbiologie! c&iar aca ea
reprezinta proba obisnuita si pentru a carei examinare se consuma mai mult timp si
numeroase materiale$
Pentru a reuce cat mai mult posibil contaminarea cu sali#a si * sau cu secretii nazale!
sputa se recolteaza in expectoratia e imineata! upa o prealabila gargara cu ser
"iziologic$
Sputa se recolteaza in recipiente sterile +cutii Petri! "lacoane cu gatul larg , si se trimite
imeiat la laborator! in nici un caz sa nu a%unga la laborator in mai mult e - ore$
In cazul ca pacientii nu prouc sputa sau nu o pot elimina! clinicienii #or "olosi metoe
alternati#e aec#ate +aspiratii sau tampoane tra&eale sau bron&ice,$
La copiii mici incapabili sa prouca sputa se #or recolta aspirate gastrice pentru
etectarea bacililor acio' rezistenti$ Daca aceste probe nu pot a%unge imeiat la
laborator! ele trebuie neutralizate$
Prelucrarea probelor
Portiunile purulente in proba se pun intr'o alta cutie Petri si se spala cu - . ml ser
"iziologic$
In cazul sputei neomogene sau #ascoase se recurge la "luii"icarea ei care se poate realiza
ast"el/
se introuce sputa intr'o cantitate mica e bulion si se agita cate#a secune sau amestecul
se aspira si respinge e mai multe ori cu o seringa sterila0
sputa se omogenizeaza intr'un balon cu perle! upa amestecarea ei cu bulion +1'23 ml$
sputa 4 .'1 ml$ bulion,0
sputa spalata cu ser "iziologic se introuce intr'o eprubeta sterila si se amesteca cu un
#olum egal intr'o solutie proaspata 3!1 5 e N'acetil' L'cisteina sterilizata prin
autocla#are +-3 minute la 2-23C,$ Se agita usor$ 6luii"icarea se prouce in cate#a
minute0
"luii"icare cu agenti c&imici/ amestecarea sputei in parti egale cu acetat e amil 2!1 5$
Aceasta te&nica egraeaza celulele epiteliale si leucocitele "acan "rotiul inutilizabil
pentru examenul citologic$
MODUL DE LUCRU
Examenul microscopic
Examinarea irecta a preparatelor nati#e
Examinarea preparatelor nati#e irecte se "ace in cazul unor paraziti si pentru
Pneumoc7stis$
Elementele "ungice se #izualieaza cu microscopul in contrast e "aza cu 235 &iroxi e
potasiu +8O9,$
Pentru aceasta examinare! o picatura in proba prelucrata ca mai sus se epune pe o lama
e sticla curata si se acopera cu o lamela$ Acest preparat nati# se examineaza la
microscop +oc$23! ob$ :3 ' :1,
Se noteaza "ormatiunile constatate$
Examinarea preparatelor + "rotiurilor , colorate
Din "iecare proba se executa . "rotiuri care upa "ixare se coloreaza ast"el/
un "rotiu cu metoa )ram pentru aprecierea "lorei )ram'poziti#e si )ram'negati#e si
stabilirea grupelor e calitate citologica a sputei sau aspiratului tra&eo' bronsic0
un "rotiu cu metoa ;ie&l Neelsen pentru bacteriile acio rezistente0
un "rotiu cu metoa Ma7 ' )rn<al )iemsa pentru citologie$
Examinarea "rotiurilor consta in aprecierea "rec#entei germenilor! a caracterelor lor
mor"ologice si tinctoriale si in stabilirea raportului intre elementele celulare $ Este
important e retinut ca in cazul pneumoniei cu Legionella! sputa poate "i putina si apoasa!
cu rare sau absente celule gaza$
Examinarea prin culturi
Se insamanteaza portiuni purulente sau in materialul omogenizat sau "luii"icat pe
urmatoarele meii/
geloza'sange )S$ O strie e sta"ilococ auriu insamantata peste ariile e epuizare a probei
permite! prin "enomenul e satelism! izolarea si ienti"icarea in cultura primara a
speciilor e 9aemop&ilus0
geloza c&ocolat0
agar Mac Con=e7 si agar cu albastru e bromtimol si lactoza0
geloza Sabouran pentru le#uri0
agar C&apman$
Pentru sputocultura cantitati#a este necesara "luii"icarea sputei care permite
omogenizarea acesteia$
Din meiile mentionate mai sus minimum ininspensabil este geloza'sange$ Aceasta
permite izolarea ma%oritatii bacteriilor implicate in etiologia in"ectiilor tractusului
respirator in"erior$
Supra"ata meiului turnat in cutii Petri se insamanteaza prin striere cu 3!32ml sputa$
Perpenicular pe striile e sputa! se insamanteaza sub "orma unei strii o ansa e
Stap&7lococcus aureus$ Prin "enomenul e satelism! in #ecinatatea striei e S$ aureus se
#or ez#olta speciile e 9aemop&ilus$
)eloza'sange c&ocolat "a#orizeaza ez#oltarea tulpinilor mai pretentioase e
9aemop&ilus si este inispensabil izolarilor cantitati#e$
Izolarea &emo"ililor este "a#orizata in sectoarele cu agar cu sange c&ocolat pe supra"ata
caruia se plaseaza iscuri cu 23 g! bacitracina! iar a pneumococilor! aca pe un sector cu
agar cu sange se epune un isc cu : g optoc&in$
Utilizarea meiilor i"erentiale lactozate +MacCon=e7! AA>(L, este "acultati#a si
urmareste izolarea bacteriilor gramnegati#e reperate microscopic$
Incubarea meiilor insamantate se "ace 2? -: ore la .@ grae Celsius $
CI(IREA SI IN(ERPRE(AREA RE;UL(A(ELOR
Examinarea "rotiului colorat cu metoa )ram
(ria%ul citologic e calitate al sputei
Se examineaza "rotiul cu o marire e 233x ! in zone bine etalate! cu celulele ispuse in
monostrat! eterminan numarul meiu al celulelor in"lamatorii +CI, si al celulelor
malpig&iene +CM, in 23 campuri$ Pe aceasta baza sunt propuse trei criterii e tria%
calitati# al sputelor pentru examenul bacteriologic prin culturi! si anume/
)rupele e calitate citologica a sputei0
Raportul celule in"lamatorii * celule malpig&iene$
>acterioscopia cantitati#a
Se selecteaza si se examineaza cu marire e 2333 x cat mai multe campuri bine etalate si
corect i"erentiate tinctorial! cu cel putin . celule in"lamatorii si la istanta e cel putin .
iametre! in orice irectie! e celulele malpig&iene$ Pe asemenea campuri se etermina
numarul meiu e bacterii intr'o categorie microscopica * camp /
bacterii pneumococoie0
bacterii &emo"iloie0
bacterii neisserioie0
bacterii )ram negati#e sau )ram poziti#e! etc$
Asocierea cu polimor"onuclearele a cel putin 23 bacterii in aceeasi categorie
microscopica se consiera asociere semni"icati#a clinic si are preilectie poziti#a e peste
3!A pentru izolarea in sputocultura a unui patogen in aceeasi categorie microscopica e
cel putin 23 B U6C * ml$
Comunicarea asocierii semni"icati#e a unei bacterii cu celule in"lamatorii in sputa
orienteaza rapi tratamentul antimicrobian al pacientilor pneumonici$
Atat in sputa! ar mai ales in "luiul e aspirat +spalatura, bronsic! un reper important!
usor e ienti"icat! sunt celule ciliate ale epiteliului respirator$ Intr'un context in"lamator!
bacteriile asociate lor capata semni"icatie clinica! c&iar in prezenta unor celule
malpig&iene! care pot "i e contaminare oro"aringiana! ar si e metaplaziere a epiteliului
tra&eobronsic$
>acterioscopia prele#atelor necontaminate
Prezenta bacteriilor in "rotiurile "acute in exuatul pleural! aspiratul pulmonar
transtoracic sau in probele biopsice este semni"icati#a ca atare! "ara a "i necesare relatii
cantitati#e$
Examinarea "rotiului colorat cu metoa Ma7 ' )rn<al )iemsa
Pe acest "rotiu se e#alueaza etaliile citologice cu interes pentru microbiolog$ Celulele
expectorate pot "i impartite in celule in"lamatorii si celule e ex"oliere$
Celule in"lamatorii/
Se etermina procentul acestor celule in expectoratii$
Polimor"onuclearele neutro"ile +PMN, 23 ' 21 microni! sunt prezente in numar mare in
in"lamatii e natura in"ectioasa +bacteriana! #irala,! upa agresiuni "izice si c&imice ale
mucoasei bronsice$Proportia lor poate a%unge pana la A3 5 si pot "i intregi sau in i"erite
staii e ezintegrare$ Sunt "rec#ente in expectoratia astmaticilor ! c&iar in absenta
in"ectiei$
Macro"agele si &istiocitele 23 ' :3 microni! sunt upa PMN! cele mai "rec#ente celule in
exuatele cailor respiratorii in"erioare$Ele au citoplasma multa! nucleu unic o#al! situat
excentric sau oi sau mai multi nuclei$
Monocitele precursori ai macro"agelor si &istiocitelor ' au talie mica! nucleul in#aginat si
citoplasma relati# clara$
Eozino"ilele ' intr'o expectoratie proaspata! bine etalata! eozino"ilele apar cu nucleul bi
sau trilobat si cu granulatii mari! rosii$ Cele prinse in trama e mucus au mor"ologia mai
putin clara! nucleul micsorat iar granulatiile mai putin istincte! cu o nuanta spre albastru$
Prezenta lor trebuie interpretata pruent$ In numar mic! ele apar in orice proces
in"lamator acut sau subacut$
La copilul mic! can in"lamatiile cronice ale tractusului respirator in"erior eterminaun
proces alergic post in"ectios +bronsita astmati"orma,! prezenta eozino"ilelor pe "on e
polinucleoza are #aloare iagnostica eosebita$ La pacientii cu bronsita cronica pot
reprezenta pana la 1 5 in celulele expectorate! iar la cei cu astm bronsic! -3 A3 5 $
Lim"ocitele au nucleul mare si citoplasma reusa si sunt estul e putine in expectoratii$
Numarul lor creste in bronsitele cronice si in tuberculoza pulmonara$
Celulele e ex"oliere a epiteliului respirator
Celulele cilinrice ciliate / corp alungit! au polul bazal ingustat si cel apical cu platou e
cili scurti! obser#ati la o marire puternica$ Nucleul o#al este situat parabazal$ Ex"oliaza
"rec#ent in bronsita cronica +pana la -3 5 in totalul celulelor ex"oliate ,! ca celule
izolate! intacte sau egenerate$ In astmul bronsic apar sub "orma e mase celulare creola
boies$ In in"ectiile cu M7coplasma pneumoniae si in #iroze respiratorii! in special gripa!
se ex"oliaza celule egenerate ! "ara cili +ciliocitop&toria,$
Celulele bazale sunt mici cu citoplasma reusa0 la o examinare super"iciala se pot
con"una cu lim"ocitele! ar spre eosebire e acestea ele au nucleul cu structura
cromatiana mai putin ensa$
Ex"oliaza in numar mare in toate procesele e iritare bronsica$ In sputa bronsiticilor
cronici! celulele bazale constituie pana la B@ @@ 5 in totalul celuleor bronsice ex"oliate$
Celulele metaplazice
Celulele metaplazice sunt elementele &eterotope a caror interpretare epaseste carul
microscopiei uzuale a sputei$ Se pot gasi izolate sau in placare$ Cea mai "rec#enta
&eterotopie este metaplazia epiteliului bronsic in epiteliu malpig&ian$ Apare "rec#ent in
pneumopatii cronice in"lamatorii +bronsita cronica! bronsiectazie! abcese pulmonare!
tuberculoza , ar poate "i si neoplazica$
Interpretarea citologiei ex"oliati#e cere experienta citologica$
Examinarea culturilor ez#oltate pe meiile inoculate! ienti"icarea izolatelor si
comunicarea rezultatelor$
Dupa perioaa e incubare se examineaza culturile ez#oltate! iar in cazul eterminarilor
cantitati#e se numara si se calculeaza U6C * ml$
Pentru ienti"icarea izolatelor! 1 colonii caracteristice se trec pe meii aec#ate !
neselecti#e! iar cultura obtinuta se supune testelor e ienti"icare speci"ice "iecarei
categorii e bacterii$ Ni#elul pana la care se "ace ienti"icarea izolatelor care intrunesc un
minim e criterii cu semni"icatia clinica epine e/
contextul clinic al pacientului
con"runtarea intre subcultura si citobacterioscopia cantitati#a$
Ienti"icarea comensalilor rezienti ai oro"aringelui +streptococii #irians!
corinebacteriile! neisseriile nepretentioase! sta"ilococii caguleaza negati#i! Cania spp$!
se opreste la ni#el e grup ,$ Izolatele asociate semni"icati# cu leucocitele pe "rotiul "acut
irect in sputa trebuie ienti"icate pana la ni#el e specie$
Streptococii
Streptococii a'&emolitici trebuie i"erentiati in pneumococi cu semni"icatie clinica
posibila si in streptococi #irians! "ara semni"icatie clinica$ Sensibilitatea la bacitracina
ramane numai un test prezumti# e i"erentiere a streptococilor in grupa A si cei
apartinan altor grupe$ Semni"icatia grupelor se "ace cu trusa e reacti#i S(REP(IC$
Streptococii ne&emolitici se inregistreaza ca atare! nu se ienti"ica si nu se comunica$
9aemop&ilus spp$
Izolatele e 9aemop&ilus trebuie ienti"icate pana la ni#el e specie pe baza criteriilor
in tabelul . si prin reactia e seroaglutinare$
Enterobacterii
Enterobacteriile pot cauza in"ectiiale tractusului in"erior la persoanele imunocompromise$
In conitii e spitalizare pot "i implicate in asemenea in"ectii! in a"ara e 8$ pneumoniae
si alte specii e enterobacterii! mai ales unele tulpini &emolitice e E$ coli$ Ienti"icarea
lor este necesara numai in situatii clinico'epiemiologice sugesti#e si can
citobacterioscopia cantitati#a atesta asocierea semni"icati#a a bacililor )ram negati#i cu
leucocitele$
Neisserii
Caracterele mor"ologice cercetate microscopic! cele culturale si reactia oxiazei poziti#a
le ienti"ica la ni#el e gen$ Daca citobacterioscopia atesta semni"icatia clinica a acestor
izolate! ele se testeaza pe meiu (&a7er Martin moi"icat pentru a i"erentia
meningococii e Moraxella cat&aralis$ Coloniile alb cenusii! "riabile si intens oxiazo'
poziti#e se apreciaza a "i Moraxella cat&aralis$
>acili )ram negati#i ne"ermentati#i
Dintre acestia semni"icatia clinica cea mai mare o prezinta P$ aeruginosa care se
ienti"ica pe baza caracterelor culturale ! pigmentogenzei si capacitatii e a se ez#olta la
:- 3 C$
Sta"ilococi
Se ienti"ica numai S$ aureus! restul se inregistreaza numai ca sta"ilococi coaguleaza
negati#i! "ara a'i comunica$ Semni"icatia clinica a S$ aureus trebuie argumentata pruent
la pacientii a"lati sub terapie antimcrobiana$
>acili )ram poziti#i
Prezenta bacililor corine"ormi in sputa poate sugera o in"ectie cu R&oococcus eCui$ Desi
au "ost semnalate cazuri e in"ectii pulmonare cu >$ cereus si >$ subtilis! totusi
semni"icatia clinica cea mai mare o prezinta >$ ant&racis care se ienti"ica pe baza
aspectului mor"ologic! capsulogenezei etectabila in materialele anormale si in meiile
agarizate cu aaos e ser sau sange!a lipsei &emolizei si a prezentei sensibilitatii la
penicilina$
In legatura cu interpretarea rezultatelor culturilor in sputa trebuie retinute urmatoarele
oua aspecte/
Examenul microbiologic al sputei reprezinta singurul mi%loc e iagnostic etiologic in
toate sinroamele pulmonare$ Rezultatul acestui examen epine in mare masura e
respectarea conitiilor e recoltare! transport si prelucrare corecta$ Can aceste operatiuni
nu se e"ectueaza corect! rezultatele examenului pot "i "alse$
6oarte "rec#ent sputa se contamineaza cu "lora buco' "aringiana! asa incat este "oarte
i"icil e precizat! care in germenul potential patogen este agentul etiologic ae#arat$
Ast"el! culturile poziti#e cu neisserii nepatogene! sta"ilococi albi! streptococi #irians!
pseuoi"terici sunt aproape cu siguranta rezultatul contaminarii sputei cu micro"lora
buco' "aringiana$
O buna coresponenta intre examenul citobacterioscopic si cel cultural! mai ales in carul
ez#oltarii unei culturi Cuasi monomor"e cu germeni intalniti "rec#ent in in"ectiile
arborelui respirator +S$ pneumoniae! 9$ in"luenzae! streptococi b ' &emolitici! 8lebsiella!
S$ aureus,! cu existenta unui suport citologic corespunzator + celule epiteliale e origine
bronsica sau al#eolara! leococite polinucleare integre sau egraate,! constituie
elementele unui rezultat "iel$
In e#entualitatea unui rezultat poziti# "iel al culturilor! este necesara e"ectuarea
antibiogramei$ Se contrainica e"ectuarea antibiogramei la "lora totala a unei spute$
Exudatul nazal
Exuatul nazal
Examenul microbiologic al exsuatului nazal +secretiei nazale,este metoa e laborator
clinic inicata in epistarea porta%ului e Stap&7lococcus aureus sau Streptococcus
p7ogenes$
Prin examenul bacteriologic al exsuatului nazal se pot ienti"ica si alti germeni/
meningococ' cu o rata e porta% e 1'.3 5! Streptococcus pneumoniae! 9aemop&ilus
in"luenzae! serotipul >! Cor7nebacterium ip&t&eriae si c&iar enterobacterii$
Prele#area probei
Recoltarea tamponului nazal se "ace in mo i"erentiat! in "unctie e scopul urmarit! e
prezenta si locul leziunii$
Ast"el! pentru cercetarea starii e porta% se introuce tamponul e uz general umectat cu
solutie salina izotonica! in "osele nazale atat cat este posibil si se roteste usor pentru a
"ace posibila esprinerea secretiei$
Atunci can se constata leziuni la ni#elul #estibulului nazal se proceeaza la riicarea
lobului nazal cu policele unei maini! restul palmei "iin asezat in "runtea bolna#ului$ In
acest "el se escopera #estibulele nazale! se inreapta "asciculul e lumina in reptul
leziunii si se rcolteaza cu tamponul$
Can leziunea este situata in "osele nazale! recoltarea se "ace e catre specialist cu
speculul nazal prin rinoscopie anterioara pentru e#ientierea zonelor respecti#e+planseul
"oselor nazale! meatul in"erior si mi%lociu! cornetul in"erior si mi%lociu, si posterioara
pentru e#ientierea coanelor si cozilor cornetelor$ In acest "el este posibila prele#area
secretiei in sinusurile aiacente$
Se recolteaza! e obicei! un tampon0 in cazul suspiciunii e porta% i"teric se recolteaza
oua tampoane$
(ransportul
(ransportul probelor si insamantarea trebuie realizate in cel mult - ore e la prele#are
aca nu se utilizeaza meii e conser#are si transport +Stuart*Amies, si in maximum -:
e ore! aca se apeleaza la acestea$
Moul e lucru
Examenul bacteriologic al secretiei nazale consta in e"ectuarea e culturi! examenul
microscopic ne"iin rele#ant ecat in situatia e porta% e bacil i"teric$
In acest caz se recolteaza oua tampoane! unul ser#in la e"ectuarea unui "rotiu! iar
celalalt la initierea unor culturi$
In mo uzual! tamponul nazal se insamanteaza pe )S si C9$
Interpretarea rezultatelor
Interpretarea examenului bacteriologic al secretiei nazale este relati# simpla$ 6lora
bacteriana normala a nasului este reusa ca numar si #arietati! "iin ominata e
Stap&7lococcus albus! i"teromor"i$ Ocazional poate "i intalnit Stap&7lococcus aureus
+mai "rec#ent ecat in "aringe,$ Rar pot "i ienti"icati streptococi &emolitici! enterococi!
neiserii nepatogene! Acinetobacter si Moraxella$
Relatia intre agentii etiologici si i"eritele boli ale nasului nu este speci"ica ecat in
putine cazuri$ Ast"el! la ni#elul #estibulului nazal! cele mai "rec#ente leziuni in"lamatorii
intalnite sunt "oliculitele si "urunculoza! e obicei e origine sta"ilococica! eczema
#estibulara e origine streptococica si impetigo! "rec#ent cauzat e o in"ectie strepto'
sta"ilococica$
In rinitele bacteriene sau in rinitele #irale suprain"ectate! mai "rec#ent au "ost izolati
sta"ilococi coagulazopoziti#i! si ocazional Neisseria menigitiis$
In rinitele purulente se constata aeseori o asociere a sta"ilococului cu pneumococul! iar
in cele cu "alse membrane! asociere sta"ilococ! pneumococ si Cor7nebacterium
ip&t&eriae$
In bolile cronice ale nasului sunt e amintit ozena si rinoscleromul in etiologia carora
sunt acreitati germenii 8lebsiella r&inoscleromatis si 8lebsiella ozaenae$
La copiii mici sau nou'nascuti se pot izola in secretia nazala germeni #ariati$ In
ma%oritatea cazurilor acestea reprezinta! e "apt! o localizare a germenilor la acest ni#el!
in carul unei boli generale$