1.2. MONITORIZAREA OMG 1.2. MONITORIZAREA OMG 1.2. MONITORIZAREA OMG 1.2.

MONITORIZAREA OMG- -- -URILOR URILOR URILOR URILOR

1.2.1. Legisla 1.2.1. Legisla 1.2.1. Legisla 1.2.1. Legislaia european ia european ia european ia european i cea rom i cea rom i cea rom i cea romneasc neasc neasc neasc referitoare la OMG referitoare la OMG referitoare la OMG referitoare la OMG- -- -uri uri uri uri
Introducerea deliberat n mediu, cultivarea, schimburile
transfrontaliere i utilizarea n alimentaie a OMG-urilor sunt
reglementate la nivelul UE de un set de proceduri stricte ce alctuiesc
un larg cadru legislativ (Mazzara et al., 2008).
Primele acte normative Comunitare, elaborate n 1990, cu scopul de
a proteja sntatea oamenilor, a animalelor i mediul, au fost Directiva
Consiliului 90/219/CEE i Directiva Consiliului 90/220/CEE (Querci et
al., 2004a).
n prezent, n cadrul UE, principalul instrument legal orizontal de
reglementare n domeniul biotehnologiilor este Directiva 2001/18/CE a
Parlamentului European i a Consiliului din 12 martie 2001 referitoare
la introducerea deliberat n mediu a OMGurilor. Aceasta abrog
Directiva Consiliului 90/220/CEE i ntrete reglementrile existente
referitoare la introducerea n mediu a OMG-urilor, aducnd totodat o
serie de principii noi, a cror implementare este obligatorie: evaluarea
riscului (risk assessment) asupra mediului i sntii, informarea
cetenilor, etichetarea (labelling) i trasabilitatea (traceability) n
toate etapele plasrii pe pia, monitorizarea post-market (post-market
monitoring). Scopul Directivei este acela de a proteja sntatea
oamenilor i mediul nconjurtor, din perspectiva utilizrii deliberate
a PMG-urilor, precum i asigurarea coexistenei, la toate nivelurile, a
produselor derivate din biotehnologii cu cele convenionale. Se pun de
asemenea bazele ntocmirii unui registru unic de eviden molecular.
Directiva 2001/18/CE, implementat n fiecare stat membru prin acte
normative naionale, face referire, att la experienele n cmp, la
scar mic (i.e. introducere voluntar n scopuri experimentale)
(seciunea B a Directivei), ct i la comercializarea OMG-urilor
(seciunea C a Directivei). Totodat, autorizaiile deja existente
conform Directivei Consiliului 90/220/CE sunt valabile pn la expirarea
perioadei pentru care au fost acordate, putnd fi apoi nnoite, conform
noii legislaii. Acordarea autorizaiei se face pentru o perioad de
maxim zece ani ncepnd cu data la care este emis, putnd fi nnoit.
Amintim c situaia proceselor de autorizare a OMG-urilor pentru
comercializare n cadrul UE poate fi consultat pe site-ul Comisiei
Europene sau pe site-ul GMO Compass (vezi Comisia European, 2009, GMO
Compass, 2009).
Pe lng directivele deja menionate, au fost elaborate i
implementate o serie de instrumente legale verticale care introduc norme
specifice privitoare la aprobarea i utilizarea n siguran a PMG-urilor
destinate consumului. Astfel, plasarea pe piaa comunitar a alimentelor
i ingredientelor alimentare noi, a fost reglementat iniial prin
Regulamentul 258/97, ulterior fiind adoptat Regulamentul 1139/98, act
normativ care a introdus un model de etichetare pentru produsele
alimentare derivate din OMG-uri.
Regulamentul 1139/98 a fost amendat de aa-numitul regulament al
pragului limit Regulamentul 49/2000 care aborda problema
contaminrii accidentale. Aceasta fcea obligatorie etichetarea
produselor al cror coninut MG, la nivel de ingredient, depea pragul
de 1%. Pentru a ntri caracterul accidental al prezenei OMG-urilor,
operatorii aveau i obligativitatea de a prezenta dovezi care s ateste
adoptarea msurilor de evitare a contaminrii.
Treptat, s-a fcut simit nevoia adoptrii unor acte normative
complete, unificate i aduse la zi. n cele din urm, n octombrie 2003,
dou noi Regulamente au fost publicate, amendnd sau nlocuind legislaia
deja existent n domeniu. Acestea sunt:
Regulamentul 1829/2003 al Parlamentului European i al Consiliului
din 22 septembrie 2003 privind produsele alimentare i furajele MG;
Regulamentul 1830/2003 al Parlamentului European i al Consiliului
din 22 septembrie 2003 privind trasabilitatea i etichetarea OMG-urilor
i trasabilitatea alimentelor destinate alimentaiei umane sau animale,
produse din OMG-uri, i de modificare a Directivei 2001/18/CE.
Cele dou regulamente, intrate n vigoare din 18 aprilie 2004, introduc,
ca elemente principale, reglementri referitoare la etichetare,
trasabilitate i autorizarea evenimentelor de transformare pentru
comercializare. Tot n aprilie 2004 a fost adoptat i Regulamentul
641/2004 care face referire la normele de aplicare a Regulamentului
1829/2003 n ceea ce privete cererea de autorizare a noilor produse
alimentare i a noilor furaje MG, notificarea produselor existente i
prezena ntmpltoare sau tehnic inevitabil a material MG care a fcut
obiectul unei evaluri de risc i a obinut un aviz favorabil.
UE recunoate dreptul consumatorilor la informare i etichetare,
ca un instrument ce faciliteaz luarea deciziilor informate/contiente,
Regulamentul 1830/2003 ntrind prevederile referitoare la aceste
aspecte. Obligativitatea de etichetare a fost extins pentru toate
alimentele i furajele care consist, conin sau au fost obinute din
OMG-uri, chiar dac detecia materialului MG nu este posibil n produsul
final. Se introduce n acest fel conceptul de trasabilitate, ceea ce
nseamn abilitatea de a identifica OMG-urile i produsele derivate,
precum i sursa acestora n toate etapele plasrii pe pia, prin
intermediul reelelor de producie i distribuie. Conceptul de
trasabilitate presupune, dac este cazul, nlocuirea dovezilor analitice
produse de metodele de testare cu nregistrrile efectuate de-a lungul
lanului de aprovizionare (GMO Compass, 2007).
Regulamentul 1829/2003 definete i un nou prag limit pentru
etichetatarea OMG-urilor autorizate, respectiv 0,9%, la nivel de
ingredient, cu condiia ca aceast prezen s fie accidental sau tehnic
inevitabil. Tot aici, precum i Anexa I a Regulamentului 641/2004, se
stipuleaz obligativitatea aplicantului de a pune la dispoziie, n
cadrul dosarului pentru obinerea autorizaiei, o metodologie validat de
detecie i cuantificare a evenimentului de transformare, precum i
materiale de referin corespunztoare.
n cadrul procedurii de autorizare, dosarul este evaluat de
Autoritatea European pentru Siguran Alimentar (European Food Safety
Authority/EFSA; http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-
1178620753812_home.htm), iar metodele de testare vor fi evaluate i
validate de ctre Laboratorul Comunitar de Referin pentru Alimente i
Furaje Modificate Genetic (Community Reference Laboratory for
Genetically Modified Food and Feed/CRL-GMFF; http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/) (CRL-GMFF, 2009a). CRL-GMFF reprezint un alt
element introdus de noua legislaie n domeniul OMG. n contextul
Regulamentului 1829/2003, Centrul Comun de Cercetare (al Comisiei)
(Joint Research Centre/JRC; http://ec.europa.eu/dgs/jrc/index.cfm)
asistat de Reeaua European de Laboratoare OMG (European Network of GMO
Laboratories/ENGL; http://engl.jrc.ec.europa.eu/), a fost numit
Laborator de Referin Comunitar pentru Alimente i Furaje Modificate
Genetic, avnd rolul de a evalua i valida metodele de testare
(Regulamentul 1981/2006), astfel nct aceastea s corespund normelor n
vigoare i s poat reprezenta instrumente pentru punerea n aplicare a
legislaiei referitoare la OMG-uri. Procesele de evaluare i testare
menionate anterior sunt cele incluse n procedura de autorizare de ctre
Comisia European a comercializrii OMG (Regulamentul 1829/2003).
Conducerea GMO-CRL a fost atribuit Unitii pentru Biologie Molecular
i Genomic (Molecular Biology and Genomics Unit/MBG) (MBG, 2009) a
Institutului pentru Sntate i Protecia Consumatorului (Institute for
Health and Consumer Protection/IHCP, JRC-Ispra;
http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) din cadrul JRC, cea care a propus i
promovat, nc din 1999, formarea unei reele de laboratoare de control
care s asigure implementarea i respectarea legislaiei aferente OMG-
urilor i problematicii acestora (CRL-GMFF, 2009c). Reeaua European de
Laboratoare OMG a fost inaugurat oficial n decembrie 2002 i cuprinde
n prezent peste 100 de laboratoare repartizate n cele 27 de state
membre UE, precum i n Norvegia i Elveia. Activitatea ENGL are ca scop
crearea unei platforme unice pentru experii implicai n eantionarea,
detecia, identificarea i cuantificarea OMG-urilor din seminele i
produsele agricole utilizate ca material semincer sau ca materie prim,
din alimente i furaje, precum i din mediul nconjurtor. Scopul acestei
platforme este de a veni n sprijinul activitilor CRL-GMFF (ENGL,
2009).
Cele mai importante aspecte tehnice luate n considerare n cadrul
activitii ENGL sunt (Querci et al., 2004a):
crearea metodelor de analiz calitativ i cantitativ;
transferul tehnologic;
instruirea i acordarea asistenei pentru dezvoltare;
validarea i expertizarea metodelor screening pentru diferite matrici
alimentare sau a metodelor de estimare a coninutului OMG;
punerea la dispoziie a materialelor de referin;
optimizarea strategiilor i procedeelor de eantionare pentru
diferite bunuri de larg consum care pot conine OMG-uri;
crearea unor baze de date i instrumente pentru bioinformatic.
Conform legislaiei, metodele analitice trebuie s fie accesibile,
eficiente, precise i versatile. Activitatea de cercetare are deci
menirea de a asigura elaborarea unor strategii i metode analitice
armonizate i standardizate la nivelul tuturor laboratoarelor de testare
OMG din UE, necesitatea acestor proceduri fiind menionat de JRC ca
element esenial pentru asigurarea succesului funcionrii legislaiei n
domeniu.
O alt instituie european important pentru domeniul OMG-urilor
este Institutul pentru Materiale de Referin i Msurtori (Institute
for Reference Materials and Measurements/IRMM, JRC-Geel;
http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm), nsrcinat cu
producerea materialelor de referin certificate (MRC), necesare
desfurrii activitlor de testare OMG.
Site-ul EUR-Lex (http://eur-lex.europa.eu/ro/index.htm) ofer
acces direct gratuit la legislaia UE.
n ceea ce privete ara noastr, armonizarea legislaiei naionale
n domeniul OMG-urilor cu cea european a fost iniiat cu mult nainte
de momentul aderrii, situaie remarcat i de Cionga (2005), care
sublinia dorina autoritilor de a introduce legi corespunztoare celor
europene, inclusiv n ceea ce privete etichetarea i trasabilitatea.
Conform Ministerului Agriculturii, Pdurilor i Dezvoltrii Rurale
(MAPDR, 2008), documentele legislative relevante n domeniul OMG sunt
urmtoarele:
Ordinul MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de
plante modificate genetic;
Ordinul MAPDR nr. 471/2006 pentru completarea i modificarea Ordinul
MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de plante
modificate genetic;
OUG nr. 43/2007 privind introducerea deliberata n mediu i
introducerea pe pia a organismelor modificate genetic;
OUG nr. 195/2005 privind protecia mediului;
Legea 265/2006 pentru aprobarea Ordonantei de urgen a guvernului nr.
195/2005 privind protecia mediului;
HG nr. 173/2006 privind trasabilitatea i etichetarea organismelor
modificate genetic i trasabilitatea alimentelor i hranei pentru
animale, obinute din organisme modificate genetic.
La cele enumerate anterior se mai adaug:
HG nr. 497/2007 privind stabilirea unor msuri pentru aplicarea
Regulamentului Parlamentului European i al Consiliului (CE) nr.
1946/2003 din 15 iulie 2003 privind micarea transfrontier a
organismelor modificate genetic;
HG nr. 256/2006 privind hrana pentru animale i alimentele modificate
genetic;
Legea nr. 3/2008 pentru aprobarea Ordonanei de urgen a Guvernului
nr. 44/2007 privind utilizarea n condiii de izolare a
microorganismelor modificate genetic.
1.2.2. Procedura integrat 1.2.2. Procedura integrat 1.2.2. Procedura integrat 1.2.2. Procedura integrat de testare OMG a produselor alimentare de testare OMG a produselor alimentare de testare OMG a produselor alimentare de testare OMG a produselor alimentare
Dup cum s-a menionat anterior, necesitatea monitorizrii OMG-
urilor i a implementrii metodologiei de testare, att n cazul soiei i
porumbului, ct i al altor taxoni, rezid n principal din contextul
geo-politico-economic n care se gsete Romnia sau alte state membre
UE. Astfel, dei legislaia cu privire la cultivarea OMGurilor este
restrictiv, schimburile comerciale transfrontaliere ofer posibilitatea
introducerii acestui tip de produse pe piaa alimentar (Ujhelyi et al.
2007). Aceast situaie accentueaz necesitatea existenei unui sistem de
control oficial care s asigure respectarea prevederilor legale n
domeniul OMG-urilor.
Aplicarea legislaiei privitoare la etichetarea produselor care
conin material transgenic se face pe baza rezultatelor obinute de ctre
laboratoare specializate. n viziunea european, acreditarea
laboratoarelor de testare OMG, n conformitate cu standardele ISO
specifice (i.e. ISO/CEI 17025), este considerat ca fiind un element
necesar pentru desfurarea controalelor oficiale (Directiva 93/99/EEC
n Schulze, 2008; Recomandarea 2004/787/CE). Este de asemenea necesar ca
laboratoarele care asist ENGL la testarea i validarea metodelor de
detecie, s fie acreditate sau n curs de acreditare n conformitate cu
ISO/CEI 17025 (Regulamentul 1981/2006).
De obicei, eantionarea este efectuat de o entitate separat,
specializat n aceast direcie. Din punct de vedere tehnic, proba
recepionat de laborator, obinut sau nu printr-un proces de
eantionare, este denumit prob de laborator, iar rezultatele
produse n urma analizelor se vor referi strict la acest eantion.
Extrapolarea rezultatelor la ntregul lot din care provine proba
analizat rmne la latitudinea beneficiarului analizei.
Este binecunoscut faptul c ADN-ul poate fi degradat n timpul
procesrii alimentelor (Engel et al., 2006; Corbisier et al., 2005).
Astfel, cantitatea de copii intacte ale fragmentelor de interes scade cu
ct matricea alimentar este mai intens procesat, determinnd totodat
i reducerea posibilitii de detecie i cuantificare a OMG-urilor.
Acest aspect este important deoarece majoritatea bunurilor alimentare de
larg consum sunt caracterizate printr-un grad mediu sau nalt de
procesare. O metod corespunztoare de izolare i purificare este deci
esenial pentru a asigura prezena n extract a ADN-ului amplificabil.
Strategiile de detecie bazate pe reacia PCR difer n funcie de
fragmentul int amplificat. Metodele de detecie cu spectru larg de
aciune metodele screening presupun amplificarea unor secvene comune
ct mai multor evenimente de transformare, respectiv promotori,
terminatori sau gene marker pentru selecie. Odat confirmat prezena
OMG-urilor, este necesar identificarea acestora, iar apoi cuantificarea
n vederea verificrii conformitii cu legislaia referitoare la
etichetare (Morisset et al.,2009).
Identificarea precis a evenimentelor de transformare presupune
detecia unei secvene unice caracteristice acestora, cum sunt regiunile
corespunztoare jonciunii dintre elementele insertului sau regiunile de
integrare a insertului n cadrul ADN-ului gazd. Cel mai ridicat grad de
specificitate l confer cea de-a doua categorie care constituie astfel
secvenele int ideale pentru protocoalele de identificare a unui
eveniment de transformare.
Necesitatea cuantificrii coninutului MG dintr-o prob a
determinat introducerea metodelor ce permit obinerea unor informaii
cantitative, cea mai utilizat tehnic n acest scop fiind amplificarea
real-time PCR (Reiting et al., 2007; Kubista et al., 2006).
Un mare numr de metode de testare OMG validate sunt deja
disponibile pentru analize de rutin (CRL-GMFF, 2009b; Bonfini, 2008a i
2008b; Bonfini et al., 2007; SR EN ISO 21750:2006; SR EN ISO 21569:2006;
SR EN ISO 21571:2006). De asemenea, pentru fiecare dintre etapele
protocolului de testare (ex. extracia ADN-ului, screening sau
cuantificare) sunt disponibile kituri comerciale de la diferii
productori (ex. Roche, Qiagen sau Biotools).
Cercetrile n domeniu sunt direcionate nspre perfecionarea
metodelor existente, precum i dezvoltarea unor metode care s vin n
ntmpinarea problemelor nou aprute:
- creterea numrului transgenelor, creterea numrului evenimentelor
de transformare,
- creterea numrului liniilor transgenice de tip stacked (OMG-
uri obinute, de obicei, n urma hibridrii dintre indivizi ce
conin diverse evenimente de transformare, rezultatul fiind
prezena inserturilor multiple i exprimarea simultan a mai multor
caracteristici transgenice), necesitatea reducerii costurilor etc.
1.2.3. Decizia de 1.2.3. Decizia de 1.2.3. Decizia de 1.2.3. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor test etichetare pe baza rezultatelor test etichetare pe baza rezultatelor test etichetare pe baza rezultatelor testrii OMG rii OMG rii OMG rii OMG
Conform legislaiei europene (i.e. Directiva 18/2001/CE), OMG-
urile introduse pe pia ca produse n sine sau componente ale altor
produse trebuie etichetate corespunztor. Dup cum s-a menionat deja,
noul prag limit pentru etichetatarea OMGurilor autorizate 0,9% a
fost introdus de Regulamentul 1829/2003, prevederea aplicndu-se:
produselor alimentare care urmeaz s fie furnizate ca atare
consumatorului final i care conin sau constau din OMG-uri, sunt
obinute din OMG-uri sau conin ingrediente obinute din OMG-uri; aceast
categorie include i produsele organice;
OMG-urilor destinate utilizrii ca furaje, furajelor care conin sau
constau din OMG-uri, furajelor produse din OMG-uri.
n acest context, odat ce un produs a fost identificat pozitiv
pentru unul sau mai multe evenimente de transformare, urmtoarele etape
ale analizei au ca scop determinarea cantitativ a coninutului OMG, la
nivel de ingredient.
n cazul n care un produs conine mai multe evenimente de
transformare derivate din acelai taxon, pentru compararea cu pragul de
0,9% proporiile acestora sunt luate n considerate mpreun.
n cazul evenimentelor de transformare neautorizate pentru
comercializare n UE, procedura de testare este similar cu cea descris
anterior. Prezena acestora este ns total interzis (zero tolerance
policy) (GMO Compass, 2007).
n ultima decad, peste 40 de ri au adoptat norme legislative
referitoare la OMGuri, caracteristicile acestora i gradul de
implementare fiind foarte variate (Gruere i Rao, 2007, n el et al.,
2008). Astfel, limite legale pentru etichetarea produselor alimentare n
funcie de coninutul de material MG sunt de 0,1% n India, 1% n
Brazilia (Cardarelli et al., 2005), 3% n Coreea (Onishi et al., 2005;
Yoshimura et al., 2005a), 5% n Japonia (Gruere i Rao, 2007, n el et
al., 2008; Huang i Pan, 2005; Onishi et al., 2005; Yoshimura et al.,
2005a) i Taiwan (Huang i Pan, 2005). n SUA, legislaia nu prevede
obligativitatea etichetrii produselor alimentare care conin OMG-uri.
Aceasta poate fi ns fcut voluntar. Etichetarea voluntar a fost
introdus i n Canada, dar peste pragul de 5% (Smith i Maxwell, 2007;
Rott et al. 2004).
CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CONSIDERENTE TEORETICE CONSIDERENTE TEORETICE CONSIDERENTE TEORETICE CONSIDERENTE TEORETICE
2.1. LABORATORUL DE TESTARE 2.1. LABORATORUL DE TESTARE 2.1. LABORATORUL DE TESTARE 2.1. LABORATORUL DE TESTARE
Existena unui spaiu adecvat i cu dotare corespunztoare este
esenial pentru buna desfurare a fluxului analitic i obinerea unor
rezultate de ncredere. De aceea, urmarea liniilor directoare i
respectarea normelor acceptate la nivel internaional sunt aspecte de
importan major, mai ales n cazul n care se dorete acreditarea
metodelor de testare. Cerinele de ordin tehnic care trebuie respectate
de laboratoarele de testare ce i desfoar activitatea n domeniul
biologiei moleculare, n care este inclus i testarea OMG, sunt
prezentate n diverse lucrri tiinifice, dar mai ales n documente de
specialitate publicate de organisme ca Organizaia Internaional de
Standardizare (International Organization for Standardization/ISO),
Comitetul European de Normalizare (Comit Europen de Normalisation/CEN)
sau Comisia Codex Alimentarius.
Urmtoarele indicaii sunt considerate eseniale pentru testarea
bazat pe PCR/real-time PCR, putnd fi ns adaptate i pentru alte
proceduri (ex. enzyme-linked immunosorbent assay/ELISA).
Temerea principal n cadrul laboratorului de testare este
reprezentat de apariia contaminrilor (el et al., 2006; Querci et
al., 2005). Principalele surse de contaminare sunt reprezentate de:
particule rezultate la pregtirea probelor, aerosoli, activitatea de
testare a mai multor probe n paralel. Msurile de prevenire trebuie s
aib n vedere ncperile, echipamentul, metodele de lucru i personalul.
Pentru a evita contaminarea, modul de organizare a laboratorului trebuie
s fie bazat pe separarea spaial a diferitelor etape metodologice i
pe asigurarea unui flux analitic unidirecional (SR EN ISO 24276:2006;
el et al., 2006; Querci et al., 2005). Ideal, pentru fiecare etap
specific a procedurii de lucru ar trebui alocat un spaiu separat,
dotat cu echipamente dedicate (el et al., 2006; Querci et al., 2005).
Standardul SR EN ISO 24276:2006 recomand ca separarea activitilor s
se fac n minim patru categorii, fiecreia corespunzndu-i un spaiu de
lucru dedicat:
pregtirea probelor (mrunire, omogenizare, obinerea probei test);
extracia ADN-ului (analitul) din proba test;
pregtirea reaciilor de amplificare (PCR/real-time PCR);
amplificrile PCR/real-time PCR i etapa post-PCR (dac este cazul).
O alt msur binevenit const n instalarea unor sisteme de
ventilaie care s asigure presiune atmosferic pozitiv sau negativ, n
funcie de necesiti, n vederea evitrii rspndirii contaminanilor.
Buna practic de laborator include de asemenea: utilizarea
halatelor dedicate fiecrei ncperi, schimbarea frecvent a mnuilor,
utilizarea vrfurilor de pipet sterile i cu barier de protecie
mpotriva aerosolilor, decontaminarea i curarea spaiului de lucru i
a echipamentelor nainte i dup efectuarea fiecrei operaiuni (el et
al., 2006).
Calibrarea sau etalonarea echipamentelor care necesit aceste
operaii (ex. pipete, balane sau platforma real-time PCR) este
obligatorie, contribuindu-se astfel la asigurarea calitii analizelor
efectuate. Toate operaiunile menionate anterior trebuie fcute dup un
program prestabilit, iar executarea lor trebuie documentat.
Stocurile de reactivi i materiale consumabile trebuie pstrate n
spaii n care probele nu ptrund, evitndu-se astfel contaminarea cu
analit (i.e. ADN).
Toate etapele de lucru trebuie s se desfoare n condiii optime
de temperatur, umiditate i presiune, atenie deosebit trebuind
acordat setrii reaciilor de amplificare.
De asemenea, pentru a evita nghearea/dezghearea repetat a
reactivilor se recomand pstrarea acestora n volume separate mai mici.

2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TEST 2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TEST 2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TEST 2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TESTRII OMG RII OMG RII OMG RII OMG
Clasificarea produselor ce pot fi testate pentru prezena OMG-
urilor se poate face dup:
gradul de procesare, existnd materii prime sau neprocesate (n
general boabe sau semine), matrici alimentare cu grad redus de
procesare (ex. fin), matrici alimentare cu grad mediu de procesare
(ex. texturatele proteice din soia) i matrici alimentare intens
porcesate (ex. pate, crnai vegetali, extract de lecitin, crem
vegetal de brnz sau ulei); ultima categorie poate fi la rndul ei
mprit n alimente compozite sau rafinate;
tipul ingredientelor (ex. pe baz de soia sau porumb);
modul de prezentare, existnd produse n vrac (boabe/semine) i
produse ambalate (texturate proteice, tofu, biscuii etc.);
gradul de umiditate, existnd produse uscate (produse de panificaie,
fulgi), produse umede (tofu, creme, ngheat) i produse lichide (ulei,
bere).
Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoatere ct mai bun a
proprietilor intrinseci ale probelor ajut la alegerea celor mai
potrivite metode de eantionare, pregtire i izolare a analitului (ADN
sau protein).
Materialele neprocesate sau cu grad redus de procesare (ex.
seminele sau fina) sunt uor de testat datorit posibilitii de
obinere a unor extracte ADN sau proteice cu caracteristici
corespunztoare din punct de vedere analitic. n cazul matricilor
alimentare procesate, ca izolatele proteice, lecitina, uleiul, sosul de
soia, derivatele din amidon, analiza este dificil de efectuat, de multe
ori chiar imposibil (Meyer, 1999), deorece:
aciunea unor factori (enzimele, forele mecanice, temperatura, pH-ul,
srurile caotropice sau solvenii anorganici) specifici proceselor
tehnologice de obinere a acestor matrici determin degradarea sau
denaturarea excesiv a analitului;
acestea pot reprezenta doar produse obinute prin rafinare, procedur
ce are ca scop o separare ct mai bun de orice alt material celular
(ex. ADN);
acestea pot reprezenta doar ingrediente ale unor matrici compozite,
materialul derivat din taxonul de interes constituind astfel doar o
parte redus din ntreaga prob.
Cu toate c produsele vegetale utilizate n alimentaie ajung la
consumatorul final de obicei sub form procesat, testarea materiilor
prime (boabe/semine) este de asemenea important deoarece conceptul de
trasabilitate, impus de legislaia european n vigoare, prevede ca
etichetarea s fie fcut chiar dac materialul MG nu este detectabil n
produsul finit. De asemenea, importurile se fac de obicei sub form de
semine/boabe.
Aceste dou aspecte subliniaz importana testrii materiilor
prime.
O alt categorie de produse care pot conine material MG sunt cele
de origine animal, provenite de la animale hrnite cu furaje pe baz de
OMG-uri. Agodi et al.(2005) au demonstrat prezena ADN-ului provenit de
la porumb sau soia MG n mai multe tipuri de lapte de pe piaa italian.
Autorii au concluzionat totui c prezena ADNului transgenic nu apare
ca efect direct al utilizrii OMG-urilor n alimentaia animalelor, ci
este datorat contaminrii laptelui dup recoltare. Identificarea
precis a verigii tehnologice n care a survenit contaminarea nu a fost
ns posibil. Lipsa contaminrii cu ADN MG a produselor (i.e. lapte,
carne sau ou) provenite de la animale n a cror diet au fost incluse
ingrediente derivate din OMG-uri, a fost semnalat i n alte publicaii
(ex. Phipps et al., 2003 i 2002, Flachowsky i Aulrich, 2001, sau
Faust, 2000, n Agodi et al., 2005).
Materialele de referin reprezint matrici cu caracteristici
cunoscute, indispensabile pentru validarea metodelor sau rezultatelor.
2.3. E 2.3. E 2.3. E 2.3. EANTIONAREA ANTIONAREA ANTIONAREA ANTIONAREA
n practica testrilor OMG, operaiunea de eantionare nu revine
laboratoarelor, fiind efectuat de personal specializat din cadrul
instituiilor abilitate ale statului. n continuare sunt prezentate
elementele de baz ale acestei operaiuni care influeneaz semnificativ
etapele ulterioare desfurate n laborator, precum i corectitudinea
rezultatelor obinute.
Dei se desfoar n afara laboratorului, eantionarea poate fi
considerat prima etap a procesului analitic, constituind un pas
important, complex i obigatoriu pentru testarea tuturor categoriilor de
produse comerciale. Obligativitatea acestei etape rezid din
imposibilitatea inspectrii tuturor produselor existente pe pia
(Querci et al., 2005), iar complexitatea este determinat de necesiatea
obinerii unui eantion reprezentativ.
Eantionul (i.e. proba de laborator) reprezint o colecie de
observaii (i.e. obiecte) selectate din cadrul unei populaii, utiliznd
o procedur corespunztoare, iar populaia (i.e. lotul) este definit ca
totatlitatea observaiilor (i.e. obiectelor) despre care se vor trage
concluzii n urma analizei (Querci et al., 2005).
Procesul de eantionare reprezint ntodeauna o surs de eroare
care apare atunci cnd din lotul de dimensiuni mari se izoleaz o parte
ce va constitui proba utilizat de ctre laborator n procesul analitic
(Querci et al., 2005, Zafar et al., 2004). De aceea, n cadrul testrii
OMG, ca de altfel n cadrul tuturor analizelor ce necesit eantionare,
pe lng eroarea analitic apare i eroarea de prelevare, iar mpreun
acestea constituie eroarea total (Querci et al., 2005). O bun practic
de eantionare asigur reducerea erorilor, ceea ce nseamn de fapt
creterea gradului de reprezentativitate al probei pentru populaia din
care provine. n acest scop trebuie cunoscute n primul rnd
proprietile populaiei iniiale.
n cazul testrii OMG caracterizarea poate fi extrem de dificil i
difer n funcie de tipul produsului luat n considerare (ex. batoane de
ciocolat sau loturi de semine).
Conform SR EN ISO 24576:2006, proba de laborator reprezint
cantitatea recepionat de laborator, iar proba test este cantitatea
utilizat direct la o extracie. n primul caz se realizeaz doar o
reducere n dimensiuni (a lotului iniial, omogenizarea fiind, de
obicei, imposibil), iar cea de-a doua situaie corespunde unor
operaiuni de omogenizare i reducere n dimensiuni. n cazul loturilor
de boabe de porumb, de exemplu, se pornete de la 109 boabe, ajungndu-se
la 103 molecule. Este astfel evident dificultatea ntlnit n obinerea
unei probe reprezentative pentru populaia din care aceasta provine
(Querci et al., 2005).
Cea mai important caracteristic a loturilor este reprezentat de
modul de distribuie a contaminailor (i.e. materialul MG), care
influeneaz foarte mult eficiena procedurilor de prelevare (Figurile 15
i 16). Diferite organisme internaionale (ex. International Seed
Testing Association/ISTA, US Department of Agriculture-Grain Inspection,
Packers and Stockyard Administration/USDA-GIPSA, ISO, CEN, Food and
Agriculture Organization/FAO sau Codex Alimentarius) au propus o gam
foarte variat de metode de eantionare pentru produsele neambalate,
majoritatea fiind ns bazate pe distribuia binomial a contaminanilor
n masa total.
Distribuia binomial poate fi utilizat fr probleme doar n
cazul loturilor omogene. n schimb, pentru bunurile alimentare (n
special materii prime n vrac), datele experimentale indic faptul c
distribuia este cel mai probabil de tip heterogen (randomizat) (Querci
et al., 2005).
Pentru asigurarea unor protocoale corespunztoare de prelevare din
loturile heterogene erau deci necesare metode statistice noi care s nu
fie bazate pe distribuia normal. n acest scop, Comisia European
asistat de ENGL a conceput i introdus software-urile KeLDA (Kernel Lot
Distribution Assessment) i KeSTE (Kernel Sampling Technique
Evaluation), destinate evalurii strategiilor de prelevare a probelor n
funcie de proprietile loturilor, fr a face ns nicio presupunere
referitoare la distribuie.
KeLDA este un instrument de estimare a distribuiei contaminrii cu
OMG-uri n loturile de semine, iar KeSTE are rolul de a investiga
impactul distribuiei OMG-urilor asupra eficienei schemelor de
prelevare, de a estima eficiena protocoalelor de prelevare n funcie de
proprietile loturilor i de a pune la dispoziie criterii de alegere a
procedurilor de prelevare a eantioanelor (Querci et al., 2005).
n concluzie, eantionarea unui lot de produse n vrac, n vederea
obinerii probei de laborator, constituie o etap foarte problematic
(Zafar et al., 2004) deoarece nu putem fi siguri de corectitudinea
procesului, adic de reprezentativitatea eantionului pentru lotul din
care provine (Querci et al., 2005). Reducerea probei de laborator pentru
obinerea probei test este ns un proces mult mai simplu, n acest caz
fiind mai uor de asigurat reprezentativitatea probei de dimensiuni mici
pentru cea din care provine (Querci et al., 2005).
n ceea ce privete produsele finite, problematica eantionrii
este asemntoare, fiind dificil definirea proprietilor unei
populaii, iar ca i consecin, stabilirea procedurilor care s asigure
reprezentativitatea probelor este greu de realizat.
Au fost utilizate diferite metode de eantionare pentru alimentele
procesate ambalate, niciuna nefiind ns special destinat acestui scop.
Noua legislaie european referitoare la OMG-uri ofer indicaii
clare pentru modul de eantionare a diferitelor categorii de bunuri
alimentare. Aceste protocoale de eantionare sunt destinate aplicrii n
cadrul testrilor OMG i iau n calcul posibila distribuie heterogen.
Recomandarea 2004/787/EC, anexat Regulamentului 1830/2003, conine
referiri la modul de eantionare a loturilor de semine sau boabe,
precum i a celor de produse neambalate (ex. fin).
Protocoalele de eantionare care pot fi aplicate n cazul
produselor ambalate sunt definite n standardul ISO 2859:1985 (Querci et
al., 2007; Querci et al., 2005). CEN/TS 15568:2006 conine de asemenea
informaii relevante pentru tehnica de eantionare aplicabil n cazul
testrii OMG.
Procedura general de eantionare a seminelor/boabelor sau
bunurilor alimentare neambalate i de obinere a probei analitice este
descris de Querci et al. (2007) i Querci et al. (2005). O procedur
asemntoare este descris i de Trapmann i Emons (2005).
Din punct de vedere practic, eantionarea produselor neambalate
este constituit din urmtoarele etape:
prelevarea eantioanelor dintr-un lot, conform schemei utilizate;
potrivit recomandrilor, eantioanele prelevate anterior vor fi
mprite n dou pri egale, una fiind folosit la constituirea probei
iniiale de laborator, iar cealalt va fi pstrat pentru analiz n
cazul n care este necesar determinarea intervalului de ncredere n
jurul coninutului estimat de OMGuri;
evaluarea coninutului de material MG al probei iniiale de laborator;
dac este nevoie, se efectueaz analiza individual a eantioanelor
iniiale pentru determinarea unui interval de ncredere n jurul valorii
estimate.
n funcie de rezultatele obinute la testarea probei de laborator,
ne putem confrunta cu una dintre urmtoarele situaii (Querci et al.,
2007):
coninutul OMG (contaminarea probei de laborator) este apropiat de
pragul
stabilit legal ( 50% din aceat valoare); n acest caz eantioanele
individuale trebuie analizate pentru stabilirea intervalului de
ncredere (ca abatere standard) n jurul valorii estimate;
coninutul de OMG-uri este situat mult sub pragul limit (OMG <
valoare limit 50%); nu este necesar analiza eantioanelor
individuale;
coninutul de OMG-uri este situat mult deasupra pragului limit (OMG >
valoare limit + 50%); nu este necesar analiza eantioanelor
individuale.
2.4. PREG 2.4. PREG 2.4. PREG 2.4. PREGTIREA PROBELOR TIREA PROBELOR TIREA PROBELOR TIREA PROBELOR
nainte de izolarea analitului este necesar aplicarea anumitor
operaiuni de pregtire a probelor (ex. reducerea mrimii, mrunire,
umectare sau omogenizare), n funcie de caracteristicile matricii
supuse analizelor (Querci et al., 2005). Scopul acestora este de a
facilita sau mbunti izolarea i purificare analitului.
Un aspect important n aceast etap este reducerea probei de
laborator rezultat prin eantionare, n vederea obinerii probei test
(proba analitic). Procesul de eantionare trebuie s asigure
reprezentativitatea probei de laborator pentru lotul din care provine,
iar operaiunile efecuate n laborator pe cea a probei analitice pentru
fraciunea superioar (Querci et al., 2005).
Reducerea probei presupune omogenizarea riguroas i cntrirea
unei cantiti mai mici ce constituie fraciunea inferioar. n cazul n
care proba este constituit din buci mari, cu grad redus de umiditate
(ex. semine sau texturate proteice sub form de cuburi), acestea vor
trebui mrunite ct mai bine, deoarece n cele mai multe cazuri, proba
test utilizat direct n protocolul de extracie este mai mic dect
prile ce compun proba iniial. Neajunsul asociat acestor proceduri
este reprezentat de posibila nclzire, ceea ce prezint riscul de
activare a DNazelor, enzime care vor degrada acizii nucleici.
Umectarea reduce gradul de nclzire i faciliteaz de asemenea
procesul de extracie, probabil datorit nmuierii particulelor. Acest
aspect a fost subliniat de Corbisier et al. (2005), n cazul probelor
sub form de fin. Probele umede (iaurt, tofu, ngheat, crem) nu
necesit adugarea apei.
Omogenizarea minuioas este necesar i n cazul probelor lichide
ca lapte, lapte de soia, ulei sau bere.
n cazul probelor compozite, doar unele ingrediente conin OMG-uri,
de aceea, dac este posibil, componentele care nu sunt vizate n cadrul
analizei i care constituie poteniali contaminani (ex. condimente sau
sosuri) trebuie separate de restul probei pentru a mri eficiena
extraciei. Uneori, ndeosebi n cazul probelor cu coninut ridicat de
amidon, acizi sau grsimi, este oportun utilizarea unor tratamente
adiionale pentru creterea eficienei lizei celulare i mbuntirea
extraciei ADN-ului.
Se recomand de asemenea ca pregtirea probelor s se desfoare
ntr-un spaiu special dedicat acestei operaiuni datorit inerenei
producerii prafului. Este absolut necesar ca aceast ncpere s fie
curat sistematic pentru a evita apariia contaminrilor ncruciate
(Querci et al., 2005).
2.5. EXTRAC 2.5. EXTRAC 2.5. EXTRAC 2.5. EXTRACIA ADN IA ADN IA ADN IA ADN- -- -ULUI ULUI ULUI ULUI
Dup cum s-a specificat ntr-unul dintre subcapitolele anterioare,
reacia PCR, clasic sau real-time, st la baza celor mai utilizate
metode de testare OMG. n cadrul analizelor ce au la baz aceast
reacie, analitul este reprezentat de ADN, a crui izolare i purificare
constituie astfel prima etap a testrii OMG, specific biologiei
moleculare.
Tehnica PCR este reproductibil, specific i sensibil,
caracterizndu-se printr-o mare capacitate de discriminare, procesare i
costuri relativ reduse. Performanele acesteia pot fi ns limitate de
caracteristicile intrinseci ale probei i de performanele metodei de
extracie, aspecte ce se reflect n absena/prezena inhibitorilor PCR i
n calitatea i cantitatea ADN-ului din extracte (Di Pinto et al.,
2007). Dac starea ADNului este influenat n principal de procesarea
industrial, eliminarea complet a inhibitorilor PCR (ex. polizaharide,
acizi humici sau lipide) depinde de procedura de extracie (Deisingh i
Badrie, 2005). Aceste substane pot persista n extractele finale,
determinnd, n general, reducerea sau inhibarea complet a procesului
de amplificare.
De aceea, utilizarea metodelor moleculare pentru analiza probelor
alimentare necesit strategii de extracie i purificare care s asigure
un grad ct mai mare de recuperare a acizilor nucleici i de ndeprtare
a substanelor inhibitoare, precum i a altor reziduuri (Smith i
Maxwell, 2007; Lipp et al., 2001, Zimmermann et al., 1998, Meyer i
Candrian, 1996, n Di Pinto et al., 2007; Meyer, 1999).
Cele mai importante caracteristici ale extractelor utilizate n
analizele PCR sunt cantitatea, calitatea i puritatea, care, dac sunt
nesatisfctoare, reduc sensibilitatea metodei sau fac imposibil
testarea OMG (Engel i Moreano, 2003, n Smith i Maxwell, 2007;
Deisingh i Badrie, 2005), mai ales n cazul n care materialul MG este
prezent doar ntr-un procent redus.
Existena unei largi varieti de metode destinate extraciei i
purificrii acizilor nucleici impune utilizarea urmtoarelor criterii
pentru alegerea celei mai potrivite tehnici: acidul nucleic int care
trebuie izolat, tipul probei sau materialul iniial (ex. esut, frunz
sau material procesat), rezultatele ateptate (ex. cantitate, calitate
sau timpul necesar pentru purificare), aplicaiile ulterioare (ex. PCR,
clonare, etichetare, blotting, real-time PCR sau sintez de ADN
complementar). Aceast alegere este foarte important, n special pentru
analiza cantitativ i reprezint de obicei un compromis ntre costuri,
concentraia extractului i puritatea acestuia. Esenial este ns
capacitatea procedurii de a permite obinerea unui extract cu
concentraie mare de ADN i lipsit de substane care pot afecta reacia
de amplificare (Cankar et al., 2006).
Extracia ADN-ului din materialul biologic vegetal necesit liza
celulelor, inactivarea nucleazelor i separarea acestuia de substanele
inhibitoare (ex. resturile celulei, compui organici din mediul celular
sau reactivi utilizai pentru izolare). De obicei, procedura de liz
reprezint o combinaie de principii diferite (ex. descompunerea
mecanic, tratament cu detergeni sau digestie enzimatic). Distrugerea
membranei celulare i inactivarea nucleazelor intracelulare pot fi
combinate n cadrul aceleiai etape, o singur soluie putnd conine
detergent pentru solubilizarea membranei celulare i sruri pentru
denaturarea enzimelor. ndeprtarea resturilor celulare rezultate din
aceast operaiune este fcut prin filtrare, extracie sau precipitare.
Aceste procedee pot fi aplicate sauccesiv sau concomitent, fiecare
presupunnd utilizarea unor metode sau reactivi specifici.
Ulterior extraciei se realizeaz splarea ndeprtarea
reactivilor i eventual a altor substane nedorite, nc prezente n
soluie care presupune de fapt o nou etap de filtrare sau
precipitare. Analitul este apoi eluat sau resuspendat, obinndu-se
extractul (soluia) de ADN.
Dup cum s-a amintit i mai sus, o larg varietate de principii i
protocoale de extracie sunt disponibile i pot fi aplicate n acest
domeniu.
2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN 2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN 2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN 2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN
nainte de efectuarea analizei OMG propriu-zise, este necesar
evaluarea pretabilitii extractelor la analize bazate pe reacia PCR
clasic, dar mai ales la cele bazate pe reacia real-time PCR.
Criteriile eseniale n acest context sunt cantitatea de ADN recuperat i
calitea extractului i a ADN-ului (Cankar et al., 2006; Moens et al.,
2005; Meyer, 1999).
Primul criteriu se refer la cantitatea de ADN prezent n extract, care
trebuie s fie suficient, adic peste limitele de detecie i
cuantificare ale metodei utilizate (Kay et al., 2001, i Hbner et al.,
2001, n Cankar et al., 2006).
Al doilea criteriu vizeaz n principal posibilitatea de a regsi
n extract substane inhibitoatre pentru PCR, ca polizaharide, proteine,
polifenoli (taninuri), lipide i ali metabolii secundari (Holden et
al., 2003, Peist et al., 2001, Wilson, 1997, i Rossen et al., 1992, n
Cankar et al., 2006; Meyer, 1999). Unele componente ale soluiilor
utilizate la extracie pot de asemenea afecta reacia PCR (Rossen et
al., 1992, n Cankar et al., 2006). Efectul substanelor contaminante n
cadrul analizelor PCR este, n general, reprezentat de reducerea
eficienei de amplificare (Kubista et al., 2006). Substanele cu efect
antagonic inhibitorilor se numesc adjuvani (ex.
polyvinylpyrrolidone/PVP sau bovine serum albumine/BSA) i sunt de
obicei incluse n mod constant ntr-unul dintre reactivii uzuali
(tamponul PCR) folosii pentru amplificare (Wilson, 1997, n Cankar et
al., 2006).
Prin calitatea ADN-ului extras se face referire la integritatea
structural a moleculelor. n acest conzext, Holst-Jensen i Berdal
(2004) au introdus conceptul de uniti PCR funcionale (PCR forming
units), pentru a face diferena ntre copiile intacte (amplificabile) de
ADN int i cele puternic fragmentate (neaplificabile) (Cankar et al.,
2006).
2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric 2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric 2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric 2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric
Caracterizarea calitativ i cantitativ a extractelor de ADN
poate fi realizat n mai multe moduri (Moens et al., 2005; Waiblinger
et al., 2006):
fluorimetric; cele mai utilizate din aceast categorie sunt migrarea
n gel de agaroz i marcarea cu o substan de intercalare (vezi
subcapiltolul 2.6.2), metoda Picogreen (Invitrogen, 2009) i utilizarea
unui sistem real-time PCR specific acestui gen de aplicaie;
densitometric;
spectrofotometric.
Datorit n principal avantajelor de ordin economic, ultima metod
de cuantificare a extractelor este des utilizat n practic, multe
spectrofotometre fiind concepute special pentru determinarea
concentraiei i puritii moleculelor biologice. Trebuie ns avut n
vedere faptul c valorile obinute nu sunt exacte (sunt, de obicei,
supraestimate), existnd o serie de factori ce determin apariia unor
erori semnificative (MATC, 2009)
Majoritatea moleculelor biologice (ex. ADN, ARN sau proteine) nu
absorb lumina din spectrul vizibil, dar o absorb pe cea ultraviolet.
Proprietatea este folosit pentru estimarea concentraiei i puritii
moleculelor respective prezente n anumite soluii (ex. extractele
obinute din probele analizate) (MATC, 2009). Astfel ADN-ul, ARN-ul,
oligonucleotidele i chiar mononucleotidele pot fi msurate direct n
soluii apoase diluate sau nediluate, prin nregistrarea absorbiei la o
anumit lungime de und, respectiv n spectrul ultraviolet. Mrimea
msurat este denumit absorban (A) sau densitate optic (optical
density/OD). Dac proba este pur (fr cantiti semnificative de
proteine, fenoli, agaroz etc.), msurarea cantitii de radiaie
absorbit are un nalt grad de precizie. n Tabelul 1 sunt prezentate
lungimile de und din spectrul UV, relevante pentru msurarea
spectrofotometric a ADN-ului.
Tabelul 1.
Lungimi de und din spectrul UV relevante pentru msurarea ADN-ului
Lungimea de und Importan Observaii
215-230 nm

Absorbie minim a acizilor
nucleici. Absorbie maxim a
proteinelor, determinat de
legturile peptidice.

Nu se efectueaz msurtori
deoarece soluiile tampon i
solvenii utilizai frecvent n
laborator absorb de asemeea
lumin n acest interval.
260 nm Absorbie maxim a acizilor
nucleici.

Bazele azotate purinice
prezint absorbie maxim la o
valoare puin mai mic de 260
nm, iar bazele azotate
pirimidinice puin deasupra
valorii de 260 nm. La aceast
lungime de und
absorbia proteinelor este
redus.
270 nm Absorbia puternic a
fenolului
Fenolul poate reprezenta un
contaminant introdus n timpul
efecturii extraciei.
280 nm

Nivel maxim de absorbie a
proteinelor, datorit
aminoacizilor aromatici.
Acizii nucleici prezint o
absorbie redus la acest
nivel.
320 nm Nici acizii nucleici, nici
proteinele nu absorb la acest
nivel.

Nivel utilizat pentru
corecii, eliminndu-se
semnalul aferent turbiditii
solventului.
Dup MATC (2009), modificat.

Esixt dou strategii de determinare a concentraiei ADN-ului pe
baza absorbiei luminii UV (MATC, 2009):
se poate construi o curb de calibrare utiliznd probe standard;
varianta simplificat a metodei anterioare, care are la baz
utilizarea constantelor de absorbie ale moleculelor de interes;
potrivit legii Beer- Lambert, ntre absorban i concentraie exist o
relaie direct proporional, astfel valorii A = 1 i corespund
aporximativ 50 g/ml AND dublu-catenar (ADNdc), aproximativ 37 g/ml
ADN monocatenar, 40 g/ml ARN sau aproximativ 30 g/ml nucleotide
libere (MATC, 2009; Somma 2004).
Prima metod se caracterizeaz printr-o precizie mai mare, n timp
ce a doua este mult mai simpl si rapid.
Spectrofotometria poate fi utilizat i pentru estimarea puritii
unei soluii de ADN. Dup cum s-a vzut anterior, soluiile de ADN
prezint absorbie maxim pentru lungimea de und de 260 nm, iar
soluiile proteice pentru 280 nm. Deoarece soluiile de ADN absorb
parial lumina la 280 nm, iar cele proteice absorb parial lumina la 260
nm, raportul dintre citirile la 260 nm i 280 nm (A260/A280) poate fi
utilizat pentru estimarea puritii extractului de ADN. Valoarea optim,
corespunztoare unei soluii pure, este cuprins ntre 1,7 i 1,9
(Qiagen, 2006). n cazul contaminrii cu proteine, raportul A260/A280 va
fi semnificativ mai mic (pentru proteine pure raportul este de 0,6)
(MATC, 2009), iar cuantificarea precis a cantitii de acid nucleic nu
este posibil. Valori mai mari de 2,0 sunt caracteristice souiilor pure
de ARN.
Absorbia la 230 nm reflect gradul de contaminare al probei cu
substane de tipul carbohidrailor, peptidelor, polifenolilor sau
compuilor aromatici. n cazul probelor pure de ADN, raportul A260/A230
trebuie s fie de aproximativ 2,2 (MATC, 2009).
Ca principiu de funcionare, spectrofotometrul utilizeaz
transmisia luminii cu o lungime de und specific printr-o soluie n
care se afl dizolvat molecula de interes. Diferena ntre cantitatea de
lumin transmis nspre prob i cea recepionat la ieire corespunde
absorbanei moleculei care este direct proporional cu concentraia
acesteia.
Acest tip de determinri pot fi utilizate i pentru stabilirea
numrului absolut de copii ale secvenei de interes. Pentru conversia
masei de ADN n numr de copii ale secvenei de interes se utilizeaz
masa unui genom haploid, denumit echivalent genomic haploid sau
valoare 1C. Determinarea acestor valori, inclusiv pentru soia, a fost
fcut n cadrul a mai multor studii: Bennett i Leitch (2004) (Huang i
Pan, 2005), Bennett i Leitch (2003) (Rott et al., 2004), Bennett i
Leitch (1997) (Cankar et al., 2006), Arumuganathan i Earle (1995)
(Reiting et al., 2007, i Taverniers et al., 2005); Arumuganathan i
Earle (1991) (Corbisier et al., 2005, i Petit et al., 2003). Subliniem
c aceste valori difer n funcie de autor (vezi valorile 1C citate i
folosite de Reiting et al., 2007, Burns et al., 2006, Cankar et al.,
2006, Foti et al., 2006, SR EN ISO 21570:2006, Waiblinger et al., 2006,
Moens et al., 2005, Somma i Querci, 2004b, i Berdal i Jensen, 2001).
Putem totui conchide c valoarea medie a unui genom haploid de
soia reprezint echivalentul a aproximativ 1,15 pg de ADN genomic.
Practic, numerele absolute de copii ale fragmentelor int sunt
determinate prin raportarea cantitii de ADN la valoarea 1C
corespunztoare taxonului analizat, nmulind apoi cu un factor ce
exprim zigoia evenimentului de transformare (Reiting et al., 2007).
Este foarte important s se in cont de stocastica distribuiei
copiilor moleculei int n soluia iniial de ADN. Acest aspect are un
impact deosebit n special n cazul n care se lucreaz cu o cantitate
mic de ADN, respectiv un numr redus de copii, deoarece probabilitatea
includerii a cel puin a unui fragment int n reacia PCR poate fi
nesatisfctoare (Berdal i Holst-Jensen, 2001).
2.6.2. Evaluarea st 2.6.2. Evaluarea st 2.6.2. Evaluarea st 2.6.2. Evaluarea strii de fragmentare a moleculelor de ADN rii de fragmentare a moleculelor de ADN rii de fragmentare a moleculelor de ADN rii de fragmentare a moleculelor de ADN
Dup cum s-a artat mai sus, integritatea structural a
moleculelor de AND reprezint o caracteristic important pentru
succesul reaciei PCR deoarece un grad ridicat de fragmentare crete
probabilitatea ca numrul copiilor amplificabile ale secvenei int s
fie insuficient, respectiv sub limita de detecie/cuantificare (Berdal
i Holst-Jensen, 2001). Acest fenomen este caracteristic n special
matricilor procesate.
Valorile satisfctoare ale concentraiei i puritii extractelor
determinate spectrofotometric nu garanteaz prezena unui ADN
nedegradat, cu mas molecular mare. Pentru evaluarea acestei nsuiri
se poate utiliza migrarea electroforetic n gel de agaroz i marcarea
cu o substan de intercalare (ex. Debode et al., 2007, CRL-GMFF, 2007,
sau Corbisier et al., 2005) sau electroforeza capilar i detecia cu
laser (Corbisier et al., 2005). Cea de-a dou tehnic se caracterizeaz
printr-o mai bun sensibilitate i rezoluie (Garcia-Canas et al., 2004,
n Engel et al., 2006), permind o mai bun evaluare a degradrii ADN-
ului (Corbisier et al., 2005). n schimb, electroforeza n gel de
agaroz este mult mai avantajoas din punct de vedere economic, fiind
cel mai frecvent utilizat pentru evaluarea strii de fragmentare.
Electroforeza n gel este o metod de separare a macromoleculelor
(ex. ADN, ARN sau proteine) n funcie de mrime, structur, ncrctur
electric i alte proprieti fizice (Somma i Querci, 2004a; Wikipedia,
2009f). n cadrul unui astfel de experiment, moleculele sunt forate s
strbat lungimea unui gel, micarea fiind determinat de curentul
electric aplicat electrozilor poziionai la ambele capete ale gelului
(Somma i Querci, 2004a).
Separarea se realizeaz deci ntr-o matrice poroas (gelul de
agaroz), iar distana strbtut n unitatea de timp i viteza de
deplasare depind de caracteristicile:
macromoleculelor separate, respectiv mobilitatea electroforetic,
determinat n principal de ncrctura electric i mrime (Wikipedia,
2009f);
mediului de electroforez, respectiv tipul i concentraia gelului i
a soluiei tampon;
curentului electric aplicat, respectiv intensitatea acestuia.
Procesul este similar trecerii particulelor printr-o sit
(Wikipedia, 2009), gelul avnd rolul de a ncetini micarea moleculelor,
datorit apariiei forelor de frecare.
ncetinirea micrii este cea care determin separarea moleculele
de ADN (ISCID, 2005), cele de dimensiuni mici strbtnd mai uor
matricea comparativ cu cele de dimensiuni mari.
O gam larg de molecule biologice (ex. aminoacizi, proteine,
nucleotide sau acizi nucleici) posed grupri ionizate care, la orice
valoare a pH-ului, sunt prezente n soluii sub form de cationi (+) sau
anioni (-) (Somma i Querci, 2004a). n cazul ADN-ului, sarcina
electric, dat de moleculele de zahar i radicalii fosfai din cadrul
nucleotidelor, este negativ (Wikipedia, 2009f), iar acesta se va
deplasa nspre anod (+).
Gelul utilizat pentru electroforez poate fi de mai multe tipuri,
n funcie de tipul aplicaiei i analitul cu care se lucreaz. Pentru
experimentele specifice testrii OMG calitative se utilizeaz geluri de
agaroz. Concentraia gelului se exprim n procente de mas raportate la
volum (weight/volume, simbolizat w/v) i reprezint de asemenea un
factor ce influeneaz viteza de migrare i capacitatea de separare a
moleculelor de diferite dimensiuni. De obicei, aceasta variaz ntre
0,7-0,8% i 1,4-2% i influeneaz invers proporional viteza de
deplasare a moleculelor.
Soluia tampon de electroforez (electrophoresis buffer) are un
anumit coninut n sruri i are rolul de a menine constant valoarea
pH-ului i de a pune la dispoziie ioni care asigur conductivitatea
electric (Wikipedia, 2009f; Somma i Querci, 2004a). Concentraia
tamponului de electroforez influeneaz direct proporional viteza de
migrare. Dac ns aceasta este prea mare, cldura generat de cmpul
electric va crete mult, putnd cauza topirea gelului sau alte
inconveniente de natur tehnic. ADN-ul nu poate fi vizualizat direct,
ci doar dup marcare. Cea mai utilizat este marcarea cu o substan de
intercalare (ex. bromura de etidiu/EtBr, SYBR Green I sau SYBR Safe).
Moleculele unei astfel de substane au proprietatea de a se intercala
ADNului dublu-catenar. Dup intercalare emisia fluorescent a acestor
molecule crete semnificativ, iar n prezena unei surse de lumin UV
ADN-ul dublu-catenar din gel poate fi pus n eviden. Procedura clasic
de marcare a ADN-ului implic utilizarea EtBr, substan ce prezint ns
o serie de neajunsuri (n special riscuri pentru sntate).
De aceea, n ultimii ani au fost introduse noi substane, mai puin
periculoase i mai performante din punct de vedere tehnic, ca SYBR Green
I sau SYBR Safe. Procedura de lucru este similar celei care utilizeaz
EtBr, costurile fiind ns mai ridicate. Mrimea fragmentelor separate
este determinat apoi prin comparare cu probe standard ce conin
fragmente de ADN de mrimi cunoscute (Somma i Querci, 2004a). Aceast
etap este obligatorie doar la interpretarea rezultatelor obinute prin
amlificare, evaluarea extractelor putndu-se face i fr probe
cunoscute.
2.6.3. Confirmarea absen 2.6.3. Confirmarea absen 2.6.3. Confirmarea absen 2.6.3. Confirmarea absenei substan ei substan ei substan ei substanelor inhibitoare elor inhibitoare elor inhibitoare elor inhibitoare
Dup cum s-a menionat i n subcapitolele anterioare, succesul
extraciei n cadrul analizelor OMG depinde de performanele metodei
utilizate, respectiv de capacitatea acesteia de a recupera o cantitate
suficient de ADN amplificabil i de a elimina inhibitorii PCR
(Waiblinger et al., 2006). Prezena acestora din urm n extract i
influena pe care o au asupra reaciei PCR pot fi evideniate printr-un
experiment realtime PCR, amplificnd o secven endogen n diluii
seriale ale extractului (CRLGMFF, 2007; Reiting et al., 2007; Foti et
al., 2006; Lee et al., 2006; Waiblinger et al., 2006; Cankar et al.,
2006; SR EN ISO 21570:2006). Principiul i caracteristicile tehnicii
real-time PCR vor fi descrise n subcapitolul 2.9.2, iar modalitatea n
care aceasta poate fi utilizat pentru evaluarea inhibiiei n
subcapitolele 2.6.3 i 3.5.2.4. Acest tip de analiz reprezint o foarte
bun modalitate de evaluare a metodelor de extracie i a pretabilitii
extractelor la amplificarea real-time PCR, constituind o parte esenial
a validrii efectuate n cadrul laboratorului (in-house validation),
nainte de verificarea printr-un studiu de comparare interlaboratoare
(Waiblinger et al., 2006).