CAPITOLUL II

MATERIALE I METODE

2.1. Materialul biologic folosit n experimente

n experimente am folosit tulpini bacteriene aparinnd Laboratorului de Inginerie
Genetica... i tulpini de fungi filamentoi recoltai de pe tomate din soiului Bella, din cultur
proprie.

2.2. Medii de cultur folosite n experimente

Mediul de cultur reprezint un substrat nutritiv de complexitate diferit, care
favorizeaz creterea i dezvoltarea microorganismelor n condiii artificiale de laborator. Se
ine cont de necesitiile nutritive ale microorganismelor ce urmeaz a fii cultivate.

n experimente am folosit urmtoarele medii de cultur:
2.2.1. Mediu de cultura cu morcov
Pentru obinerea acestuia am folosit 50 de grame de morcov ras, 250 de mililitrii de
ap distilata, 2% glucoz, 1,5% agar. Morcovul l-am introdus in apa distilat si l-am pus la
autoclav timp de 30 de minute la o temperatur de 120 de grade Celsius si o atmosfer. Am
filtrat amestecul obinut din care am preluat 100 mililitrii de lichid peste care am adugat
glucoza i agarul i am reintrodus la autoclav timp de 30 de minute in aceleai condiii.
Mediul gata preparat l-am repartizat in vase Petri.

2.2.2. Mediu de cultura cu mazre
Pentru obinerea acestuia am folosit 50 de grame de mazre zdrobit, 250 de mililitrii
de ap distilat, 2%glucoz, 1,5% agar. Mazrea am amestecat-o cu apa distilat am introdus-
o la autoclavator timp de 30 de minute la o temperatur de 120 de grade Celsius si o
atmosfer. Am filtrat amestecul obinut, am preluat 100 mililitrii peste care am adugat
glucoza i agarul, am reintrodus la autoclavator timp de 30 de minute in aceleasi condiii.

2.2.3. Mediu de cultura PDA Potato-Glucose-Agar
Acest mediu de cultura conine extrat de cartof 4 grame la litru, agar 15 grame la litru,
dextroz 20 de grame la litru, avand un pH final de 5,40,2( la 37 grade Celsius)

2.2.4. Mediu de cultura cu secar ( nu am reteta)
2.2.5. Mediu de cultura bulion lichid ( nu am reteta)

Figura Medii de cultur foosite n experiment.

2.3. Metode de realizare a interaiunilor dintre microorganisme
Pentru realizarea experimentului am izolat tulpinii de microorganisme de pe tomate
din soiul Bella, am folosit fructe i aparat foliar.
Am folosit 4 roii cu infecie i 8 frunze, acestea fiind cultivate pe plci Petri pe
urmtoarele medii de cultur: pentru mediul PDA am folosit 4 placi, pentru mediu cu morcov
am folosit 4 plci, pentru mediu cu mazare am folosit 4 plci, pentru mediu cu secar am
folosit 4 plci, iar pentru izolarea microorganismelor de pe frunze am folosi cte 2 placi din
fiecare mediu de cultur. Acetia au fost incubai timp de 5 zile la 27C.
Scopul acestor inoculri a fost acela de a afla ce tipuri de microorganisme se afl pe
cele 4 medii de cultur.
.


Figura Aspectul fungilor dupa 5 zile de incubare.

Dup cele 5 zile de incubaie am selectat cele mai reprezentative culturi pentru a forma
culturi pure din acestea


Figura Cele mai reprezentative culturi
.
Din aceste culturi, am realizat culturi pure de microorganisme pe mediu de cultur
PDA, inute la incubator timp de 5 zile la 27C.
Am obinut 7 culturi pure, pe care le-am analizat la microscopul optic i microscopul
electronic, iar din acestea cu interes deosebit au fost Phytophthora infestans i Alternaria
solani.


Figura Culturi pure

Pentru speciile cu interes pentru lucrarea mea am realizat culturi pure.

2.4.Testarea antagonismului microbian
Am folosit culturile pure de P si A pe care le am inoculat cu tulpini bacteriene de
Bacillus suptilis , pentru a testa proprietile antagoniste ale acestor tulpini bacteriene.
Am folosit 8 culturi bacteriene de Bacillus suptilis. Aici fac un tabel cu cele 8 bacterii?









Tulpina ce a influenat
dezvoltarea fungului
Dimensiune cultur
Phytophthora
infestans
dimensiune cultur
Alternaria solani
b1 14.8 5.96
b2 8 8.84
b3 6.2 9.78
b4 10 24.2
b5 7.94 13.48
b6 8 11.9
b7 8.2 11.5
b8 5.4 7.68
martor 14.8mm 24.2mm

Formula de calcul a eficienei = (1-(dimensiune cultur nregistrat pentru fiecare
bacterie/dimensiune martor))*100

Pentru Phytophthora infestans am obinut urmtoarele rezultate:

b1= (1-(14,8/14,8))*100= 0%
b2= (1-(8/14,8))*100= 45.9%
b3= (1-(6,2/14,8))*100= 58.2%
b4= (1-(10/14,8))*100= 32,5%
b5= (1-(7.94/14.8))*100= 46,4%
b6= (1-(8/14,8))*100= 45,9%
b7= (1-(8.2/14,8))*100= 44,6%
b8= (1-(5.4/14.8))*100= 35.4%

Pentru Alternaria solani am obinut urmtoarele rezultate:

b1= (1-(5.96/24,2))*100= 24.59%
b2= (1-(8.84/24,2))*100=35,5%
b3= (1-(9.78/24,2))*100= 59.6%
b4= (1-(24.2/24.2))*100= 0%
b5= (1-(13.48/24.2))*100= 44,3%
b6= (1-(11.9/24.2))*100= 50,9%
b7= (1-(11.5/24.2))*100= 53,1%
b8= (1-(7.68/24.2))*100= 68,3%

2.5 Testarea unor mecanisme de aciune a microorganismelorcu proprieti
antifungice

Pentru testarea mecanismelor de aciune a microorganismelor am selectat bacteriile b5
i bir, deoarece au avut cele mai pronunate efecte de inhibare a dezvoltrii Phytophthora
infestans i Alternaria solani.
L-am inoculat n mediu bulion lichid cu scopul de a identifica componenta activ, fie
c este vorba despre bacterie n sine, fie de metabolitii produi de acetia.
n acest scop vom face urmtoarele variante de testri pe Alternaria solani.
suspensia bacterian inctivat de temperatur
suspensia bacterian filtrat
suspensia bacterian n sine