Obtinerea biotehnologica

a aminoacizilor
A efectuat: masterand in anul I
Nia Radu
A verificat: doctor n tiine,
confereniar universitar
Leanu Mihai

Biotehnologii Vegetale si
Animale

Prezentare la tema:

Chiinu, 2013

Ministerul Educaiei R.M.
Universitatea de Stat din Moldova
Facultatea de Biologie i Pedologie
Departamentul Biologie i Ecologie

Fig. 1. Cei 21 aminoacizi naturali gasiti in eucariote.
Aminoacizii in nutritia umana
Esentiali
Histidine*
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Threonine
Tryptophan
Valine
Neesentiali
Alanine
Arginine**
Asparagine
Aspartic acid
Cysteine**
Glutamic acid
Glutamine**
Glycine
Ornithine**
Proline**
Selenocysteine**
Serine**
Tyrosine**
(*) aminoacid esenial pentru
copiii cu vrsta sub 1 an
(**) esenial numai in unele cazuri
Necesitatea producerii
aminoacizilor
Plantele isi sintetizeaza aminoacizii din compusi anorganici simpli: CO
2
, H
2
O,
NH
3
. Animalele sintetizeaza aminoacizii prin sintetiza endogena in cazul celor
neesentiali si exogena pentru cei esentiali: izoleucina, treonina, valina,
metionina, triptofan, fenilalamina, leucina, izoleucina. La acestia se adauga
cei 2 aminoacizi facultativi esentiali: histidina si arginina. Arginina ocupa o
pozitia aparte, este foarte utilizat in industria farmaceutica si alimentara,
deci cererea este foarte mare.
Necesitatea adaosului de aminoacizi in hrana se impune mai ales pentru
marirea valorii nutritive a alimentelor de natura vegetala. Acestea sunt
foarte sarace in aminoacizi esentiali: faina de porumb nu contine lizina si
triptofan, iar gliadina din grau contine lizina in cantitati mici.
Aminoacizii sunt utilizati in alimentatie, furajare, medicina, cosmetica,
industria chimica.
Folosirea aminoacizilor in alimentatie se bazeaza pe valoarea lor nutritiva,
pe gust, proprietati chimice si activitatea biologica. Din totalul aminoacizilor
produsi industrial in lume 66% provin din alimente, 31% din furaje, 4% din
cosmetica, medicina, industria chimica.
Caile de obtinere a aminoacizilor
Hidroliza proteinelor
vegetale si animale
Prin acest proces s-a obtinut L-
glutamatul din faina de grau,
soia sau din melasa. Astazi
aceasta metoda nu este
foarte des folosita, deoarece
se folosesc cantitati foarte mari
de materie prima (alimente).
Sinteza chimica
Metoda este laborioasa,
costisitoare si se obtin
preparate racemice (amestec
de 2 izomeri optici + si -) din
care se separa antipozi optici
(cu izomeri)
Biosinteza microbiologica;
Sinteza enzimatica.


Prin ultimele doua procedee se obtin
compusi optic activi. Sunt folosite pe
scara industriala si prezinta avantaje si
dezavantaje.

Metoda microbiologica foloseste
materie prima ieftina dar necesita timp.
Aminoacizi trebuie separati de alti
aminoacizi din mediul de impuritati
(inclusiv cel microbian).

Sinteza enzimatica este rapida,
eficienta si nu produce impuritati si
deseuri dar se folosesc materii prime
foarte scumpe. Substratul este un
precursor sau o substanta inrudita
chimic cu aminoacidul ce se doreste a
fi sintetizat. Deoarece enzimele sunt
foarte scumpe, metoda microbiologica
este cea mai raspandita.

Sinteza chimica a aminoacizilor
Substitutia nucleofila
a halogenului
bromurarea -
carbonului al unui
acid carboxilic
(halogenarea Hell
VolhardZelinsky)
substituie
nucleofil cu
amoniac
(convertete
bromura de alchil
la aminoacid)

Sinteza aminoacizilor
dupa Strecker
tratarea unei
aldehide cu
cianur de
potasiu i
amoniac
(produce un -
aminonitril)
Hidroliza
nitrilului
(produce un -
aminoacid)
Sinteza
stereoselectiva
Sinteza clasic produce amestecuri
racemice ale -aminoacizilor.
Proceduri alternative:
Reactia asimetrica Strecker (Kaoru
Harada, 1963, inlocuirea
amoniacului cu (S)--feniletilamina).
Reactia asimetrica catalitica
Strecker (Eric N. Jacobsen, 2009,
utilizarea catalizatorului derivat al
tioureei).
Cea mai adoptata metoda la
momentul actual:
sintez automat pe un suport solid
(ex:. margele de polistiren);
grupri protectoare (ex:. Fmoc,
t-Boc);
grupri activatoare (ex:. DCC, DIC ).

Fig. 2. Sinteza aminoacizilor dupa
Strecker
Sinteza enzimatica a aminoacizilor
In sinteza enzimatica a
aminoacizilor se utilizeaza
inprealabil 5 clase de
enzime:
Hidrolaze (ex:. L-a-
amino-e-caprolactam-
liaza, 2-aminotiazolin-4-
carboxilat-hidrolaza);
Liaze (ex:. aspartaza);
Enzime ce contin
piridoxalfosfat (ex:.
triptofanaza);
Dehidrogenaze ale
aminoacizilor (ex:.
leucindehidrogenaza,
alanindehidrogenaza);
Glutaminsintaza.

Sinteza microbiologica a aminoacizilor
Conditii:
stimularea sintezei enzimatice
implicate si a activitatii lor;
stimularea potrivita in cel a
substantelor nutritive care utilizeaza
ca material de pornire in biomasa;
impiedicarea reactiilor secundare;
inhibarea activitatii enzimatice care
produc degradarea aminoacizilor;
stimularea secretiei de aminoacizi in
mediu.
Realizarea acestor deziderate s-a facut
folosind mutageneza si prin
cunoasterea mecanismelor de reglaj
metabolice la nivel molecular.

In 1955 japonezii au inceput studiul enzimatic al formarii aminoacizilor de catre
microorganisme, folosind tulpini cunoscute sau nou izolate. Cele mai active producatoare
de aminoacizi sunt bacteriile apartinand genurilor Microccocus, Mycobacterium
Corynebacterium, Brevibacterium. In mediul de cultura se acumuleaza mai multi
aminoacizi si doar rar cate unul. Cei mai frecventi sunt: glicocolul, alanina, serina, valina,
leucina, acidul glutamic, acidul aspartic.
Productia microbiologica de aminoacizi se
realizeaza cu:
tulpini salbatice (prototrofe): acidul L-
gluconic, L-valina, L-alanina, L-prolina;
mutante auxotrofe de aminoacizi: L-lizina, L-
treonina, leucina, L-prolina;
mutante auxotrofe de biotina: acidul L-
glutamic;
mutante regulatoare: L-lizina, L-treonina, L-
arginina, metionina;
precursori de biosinteza: L-triptofan, L-
fenilalanina, L-serina, L-histidina.
Factorii care influenteaza productia
microbiologica de aminoacizi:
culturile microbiene;
mediul de cultura.

Culturile microbiene
In productia microbiologica de aminoacizi se folosesc mai ales mutante
auxotrofe si reglatoare. Principiul folosirii acestor mutante: daca o cultura
microbiana obtinuta pe cai folosind ramificatii complicate, mutantele
produc in mediu doar aminoacizi care intereseaza. Deci ele pot fi
auxotrofe de catre un aminoacid care este un intermediar cheie in calea
biosintetica sau pot fi auxotrofe de un aminoacid obtinut prin una din caile
de ramificatie.
Stabilitatea genetica a culturii este o caracteristica importanta pentru
obtinerea de productivitati mari. Testarea stabilitatii se poate constata
exclusiv pe baza cresterii acesteia in lipsa substantelor pentru care ea este
auxotrofa.
Mutantele reglatoare producatoare de aminoacizi si-au pierdut o anumita
cale de reglare biochimica. Cele mai importante sunt cele rezistente la un
analog al aminoacidului. Unii compusi au structura asemanatoare cu cea
a aminoacizilor naturali si cu efecte inhibitoare asupra cresterii anumitor
microorganisme. Aceste substante se numesc izosteri pentru a sublinia
similitudinea stereochimica. Cei mai importanti izosteri sunt analogii
aminoacizilor care functioneaza ca si inhibitori de tip feed-back sau inhiba
incorporarea aminoacizilor in proteine.

In primul caz, cand aminoacidul
cheie se afla in apropierea
punctului de ramificatie, va fi
blocata enzima care actioneaza:
A compus intermediar comun
B aminoacidul care ne
intereseaza
C aminoacidul cheie
intermediar
D aminoacidul obtinut pe calea
ramificarii
enz enzima cheie a transformarii
din A in C
Ex.: Productia microbiologica de
lizina homoserina este primul
aminoacid format pe calea
ramificarii (C), iar mutantele
auxotrofe de homoserina au
blocat activitatea enzimelor
(homoserin dehidrohenaza).

In al doilea caz, mutanta este
auxotrofa de un aminoacid
obtinut pe una din caile
ramificarii si se va bloca
activitatea enzimelor care
catalizeaza formarea acestui
aminoacid:
A compus intermediar
comun
B aminoacidul care ne
intereseaza
C aminoacidul cheie
intermediar
D aminoacidul care se
formeaza alaturi de B
enz enzima cheie a
transformarii din C in D
Mediul de cultura
Sursa de carbon: cele mai bune rezultate le-au dat glucoza si zaharoza, dar
din cauza pretului ridicat, se prefera melasa, insa aceasta trebuie testata,
pentru ca poate contine substante inhibitoare.

Sursa de azot depinde de caracteristicile nutritionale ale culturii.
Microorganismele auxotrofe necesita saruri de amoniu sau acid azotic sau
hidrolizatele de proteina din faina de soia, seminte de bumbac.

Pentru obtinerea acidului glutamic si lizinei, ureea este sursa de azot ideala, pH-
ul optim este intre 6 si 8, cel ideal fiind 7; temperatura este intre 25-37C, dar
cea optima trebuie testata experimental pentru fiecare proces in parte (ex.:
pentru acidul glutamic este de 28C).

Aerarea: productia de aminoacizi are loc in mediu aerat.

Pe plan mondial prin acest procedeu se obtin urmatorii aminoacizi: lizina,
treonina, metionina, acidul glutamic, triptofan. Cele mai mari companii ce
produc aminoacizi apartin japonezilor.
S-a facut prima data in Japonia in 1956 cand s-a izolat un microorganism
capabil sa produca glutamat intr-un mediu cu glucoza si amoniu. Aceste
microorganisme Microccocus glutamicus prezinta caracterul genurilor
Corynebacterium si Brevibacterium. De aceea azi se numesc
Corynebacterium glutamicum. Mecanismul producerii glutamatului din
glucoza si saruri de NH4 este relativ simplu: glucoza este oxidata la acid citric,
care pe calea ATC se transforma in -cetoglutamat. Enzimele implicate sunt
NADP dehidrogenaza in prezenta de amoniu izocitratdehidrogenaza si L-
glutamatdehidrogenaza:
Biotehnologia obtinerii acidului glutamic.
Biosinteza din glucoza si microorganisme.
In conditii aerobe se acumuleaza glutamat, iar in
conditii anaerobe acid lactic.
Un alt factor care regleaza producerea de acid
glutamic este cantitatea de biotina (vitamina H)
din mediu: daca cantitatea este mare continutul
de acid glutamic este scazut si invers.
Producerea glutamatului monosodic se realizeaza prin fermentatie bacteriana.
Bacteria Corynebacterium glutamicum se creste intr-un mediu lichid ce contine
zahar, melasa sau amidon ca si substrat de fermentare. Bacteria este capabila
sa produca acid glutamic in mediu, apoi se separa prin fitrare, purificare si prin
neutralizare, rezultand glutamat monosodic.

In productia acidului glutamic sunt implicate urmatoarele:
tulpinile ce produc acidul glutamic trebuie sa prezinte o activitate scazuta
sau nula a -ceto-glutaratdehidrogenazei, care sa nu permita ca acidul -
cetoglutaric sa fie transformat in acid succinic.
tulpinile ce produc acidul glutamic trebuie sa aiba enzima L-glutamat
dehidrogenaza intr-o forma mai sensibila la inhibitia feed-back manifestata
de glutamat sau sa fie inhibate doar la concentratii ridicate de acid
glutamic.
tulpinile trebuie sa aiba permeabilitatea membranelor alterate pentru a
permite acumularea acidului glutamic in mediu si eliminarea lui. Aceasta se
poate realiza prin folosirea unei concentratii scazute de biotina in mediu sau
a mutantelor auxotrofe de biotina. O alta posibilitate este adausul de
penicilina sau de acizi grasi saturati.
Mediul de cultura contine:
sursa de carbon de
obicei glucoza (5
200%). De curand se
foloseste melasa, ce
contine o serie de acizi
organici sau amestec
de
glucoza+fructoza+zaha
roza;
sursa de azot: sarurile
de amoniu;
hidrolizat de faina de
soia, in cantitati mai
mari decat cele
calculate pentru
transformarea glucozei
in acid glutamic;
cereale oparite;
sulfati, fosfati de Ca
2+
,
Mg
2+
, K
+
;
urme de Fe, Zn, Mn, Co;
biotina.

Productia industriala a acidului glutamic
pH-ul este intre 6
si 8;
timpul in care
mediul se
inoculeaza in
cultura este intre
15-30 ore;
temperatura
este intre 27-
30C.

Mediul se mentine
bine aerat, iar pH-ul
se regleaza cu
solutie de NH
4
OH
pentru deplasarea
echilibrului in
favoarea aminarii
reductive a -ceto-
glutaratului.
Producerea acidului glutamic are loc
in doua etape:
prima etapa dureaza 10-20 ore, in
care are loc cresterea culturii;
in etapa a doua are loc
acumularea acidului glutamic.

Procesul este terminat in 30-50 ore. La o
concentratie de 100 g glucoza/l
mediu, se formeaza 50-60 g glutamat/l.

Ca sursa de carbon s-a realizat cu
specii de Brevibacterium cu un
randament de 60 g/l acid glutamic.
Aceste tulpini care folosesc etanolul ca
si sursa de carbon, necesita biotina ca
factor de crestere.
Producerea de acid glutamic pe baza
de parafine s-a realizat cu o tulpina
auxotrofa de glicerol de
Corynebacterium alcanaliticum
rezultand 40 g glutamat/l.
S-a facut prima data in , lizina obtinandu-se in 2 etape:
biosinteza acidului diaminopimelic (DAP);
decarboxilarea enzimatica a acidului diaminopimeloc.

In prima faza se cultiva pe un extract de porumb si adaus de saruri minerale o
mutanta lizino-dependenta de Eschericlia coli, capabila sa produca
acumularea de acid diaminopimeloc. Simultan se cultiva o tulpina de
Eschericlia coli care poseda DAP carboxilaza, enzima care produce
decarboxilarea acidului DAP cu formare de lizina. Apoi se amesteca cele doua
solutii nutritive si se continua fermentatia, timp in care are loc decarboxilarea
DAP, rezultand lizina. Sinteza in 2 etape a fost abandonata si in prezent se
foloseste sinteza directa (Japonia 1958), folosind ca agent mutageni UV sau
radiatii pentru a obtine:
mutante auxotrofe de homoserina si metionina;
mutante auxotrofe de homoserina si biotina;
mutante auxotrofe de metionina;
mutante auxotrofe de metionina si leucina;
mutante auxotrofe de izoleucina.

Biotehnologia obtinerii lizinei.
Factorii care influenteaza producerea de lizina:
concentratia de biotina in mediu: o acumulare remarcabila de lizina are loc
intr-un mediu cu o concentratie optima de biotina. Pentru o concentratie
mai mica de biotina se acumuleaza glucoza;
concentrata de aminoacizi din mediu: folosind mutante auxotrofe de
homoserina, rezulta in medii continand mari de homoserina. Homoserina
poate fi inlocuita cu o cantitate de metionina si treonina.
Cele mai bune rezultate sub raportul acumularii de lizina s-au obtinut cu
mutante auxotrofe de homoserina si biotina. Conform procedeului elaborat
de firmele japoneze, se cultiva o mutanta de Corynebacterius glutamicum
pe un mediu ce contine sursa de carbon, azot, saruri minerale si aminoacizi
(homoserina, metionina, treonina) si se obtine direct L-lizina.
Fermentatia se produce in conditii aerobe la 24-37C, pH=5-8,5. Durata
fermentatiei este de 4-5 zile. Se acumuleaza 20-25 g/l lizina. Din mediu se
separa lizina in stare pura prin adsorbtie pe cationiti puternici, eluare cu o
baza slaba, concentrarea eluatului si cristalizarea produsului pur. Pentru
producerea de uz veterinar, biomasa rezultata se prelucreaza prin
atomizare, obtinandu-se in final un amestec de 10% L-lizina in masa
bacteriana.
Influenta factorilor de
mediu asupra
biosintezei L-lizinei
compozitia mediului
de cultura;
aportul de oxigen;
pH, agitare,
temperatura, timp.

Compozitia mediului de
cultura are rol hotarator
in biosinteza lizinei,
pentru ca
microorganismele
necesare sunt surse de
carbon, azot,
aminoacizi, substante
minerale. Acestea
trebuie sa fie dotaze in
limite foarte stranse.
Sursa de carbon. Lizina se obtine industrial pe un
mediu de cultura care contine glucoza si zaharoza.
Se mareste productia de lizina. O buna sursa de
carbon este melasa subprodus de la fabricarea
zaharului, cu compozitie complexa, folosita si ca
sursa de saruri, vitamine, aminoacizi. Melasele
difera intre ele prin pH, continut de aminoacizi,
biotina, zaharoza invertita, dar si prin substante
daunatoare: caramel, substante humice si
substante melanoide. Melasele au pH scazut, cu
procente ridicate de zaharoza invertita, din care
lipsesc metioninele cu continut ridicat de substante
colorate (caramel, substante melanoide),
rezultand un nivel scazut de aminoacizi.
Melasele au fost delimitate in 3 categorii:
calitatea I, cu 40-50 g/l lizina;
calitatea II, cu 30-40 g/l lizina;
melasa necorespunzatoare biosintezei lizinelor.
Alte surse de carbon: suc de sfecla de zahar si
saruri minerale, cand se obtin in 48 h, 22,2 g lizina
(Cehia).
Sunt aminoacizi esentiali care se
pot obtine prin diferite procese
biotehnologice din glucoza sau
zaharoza. Se utilizeaza
microorganisme din speciile
Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium. Se inhiba
activitatea aspartatkinazei printr-
un mecanism de inhibitie de tip
feed-back si in paralel se
activeaza
homoserindehidrogenaza in
vederea facilitarii caii de
obtinere a metioninei:
Biotehnologia
obtinerii metioninei,
treoninei,
izoleucinei.
In trecut, productia industriala s-a bazat in
principal pe sinteza enzimatica, la ora actuala
fiind preferata producerea prin fermentatie
bazata pe mutanti de inalta performanta.
La ora actuala, cele mai bune rezultate sunt
obtinute prin adaugarea de amoniac la acidul
trans-cinamic, utilizand fenilalanil-amoniac-
liaza produsa de Rhodotorula glutinis. Se
lucreaza cu bioreactoare in care
microorganismele sunt imobilizate, productia
fiind de aproximativ 50 g/l cu un randament
estimat la 83%. O alta metoda se bazeaza pe
scindarea D,L-5-benzilhidantoinei sub actiunea
L-hidantoinazei si L-N-carbamoilazei produse
de Flavobacterium ammoniagenes.
O alta metoda frecvent intalnita este cea
fermentativa, ce utilizeaza mutante de E.coli si
Corynebacterium, sursa de carbon fiind
glucoza. Recuperarea produsului se poate
face prin intermediul membranelor, a
cromatografiei prin schimb de ioni sau prin
cristalizare. Randamentul acestei metode este
estimat la 40g/l, timpul de productie fiind de 60
de ore.
Acest aminoacid a fost obtinut la
inceput prin extractie din
hidrolizatul unor proteine. La ora
actuala se prefera sinteza pornind
de la amoniac si acid fumaric, in
prezenta de Escherichia coli. In
mod uzual sunt utilizate reactoare
in care bacteriile sunt imobilizate
pe poliacrilamida, productivitatea
unui astfel de sistem fiind de 140 g/l
timp de o ora. Aceasta
productivitate creste daca sunt
utilizate celule liofilizate pana la 166
g/l.
Productia de acid aspartic
se realizeaza frecvent cu celule
imobilizate de E.coli de
concentratie 1,2M, in prezenta de
amoniac si acid fumaric, in reactor
de tip multi-stage, la pH 8,5 si
temperatura de 37
o
C.
Recuperarea produsului se
realizeaza cu H
2
SO
4
, la 15
o
C si pH
2,8 conditii in care acidul aspartic
precipita.

Biotehnologia obtinerii fenilalaninei Biotehnologia obtinerii acidului aspartic
V mulumesc
pentru atenie!