VARIANTELE HISTONICE

Variantele histonice sunt forme non-alelice ce nlocuiesc histonele

convenionale din structura nuclesomului
Variantele homomorfice H2B.1, H2B.2, H3.1, H3.2 i
H3.3 prezint diferene infime n compoziia
aminoacizilor, iar expresia lor este supus unui reglaj
temporal pe parcursul diferitelor stadii ale diferenierii
i ale mbtrnirii celulare
Variantele heteromorfe , o alt clas major de
subtipuri histonice prezint o diferen semnificativ
n structura primar, n dimensiune i/sau n
secvena de aminoacizi .
Variantele histonelor linker

La mamifere sunt exprimate cel puin 6 subtipuri
somatice (H1.1 H1.5 i H1o), o variant specific ovocitelor
i 2 histone linker specifice esutului testicular (H1t i HILS1)
H1t conine o structur tripartit ce este nalt divergent
n structura sa primar comparativ cu ceilali 5 membrii H1.1
H1.5 Interacia H1t cu nucleozomii conduce ctre o structur
mai puin compact dect celelalte subtipuri H1 sugernd c
aceast variant ar putea ajuta cromatina n despachetare
crend accesibilitate altor factori implicai n remodelarea
cromatinei.
VARIANTELE H3
Au fost descrise cel puin 5 variante H3, din care una este specific testicular.
n anul 1966 a fost izolat a variant H3 specific esutului testicular doar la om
Aceast variant denumit H3t difer de H3 prin doar 4 aminoacizi. ARNm al
acestei variante a fost detectat doar n spermatocitele primare. Secvenierea a
ajutat la identificarea unei alte variante specific testicular, denumit TH3 la
Sunt disponibile mai multe date asupra variantelor H3 non-testiculare. CENP-A
este o variant specific centromerului i unic din punct de vedere al
compoziiei n aminoacizi din domeniul N-terminal . n celulele somatice, CENP-
A este depozitat la nivelul centromerilor nou duplicai i este necesar pentru
recrutarea altor proteine la centromeri i kinetocori. O funcie similar n celulele
germinale ar putea implica aceast variant n segregarea mitotic i/sau
meiotic .
H3.3 este o varianta este o varianta H3 intalnita in cromatina activa
transcriptional. Aceasta varianta este asamblata la nivelul nucleosomilor atat intr-
o maniera dependenta de replicare cat si independent de replicare
Exista si alte 2 izoforme minore H3.1 si H3.2 ce se deosebesc printr-un singur
aminoacid. Sunt forme interschimbabile ale caror proprietati nu sunt cunoscute
pentru moment.

VARIANTELE H2B
Diferena major ntre H2B i TH2B const n domeniul N-
terminal i mai puin n domeniul de pliere. Cele mai multe
dintre aceste diferene sunt conservate la om, oarece i
obolan, sugernd c funcia acestei variante n
spermatogenez este conservat.
La obolan, TH2B este activ exprimat n spermatidele
primare pn n stadiul de pachiten mijloci,u, ulterior, n
spermatocitele rotunde i n curs de elongare este meninut
forma de baz H2B.
Prin utilizarea unui anticorp pentru TH2B la om, s-a evideniat
c aceast variant apare iniial n spermatogonii, atinge un
prag maxim n spermatide, ulterior dispare gradat n timpul
elongrii spermatidelor.
VARIANTELE H2A
A fost caracterizat o singur variant specific esutului testicular pentru H2A, TH2A.
Aceast variant difer de H2A somatic prin civa aminoacizi localizai n domeniul de
pliere i n domeniile N- i C-terminale. TH2A este activ exprimat i ncorporat n
cromatina spermatocitelor pachitenice
Expresia variantelor H2A non-testiculare au fost studiate mai n detaliu i s-a constatat c
doar dou variante H2A sunt exprimate n cursul spermatogenezei. H2A.X i macroH2A. n
celulele somatice H2A.X este implicat n supravieuirea i repararea rupturilor dublu
catenare.
MacroH2A este o variant mai lung a H2A, coninnd o regiune C-terminal mare, non-
histonic .
Sunt exprimate dou forme alelice ale macroH2A, i anume: macroH2A1 i macroH2A2.
Acestea prezint o similitudine de aproximativ 80%.
Gena macroH2A1 codific pentru dou proteine (macroH2A1.1 i macroH2A1.2) generate
printr-un mecanism de splicing alternativ . n celulele somatice ale femelelor de la mamifere,
la nivelul cromazomului X inactiv este concentrat o cantitate mare de macroH2A ce
formeaz o structur dens denumit corp macrocromatinic. S-a observat c
macroH2A1.2 se gsete n concentraii crescute n esutul testicular de oarece Posibil ca
aceast variant histonic s reprezinte o legtur structural ntre complexele
nucleosomale specializate i silenierea transcrierii.
MacroH2A1.2 se acumuleaz n corpusculul sexual precednd heterocromatinizarea
transient a corpusculului XY n pachiten.
Histona H2A.Z este o variant minor a H2A, fr specificitate de esut, dar care este
rspndit la toate organismele eucariote, i a crei absen pare a fi letal la organisme
cum ar fi Tetrahymena i Drosophila. S-a emis ipoteza c aceast variant histonic
afecteaz conformaia/stabilitatea subunitilor nucleozomale, precum i a nivelelor
superioare de pliere a fibrei de cromatin. H2A.Z este implicat n silenierea cromatinei
ceea ce ar determina o stabilizare a cromatinei.
MODIFICRILE CHIMICE ALE HISTONELOR I
MECANISMELE DE REGLARE A TRANSCRIERII

Histonele sufer anumite modificri chimice cum
sunt: metilarea, acetilarea, fosforilarea,
ubiquitinarea, glicozilare i ADP-ribozilare. Aceste
modificri duc la schimbarea sarcinii moleculelor
histonice i sunt corelate cu activitatea genelor,
replicarea ADN i diferenierea celular.
Metilarea histonelor
Metilarea are loc specific la nivelul aminoacizilor bazici
(arginina, lizina i histidina). Incorporarea gruprii metil este
specific. n transferul gruprilor metil intervin enzime de
metilare, care sunt de origine nuclear. Enzima specific
metilrii histonelor este metilaza III. Ca donor de grupri metil
servete S-adenozinmetionina.
Efectele metilrii histonelor sunt urmtoarele: crete bazicitatea
aminoacizilor metilai i, prin urmare, crete interaciunea
dintre histone i ADN; crete hidrofobicitatea i se amplific
interaciunile hidrofobe ale histonelor cu alte proteine; induce
modificri sterice. Metilarea este corelat cu scderea activitii
de transcriere.
Acetilarea histonelor
Acetilarea are loc la nivelul serinei i al lizinei. Ca donor de grupri
acetil servete acetil-CoA. Acetilarea lizinei se realizeaz
posttranslaional i duce la formarea aminoacidului modificat -N-
acetillizin, iar acetilarea serinei are loc simultan cu translaia i duce
la formarea aminoacidului modificat N-acetilserin. N-acetilserina
apare mai mult n histonele H1, H2A i H4.
Acetilarea lizinei are rol n aspectele dinamice ale structurii i funciei
cromozomului.
Cu mai mult de 40 de ani n urm Vincent Allfrey a propus ideea c
acetilarea histonelor este asociat cu activitatea transcripional a
celulelor eucariote
n ultimii ani, cunotinele referitoare la relaia cauzal dintre
acetilarea histonelor i expresia genelor au crescut simitor datorit
identificrii proteinelor cu activitate intrinsec acetilazic i
deacetilazic. Iniial, aceste proteine au fost identificate ca fiind pri
componente ale polimerazei II, ale mainriei de transcriere, proteine
asociate cu factorii de transcriere, sau proteine ce afecteaz pozitiv
sau negativ transcrierea in vivo. Aceste descoperiri au condus spre o
paradigm major. Acum este clar c structura cromatinei i
modificarea acesteia nu poate fi privit ca un proces independent de
iniierea transcrierii, astfel c, cromatina nu este o simpl structur
ce servete la compactarea ADN n nucleu, ci pare a fi un substrat
relativ pasiv, pentru aciunea factorilor de transcriere.
Perturbrile locale ale structurii cromatinei ar putea afecta,
specific, accesibilitatea i/sau funcia proteinelor reglatoare ale
transcrierii ce se leag de secvenele de ADN din regiunile n
care au loc acetilri/deacetilri ale histonelor. Totui,
accesibilitatea regiunilor promotor sunt influenate de : (1)
abilitatea proteinelor cu legare de ADN de se lega la matriele
nucleozomale; (2) poziionarea nucleozomilor la nivelul
promotorilor; (3) nivelul intracelular de proteine cu legare la
ADN; (4) calitatea situsului de legare i (5) competiia la
legarea acestor proteine la nivelul secvenelor promotor i la
alte secvene situate n restul genomului.

Fosforilarea histonelor
Fosforilarea are loc la nivelul serinei i treoninei. Prin
fosforilare, sarcina negativ a histonelor crete, facilitnd
desprinderea lor de ADN. Histona H1 sufer fosforilarea maxim
n faza S a ciclului celular, avnd ca rezultat derepresia unor
regiuni din genom, n vederea transcrierii. Ca donor de grupri
fosfat este ATP, iar enzimele de fosforilare sunt proteinkinazele i
fosfatazele.
Ubiquitinarea histonelor
Ubiquitinarea este o modificare cunoscut a fi marker
pentru degradarea proteinelor via proteasom. Totui, funcia
ubiquitinrii proteinelor nu este restrns la degradare, datele
din literatur sugereaz implicarea sa n repararea ADN,
controlul ciclului celular, rspunsul celular la stress, ct i n
codul histonic.
ADP-ribozilarea histonelor
PoliADP-ribozilarea este o modificare posttranslaional
ce implic ataarea unui homopolimer de ADP-riboz (ADPr)
la o protein specific. Aceti polimeri pot varia att n
lungime, ct i n complexitate, formnd structuri liniare sau
ramificate. Adiia de uniti ADPr este catalizat de poly(ADP-
ribose) polimeraza (PARP).
METILAREA ADN
Cromatina sau complexul nucleoproteinic are o structur bazat pe
interactii eseniale, electrostatice. Labilizarea conformaiei
cromatinice, astfel nct s se elibereze anumite secvene ADN
pentru accesul ARN polimerazei, necesit modificarea interaciilor
electrostatice amintite.
Dou procese cheie contribuie la modificarea interaciei ADN-histone:
(1) metilarea ADN i (2) acetilarea histonelor;
ADN este, la rndul su, o macromolecul cu o structur secundar
rigid, numit frecvent structur nativ ADN-B, accesibil interaciei
cu proteinele n curbura major. Modificarea acesteia din urm se
poate realiza printr-o reacie independent de secvena primar:
metilarea resturilor de citozin, aflate n cadrul unor structuri
repetitive de dinucleotide: purina-pirimidina sau CpG. O astfel de
modificare a resturilor de Citozin din cadrul moleculei de ADN
determin fixarea distorsiunilor de tip conformaie ADN-Z, frecvent
asociate cu gruprile metil (-CH3). Pe de alt parte,
modificarea histonelor, care are loc prin acetilarea grupelor bazice (-
NH2), determin alterarea interaciei electrostatice de tip baz
(NH2)- acid (grupe PO4-2). Ca i n cazul metilrii ADN, acetilarea
histonelor nu este randomic, ci are loc la situsuri critice. Ambele
procese nu sunt randomice i sunt realizate n funcie de factorii de
remodelare ai cromatinei.

Metilarea ADN este una din cele mai studiate
modificri epigenetice ale ADN. Aceasta const n
adiia covalent a unei grupri metil la carbonul din
poziia 5 a citozinei. Aceast reacie enzimatic este
catalizat de ADN metiltransferaze. Aciunea
enzimatic presupune urmtoarele etape:
(1) recunoaterea i legarea specific a dou
compunente eseniale ale reaciei de metilare
enzimatic: strbstratul citozina i donorul de
grupri metil SAM (S-Adenozil Metionina);
(2) clivarea i transferul gruprii metil n poziia
C-5 a citozinei;
(3) stabilizarea legturii covalente nou formate
(5-metil citozina), eliberarea SAH (S-Adenozil
Homocisteina) i a ADN- MTazei.
ChIP
(Chromatin ImmunoPrecipitation)
ASSAY
Structura cromatinei joac un rol
fundamental n reglarea proceselor
n care este implicat ADN, cum ar fi:
transcriere, replicare i recombinare
toate aceste procese avnd loc la
nivelul matriei nucleozomale.
Astfel, identificarea poziiei
histonelor modificate chimic sau a
variantelor histonice, ori a
componentelor non-histonice ale
cromatinei de la nivelul unei
secvene specifice ADN poate aduce
informaii importante despre funcia
acestor proteine (sau a modificrilor
suferite de aceste proteine) n
contextul cromatinei.

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP Chromatin ImmunoPrecipitation) este o
metod biochimic utilizat pentru a identifica proteine specifice asociate cu o
anumit regiune din genom, sau pentru a identifica regiuni din genom ce sunt asociate
specific cu anumite proteine. Aceste proteine pot fi izofome modificate ale histonelor
convenionale sau proteine cromozomale non-histonice.
Analiza ChIP cu anticorp anti-H4 hiperacetilat (IgG
iepure, Upstate) asupra secvenei 544 pb ce conine i
regiunea promotor a cistronului ribozomal a evideniat
prezena histonei H4 n stare hiperacetilat la nivelul acestei
regiuni n ovocitele previtelogenetice (stadiile I i II) i
vitelogenetice (stadiile III-V). Se constat absena acestei
modificri a histonei H4 n secvena de interes la nivelul
spermatidelor elongate i spermatozoizilor


Pentru a studia prezena 5MeC la nivelul secvenei
promotor a cistronului ribozomal am utilizat analiza ChIP
cu anticorp anti -5MeC (IgG oaie, Biomol).
Prin analiza ChIP s-a determinat prezena citozinei metilate
(de la nivelul dinucleotidelor CpG) att n ovocitele
previtelogenetice, ct i n spermatozoizi.


Analiza PCR a imunoprecipitatului cu anticorp anti-uH2A
clona E6C5 (IgM oarece) pentru secvena de interes
(ampliconul de 544 pb) a evideniat prezena histonei H2A
ubiquitinat doar la nivelul ovocitelor previtelogenetice.
O
v
o
c
i
t
e

p
r
e
-
v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

O
v
o
c
i
t
e

v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

S
p
e
r
m
a
t
i
d
e

i

s
p
e
r
m
a
t
o
z
o
i
z
i

M H4hac C+ C- H4hac C+ C- H4hac C+ C -
702 pb

544 pb
544 pb
702 pb

O
v
o
c
i
t
e

p
r
e
-
v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

O
v
o
c
i
t
e

v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

S
p
e
r
m
a
t
i
d
e

i

s
p
e
r
m
a
t
o
z
o
i
z
i

M 5MeC C+ C- 5MeC C+ C- 5MeC C+ C -
O
v
o
c
i
t
e

p
r
e
-
v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

O
v
o
c
i
t
e

v
i
t
e
l
o
g
e
n
e
t
i
c
e

S
p
e
r
m
a
t
i
d
e

i

s
p
e
r
m
a
t
o
z
o
i
z
i

M uH2A C+ C- uH2A C+ C- uH2A C+ C -
702 pb

544 pb