Universitatea Babe-Bolyai Cluj-Napoca

Facultatea de Chimie i Inginerie Chimic

Studiul comportamentului mioglobinei prin

spectroscopie UV-VIS

Marincu Alina, IMPM an II

1. Introducere
Mioglobina este o protein constituit dintr-o component proteic (globulina) i
o component protetic (hemul). Este format dintr-un lan de 154 de aminoacizi
organizai n opt alfa helixuri. Aceasta se gsete n fibrele musculare scheletice i
cardiace i are ca rol legarea oxigenului.

Fig.1 Structura tridimensional a hemoglobinei i structura hemului.[1]

n cadrul laboratorului de chimie bioanorganic am nvat s manipulm proteine

i soluii tampon .
Folosirea spectrelor de tip UV-vis ne-a ajutat deoarece am descoperit influena
ligandului i a metalului asupra proprietilor spectrale ale unei metaloproteine. De
asemenea am vzut cum arat spectrul UV-vis al unei proteine denaturate .

2. Materiale i mod de lucru

Concentraia soluiei tampon necesar pentru experimentele noastre este de
200mM. Soluiile tampon le-am preparat n ap de cea mai nalt puritate posibil. Am
preparat cte 500 sau 250 mL din fiecare soluie, nefiind necesar s preparm un volum
mai mare.
n cadrul laboratorului ne-am mpartit n 2 echipe. Ne-au fost prezentate mai
multe ci prin care putem prepara soluiile tampon. Prima echip a preparat soluiile
tampon cu pH-ul de 2, 3, 4, 5, 6 i 7, iar a doua echip a preparat soluiile tampon cu pHul de 8, 9, 10, 11, 12 i 13.

Pentru soluiile tampon cu pH-ul cuprins de la 2-7 am pregtit soluia uneia dintre
componente (sarea sau acidul , n funcie de posibiliti i/sau pKa) la concentraia dorit
iar pentru soluiile cu pH-ul cuprins ntre 8 i 13 am folosit baza de date
http://www.bioinformatics.org/JaMBW/5/4/index.html de unde am urmat ntocmai reeta
furnizat. La aceste soluii am ajustat pH-ul pn la valoarea dorit cu acid sau baz dup
caz , monitoriznd-o cu pH-metru.
Astfel am ales ca pentru soluia de pH 2 s folosim fosfat disodic (Na 2HPO4),
pentru soluia de pH 3 s folosim citrat de sodiu, pentru pH 4 i 5 acetat de sodiu
(CH3COONa 3H2O), pentru soluii de pH 6 i 7 am folosit fosfat monosodic , pentru
soluiile de 8 i 9 am folosit trizma , pentru soluiile de pH 10 i 11 am folosit CAPS, iar
pentru 12 i 13 am folosit fosfat disodic (Na2HPO4).
Dup ce calculele au fost efectuate , am cntrit la balana analitic i am pus ntr-un
balon cotat de 250 ml sau 500 ml (dupa caz) pe care l-am adus la cot cu ap distilat .
Am agitat bine pn s-a dizolvat toat substana i am introdus agitatorul magnetic. Am
pornit aparatul i am introdus electrodul pH-metrului n soluie (care n prealabil a fost
calibrat). Dup ce s-a stabilizat, am citim valoarea care ne era indicat pe display-ul
aparatului. Acesta ne-a indicat o valoare pe care am ajustat-o cu HCl sau NaOH pn la
pH-ul dorit.
O dat preparate, soluiile tampon au fost etichetate i depozitate n sticle nchise
la culoare i pstrate la ntruneric i la rece (4 C), iar nainte de folosire au fost aduse la
temperatura camerei.
Proteinele sunt rar disponibile sub form solid, fie pentru c majoritatea nu sunt
accesibile n cantiti mari, fie pentru ca procedeele de concentrare, evaporare i apoi
redizolvare nu sunt rentabile din punct de vedere al randamentului n laborator sau al
stabilitii proteinei.
Mioglobina sau albumina serica bovin sunt excepii, ele fiind uor accesibile i
disponibile comercial n stare solid.
Stocurile de protein nu se vor depozita la temperatura camerei. Extragerea probelor
din soluiile stoc se va face cu un vrf de pipet nou de fiecare dat, sau cel puin cu un
vrf necontaminat cu ali reactivi. [2]

n laborator, noi am preparat o soluie stoc de mioglobin, deoarece aceasta a fost

disponibil n stare solid : peste mioglobina solid am adugat apa distilat, am agitat cu
grij i apoi am lsat s se aeze pentru a nu distruge molecula de protein.
Domeniul util de colectare a spectrului UV-vis pentru o protein este de obicei 260800 nm; de multe ori pentru mioglobina i alte hemoproteine se nregistreaz spectrul
doar n domeniul 400-750 nm.
Pentru o protein se va observa ntotdeauna un maxim n jur de 280 nm, datorat
materialului proteic (mai exact, aminoacizilor aromatici); alturi de acest protein ca
mioglobina prezint cofactori sau grupri prostetice cu absorban n domeniul vizibil.
Un spectu UV-vis ideal are absorbanele cuprinse n intervalul 0,11 uniti ; aceast
int poate fi dificil de atins cu proteine care prezint maxime de intensiti mult diferite
n cadrul aceluiai spectru (cazul Mb, care prezint de obicei o band intens numit
Soret n jur de 410 nm, dou benzi mai slabe n domeniul 500-600 nm numite beta i
alfa , i benzi mult mai slabe pe care de obicei le ignoram).[2]
Pentru a nregistra spectrele UV-vis ale mioglobinei ferice n domeniul de pH= 2-13
punem n cuva spectrofotometrului 10 microlitri de mioglobin i 900 microlitri soluie
tampon de valori diferite ale pH-ului. Dup ce aceste soluii au fost efectuate, nregistrm
spectre UV-vis pentru fiecare soluie n parte .
Prima soluie introdus n cuva spectrofotometrului alturi de mioglobin a fost de
pH=7.
Pentru a nregistra spectrele am procedat n felul urmtor: am pornit
spectrofotometrul, am deschis programul i apoi am introdus cuva cu soluia de analizat
n aparat. Dupa ce cuva a fost introdus apsm Blanck pentru fiecare soluie tampon
n parte. Odat realizat blanck-ul, apsm butonul Sample pentru a se nregistra
spectrul soluiei. Graficul care ne apare l salvam ntr-un folder. Procedm la fel i pentru
prepararea i ridicarea celorlalte spectre.
Influena agentului reducator
Deoximioglobina (forma Fe (II)), fr liganzi exogeni se prepar uor prin adugarea
ctorva cristale de ditionit de sodiu Na 2S2O4 la o soluie aerobic de metmioglobin

(Fe(III)). Ditionitul este un agent reductor puternic, care elimin oxigenul molecular din
soluie i reduce Fe (III) la Fe (II).[2]
Pentru nregistrarea spectrului UV-VIS al deoximioglobinei (Fe (II)), la pH=7 se
amestec mioglobina Fe (III) cu soluie tampon ( pH=7) i se ridic spectrul. Se adaug
apoi ditionit cu spatula i se nregistreaz din nou spectrul.
Pentru formarea aductul CO, modul clasic de preparare este sa barbotm CO ntr-o
soluie de deoximioglobin.
Efectum din nou aceeai operaie, dar de aceast dat avem soluie tampon de
pH=12 i adugm i CO pentru a putea observa dac spectrul rmne acelai.
Rezultatele obinute n urma nregistrrii spectelor au fost interpretate cu ajutorul
programului Excel.

3. Rezultate i discuii :
Din reprezentarea grafic a spectrelor suprapuse pentru toate soluiile tampon (vezi
figura 2), putem observa c spectrele pentru soluiile tampon de pH 2, 3 i 4 sunt diferite
fa de spectrele obinute pentru soluiile tampon de pH 5-13.
Dac urmrim forma spectrelor pentru pH 2, 3, 4 fa de spectrele obinute pentru pH
5-13, observm c primele au o form total diferit. n mediul acid hemoblobina este
protonat la nivelul legturilor de hidrogen dintre N i O. n exces de H +, legturile de
hidrogen dintre lanurile de aminoacizi se rup, astfel proteina ii schimb structura dintruna teriar, ntr-o structur liniar.

Fig.2 Spectrul UV-VIS al mioglobinei la toate valorile de pH

La pH bazic, odat cu scderea excesului de protoni din soluie, legturile de

hidrogen nu mai sunt influenate de H+. Aceste nregistrri se pot vedea n figura 3 n
detaliu.

Fig. 3 Spectrul UV-vis al mioglobinei la diferite valori de pH . Banda Soret

n figura 3 sunt prezentate reprezentrile grafice ale spectrelor pentru pH 5-13. Se

observ c la pH 9 se deplaseaz maximul. Astfel dac pentru pH 5 - 8 avem un maxim la
409 nm, la pH 9 avem un maxim la 410 nm i pentru pH 10 maximul devine 411.
Maximul continua sa se deplaseze odat cu creterea pH-ului; pentru valori ale pH-ului
cuprinse ntre 11-13, hemoglobina prezint maxime la 413.
n figura 4 sunt reprezentate n detaliu reprezentrile grafice pentru intervalul de
lungime de und de 450-750. Dup cum se observ din figur, spectrele nregistrate
pentru valorile de pH 5, 6, 7, i 8 au o form asemntoare, acestea prezentnd maxime la
504 nm i la 630 nm. Deasemeni se poate observa c spectrele nregistrate pentru pH
bazic (10-13) sunt asemntoare ca i form, ele prezentnd maxime la 545 nm i la 585
nm. Astfel putem deduce c pentru pH acid avem o specie ( Fe-OH23+ ), iar pentru pH bazic
se formeaz o alt specie (FeOH2+). Se observ deasemeni c spectrul pentru pH 9 are o
form special, acesta prezentnd maximele att pentru pH acid ct i pentru cel bazic
(505, 544, 585 i 638). Putem presupune c la pH 9 n soluie ntlnim un amestec din
cele dou specii mai sus amintite.
n jurul valorii de 626 nm spectrele se ntersecteaz ntr-un punct numit punct
isosbestic.

Fig. 4 Spectrul UV-VIS al mioglobinei la diferite valori de pH .Benzile i n domeniul 500-650 nm

n figura 5 am reprezentat absorbanele nregistrate la valoarea de 410 nm pentru

soluiile cu pH cuprins ntre 5-13. Observm c reprezentarea grafic are o form
sinusoidal, ce ne duce cu gndul la o curb de titrare. Din aceast reprezentare se poate
determina pKa din punctul de inflexiune. Astfel, pKa n cazul de faa are valoarea 9.
Pentru valori de pH acid, protonul H+ de la o molecul de ap se leag la Fe, iar la
valori de pH bazic, se leag OH-. Putem presupune astfel c dac se leag OH- la Fe,
acesta devine de spin jos, iar cnd se leag H2O, acesta devine de spin nalt. Observm
astfel c dac schimbm ligandul, se schimb i starea de oxidare a metalului.

Fig.5 Banda Soret la 410 nm

n figura 6 sunt prezentate reprezentrile grafice pentru mioglobina la pH 7 (Fe II)

i pentru deoximioglobin la pH 7 (Fe III). Dupa cum se observa, forma spectrelor pentru
mioglobina si deoximioglobina difera intre ele. Odata cu reducerea metalului se observa
o deplasare a benzii Soret, astfel pentru forma ferica aceasta prezinta un maxim la 412,
iar pentru forma feroasa prezinta maximul la 428.

Fig.6 Spectrele UV-VIS ale mioglobinei si deoximioglobina la pH 7

Spectrul nregistrat pentru aductul CO este reprezentat n figura 7. Prin

compararea spectrelor pentru Fe(II) i Fe(II)-CO, ambele la pH 12 se observ c difer ca
i form. Pentru forma Fe(II)-CO se poate observa banda Soret n jurul valorii de 420 nm
i dou maxime n domeniul benzilor alfa i beta la 544 i la 580 nm.

Fig.7 Spectul UV-VIS al aductului CO la pH=12

4. Concluzii :
n cadrul laboratorului am urmrit influena ligandului asupra proprietilor
spectrale ale mioglobinei.
Cu ajutorul acestor explerimente am demonstrat cum spectrele UV-vis ne pot
ajuta sa investigam schimbarile de stare de oxidare si de liganzi de la un centru metalic
dintr-o proteina.
Domeniul util de colectare a unui spectru UV-VIS pentru o protein este de obicei
260-800 nm. De multe ori pentru mioglobin se nregistreaz spectrul doar n domeniul
400 -750 nm, deoarece de multe ori banda Soret este foarte intens i dac alegem alt
domeniu spectral aceasta apare distorsionat .

Bibliografie:
1. http://ro.wikipedia.org/wiki/Mioglobin
2. Lucrarea de laborator Chimie bioanorganica