Clonarea simpla

1.1 Experimentul de baza

1.1.1. Clonarea folosind o simpla plasmida
Un exemplu simplu pentru a vedea modul de aplicare, au fost supravegheate
tehnici si enzime folosite in clonare si astfel, una dintre cele mai simple exercitii este
introducerea ADN-ului in E. coli, intr-o plasmida precum pUC18. Plasmidele bacteriene
sunt molecule circulare dsADN capabile de reproducere in celulele bacteriene. Inserarea
ADN- ului in plasmida, permite propagarea sa in celula gazda. Moleculele utilizate
pentru propragarea ADN-ului in acest mod poarta denumirea de vectori. Plasmidul
pUC18 este unul dintre o serie similara de vectori ce poarta doua gene de o improranta
deosebita: una ce confera rezistenta la antibioticul ampicilina (care blocheaza lanturile
reticulare de plozaharide din peretele ceulelor bacteriene). Lipsa lanturilor reticulare
slabeste peretele celular bacterian si eventual liza celulelor. Gena de rezistenta (bla sau
amp) codifica enzima beta-lactamaza, care hirolizeaza segmentul beta-lactamic al
antibiotiului prin inactivarea sa. Cealalta gena codifica o parte din enzima betagalactozidaza, care in mod normal descompune dizaharidele (cum ar fi lactoza in
monozaharide). De asemenea, se poate scinda un substrat artificial 5-Br-4-Cl3-indolilbeta-D-galactosid, cunoscut si sub numele de X-gal, pentru a elibera un colorant
albastru. Din acest motiv, substratul este numit cromogenic. Se va observa mai tarziu, de
ce intreaga enzima beta-galactozidaza nu este utilizata, dar putem trata pe moment
plasmida ca si cum ar contine intreaga gena. Precum genele ampR si lacZ, plasmida are
unele caracteristici mai putin imediate, cum ar fi originea replicarii. Are de asemenea, un
numar de situsuri de recunoastere pentru endonucleazele de restrictie si multe dintre
acestea sunt localizate intr-o zona a genei lacZ cunoscuta sun numele de clonare
multipla sau situs de policlonare.
Sa presupunem ca am dori sa clonam ADN genomic din organismul ce a fost
studiat in situsul BamHI din pUC18, localizat in situsul de policlonare a genei lacZ (nu
trebuie sa utilizati doar situsul BamHI, se poate folosi oricare din situsurile de restrictie
din policlonare). Procedura este urmatoarea: prima etapa este purificarea ADN-ului
genomic din organismul de interes si separarea acestuia cu enzima BamHI. Trebuie
purificat si pUC18 si taiat cu aceeasi enzima. Apoi plasmida BamHI-asimilata si ADNul genomic asimilat de BamHI sunt amestecate si apoi adaugate intr-un tampon
corespunzator ADN ligaze. Din punct de vedere topologic va genera un numar mare de
molecule liniare sau circulare.
Moleculele liniare nu vor fi propragate in mod stabil in etapele ulterioare ale
experimentului, asa ca nu vor fi luate in considerare. Ligarea intramoleculara a ADNului plasmidial va genera plasmide circulare pUC18 (originale). Pot avea loc o gama
larga de ligari intermoleculare. Cel mai important este ca o molecula de ADN genomic
1

poate fi ligata la o molecula de ADN plasmidial, si desigur o mare varietate de ligari

poate avea loc cu implicare de trei sau mai multe molecule, dar vor fi mai rar intalnite
decat ligarile unimoleculare sau bimoleculare. Moleculele ce contin combinatii noi de
secvente/fragmente sunt denumite recombinari. Introducerea ADN-ului in genalacZ va
distruge functia genei, pt ca ea perturba regiunea de codificare a proteinei lacZ.
Urmatoarea etapa estre transferul ligantilor inapoi in E. coli, acest experiment este
de obicei indus chimic sau prin electroporatie. Utilizarea de ADN de E. coli este mai
degraba ineficienta, in care probabilitatea a oricarei celule bacteriene individuale de a
lua un fragment de ADN este foarte scazuta. Pentru proceduri cu trasformare simpla
doar 10 la puterea5 va avea succces din 10 la puterea9 de celule tratate cu 1 mg de ADN
plasmidial superrasucit si spunem ca, este o frecventa de trasformare de 10 la puterea5
colonii/microgram de ADN; acesta este scazuta, deoarece 1 mg de pUC18 contine
molecule de ordinul 10 la puterea11. Apoi celulele sunt placate pe agar care contine
ampicilina impreuna cu un inductor al genei lacZ (izopropil-tiogalactoza (IPTG)) si un
substrat cromogen de X-gal. Celulele care nu au luat plasmida vor fi sensibile la
ampicilina si mor dupa cateva generatii, dar si cele care au preluat doar ADN genomic.
Cele care au preluat ADN pUC18 vor dobandi o gena de rezistenta la ampicilina si pot
astfel creste in mediul selectiv formand colonii izolate, doar daca au fost placate la o
dilutie corespunzatoare. Astfel, toti membrii unei colonii sunt derivate de celul i ar
trebui s aib dobantit o singura plasmida. (Deoarece probabilitatea unei celule de a
prelua o molecula de ADN este scazuta; este posibil sa nu fie cazul, desi doar un mic
fragment din celule este capabila de a lua ADN, aceste celule sunt eficiente in asimilarea
ADN-ului. Deci, un mic fragment, dar semnificativ de colonii poate contine doua
plasmide diferite, si de-a lungul timpului, acestea se segrega cu unele celule care contin
o plasmida si restul continand altceva).
Problema este acum de a distinge coloniile care au dobandit ADN genomic din
toate celelalte, si in acest exemplu se poate face folosind gena lacZ. Coloniile care au
dobandit molecule pUC18 fara un insert de ADN genomic va avea gena lacZ intacta
(care va fi indusa prin IPTG); ei vor putea descompune X-galul si sa fie colorat in
albastru. Coloniile care au dobandit molecule cu un insert de ADN genomic va avea o
gena lacZ inactivata prin insertie, astfel aceste colonii vor fi incapabile de a metaboliza
X-galul si va fi de culoare alba (off-white). Moleculele pUC18 dimerice cap-la-coada
vor da colonii albastre, si dimerii cap-la-cap nu se vor reproduce stabil in celula gazda.
Abundenta relativa a coloniilor de albastru si alb va depinde de factori precum
proprortiile relative de ADN genomic si plasmidic in ligarea initiala. In coloniile albe
putem confirma ca plasmidele contin o insertie de crestere a bacteriilor, prin purificarea
ADN-ul plasmidic si taierea cu o enzima de restrictie. BamHI ar trebui sa genereze doua
dimensiuni de molecule: plasmida si ADN-ul genomic inserat. Plasmidele din coloniile
albastre, acolo unde nu exista inserare, va da o singura marime/dimensiune a
fragmentelor de restrictie corespunzatoare ADN-ului plasmidic, acelasi lucru este vazut
la plasmidele dimere cap-la-coada. (O metoda alternativa de a diferentia daca plasmidele
au insertie, si sa se masoare dimensiunea insertiei este de a face PCR pe ADN-ul din
2

colonii folosind primeri care alipesc pe fiecare parte a situsului de donare; acesta se
poate face direct, fara a fi nevoie de purificarea ADN-ului si poarta numele de colonie
PCR).
Rezultatul acestui experiment este un numar mare de colonii de E. coli, fiecare
purtand o plasmida care contine un fragment BamHI de ADN genomic; acest lucru este
util in multe moduri. De exemplu, pentru a obtine mult mai mult ADN genomic, acesta
este o chestiune de cresterea cantitatii de E. coli prin extragerea plasmidei si daca este
necesar si prin separarea din plasmida a insertiei (acesta este un mod mult mai usor
decat extragerea ADN-ului). Pentru a separa un singur fragment definit din ADN-ul
genomic total, ar fi prea laborios . Aceasta propragare specifica, definit ca un fragment
de ADN intr-un organism adecvat este clonarea.
Generarea de recombinari in acest mod de catre fragmente de clonare aleatoriu ale
ADN-ului total dintr-un organism numit clonare shotgun, si colectarea aleatoarie de
colonii de E. coli ce contine molecule de ADN recombinant se numeste library
(biblioteca). Acesta se mai numeste biblioteca genomica deoarece a fost utilizat ADN
genomic total. O biblioteca genomica ideala ar contine toate secventele prezente in
genomul organismului original si poate fi descris ca reprezentant. O biblioteca costruita
in modul descris, probabil nu ar fi reprezentativa. De exemplu, fragmente mici de ADN
tind sa fie clonate mai eficient decat cele mari, deci biblioteca noastra ar fi
nereprezentativa pentru fragmente mari. O alta problema cu biblioteca este ca, orice
gena ce contine un situs BamHI nu a putut ramane intact, deoarece asimilarea BamHI a
fost utilizata pentru generarea de fragmente pentru clonare (ar fi bine sa fie folosita o
alta metoda de generare a fragmente).
1.1.2 Utilizarea sistemului indicator de lacZ (alfa-complementarea)
In acest exemplu, am spus ca plasmida pUC continea doar o parte din gena betagalactozidaza lacZ. Beta-galactozidaza este o proteina destul de mare (116 kDa) si este
mai convenabil sa aiba doar o portiune a genei pe plasmida pentru a mentine plasmida
cat mai mica posibil. Acest fragment codifica primii 146 de aminoacizi si uneori este
numit minigena lacZ. In aditionarea genei lacZ si gena de rezistenta la ampicilina,
plasmida contine gena lacI pentru proteina represor Lac, acest lucru tine minigena
reprimata, cu exceptia prezentei unui inductor, de exemplu: IPTG. Acest lucru poate fi
deosebit de important in cazul in care secventele inserate in minigena sunt toxice( daca
s-a explimat la un nivel inalt). Restul genei lacZ este in gazda, de cele mai multe ori pe
plasmida F. De fapt, acesta este o versiune a genei numita M15 delection
(stergere/suprimare) care este lipsita de codonii 11-41. Polipeptida produsa din acesta la
tetramerize esuiaza si acesta tetramerizare este necesara pentru activitatea enzimatica.
Cu toate acestea, in prezenta produsului minigenenic (aminoacizii 1-146) asamblarea
poate avea loc pentru a produce o molecula cu scazuta, dar detectabila activitate a betagalactozidaza; acesta complementare intragenica este numita alfa-complementare. In
3

esenta, acesta este doar o modalitate de a reduce marimea vectorului necesar. Vectorii
pUC au fost elaborate la Universitatea din California (de unde si numele lor).
1.2 Vectori, transformare si gazde
1.2.1 Vectori
Vectorii reprezinta molecule de ADN in interiorul carora se introduc fragmente de
ADN strain pentru propagarea ulterioara intr-o celula gazda. Un vector ar trebui sa aiba
mai multe caracteristici:
1. O origine a replicarii. Fara o origine de replicare, vectorul nu ar putea replica, si
atunci cand celulele se divid dupa preluarea moleculei vector doar una din celulele fiice
trebuie pastrata. Originea replicarii pUC18 a venit de la o plasmida intr-un izolat clinic
bacterian notat pMB1.
2. Un marker de selectie. Acest lucru este necesar pentru a distinge celulele care au
preluat vectorul de cele care nu au preluat. In exemplul dat, marker-ul de selectie a fost
rezistenta la ampicilina. Gena de rezistenta la ampicilina deriva dintr-un transpozon (un
fragment de ADN capabil sa se miste, sau transpune in diferite locuri in genom) dintr-o
alta plasmida: pRSF2124.
3. Situsuri unice de restrictie. pUC18 a avut un singur situs de recunoastere pentru
enzima BamHI care a fost utilizat in clonare. Daca ar fi existat mai mult de un situs
BamHI in pUC18, vectorul nu ar fi fost adecvate, deoarece taierea cu BamHI ar taia in
mai multe fragment. Reasamblarea vectorului cu o insertie in timpul ligaturii ar fi
necesar cel putin de o reactie trimoleculara ( care ar fi putin probabil). Daca moleculele
de insertie au fost generate de asimilarea Sau3A, ar putea fi folosit BamHI pentru a
reduce vectorul, deoarece capetele BamHI sunt compatibile cu capetele Sau3A. Taierea
vectorului Sau3A nu ar fi posibil, deoarece exista prea multe situsuri pentru Sau3A in
vector. Situsurile de restrictie situate in gene indispensabile vectorului sunt impropii
pentru clonare, deoarece inserarea ADN-ului nu ar fi de natura sa distruga functia genei
si prin urmare, viabilitatea vectorului.
4. Dimensiune corespunzatoare. Intr-o anumita masura, avand o dimensiune
corespunzatoare este corolar de a avea situsuri unice de restrictie. Clivajul situsului unei
enzime de restrictie care cuprinde 6 nucleotide va avea loc in medie, aproximativ o data
la fiecare 4 la putarea 6 pb (la fiecare 4 kpb). Deci, un vector care a fost mai mare decat
4 kpb ar fi de asteptat sa aiba mai multe situsuri pentru enzima data, iar taierea
vectorului ar reduce in mai multe fragmente, care ar fi putin probabil asamblate corect
intr-o reactie de ligare; este posibila eliminarea situsurilor de restrictie aflate in exces,
4

dar eliminarea acestora nu inlatura problema. Moleculele mari de ADN sunt sensibile la
diviziunea fizica, chiar si in simplul act de pipetare sunt dificil de manevrat. Utilizarea
sistemului alfa-complementar a permis reducerea dimensiunii plasmidelor pUC la ceea
ce ar fi necesar pentru a codifica beta-galactozidaza.
5. Markeri pentru inserarea ADN-ului. In exemplul dat, inserarea ADN-ului intr-un
vector poate fi detectata prin inactivarea genei lacZ, care la randul sau ar putea fi usor
determinat prin placarea celulelor pe un mediu continand un inductor si un substrat
cromogenic precum ampicilina. La unii vectori mai vechi a fost nevoie de o runda
suplimentare de placare pentru distingerea recombinantelor de non-recombinate. Un
exemplu in acest sens este vectorul pBR322 care contine o gena de rezistenta la
ampicilina si o gena rezistenta la tetraciclina; exista situsuri de donare pentru ambele
gene. Sa presupunem ca, am folosit situsul BamHI in tetraciclina, gena de rezistenta
pentru inserarea ADN-ului. Dupa transformare, am placat celule de E. coli pe un mediu
continand ampicilina pentru selectie ( la achizitionarea de o plasmida). Daca ADN-ul a
fost inserat in situsul BamHI, apoi gena de rezistenta la tetraciclina ar fi inactivata si
celulele care contin plasmide recombinante ar fi sensibile la tetraciclina. Celulele care au
dobandit o plasmida fara insertia ADN-ului ar fi rezistente la tetraciclina, precum si la
ampicilina. Acesta are nevoie de doua runde de placare si a fost unul din motivele
pentru care plasmidul pBR322 a fost inlocuit de pUC. Singurul mod de a detecta
insertia, a fost de a izola ADNs plasmidial asimilat cu o enzima adecvata si analiza
fragmentelor produse electroforetic.
6. Numar mare de copii. Este de dorit un numar mare de copii per celula, dar nu
esential, avand markeri pentru insertia ADN-ului. Maximizarea randamentului de
plasmid din celule transformate, numarul de copii in fiecare celula trebuie sa fie cat mai
mare posibil; plasmide diferite au numar de copii diferite. Factorul F are numar mic de
copii, probabil unul sau doua pentru fiecare celula. Replicarea factorului F este stars
legata de replicarea cromosomului, si astfel controlul de replicare este riguros. Plasmida
pSC101 (unul dintre primlee palsmide utilizate pentru clonare) este, de asemenea, sub
conlrolul riguros si prezent nu mai mult de 5 copii per celula. Plasmide cu diferite
origini de replicare, replicarea a fost mai putin controlata. Aici, numarul de copii poate
varia pe scara larga. Numarul de copii a pBR322 este de obicei 15-20 per celula, intrucat
vectori cum ar fi plasmidele pUC pot fi prezente in 500-700 copii per celula. Originea
replicarii pentru ambele plasmide pBR322 si pUC au venit de la plasmida pMB1.
Motivul diferentei numarului de copii intre plasmide este originea aceleeasi replicari
( se poate afla intr-o mutatie a plasmidelor pUC, in regiunea care codifica molecule de
ARN care reglementeaza replicarea prin interactiune cu originea). Acesta mutatie face ca
sistemul de represiune care controleaza replicarea plasmidei mai putin eficace.
Plasmidel cu un numar scazut de copii care are originea pMB1, numarul de copii poate
fi crescut de amplificarea cu cloramfeniclol. Cultura de celule gazda este tratata cu
cloramfenicol care inhiba sinteza proteinei bacteriene; inhibarea este strans legata de
5

replicarea ADN-ului cromosomial. Replicarea plasmidiala necesita doar proteine ce

traiesc mai mult; se poate continua atunci cand replicarea ADN-ului cromosomial si a
diviziunii celulare a incetat. Si prin urmare replicarea ADN-ului plasmidial inceteaza,
dar numarul de copii per celula este foarte crescurt.
7. Incapacitate. Inca de la primele experimente de manipulare genetica, nu a fost
ingrijorarea fata de emanarea si raspandirea in mediu a moleculelor de ADN
recombinant. Probabilitatea acestuia se poate reduce daca plasmida este intr-un fel
dezactivata, in asa fel incat, sa nu se poate raspandi la alte bacterii prin procese de
conjugare. Multe plasmide cum ar fi pBR322 a fost dezactivate pentru indepartarea
genei mob, ce este necesara pentru mobilizarea ei prin conjugare. Astfel de plasmide pot
fi transmise de la celule care contin alte plasmide ce ofera functiile necesare pentru
mobilizare. Acesta transmisie poate fi blocata prin indepartarea unei regiuni care contine
situsuri numite nic si bom din plasmida care trebuie mobilizata. Acesta regiune se afla
in proteinele furnizate de activitatea altor plasmide; vectorii pUC sunt printre cei care au
aceasta regiune indepartata.
1.2.2 Transformarea
In functie de eficienta dorinta, necesara, depinde si alegerea metodei de transformare.
Metodele chimice complexe pentru o inducere competenta poate genera pana la 10 la
puterea 9 transformatii per microgram ADN plasmidic, cu pana 5% celule viabile
competente pentru transformare. Daca moleculele recombinante sunt doar de un singur
sau de mai multe tipuri, apoi un simplu tratament cu clorura de calciu va fi suficienta
pentru a produce mai multe astfel de plasmide, prin reintroducerea unui stoc de ADN
plasmidic in celule. Daca numarul disponibil de molecule recombinante este foarte
scazut este posibil sa fie recuperate prin electroporare, fiind cel mai eficient sistem.
Foarte optimizant este ca, acesta abordare poate produce un numare mare de
transformanti pe microgram de ADN decat oricare din tratamentele chimice (au fost
revendicate 510 la puterea10 per microgram). De obicei, este utilizata o intensitate de
camp de ordinal 15kV/cm cu o constanta de degradare de 5m/s. Aceste conditii vor avea
rezultat la celulele ramase viabile si vor mentine un echilibru intre celulele ucise si
inductia de competenta.
1.2.3 Gazde
Gazda reprezinta celula in care moleculele sunt recombinate pentru a fi propragate.
Alegerea unei gazde potrivite este la fel de importanta ca si alegerea potrivita a unui
vectorului. Caracterele esentiale sunt urmatoarele:
1. O transformare eficienta. Acest lucru depinde de doua caracteristici principale: o
6

caracteristica consta in capacitatea de a lua ADN in celula, dar acest process este
prost inteles. Genotipuri diferite raspund diferit la diferite sisteme de
transformare. Unele mutatii par sa sporeasca eficienta de trasnformare in sine.
Acestea includ mutatii deoR care par sa ajute in special in asimilarea moleculelor
mari de ADN. DeoR este un regulator de transcriptie cu activitate de legare a
ADN-ului care controleaza expresia setului de gene implicat in catabolismul
deoxiribonicleozidic.
Principala caracteristica in determinarea randamentului de tarnsformare este in
prezenta sau absenta unor sisteme endogene de ADN-degradant. Multe gazde
utilizate pentru clonare sunt derivate din tulpina K de E. coli, care contine sistemul K
de restrictie-codificare, codificat de locusul hsdRMS. Gena hsdR codifica o
endonucleaza care scindeaza ADN-ul ce contine secventa -AACNNNNNNGTGC-,
in afara cazului al doilea dintre cele doua resturi de adenina si reziduul adenina pe
catena opusa timina este metilat. Multe gazde au o mutatie hsdR (sau cu deletie mai
mare) pentru a evita scindarea ADN-ului neprotejat la intrare. Gena hsdM codifica
metilaza si protejeaza impotriva degradarii prin trecerea ADN-ului printr-o tulpina
hsdR(-)M(+), daca este necesar pot permite metilarea si ulterior sa se propage intr-o
tulpina hsdR(+).
Exista si alte proteine in tulpina K de E. coli, in cazul in care este metilat va degrada
ADN-ul de intrare, apartinand sistemelor de restrictie metilano-dependente (MDRs).
Acestea nu sunt la fel de bine intelese precum Clasele de restrictie-modificare I-III.
Acestea includ endonucleaze care sunt produse de pozitile mcrA, mcrB si mmr care
vor degrada ADN-ul cu metilcitoza (mcrA, mcrB) sau metiladenina (mmr). Este de
dorit sa folosim tulpini mutante in special atunci cand clonarea ADN-ului este extrem
metilizata.
In gazda, gradul de metilare al ADN-ului poate afecta de asemenea eficienta cu care
enzimele de restrictie vor scinda ADN-ul in vitro. Metilarea poate fi realizata prin
exzimele deja mentionate, dar si de produsul genelor dam si dc m( proteina Dam
adenin metilare a secventei - GATC si Dcm citozin metilare a secventelor- CCAGG
- i - CCTGG -). Unele enzime de restritie utilizate frecvent au situsuri de
recunoastre care se suprapun cu acestea si sunt inhibate de metilare , astfel incat
ADN-ul preparat din tulpinile de tip salbatic pentru aceste locusuri nu va fi eficient
restrictionata. Utilizarea tulpinelor dam (-) si dcm (-) au ridicat ratele de mutatie.
Acest lucru se datoareaza recentei replicari de dsADN care este hemimetilic. Daca
polimeraza a indus erori pe parcursul sintezei, acestea vor avea ca rezultate o
nepotrivire; aceste nepotriviri sunt rezolvate in mod normal la nivelul celulei de
corectie pentru componenta metilica. In dam (-) sau o tulpina similara, nici o
componenta un este metilica si corectarea nepotrivirii este la fel de probabila sa fie
incorecta (nou sintetizata) ca la o corecta tulpina.
2. Mentinerea stabila a plasmidei.
Dupa ce o plasmida recombinanta a intrat in celula (presupunand faptul ca a scapat de
7

orice restrictie endogena a activitatii enzimatice), un este inca garantata reproducerea

stabila chiar daca are o origine de replicare adecvata. Rearanjarea recombinarii poate
aparea si cea mai frecventa manifestare al acestui fapt este deletita partiala (pierderea
unei partid in molecula). Acest lucru se intampla, de obicei, prin recombinarea directa a
secventelor. Nu toate moleculele plasmidiale dintr-o celula trebuie supuse aceluiasi
recombinare in acelasi timp, deci recombinarea directa intr-o pereche de secvente
repetate intr-o plasmida va rezulta trei tipuri de molecule in celula: de tip original, cel
nerecombinant si produse recombinante mici. La unul dintre produsi le va lipsi o origine
a replicarii si astfel vor pierde din populatie. Altele vor fi capabile in continuare de
reproducere, si va face acest lucru mai repede decat molecula originala deoarece are
dimensiunea mai mica. Peste un numar de runde de replicare, chiar si o mica diferenta in
timpul replicarii poate rezulta o mare diferenta in numarul moleculelor prezente. Pentru
generarea a 1mg de ADN dintr-o singura copie a plasmidei de 4kpb dureaza aproximativ
40 de cicluri de replicare. O plasmida carea r putea sa re replice mai repede cu 10%, ar
genera aproximativ de 16 ori mai mult ADN si prin urmare, vor fi cele mai abundente
celule in totalul populatiei. Se pune problema daca plasmida originala este nociva pentru
gazda, probabil din pricina exprimarii unei proteine care este toxica pentru celule, si
stergerea partiala cauzata de recombinare desfiinteaza productia acestei proteine.
Trebuie avuta in vedere posibilitatea de propagare preferentiala a moleculelor modificate
in timpul clonarii. Recombinarea un are nevoie intotdeuna de deletie; aceasta poate
provoca, de asemenea o inversiune. Deoarece deletiile si inversiunile depind de obicei
de recombinare , mutatiile in gazda care suprima recombinarea contribuie la stabilitatea
moleculelor de transformare. Exista trei sisteme principale de recombinare in E. coli
folosind produsele genelor recBCD, recE si recF; aceste sisteme depind in mare masura
de produsul genei recA, astfel tulpinile mutante vor avea o frecuenta de recombinare
foarte mult redusa. Unele secvente, in special cele care contin repetitii inversate pot fi
supuse rearanjarii intr-un mod recA-independent. Acest lucru poate fi cauza functionarii
recF in absenta (sau nivel scazut ) de recA, deci o mutatie recF este de dorit decat recA.
Este precizata de asemenea ca deficiente de ADN giraza codificata de genele gyrA si
gyrB pot duce la o mai buna stabilitate a moleculelor care contin secvente repetate.
3. Incapacitatea.
Ca si vectorii, este necesar sa se ia masuri de precautie pentru a se asigura ca tuplinile
transporta plasmide recombinante si sete purin probabil sa scape si sa se propage in afara
laboratorului (de exemplu sub forma de sport de izolare). Din acest motiv, tulpinile
transporta de obicei mutatii care reduc viabilitatea lor in salbaticie. Acestea sunt de
multe ori mutatii ce confera auxotrofie.
4. Caracteristici care permit utilizarea minigenei lacZ.
Utilizarea minigenei lacZ necesita utilizarea unei gazde producatoare a unui fragment
LacZ adecvat, si ca aceasta este uneori codificata pe o plasmida F. In aceste cazuri este
necesar sa fie in masura sa asigure retentia plasmidei F. Din acest motiv, plasmidul F
8

contine genele proA si proB pentru doua din encmele biosintezei prolinei (5-glutamil
fosfat reductaza, respectiv glutamat-5-kinaza), iar acestea se elimina din cromosomul
gazdei. Propagarea gazdei pe mediu lipsit de prolina asigura ca numai celulele
transportoare plasmidului rezident F va creste.
5 . Alti markeri.
Este foarte util de a avea tulpini care sunt marcate genetic pt ca astfel tulpinile corecte
pot fi recunoscute. Recombinarea si deficiente nutritionala a markerilor sunt utile in
acesta privinta, este convenabil sa aiba alti markeri care pot fi selectati mai usor.
Rezistenta la antibiotice poate fi utila si ar trebui sa fie diferita de oricare rezistenta a
antibioticului conferite de vectorii utilizati. O alta mutatie care este adesea incorporat
in gazde este endA, inactivarea genei pentru ADN-ul specific. Aceasta mutatie
imbunatateste randamentul cat si calitatea a preparatului ADN-ului palsmidial. Mutatia
relA suprascrie controlul asupra sintezei ARN-ului prin imbunatatirea ratei de sinteza
in absenta sintezei proteinelor. Mutatia tonA cauzeaza pierderea unei proteine a
membranei exterioare care absorb fagii T1 si T5. Infectia cu acesti fagi poate fi o
problema de laborator, astfelca mutatia tonA este utila deoarece confera rezistenta la
infectia cu fagi.
Tulpina DH5 este o gazda comuna pentru plasmidele pUC si este un derivat de
tulpina K de E. coli, iar genotipul sau este endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyr (nal
la puterea r) relA1 (lacZYA-argF) U169 F80lacZM15.
endA a fost descris mai sus
hsdR17 inactiveaza sistemul de restrictie a gazdelor, permitand ca ADn-ul sa fie
protejat prin metilare, dar un digerat.
supE44 - este utilizat pentru propragarea fagilor, cresterea unor astfel de fagi sete
posibila doar intr-o gazda supresoare.
thi-1 - este o cerinta nutritionala pentru tiamina
recA1 gyr (nal la puterea r)- nal la puterea r este rezistenta la acidul nalidixic inhibitor a
ADN girazei conferita de mutatia gyrA.
relA1 (lacZYA-argF) U169 este o deletie a operonului lac , necesara selectiei albalbastra.
80lacZM15 descrie un profag 80lacZ care directionenaza sinteza a LacZ partial
sters necesara selectiei alb-albastra.
1.3 Modificari
9

1.3.1 Evitatrea autoligaturarii

10