Lucrarea practic 1.

Microscopul. Tehnica microscopic. Metodele histochimice i imunohistochimice.

Celula. Criterii generale de recunoatere a esuturilor.
Coloraii:
HE
Tricrom Masson
Tricrom Gmri
PAS
Impregnare argentic pentru reticulin
Albastru de toluidin
Anti-actin
Anti-citokeratine

1. Microscopul optic:
Corp (rol de susinere)
Oculare
Revolver cu obiective
Platin
Macro i microviz
Condensator
Sistem de iluminare
Corpul microscopului
- susine celelalte componente
- plaseaz ocularele, obiectivele, preparatul i sursa de iluminare n acelai ax
Ocularele
- lentile mritoare (10x)
- formeaz prin intermediul prismei o imagine binocular
- distana interpupilar reglabil (privind cu 2 ochi se vede un singur cmp)
- dioptrii reglabile (imagine clar pentru fiecare ochi)
Revolverul cu obiective
- permite schimbarea lor facil
- obiective de 4x, 10x, 20x, 40x, 100x
- obiectivele se schimb din revolver FR modificarea macrovizei
Platina
- susine lama cu preparatul
- sistem de fixare a lamei (cavaleri)
- sistem de deplasare a lamei pe axele Ox i Oy
Macro i microviza
- sisteme de angrenaje
- permit deplasarea pe axa Oz
- macroviza produce deplasri vizibile
- microviza produce deplasri de ordinul micrometrilor
Condensatorul
- sistem de lentile care mpreun cu apertura transform fasciculul de lumin emis
de surs ntr unul paralel (iluminare uniform a cmpului)

Sursa de lumin
- permite trecerea luminii prin preparat (transiluminare)
Etapele examinrii unei lame la microscop
- se mut platina n cea mai de jos poziie
- se fixeaz n ax obiectivul 4x
- se ajusteaz intensitatea luminoas a sursei
- se ajusteaz distana interpupilar (un singur cmp la privirea cu ambii ochi)
- plasarea lamei cu preparatul pe platin
- aducerea preparatului n axul optic
- privind n microscop, se deplaseaz platina din macroviz (se ridic preparatul) pn se
obine imaginea relativ clar
- se clarific imaginea cu microviza
- deplasarea zonei de interes n mijlocul cmpului
- schimbarea obiectivului
Prelucrarea primar a preparatelor
- permite conservarea i manipularea lor
- este standardizat (Ehrlich, acum peste 100 ani)
- etape:
- fixarea: ntrerupe procesele de distrucie celular post mortem
- incluzionarea: nlocuirea apei din preparat cu alcool i apoi cu benzen
sau xilen i n final cu parafin bloc care se poate manipula
- secionarea: cu ajutorul microtomului, seciuni cu grosimea de 5 care
se lipesc pe lam (de obicei cu albumin)
- colorarea are ca scop creterea contrastului dintre nucleu i citoplasm,
permind identificarea celulelor i esuturilor (pe lama necolorat nu se
vd detaliile morfologice celular tisulare)
- montarea: lipirea unei lamele deasupra seciunii cu balsam de Canada
Colorarea
acidofilia: afinitatea pentru colorani acizi (caracteristic substraturilor bazice
proteine citoplasmatice, colagen)
bazofilia: afinitatea pentru colorani bazici (caracteristic substraturilor acide
acizi nucleici nucleu i reticul endoplasmic rugos)
metacromazia: proprietate mixt a substratului i a colorantului: virarea culorii
colorantului n contact cu anumite substraturi (cea mai frecvent: albastruviolet)
Coloraii:
1. Morfologice:
- bicrome (un colorant nuclear bazic i unul acid, pentru citoplasm)

- cea mai frecvent utilizat: Hematoxilin Eozin (HE)

- tricrome (un colorant nuclear, 2 colorani acizi, din care de regul unul pentru
colagen)
- cele mai frecvente:
- Masson: colagenul este colorat n albastru
- Gmri: colagen verde, citoplasma rou aprins, nuclei violet
nchis
2. Coloraii histochimice:
- permit identificarea cu relativ specificitate a unui substrat prin reacii de
culoare sau de precipitare datorate unor grupri ale acestuia
- se mai folosesc:
- reacia PAS: identificarea polizaharidelor prin colorarea n violet-rou a
gruprilor aldehidice libere create n structura lor (glicogen, membrane bazale)
- coloraia cu albastru de toluidin: identificarea glicozaminoglicanilor din
granulaiile mastocitelor i mucinelor prin metacromazie (violet), utilitate pentru
organele nervoase
- coloraia albastru alcian: mucine (glicozaminoglicani)
- impregnrile argentice: 4 tipuri
- pentru fibre de reticulin i membrane bazale
- pentru componente ale neuronilor i celulelor gliale
- pentru celule neuroendocrine
- pentru germeni (H. pylori)
- mucicarmin (pentru mucus)
- orcein pentru fibre elastice
- coloraii histoenzimologice: identificarea prezenei i activitii unor enzime
- se mai folosesc:
- ATP aza (intens pozitiv la polul biliar al hepatocitelor, identificarea
canaliculilor biliari)
- mieloperoxidaza (identificarea unor subtipuri de leucocite)
3. Coloraii imunohistochimice:
- bazate pe reacia antigen anticorp
- anticorp primar anticorp secundar
- anticorpul secundar este marcat, de regul enzimatic
- vizualizare prin reacie de culoare catalizat de enzima care marcheaz
anticorpul secundar
- identific tipuri de celule i molecule ale acestora, inclusiv cnd celulele sunt
transformate malign
- utile n embriologie molecular, histologie i patologie
- exemple de markeri: citokeratine, vimentin, actin de tip muchi neted,
cromogranin A, enolaz neuronal specific, protein glial fibrilar acid,
colagen IV

4. Coloraii citologice:
- APT - Drgan: - simpl, nu d foarte multe detalii celulare
- Papanicolaou:
- mai complicat
- d detalii celulare mai multe (ex. acumularea de keratin n citoplasm,
util n diagnosticul cervico vaginal, pleural, lavaj bronic)
- May Grnwald Giemsa:
- util pentru frotiuri de snge periferic i mduv osoas hematogen
- d detalii citoplasmatice mai multe (granulaii)