Cultura de suspensii celulare: monitorizarea culturilor

Laborator nr. 5

http://www.botany.unimelb.edu.au/botanyunimelb/1pages/research/labs/crc/foodgums.html

Control bun al culturii

se verific:

temperatura
pH-ul

cantitatea de gaze dizolvate

concentraiile diferitelor
componente/metabolii
numrul celulelor/unitatea
de msur din suspensie

Obiectivul principal n culturile de suspensii celulare =

- obinerea nr. ct mai mare de celule sau
- cantitate ct mai mare de metabolii
Monitorizarea curbei de cretere
Funcie de nr. de celule din suspensie avem:
- faza de adaptare (lag) - adaptarea celulelor (1)
- faza de cretere exponenial - dublarea nr. de celule (2)
- faza de platou - sinteza metaboliilor secundari (3)
- faza de senescen - celulele degenereaz (4)

Aprecierea
cantitativ a
celulelor

Aprecierea cantitativ a celulelor

Se face n funcie de:
- numrul celulelor sau
- masa celulelor sau
- volumul celulelor
Numrarea celulelor - manual (hemocitometru)
- automat (flowcitometre)
Masa celulelor - n stare proaspt Cntrire (exprimat n g/l, n
- uscate
raport cu volumul mediului de
cultur)
Volumul celulelor - n raport cu volumul mediului de cultur,
exprimat n procente (sedimentare forat prin centrifugare)

Numrarea celulelor cu ajutorul hemocitometrului

1 mm2

http://openwetware.org/wiki/BE.109:DNA_engineering/Restriction_map_and_tissue_culture
http://www.wisc.edu/ansci_repro/lab/procedures/hemacytometer/Hemocytometer%20use.html

Lam de sticl

Nu se numr celulele n
contact cu linia inferioar i
cea din dreapta
Se numr celulele din 5
ptrate cu suprafaa de 1 mm2,
n ordinea indicat de sgei

http://www.biocompare.com/technicalarticle/673/The-QIAGEN-Guide-To-Animal-Cell-Culture---5-from-QIAGEN.html
academy.d20.co.edu/.../ptc/images/protoplast.gif

Numrarea celulelor cu ajutorul hemocitometrului

n*s*f*104
N=
p
N = numrul de celule ntr-un ml
n = nr. de celule numrate
s = suprafaa ptratului n care s-a efectuat msurtoarea, exprimat
n mm2
f = factorul de diluie
p = numrul de ptrate n care s-au numrat celulele

Msurarea volumului celulelor compactate

- Se introduc 10 ml de suspensie celular ntr-un tub de centrifug
gradat
- Se centrifugheaz 3 minute la 1000 rpm
- Se citete volumul de celule sedimentate
V%=

V2
V1

*100

V % = volumul celulelor compactate, exprimat n procente

V1 = volumul de suspensie utilizat
V2 = volumul celulelor compactate citit

Msurarea masei celulare proaspete

- Se cntrete un tub de centrifug gol i se noteaz masa
- Se introduc 10 ml de suspensie celular n tubul de centrifug cntrit
- Se centrifugheaz 3 minute la 1000 rpm
- Se ndeprteaz supernatantul i se cntrete din nou
(g2-g1)*1000
M(g/l) =
V
M(g/l) = masa celulelor proaspete, exprimat n grame/litru
g1 = masa tubului de centrifug gol
g2 = masa tubului dn centrifug mpreun cu celulele
V = volumul de suspensie utilizat
Msurarea masei celulare uscate
Aceeai metod ca mai sus, numai c se ndeprteaz supernatantul dup
centrifugare i se cntrete dup ce a fost inut n etuv 1 or la 80C

Determinarea viabilitii celulare

- metode colorimetrice
Testul FDA (fluorescein diacetat)
FDA - compus nefluorescent
- traverseaz numai membrana celulelor vii
- celulele moarte - roii
Vizualizarea - sub incidena razelor UV

Bibliografie:
Micropropagarea ndrumtor practic, Corina Ctan, Ed. Risoprint,
Cluj-Napoca, 2005
Biotehnologii celulare, Corina Ctan , Ed. AcademicPres, ClujNapoca, 2005
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.ht
ml
http://everything2.com/index.pl?node_id=1122202

http://ausubellab.mgh.harvard.edu/picturehtml/pic14.html