Tema 2. Morfologia si ultrastructura bactertiilor. Examenul Microscopic.

1. Metodele de diagnostic in microbiologia medicala. Esenta lor. Metoda microscopica.

Metode microbiologice de diagnostic:
diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui)
1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structura
a)optica
b) pe fond intunecat
c) prin contrast de faza
d) cu luminiscenta
e) electronica
2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB
3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator,
provocare maladie tipica
4. depistare Ag mi/o in lichide biologice
5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara
diagnostic indirect (imunologic)
1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului
2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie
pozitiva = aparitie eritem hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag)
2. Morfologia si ultrastructura bacteriilor
Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonom
Grupe morfologice de bct:
coci:
1. micro
2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati)
3. tetra
4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus
5. stafilo (gramezi)
6. sarcine (pachete 8-16-32 coci)
bastonase
1. bacterium capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli)
2. bacillus capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B.
anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili
3. clostridium capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C.
perfringens)
spiralate/incurbate
1. vibrio (ex. V. cholarae)
2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni)
3. spirillum = cel. spiralate rigide
4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia)
polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma)
Elemente permanente: PC, MCt, Ct, nucleoid, ribosomi, mezosomi G+ (E, citocromi)
Elemente nepermanente: capsula, spor, flageli, fimbrii, plasmide, incluziuni celulare
MCt:
mozeic fluid Singer
lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi
mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite)
PBP catalizare transpeptidare si sinteza PC
permeaze transport
prot. sist. de secretie
receptori
E lant respirator

Rol MCt:

1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata

2. Permeaze transport activ
3. E activitate metabolica
4. Metabolism energetic
5. Participa la diviziunea celulara
6. Sinteza PG si fosfolipidelor
7. Chemotaxis (R specifici)
Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energetica
Ct:
Lipsesc organitele
Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide
pH acid
Rol Ct: sediul proceselor metabolice
3. Etapele si tehnica de pregatire a micropreparatelor din culturi bacteriene, crescute pe
medii lichide si solide, din produs biologic : sputa, puroi, singe, fragmente de tesuturi.
Pregatirea frotiurilor examen microscopic. Pe masa trebuie sa se afle numai materialele si obiectele
necesare pentru investigatia data. La pregatirea frotiului in prealabil se flambeaza lama.
Etape in pregatirea frotiului:
Medii compacte se aplica o picatura de solutie izotopica de clorura de Na sau apa pe lama.
Ansa bacteriologica se sterilizeaza la flacara spirtierei. Ansa rece se introduce in eprubeta, se atinge cultura
de microorganisme si se extrage. Marginile eprubetei se flambeaza si se astupa cu dopul. Cultura se depune
pe o lama.
Medii lichide se aplica o picatura de cultura cu ansa sau pipeta la mijlocul lamelei.
Puroi/sputa se folosesc 2 lamele. O portiune mica de material steril se transfera la mijlocul lamei cu ansa si
se acopera cu alta lama in asa mod, casa ramina libere cote o 1/3 din ambele. Lamelele se departeaza in
parti opuse, obtinind 2 frotiuri identice.
Singe :
1) uscare
2) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant
3) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal
4) examinare (microscop optic cu imersie)
Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul
4. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii utilizati in microbiologie.
Metoda simpla de colorare si importanta ei practica.
CARACTERELE TINCTORIALE (de colorare) - permit diferentierea bacteriilor in gram pozitive si gram
negative.
Frotiul se coloreaza cu coloranti de anilina. Deosebim coloranti acizi, bazici si neutri. Colorantii bazici, la
care partea activa a moleculei poseda o incarcatura pozitiva, reactioneaza mai activ cu celula bacteriana,
care are incarcatura negativa.
Colorarea bacteriilor reprezinta un proces fizio-chimic compus. La interactiunea colorantului cu substantele
celulei microbiee se formeaza saruri, care asigura stabilitatea coloratiei. Reactia diverselor specii
microbiene fata de coloranti se numeste propietate tinctoriala.
Mai frecvent sint utilizati urmatorii coloranti: 1) rosii (fucsina bazica/acida, safranina, rosu neutru, rosu de
Congo); 2) albastri (albastru de metil/de toluidina/de tripan); 3) violeti (violet de gentiana, violet de metil
sau cristal violet); 4) galbeni bruni (vezuvina, crizoidina).
Colorantii utilizati au aspect de pulbere sau cristale. Din astfel de coloranti ca fucsina bazica, violetul gentian
albastru de metil se pregatesc in prealabil solutii alcoolice concentrate (1 gr de colorant la 10 ml de alcool
de 96%). Din solutiile concentrate de coloranti alcoolici si fenolici se prepara solutiile apoase, folosite pt
colorarea simpla/compusa.

Metodele simple de colorare permit determinarea formei bacteriilor, la ele se foloseste un singur colorant.
Exemplu : a)Fucsina bazica se intrebuinteaza pt pregatirea fucsinei fenicate Zienl, in particular stabila la
pastrare. Cu fucsina se coloreaza in rosu microorganismele acidorezistente si sporii.
Coloratia microorganismelor vii se face cu albastru de metil, rosu neutru si alti coloranti slab toxici in
diluatia 1 la 10000.
5. Metodele diferentiale de colorare : Gram, Ziehl- Neelsen, Aujeszky, Burri- Hinss,
Neissner. Mecanismele, componentii si tehnica de colorare. Importanta.

6. M
ic
ro
sc
op
ul

optic cu imersie. Constructia si modul de utilizare.

Microscopul are in componenta sa :
a)
Parte mecanica
- Piciorul F. Asigura stabilitate
- Bratul microscopului
- Corpul

- Tubul microscopului
- Masa portobiect
b)
Sistem optic
- Obiective cu imersie obiective la care mediul interpus intre obiect si lentila frontala are un indice
de refractie mai mare decit al aerului si apropiat de cel al sticlei, de exemplu uleiul de cedru.
Apertura numerica maxima practica = 1,4
c)
Sistem de iluminare.
7. Protoplastii. Sferoplastii. Formele L de bacterii. Importanta.
8. Studierea bacteriilor vii. Metodele indirecte de evidentiere a cililor. Pregatirea
preparatelor picatura suspendata si picatura strivita.
9. Microscopiile contemporane : optic cu sistemul de imersie, contrast de faza, fond obscur,
luminiscent si electronic. Constructia, principiile si tehnica microscopiei.
Microscopul optic = dispozitiv cu ajutorul caruia se pot examinastructuri cu dimensiuni mult
sub puterea de rezol 12212t1921m utie a ochiului uman
Componenete microscop optic :
n
1. SURS DE LUMINA
n
2. CONDENSOR
n
3. DIAFRAGM
n
4. MASA
n
5. DISPOZITIV DE DEPLASARE A LAMEI
n
6. REVOLVER
n
7. OBIECTIVE
n
8. SISTEM DE PRISME
n
9. OCULAR
n
10. MACROVIZA
n
11 MICROVIZA
Modul de formare al imaginii la MO :
n
Obiectivul formeaza o imagine marita , reala si rasturnata a obiectului
n
Ocularul- are ca obiect imaginea data de obiectiv si va forma imaginea finala mult
marita , rasturnata si virtuala , la infinit deci nu necesita efort de acomodare
Performantele MO sunt :
n
Puterea de marire
n
Puterea de rezolutie
PUTEREA DE MARIRE :
n
Puterea de marire = produsul dintre puterea de marire a obiectivului si cea a ocularului
n
Puterea de marire maxima x1500 ori
n
Puterea de marire - 4, 10 ;- 20, 40 - diagnostic histologic ;- 60, 100 - diagnostic
citologic
PUTEREA DE REZOLUTIE =Cea mai mica distanta dintre doua puncte la care acestea pot
fii percepute distinct
n
De ea depinde claritatea si bogatia n detalii a imaginii
n
Depinde de lentila obiectivului
n
FORMULA LUI ABB :
n
d=l/ n sin
n
l= lungimea de unda a radiatiei electromagnetice ( 0,55 m)
n
n= indicele de refractie al mediului dintre preparat si obiectiv
n
a= din aperura unghiulara a obiectivului
Limitarile puterii de rezolutie a
microscopului optic in practica
n
l este o constanta naturala ce nu poate fi influentata (0,55)
n
Mediul dintre preparat si obiectiv este de obicei aer (n = 1)
n
Obiectivul cu imersie - intre obiectiv si preparat se interpune o picatura de lichid cu un
indice de refractie supraunitar, cum este uleiul de cedru (n=1,51)
n
Apertura unghiulara maxima teoretica este 180 , deci a=90, limita teoretica maxima a
sin a=1
Rezolutia maxima a microscopului optic= 0,2m

STUDIUL CELULELOR VII NECOLORATE

n
1.MICROSCOP CU CMP NTUNECAT
n
2. M. CU CONTRAST DE FAZ
n
3. M. CU INTERFEREN
n
4. M. TIP NOMARSKI
n
5. MICROSCOPUL RANVERSAT
n
1.MICROSCOP CU CMP NTUNECAT
n
PRINCIPIU - exista un diafragm in condensor care selecteaza doar lumina laterala iar
imaginea finala este formata de catre razele reflectate de componentele din preparat
n
2. M. CU CONTRAST DE FAZ
n
PRINCIPIU
n
- lumina care trece prin medii cu indici de refractie diferiti si modifica directia si viteza
n
- micoscopul transforma aceste diferente n diferente de intensitate luminoasa
n
3. M. CU INTERFEREN
n
PRINCIPIU
n
- mai foloseste nca o raza de lumina care nu traverseaza tesutul analizat ,dar interfera cu
raza provenita de la sursa de lumina
n
- ofera informatii despre densitatea obiectului analizei
4. M. TIP NOMARSKI
n
Un tip modificat al microscopului cu contrast de faza, oferind imagini aparent
tridimensionale
n
5. MICROSCOPUL RANVERSAT
n
- pentru examinarea celulelor din flacoane sau placi Petri
n
- obiective sub masuta
n
- sursa de lumina deasupra
MICROSCOPUL CU FLOURESCENTA
LUMINISCENTA = proprietatea unor substante de a emite lumina atunci cand sunt
stimulate
luminos =FOTOLUMINISCENTA
n
FLUORESCENTA - proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioase doar in
timpul stimularii
n
FOSFORESCENTA -proprietatea unei substante de a emite radiatii lumioase si dupa
incetarea stimularii
TERMOFLUORESCENTA = proprietatea unor substante de a emite lumina atunci cand sunt
stimulate termic.
Aplicatii practice MICROSCOP CU FLOURESCENTA:
1.AUTOFLUORESCENA
capacitatea tesuturilor vii de a absorbi radiatii luminoase cu o anumita lungime de unda si
de a o emite ulterior alte radiatii, cu o alta lungime de unda, mai mare
2. FLUORESCENTA SECUNDARA - dupa marcare cu compusi fluorescenti :
n
a. Acridine orange - ADN-verde/ ARN-rosu
n
b. Quinacrina - cromozomi = bandare
MICROSOPUL CU FLORESCENTA
IMUNOFLUORESCENA : punerea n evidenta a diferitilor antigeni cu ajutorul unor
anticorpi specifici marcati cu un compus fluorescent IZOTIOCIANAT
DE
FLUORESCEINA (FITC)
-2 tipuri: directa si indirecta
IMUNOFLOUESCENTA DIRECTA=Ag + Ac specific marcat
IMUNOFLOURESCENTA INDIRECTA Ag + Ac specific + Ac sec. marcat
- are o sensibilitate mai mare ca metoda a-se foloseste in cazul in care antigenele se
gasesc in cantitate mica in tesut
n
4.SONDE FLUORESCENTE , molecule care detecteaza concentratia i.c. a ionilor , a
rad. liberi , a variatiilor de pH i.c. si isi modifica proprietatile in functie de valorilor acestora.