Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
GENOMICA
Genomica este stiinta care se ocupa cu studiul genomului organismelor. Genomul este intreaga informatie ereditara a unui organism. Este codificata fie in ADN fie in ARN pentru unele tipuri de virusuri. Genomul include atat genele cat si secventele non codificatoare ale ADN-ului In timp ce genomica ofera oportunitatea de a corela raspunsul unui organism cu factorii stresanti din mediul (din punct de vedere al modificarii expresiei genelor), intelegerea efectului unor astfel de evenimente asupra organismului uman este departe de a fi indeplinita. Acest domeniu include eforturi intensive de a determina intreaga secventa a ADN-ului organismelor si mapping-ul genetic in detaliu.
GENETICA
Investigarea rolului si functiei unei singure gene este scopul principal al biologiei moleculare sau geneticii si este un subiect comun al cercetarii medicale si biologice moderne. Cercetarea unei singure gene nu intra in cadrul definitiei genomicii, cu exceptia cazului in care scopul analizei acestei informatii genetice si functionale este de a elucida efectul si locul sau in cadrul intregii retele a genomului. Biologia moleculara se ocupa cu intelegerea interactiunilor dintre diferite sisteme ale celulei (inclusiv interactiunile dintre AND, ARN si biosinteza proteinelor) si deasemenea cu intelegerea modului in care aceste interactiuni sunt reglate.
IZOLAREA ADN
Etape ale izolarii i purificarii AND-ului genomic: 1. Ob inerea sedimentului celular. 2. Distrugerea peretelui celular: distrugerea peretelui celular se realizeaza prin tratament cu lizozim. 3. Liza peretelui nuclear. 4. Deproteinizare enzimatic . 5. Precipitarea proteinelor cu solu ie salin : proteinele/peptidele sunt precipitate cu solu ie KCl. 6. Precipitarea acizilor nucleici: precipitarea acizilor nucleici se realizeaza cu alcool izopropilic 7. Indep rtarea moleculelor de ARN din extract: In marea majoritate a experimentelor, n vederea ndep rt rii moleculelor ARN din extract se efectueaza i tratament cu RNaz A 8. Este necesar i parcurgerea unei etape de sp lare a sedimentului ADN cu etanol 70% rece. 9. Resuspendarea sedimentului ADN: Sedimentul ADN este uscat 20 min apoi resuspendat n TE.
TEHNOLOGIA PCR
Reac ia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reac ie de Polimerizare n Lan ) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secven e de ADN. Pe scurt, tehnica PCR permite ca o singura copie a unei secvente de ADN sa fie copiata de milioane de ori sau chiar sa fie modificata pe parcursul amplificarii (atunci cand este dorit acest lucru: ex. Introducerea unei mutatii).
Din punct de vedere chimic, reac ia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secven ei originale (folosit ca matri n replicare). Diferen a esen ial ntre o asemenea reac ie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reac ia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ata are a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur , iar singura enzim folosit n reac ie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu func ie de replicaz ). Principalele 3 etape ale unei reac ii PCR pot fi sintetizate astfel :
TIPURI DE PCR
Revers PCR (utilizat pentru amplificarea ARN): denaturarea structurilor secundare ale moleculelor ARN, ata are un primer complementar capului 3 al moleculei ARN i are loc sinteza primei catene de ADNc. In aceast reac ie se folose te o ADN polimeraz ARN-dependent (revers-transcriptaz ), Hibridul ARN:ADN ob inut n aceast reac ie de revers-transcriere este supus unei reac ii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, dup care la catena ADN r mas este ata at un primer complementar cu capul 3 al acesteia. Dup sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse ntr-o reac ie PCR obi nuit . MS PCR (Mutation Specific PCR): n experimentele de mutagenez situsspecific , modific rile dorite pot fi introduse n ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inser ii sau de dele ii. Ob inerea de sonde ADN/ARN marcate Foarte multe tehnici de ob inere de sonde ADN/ARN folosesc variante de reac ii PCR. Astfel, ntr-o variant , se folosesc primeri marca i (n sistem radioactiv sau neradioactiv de marcare) i dNTP nemarcate. Ampliconii ob inu i ntr-o asemenea reac ie sunt molecule dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reac ii PCR intr n structura produ ilor de reac ie).
TIPURI DE PCR
Real Time PCR (PCR cantitativ), Real Time PCR este o metoda diferita fata de RT-PCR (reverse transcriptase PCR). Real Time PCR este o metoda care include atat amplificarea fragmentului ADN in timp real cat si analiza acestuia. Se folosesc cantitati foarte mici de proba. Se pot amplifica atat probe ADN cat si probe ADNc cu aceeasi viteza si eficienta Un numar mult mai mare de probe de concentratii diferite pot fi analizate in acelasi timp. Amplificarea fragmentului ADN se poate vizualiza cu ajutorul moleculei reporter pe tot parcursul reactiei, nu la sfarsit.
Electroforeza in gel
Este o tehnica utilizata pentru separarea ADN, ARN sau a proteinelor utilizand un curent electric aplicat unei retele alcatuita dintr-un gel pe baza de agaroza. Este utilizata de obicei pentru analiza, dupa amplificarea ADN prin PCR. In solutie libera, la pH neutru sau alcalin, acizii nucleici nu pot fi separati. Pentru separarea lor se se folosesc matrici de gel de agaroza sau poliacrilamida. Un camp electric determina migrarea lor prin gel. Datorita numarului mare de resturi fosfat, acizii nucleici au o puternica incarcatura negativa, migrand in campul electric spre anod Fragmentele se separa sub forma unor benzi electroforetice In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct proportionala cu tensiunea aplicata Dupa ce separatia este completa, fragmentele ADN avand lungimi diferite sunt adesea vizualizate prin legarea lor de un colorant fluorescent precum bromura de etidiu
Electroforeza in gel
blanc 58 59.1 60.3 M50 61.4 62.5 63.5 64.5
Marimea fragmentelor este exprimata in:nucleotide, perechi de baze sau kb -pentru o mie de perechi de baze. -Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu DNA-ladders ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute Electroforeza acizilor nucleici este o etapa obligatorie in orice protocol de analiza a acizilor nucleici Prin ea se realizeaza: separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu enzime de restrictie; verficarea amplificarii PCR; identificarea si/sau determinarea semicantitativa a fragmentelor ADN rezultate in urma amplificarii PCR; detectia si determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma extractiei din tesuturi
SECVENTIEREA
Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie chimic prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la unul din capetele sale, denaturarea, urmata de de separarea prin electroforeza in gel a celor doua catene Are loc apoi taierea ADN-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de ADN cu lungime varibila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de poliacrilamida Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta in secventa de analizatde catre dideoxinucleotide
Enzimele de restrictie sunt o clasa speciala de enzime utilizate pentru a taia ADN-ul la un anumit site de restrictie pe care il recunosc, avand ca rezultat fragmente de ADN de lungimi predictibile. Utilizarea enzimelor de restrictie permite ca fragmente de ADN din surse diferite sa fie reconectate si astfel, prin ligarea lor, este obtinut AND-ul recombinat. Adesea asociat cu organismele modificate genetic, ADN-ul recombinat este utilizat in constructia vectorilor care au la baza plasmidele (fragmente scurte de ADN circular).
Microcipurile microarray traditionale reprezinta o colectie de spoturi ADN microscopice atasate de o suprafata solida sticla, plastic sau silicon - BIOCIPURI
PROTEOMICA
Proteomica se ocupa cu studiul la scara larga a structurii si functiei proteinelor. Analiza de secven poate furniza mai multe date dect simpla identificare a proteinei. Prin compararea secven ei unei proteine cu cele stocate n bazele de date, se pot g si informa ii despre: structura, interac iile, activitatea biochimic , evolu ia i chiar rolul poten ial ntr-o boal . Structura tridimensional depinde de plierea catenei polipeptidice n spa iu care reflect : Lungimea secven ei (tip de aminoacizi i secven ) Structura primar Modific ri post transla ionale suferite de aminoacizi Func ia proteinei depinde de structura tridimensional pentru c aceasta specific forma, distribu ia sarcinilor si pozi ia unor aminoacizi cheie. Proteinele cu secven e similare au propriet i similare. Paradigma secven similar / func ie similar st la baza bioinformaticii i ne permite s se fac predic ii structurale i func ionale pe baza secven ei proteice.
PROTEOMICA
Gradul de nrudire corespunde nivelului de conservare a func iei. Dac dou secven e proteice sunt foarte similare, ar putea reprezenta molecule omoloage care au func ii identice n specii diferite i care au acumulat muta ii datorit specia iei. Asemenea proteine se numesc ortoloage (de ex. globina uman i de oarece). Un grad mai sc zut de omologie ar putea indica faptul c proteinele sunt omoloage dar au evoluat divergent n termeni func ionali. Asemenea proteine se numesc paraloage i rezult din duplica ia genelor i divergen a n cadrul genomului. De ex.: mioglobina i globina umane.
Mioglobina i globina sunt similare, reflectnd rela iile evolutive i func ia conservat . Au secven e cu 26% identitate i 39% similitudine. Teoretic, mii de proteine ipotetice sunt nrudite cu proteine cunoscute, dar secven ele lor au devenit divergente. Structura lor poate identifica nrudirea. Cu alte cuvinte, n era postgenomic , datele de baze de secven de proteine, n primul rnd conduc la elucidarea func iei proteinelor. n evolu ie, structurile proteinelor sunt mult mai bine conservate dect secven ele. Scopul proteomicii structurale este de a g si membrii reprezentativi ai fiec rei familii de conforma ii proteice, de a descifra structura i a furniza o matri pentru compararea acestora. O aplica ie direct a proteomicii structurale este proiectarea ra ional a medicamentelor. Nu exist ntotdeauna o rela ie direct structur -func ie. Faptul c secven e divergente pot adopta aceea i structur este folositor pentru identificare rela iilor evolutive aflate la distan . Totu i se pot deduce i rela ii false, pentru c uneori, structuri echivalente din punct de vedere func ional au evoluat independent.
Tehnici de determinare a structurii proteinelor: Nu este nc posibil s se anticipeze structura ter iar a unei proteine numai din datele de secven . Tehnicile majore de studiu sunt: Cristalografia cu raze X Spectroscopia RMN Pentru RMN proteinele trebuie s fie solubilizate, s fie stabile i solubile la concentra ii ridicate i s nu se agrege sau denatureze n aceste condi ii. Tehnici de determinare a functiei proteinelor: Analiza de expresie genica o In cazul analizei ARNm sau a profilului de exprsie genica se monitorizeaza nivelul de expresie a mii de gene SIMULTAN in vederea studierii efectelor anumitor tipuri de tratamente, boli sau analiza genica a diferitelor stadii de dezvoltare a tesuturilor sau a organismelor vii o De exemplu, pe baza analizei microaray se pot identifica genele a caror expresie se modifica ca raspuns la actiunea unui anumit agent patogen sau alt organism, comparand nivelul de expresie din celulele sau tesuturile infectate cu nivelul de expresie din celulele sau tesuturile sanatoase, neinfectate. Microarrays poate fi utilizat pentru a evalua expresia mai multor gene in acelasi timp
oValorile nivelului de expresie genica indica cum conditiile experimentale influenteaza nivelul de expresie ARNm a unui grup de gene oMarcarea in verde indica un nivel redus de expresie genica oAnaliza de CLUSTER identifica un grup de gene a caror expresie este redusa
Protein databases
UniProt Protein Information Resource (PIR) Swiss-Prot Protein Data Bank (PDB) National Center for Biotechnology Information (NCBI) Human Protein Reference Database Proteopedia The collaborative, 3D encyclopedia of proteins and other molecules.
Telomere
In 2009 premiul Nobel pentru Fiziologie si Medicina a fost acordat echipei alcatuite din Elizabeth Blackburn, Carol Greiger i Jack Szostak pentru descoperirea felului n care cromozomii sunt proteja i de degradare de catre telomeri i de enzima telomeraza, n marea parte a regnului animal i vegetal, de la amib la om.
Telomerii nu sunt altceva dect extremit ile cromozomilor (n greac , telos=sfr it, meros=parte). Sunt secvente de AND repetitiv care se gasesc la capatul unui cromozom
Telomere
In vederea diviziunii celulare, ADN, purt torul informa iei genetice, este copiat cu ajutorul unui sistem replicativ n care un rol important l are enzima ADNpolimeraza. Aceasta ns nu tie s copieze telomerii. In consecin , s-ar deduce c n urma fiecarei diviziuni celulare, dimensiunile telomerilor se reduc. Ins n cele mai multe cazuri realitatea nu confirm . Echipa mentionata a identificat motivul - telomeraza. Enzima ajut ADN polimeraza s produc ADN la nivelul telomerilor pe baza unei matri e de ARN. Daca celulele se divid fara telomeraza, atunci capetele cromozomilor vor disparea si deasemenea si informatia pe care o contin.
Telomerii scurta i sunt una dintre cauzele mb trnirea, referindu-ne nu numai la cea a celulelor individuale, dar a organismului ca tot unitar. Pe de alt parte, exist boli genetice care au drept caracteristic telomeraz deficitar , care implic sinteza unor celule incapabile de a- i ndeplini func ia. Efectele variatiilor in vivo a lungimii telomerelor: A fost raportat ca persoanele peste 60 ani, ale caror celule sanguine au telomere mai scurte au rate mai mari ale mortalitatii Telomerele mai scurte au fost asociate cu:
Cresterea de 3,2 ori a mortalitatii prin boli cardio-vasculare Cresterea de 8,5 ori a mortalitatii prin boli infectioase O supravietuire in urma tuturor patologiilor global scazuta Cawthon et al, Lancet 361: 393-395, 2003
In schimb, dac activitatea telomerazei este ridicat , lungimea telomerilor este men inut , senescen a celular fiind ntrziat . Este cazul celulelor canceroase, care sunt considerate nemuritoare. Telomeraza este detectata in cantitate mare in 80-90% din formele de cancer invaziv Nivelul crescut de telomeraza promoveaza fenotipul celular nediferentiat In plus, telomerele cromozomilor celulelor canceroase sunt mai scurte (dovada a multiple cicluri de replicare), dar nu devin atat de scurte incat sa induca moartea acestora Daca se introduc mutatii in gena care codifica telomeraza si aceasta devine inactiva: Este inhibata RAPID cresterea celulelor canceroase Este redus procesul de metastazare Aceasta se produce prin: Downregularea RAPIDA a ciclului celular si a progresiei tumorale Downregularea metabolismului glucozei Si (posibil) este indusa diferentierea celulara
Din acest motiv, se evalueaz n prezent compusi mpotriva celulelor cu activitate telomerazic intens . Rezultatele obtinute pna acum sunt promitatoare. Deja s-au obtinut o serie de compusi care inhiba activitatea telomerazica la nivelul celulei canceroase, nsa se pare ca dozele utilizate sunt destul de mari ceea ce ar putea duce la posibile efecte adverse. La om: Telomeraza este activa in timpul dezvoltarii fetale si ramane activa in diferite celule proliferative Celule stem cells Limfocite, foliculii pilosi, etc Telomeraza este downregulata, dar inca activa, in multe alte celule de tip adult Epiteliale Fibroblasti Endoteliale
CELULELE STEM
Deriva din masa celulara a blastocistului. Pot realiza numeroase diviziuni fara sa se diferentieze. Mentin un set complet de cromozomi Din ele se pot dezvolta celule ce deriva din toate cele trei foite embrionare. Sunt capabile sa se integreze in toate tesuturile fetale pe parcursul dezvoltarii Dintr-o singura celula poate rezulta o linie celulara. Pot fi determinate sa prolifereze sau sa se diferentieze. Le lipseste punctul de control G1. Celulele stem se gasesc de cele mai multe ori in faza S a ciclului celular Producerea de celule stem pluripotente umane: Pot deriva din masa celulara a blastocistilor rezultati in urma unor tratamente de fertilizare Pot deriva din tesut fetal (mai intai s-au folosit celule germinale din tesut fetal de soarece apoi au fost izolate celule germinale umane din tesut fetal de 5-9 saptamani) Pot fi obtinute pe calea transferului nuclear in celule somatice (cazul oitei Dolly).
CELULELE STEM
Importanta celulelor stem embrionare Descifrarea mecanismelor ce duc la diferentierea celulelor tratarea unor boli grave cum ar fi cancerul, determinate de cresterea si diferentierea anormala a unor celule Testarea medicamentelor pe linii celulare Terapia celulara tratarea unor boli Parkinson, Alzheimar, boli cardiovasculare, arsuri, diabet, osteoartrita
CELULELE STEM
Clonarea terapeutica implica indepartarea nucleului dintr-un ou si inlocuirea lui cu nucleul subiectului cercetat. Desi oul se dezvolta folosind ADN-ul donorului de nucleu, creste intr-un blastocit din care rezulta celule stem embrionice cu potential de a deveni celule utilizabile din punct de vedere terapeutic. Celulele, dezvoltandu-se cu ADN-ul donorului, o data implantate in corp nu vor fi atacate de donorul sistemului imun. Intr-un studiu s-au folosit celule epiteliale din cozile a 24 de soareci cu Parkinson pentru a crea 187 linii de celule, din care au derivat neuroni dopaminici, acestia fiind ajustati la ADN-ul fiecaruia. In continuare celulele ajustate au fost grefate soarecilor cu acelasi ADN. Un alt grup, de control, a primit celule cu ADN ce nu se potrivea cu ADN-ul propriu. Soarecii ce au primit neuronii dopaminici compatibili cu propriul ADN au prezentat imbunatatiri neurologice si lipsa raspunsului imunologic in timp ce grupul de control nu.
CELULELE STEM
Expertii au confirmat ca studiul aduce medicina cu un pas mai aproape de un tratament eficace pentru Parkinson. Insa este un drum lung pana la demonstrarea eficacitatii pe oameni, supravegherea soarecilor analizati realizandu-se doar timp de 11 saptamani, ceea ce nu este indeajuns pentru a determina daca tratamentul persista. Fiind primul de acest tip, cercetatorii au demonstrat ca transferul nuclear de celule somatice sau clonarea terapeutica, folosind celule de la un soarece pentru a trata acelasi soarece, poate fi efectuata cu succes.
CELULELE STEM
Probleme actuale de rezolvat: Durata scurta a efectului in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie Controlul raspunsului imun declansat de prima sedinta de terapie,accentuat la repetarea sedintei Probleme speciale legate de vectorii virali efecte adverse nedorite (raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei) Bolile multigenice dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate
CELULELE STEM
Rezultate semnificative in prezent: 2008: UCL Institute of Ophthalmology ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate 2007: University of Texas si M. D. Anderson Cancer Center - un studiu pe soareci (combinatie de terapie genica + tehnici nanotehnologice de introducere a genelor) au indus scaderea semnificativa a volumului unor tumori pulmonare 2006: National Cancer Institute (NCI) au obtinut limfocite modificate genetic care ataca celule tumorale de melanom malign 2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare Alte rezultate promitatoare deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc
CELULELE STEM
Gene knockout
Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicin 2007 a fost acordat echipei: Mario Capecchi, Martin J. Evans i Oliver Smithie. Ei au descoperit cum s foloseasc celule stem embrionare pentru a crea schimb ri genetice precise i permanente n oareci. oarecii produ i n acest fel sunt cunoscu i ca oareci knockout pentru c schimbarea poate conduce la eliminarea (knock-out) func iei unei gene. Ast zi avem acces la o multitudine de tipuri de oareci knockout; n total, peste 10.000 de diferite gene au fost modificate. Modificare nu nseamn neap rat c genele sunt inactivate, ele pot fi activate (knock-on), modificndu-li-se funcia, sau nlocuite de alte gene (knock-in). Aceast tehnic a devenit att de precis nct este posibil activarea genei sau dezactivarea genei numai n anumite esuturi, de exemplu n celulele sangvine sau sistemul nervos, sau n multe dintre celulele care formeaz sistemul imun. De asemenea, este posibil dictarea cu precizie a nivelului de dezvoltare la care o gen ar trebui s devin activ sau inactiv . Temelia acestui sistem ingenios const n faptul c genei introduse i este dat o secvent start special , n aa numita zon promoter. Aceast secven necesit adiia unor substane specifice nainte ca gena s poat fi citit i ca ea s iniieze formarea proteinei. Substana poate fi un antibiotic, de exemplu, pe care oarecii l primesc la un anumit moment dat.