1.

GENERALITATI

Prezentul standard stabileste la metodele pentru controlul eficientei pasteurizarii joase,mijlocii si inalte a laptelui si produselor lactate. Controlul eficientei pasteurizarii joase si mijlocii se face cu ajutorul testului fosfatarii alcaline,prin urmatoarele metode: -folometrica,pentru:laptele integral,lapte partialsmintanit provenit de la diferite specii de animale,lapte de consum,lapte omogenizat,lapte concentrat,zer,produse lactate sub forma de praf,produse lactate acide,branzeturi,smantana si inghetata:metoda este obligatorie in caz de litigiu -cu fenolitaleina-fosfat de sodiu,pentru:lapte integral,lapte partial smantanit provenit de la diferite specii de animale,lapte de consum,lapte omogenizat,produse lactate acide si smantanita -cu fenilfosfat disodic,pentru:lapte integral,lapte partial smantanit provenit de la diferite specii de animale,lapte de consum si produse lactate acide -rapida,numai pentru lapte Controlul eficientei pasteurizarii inalte se face cu ajutorul testului peroxidazei prin urmatoarele metode: -cu para-fenilendiamina hidroclorica,pentru: lapte integral,lapte partial smantanit provenit de la diferite specii de animale,lapte de consum,produse lactate acide,smantana,branza de vaca,branza telemea si unt,metoda este obligatorie in caz de litigiu -cu benzidina,pentru:lapte,smantana,unt si branza telemea -rapida,pentru:lapte si produse lactate acide,excluzandu-se bauturile lactate cu cacao Reactivii folositi pentru analiza trebuie sa fie de calitate pentru analiza sau de calitate echivalenta.Apa trebuie sa fie distilata sau de puritate echivalenta Reactivii se pastreaza in sticle brune inchise etans.Atat reactivii cat si sticlaria trebuie sa fie liberi de fenol si feriti de praf,substante dezinfectante si detergenti care contin fenol,precum si de sapunuri care contin fenol

2.LUAREA SI PREGATIREA PROBELOR

Probele se iau conform standardelor sau normelor tehnice interne in vigoare ale produselor respective,cu respectarea regulilor si cu urmatoarele precizari: -probele luate ca mai sus se pastreaza in vase de sticla lipsite de fenol,inchise cu dopuri de pluta.Nu se folosesc vase sau dopuri din material plastic sau cauciuc -la inghetata,probele se iau din amestecul de lapte si smantana folosit in fabricatie Pregatirea probelor pentru analiza se face ,cu urmatoarele precizari: -deoarece fosfataza alcalina nu este repartizata unifosrm in lapte,proba trebuie amestecata foarte bine inaintea determinarii -la branzeturile sub forma de bucati,se rupe bucata (nu se taie) si apoi se scoate proba pentru analiza din interior,cu ajutorul unui cutit curat ,fara ca lama sa atinga suprafata exterioara a bucatii La testul fosfatazei alcaline,se va tine seama de urmatoarele: - determinarea trebuie sa se faca in maximum 48 ore de la luarea probelor in cazul cand sant pastrate la 15....20 grade C exceptand probele de lapte,care trebuie sa fie analizate in interval de 18 ore de la pasteurizare - probele pot fi pastrate in laborator la temperatura de 0.....4 grade C:in cazul probelor din produse refrigerate,trebuie sa se evite congelarea lor:in ambele cazuri,probele se supun direct determinarii,fara sa fie lasate sa ia temperatura camerei -probele nu se analizeaza daca prezinta flocoane de coagul la incalzirea preliminara -la efectuarea determinarii trebuie sa se evite lumina directa a soarelui -pipetele folosite in timpul determinarii trebuie sa fie prevazute cu vata la capatul neefilat

3. TESTUL FOSFATAZEI ALCALINE

Metoda de fotometrica Principiul metodei. In conditii stabilite de temperatura si pH,fosfataza alcalina prezenta in proba de analizat are proprietatea de a elibera fenolul din fenilfosfatul de sodiu.Intensitatea culorii indofenolul format din reactia fenolului cu 2,6-diclorchinon-clorimida se masoara fotometric,la lungimea de unda de 620nm. Cantitatea de fenol eliberata este proportionala cu cantitatea de fosfataza alcalina activa prezenta in proba de analizat si indica eficienta pasteurizarii Sensibilitatea metodei este de 0,2 pg fenol Aparatura -fotoclorimetru -termostat sau baie de apa termoreglabila -eprubete din sticla libera de fenol Reactivi si materiale

-solutia tampon substrat: intr-un balon cotat de 1000 cm se introduc 11,5g carbonat de sodiu anhidru,10,2 g bicarbonat de sodiu anhidru si 1,1g fenilofosfat disodic,se dizolva in apa,se aduce la semn cu apa si se omogenizeaza Solutia are pH 9,8 -Reactiv de precipitate a proteinelor: intr-un vas de laborator se dizolva 25g acid tricolaracetic in 50 cm apa,apoi se adauga 50 cm acid clorhidric d=1,18.....1,18 si se amesteca bine -Carbonat de sodiu anhidru,solutie 8% -Sulfat de cupru-hexametafosfat de sodiu,solutiea:intr-un balon cotat de 1000 cm se dizolva 0,5 g sulfat de cupru(CuSO4..5H2O)in apa,apoi se adauga 50 g hexametafosfat de sodiu cristalizat,se aduce la semn cu apa si se omogenizeaza. -2,6-Diclorchinon-clorimida solutie alcoolica 0,8% in alcool etilic 96% col.Solutia se pastreaza la rece.La schimbarea culorii in brun,solutia se arunca -Alcool butilic n -Solutia tampon: intr-un balon cotat cu 1000 cm se introduce 11,5g carbonat de sodiu anhidru,10,2 g bicarbonat de sodiu anhidru si 0,1 g sulfat de cupru (Cu SO4..5H2O) se dizolva in apa,se aduce la semn cu apa si se omogenizeaza. -Solutii etalon de fenol: a) Solutie etalon de rezerva: intr-un balon cotat de 1000 cm se dizolva in apa 1g fenol cristalizat proaspat distilat si se aduce la semn cu apa b) Solutie etalon de lucru cu un continut de 4 pg fenol la 1 cm :intr-un balon cotat de 500 cm se introduc 2 cm solutie de etalon de rezerva si se aduce la semn cu solutia tampon -Hartie de filtru cantitativa cu porozitate medie.

Modul de lucru
Intr-o eprubeta se introduce 1 cm masurat cu pipeta,din proba de lapte si produse lactate lichide,peste care se adauga 10cm solutie tampon substrat cu pH 9,8 incalzita la 37 grade Se acopera eprubeta cu un dop de pluta si se agita 3 minute prin rasturnari repetate.In cazul branzeturilor si al laptelui praf se procedeaza astfel: se cantaresc,cu precizie de 0,0001 g 0,5 g proba pregatita conform cap 2 si se introduc intr-o eprubeta. Se adauga 1 cm solutie tampon sunstrat,incalzita la 37 grade si se tritureaza cu o bagheta pana se obtine o pasta omogena .Se adauga 9 cm solutie tampon substrat,se astupa cu dop de pluta si se agita 3 minute prin rasturnari repetate. Dupa agitare,eprubetele cu probe se termostateaza la temperatura de 37 grade timp de o ora. Dupa termostatare,se introduce cu atentie 1 cm reactiv de precipitare (masurat cu pipeta),se agita cu atentie,se lasa 5 minute si se filtreaza prin hartie de filtru cu porozitate medie,intr-o eprubeta uscata Din filtratul obtinut se masoara cu pipeta 5 cm care se introduc intr-o eprubeta,peste care se adauga 1 cm solutie de sulfat de cupru-hexametafosfat de sodiu,se agita se adauga 5 cm solutie de carbonat de sodiu,se agita,se introduc 2 picaturi de solutie de 2,6-diclorchinon-clorimida,se astupa cu un dop de pluta si se agita prin rasturnare Eprubeta se mentine in repaus la 37 grade exact 5 minute,apoi se adauga 5 cm alcool butilic n,se astupa cu un dop de pluta si se agita prin rasturnari repetate (de 5 ori).Se lasa in repaus un minut pentru separarea stratului alcoolic colorat Din extractul alcoolic se iau 3 sau 4 cm care se introduc in cuva cu grosimea stratului de 1 cm.Se masoara exctinctia la fotocolorimetru la lungimea de unda de 62a0 nm sau cu filtru rosu S 61,folosind ca solutie de referinta extractul alcoolic al probei obtinut confosrm pct.3.1.6.1 si introdus intr-o cuva identica. Se citeste apoi pe curba de etalonare continutul de fenol corespunzator extinctiei rezultate Se efectueaza in paralel doua determinari din aceeasi proba pentru analiza Trasarea curbei de etalonare Intr-o serie de 9 eprubete identice se introduc cantitatile de solutie etalon de lucru si solutie

tampon indicate in tabelul 1 Numarul de ordine al etalonului (epribetei) Solutie etalon de lucru (4 pg fenol/cm)cm Solutie tampon,cm Continut de fenol,pg 0 0 10 0 1 2 3 1 9 4 4 2 8 8 5 3 7 12 tabelul 1 6 7 4 6 16 5 5 20 8 10 0 40

0.25 0.5 9.75 9.5 1 2

In fiecare eprubeta se adauga 2 picaturi de solutie de 2,6-diclorchinon-clorimida,agitand repede prin rasturnarea eprubetei o singura data. Cu valorile obtinute se traseaza o curba de etalonare insciind pe abscisa continutul de fenol,inpg iar pe ordonata extinctiile corespunzatoare Curba de etalonare este o linie dreapta Exprimarea si interpretarea rezultatelor Exprimarea rezultatelor Valorile citite pe curba de etalonare reprezinta continutul de fenol exprimat in pg,corespunzator la 0,5 cm respectiv 0,25 g produs de analizat Ca rezultat se ia media aritmetica a celor doua determinari efectuate in paralel. Interpretarea rezultatelor Valorile sub 1 pg fenol/0,5 cm sau sub 1 pg fenol/0,25 g arata ca testul fosfatazei alcaline este negativ,deci o pasteurizare eficienta. Valorile peste 1pg fenol/0.5 cm3 sau peste 1 pg fenol/0.25 g rata ca testul fosfatazei este pozitiv, deci o pasteurizare insuficienta. Controlul testului fosfatazei alkaline In cazul in care la testul initial s-a obtinut rezultat pozitiv, este necesar sa se faca in - controlul substantelor care interfereaza, - determinarea fosfatazei microbiene, - determinarea fosfatazei reactivate. Controlul negativ Acest control se efectueaza pentru fiecare proba de analizat. Din proba pregatita cnform cap. 2 se cantaresc 5g produs solid cu precizie de 0.0001 g sau dupa caz, se masoara cu pipeta 5 cm3 produs lichid si se introduce intr-o eprubeta prevazuta cu dop si termometru. Se incalzeste la 90 grade Celsius timp de 1 minutsi se raceste rapid. Pentru a asigura inactiva re a fosfatazei se agita tot timpul. Orice aparitie de culoare la controlul negative nu se datoreaza fosfatazei active, ci indica contaminarea reactivilor si/sau prezenta substantelor care interfereaza ( substante aromate cu compusi cu structura fenolica), in care caz trebuie sa se efectueze controlul acestor substante. Controlul pozitiv Pentru fiecare serie de probe de analizat se efectueaza un singur control pozitiv. La 100 cm3 lapte nepasteurizat, proaspat incalzit la 90 grade Celsius timp de 1 minut si racit rapid, se adauga 0,1 cm3 lapte nepasteurizat. Aparitia culorii albastru deschis arata ca reactivii sunt corespunzatori. In caz contraracestia trebuie inlocuiti. Controlul substantelor care interfereaza Se procedeaza la fel cu o singura modificare si anume: la prepararea solutiei tampon substrat nu se mai adauga fenilfosfat-disodic. Orice coloratie aparuta la acest control indica prezenta substantelor care interfereaza. Daca valoarea obtinuta este cea mai mica decat valoarea obtinuta la testul fosfatazei alkaline

aceasta indica o pasteurizare insuficienta. Determinarea fosfatazei microbiene Din proba pregatita conform cap 2 se cantaresc, cu precizie de 0.01 g din produsele lactate solide sau se masoara cu pipeta 5 cm3 din produsele lactate lichide intr-o eprubeta prevazuta cu termometru. Se pasteurizeaza cu grija la 6263 grade Celsius timp de 30 min amestecand proba cu termometru in timpul incalzirii. Pasteurizarea se face cu atentie pentru a nu se depasi temperatura si timpul de pasteurizare. Daca proba repasteurizata nu prezinta o reducere seminificativa de fenol, rezultatul pozitiv obtinut la testul fosfatazei alcaline este datorat fosfatazei microbiene. In acest caz rezultatul initial obtinut la testul fosfatazei alcaline se interpreteaza ca negative, deci o pasteurizare eficienta. Principiul metodei Produsele lactate lichide, pasteurizate la temperature ridicata (8595 grade Celsius), pot sa prezinte o crestere a activitatii fosfatazei (reactivare) atunci cand sunt depozitate in conditii necorespunzatoare. Reactivarea fosfatazei se pune in evidenta prin mentinerea produsului la temperatura de 34 grade Celsius in prezenta clorurii de magneziu. Produsele insificient pasteurizate nu prezinta reactivarea fosfatazei. Aparatura Conform celei descrise mai sus si in plus micropipete de 0.1 si 0.2 cm3. Reactivi si materiale In plus: - Clorura de magneziu solutie: intr-un vas de laborator de 200 cm3 se cantaresc, cu precizie de 0.1 g 100 g clorura de magneziu (MgCl2 6H2O), se dizolva in 25 cm3. Se aduce la semn cu apa, dup ace se raceste. Aceasta solutie contine 0.1196 g Mg/cm3. Modul de lucru Din proba pregatita conform cap 2 la care s-a determinat grasimea , se masoara cu pipeta cate 5 cm3 si se introduce in doua eprubete. Se pregateste o solutie de diluare astfel: 10 cm3 din aceeasi proba se introduce intr-o eprubeta care se mentine 1 minut la temperature de 95 grade Celsius , intr-o baie de apa, apoi se raceste. In una din cele doua eprubete care contin cate 5 cm3 proba se adauga solutie de clorura de magneziu conform tabelului 2. Continutul de grasime al probei, % 37 Peste 712 Peste 1218 Peste 1825 Peste 2531 Peste 3140 Cantitatea de solutie de clorura de magneziu, cm3 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075

Cele doua eprubete se termotesteaza la 34 grade Celsius timp de o ora. Din eprubeta care contine proba si clorura de magneziu se ia dupa termostatare 1 cm3 care se introduce intr-o eprubeta si se dilueaza cu 5 cm3 solutie de diluare (dilutie 1+5). Pe proba cu clorura de magneziu diluata 1+5 si pe proba fara clorura de magneziu, nediluata, se

efectueaza testul fosfatazei alcaline Exprimarea rezultatului Valorile citite pe curba de etalonare reprezinta continutul de fenol exprimat in pg,corespunzator la 0,5 cm respectiv 0,25 g produs de analizat Ca rezultat se ia media aritmetica a celor doua determinari efectuate in paralel. 3.1.5.2 Interpretarea rezultatelor Valorile sub 1 pg fenol/0,5 cm sau sub 1 pg fenol/0,25 g arata ca testul fosfatazei alcaline este negativ,deci o pasteurizare eficienta. Valorile peste 1pg fenol/0.5 cm3 sau peste 1 pg fenol/0.25 g rata ca testul fosfatazei este pozitiv, deci o pasteurizare insuficienta. Interpretarea rezultatului Determinarea indica reactivarea fosfatazei daca proba cu clorura de magneziu diluata prezinta un continut de fenol egal sau mai mare decat al probei fara clorura de magneziu. In acest caz, rezultatul pozitiv obtinut la testul fosfatazei alcaline se interpreteaza ca negative. Daca proba cu clorura de magneziu diluata prezinta un continut de fenol mai mic decat al probei fara clorura de magneziu, rezultatul pozitiv initial obtinut la testul fosfatazei alcaline indica o pasteurizare insuficienta.