Popa Mihaela 12 U3 Tehnica ADN-ului recombinat/Ingineria genetica

Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinat i la transferul de gene peste barierele de specie. Tehnica recombinrii genetice n vitro include trei etape principale: 1) extragerea sau sinteza chimic a ADN-ului din diferite specii; 2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN; 3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN ntr-o celul vie pentru reproducerea i ei (fig. 1).

expresia

Extragerea ADN-ului se produce utilizndu-se o serie de enzime specifice, n primul rnd, cele de restricie, capabile s rup molecula de ADN n anumite locuri. Restrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci). Nu toate restrictazele se utilizeaz n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoarele proprieti: pot tia molecula de ADN n fragmente discrete; posed o specificitate de aciune nalt (taie molecula de ADN ntr-o anumit succesivitate - siteul de recogniie); pot forma, n rezultatul restriciei, margini lipicioase la capetele fragmentului de ADN (aceast proprietate nu este caracteristic tuturor restrictazelor); pot fi izolate relativ uor n stare pur din mediul incubaional. La repartiia ADN-ului este implicat ADN-ligaza, care poate lega unele fragmente de restricie. Acestea i alte enzime stau la baza obinerii moleculelor recombinate de ADN (fig.2). Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizai vectorii (moleculele speciale de ADN ce transfer informaia genetic dintr-o celul n alta) reprezentai prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial i ADN cloroplastic. Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informaiei strine n celulele (organismele) - gazd, trebuie s corespund urmtoarelor cerine: inofensivitatea vectorului; multiplicarea rapid n celula-gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare n celulele altor organisme; izolarea relativ uoar, clonarea i expresia n celulele (organismele) strine. n calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit. Plasmidele reprezint nite molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistena la antibiotice, agresivitatea.Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie. n acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de ADN exogen n plasmid.

Popa Mihaela 12 U3

Fig.2. Obinerea moleculelor recombinate de ADN: A) metoda ligazic; B) metoda terminal. Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusul tumoral SV-40 i virusul papiloma bovin (BPV). Se crede c vectorii virali vor putea fi utilizai i la plante. Celulelor utilizate n experimentele ingineriei genice le sunt naintate o serie de cerine care au menirea de a asigura securitatea investigaiilor tiinifice. Conform Regulilor despre molecule recombinate de ADN celulele-gazd trebuie s satisfac urmtoarele cerine: capacitatea sporit de implicare n investigaiile tiinifice; incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare n afara laboratorului; capacitatea lizrii ADN-ului su n afara laboratorului; imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme; imposibilitaea polurii mediului nconjurtor n rezultatul transformrii i/sau transfeciei. Dup obinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate n celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea i transmiterea informaiei ereditare). Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde n celula (organismul) gazd, este protejat pe diferite ci: transferul moleculei liniare de ADN n form circular ; blocarea sistemului de restricii al celulei-gazd ; aciunea restrictazelor. n acelai timp, celula-gazd i protejeaz informaia ereditar prin diferite mecanisme: aciunea restrictazelor specifice; metilarea ADN; aciunea vecintii epigenetice; aciunea nespecific a nucleazelor celulare; protecia mecanic prin membranele celulare; aciunea proteinelor histonice i nehistonice;
2

Popa Mihaela 12 U3
aciunea interferonului.