METODE DE ANALIZ A COMPONENTELOR FURAJELOR I. Prevederi generale cu privire la metodele de analiz pentru furaje A.

Pregtirea probelor pentru analiz 1. Scopul Procedurile descrise mai jos se refer la pregtirea pentru analiz a probelor finale, trimise laboratoarelor de control dup prelevare, n conformitate cu prevederile Normei sanitare veterinare privind controlul oficial al furajelor pentru animale, aprobat prin Ordinul ministrului agriculturii, alimentaiei i pdurilor nr. 390/2001, publicat n Monitorul Oficial al Romniei, Partea I, nr. 766 din 30 noiembrie 2001, ce transpune n legislaia naional Directiva Comisiei 76/371/CEE. Aceste probe trebuie s fie preparate n aa fel nct cantitile cntrite, aa cum au prevzut metodele de analiz, s fie omogene i reprezentative pentru probele finale. 2. Precauii Toate operaiunile necesare trebuie s fie efectuate n aa fel nct s se evite pe ct posibil contaminarea probei i schimbarea compoziiei acesteia. Mcinarea, amestecarea i cernerea trebuie s fie efectuate ct de repede posibil cu o expunere minim a probei la aer i lumin. Nu trebuie s fie utilizate mori i rnie care pot nclzi apreciabil proba. Este recomandat mcinarea manual pentru furajele care sunt n mod deosebit sensibile la cldur. Trebuie, de asemenea, s se aib grij ca nsi aparatura s nu fie o surs de contaminare cu oligoelemente. Umiditatea se determin nainte i dup preparare, dac prepararea nu poate fi efectuat fr schimbri semnificative ale umiditii probei, n conformitate cu metoda stabilit n partea 1 a anexei la Norma sanitar veterinar ce stabilete metode de analiz pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total i uleiurile i grsimile brute, aprobat prin Ordinul preedintelui Ageniei Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor nr. 15/2004, publicat n Monitorul Oficial al Romniei, Partea I, nr. 1.020 i 1.020 bis din 4 noiembrie 2004, ce transpune n legislaia naional Directiva Comisiei 71/393/CEE. 3. Procedur Se amestec bine proba final, fie mecanic, fie manual. Se mparte proba n dou pri egale (poate fi utilizat metoda de mprire n patru, atunci cnd este cazul). Se pstreaz una dintre pri ntr-un container corespunztor, curat i uscat, echipat cu un dop etan, iar din cealalt parte sau dintr-o parte reprezentativ a acesteia se pregtesc cel puin 100 g, aa cum se indic mai jos. 3.1. Furaje ce pot fi mcinate ca atare Cu excepia cazului cnd nu s-a specificat altfel n metodele de analiz, dup mcinare, dac este necesar, se cerne ntreaga prob printr-o sit cu ochiuri de 1 mm (n conformitate cu Recomandarea ISO R 565). Se evit orice supramcinare (mcinare excesiv). Se amestec proba mcinat i se colecteaz ntr-un container corespunztor, curat i uscat, echipat cu un dop etan. Se amestec din nou, imediat nainte de cntrirea cantitii pentru analiz. 3.2. Furaje ce pot fi mcinate dup uscare n cazul n care n metodele de analiz nu se specific altfel, se usuc proba pentru a se aduce coninutul n umiditate al acesteia la un nivel sczut de 8% pn la 12%, n conformitate cu procedura preliminar de uscare descris n baza pct. 4.3 al metodei de determinare a umiditii, menionat la pct. 2 de mai sus. Se procedeaz apoi aa cum s-a indicat la seciunea 3.1. 3.3. Furaje lichide sau semilichide Se colecteaz proba ntr-un container corespunztor, curat i uscat, echipat cu un dop etan. Se amestec bine imediat nainte de cntrirea cantitii pentru analiz. 3.4. Alte furaje

Probele ce nu pot fi preparate n conformitate cu una dintre procedurile anterioare trebuie s fie tratate prin orice alt procedur care asigur c, n fapt, cantitile cntrite pentru analiz sunt omogene i reprezentative pentru probele finale. 4. Depozitarea probelor Probele trebuie s fie depozitate la o temperatur care s nu altereze compoziia acestora. Probele destinate pentru analiza vitaminelor sau a substanelor care sunt sensibile n mod deosebit la lumin trebuie s fie depozitate n recipiente din sticl fumurie. B. Prevederi n legtur cu reactivii i aparatura utilizat n cadrul metodelor de analiz 1. n cazul n care nu s-a specificat altfel n metodele de analiz, toi reactivii analitici trebuie s fie puri din punct de vedere analitic (a.p.). Cnd se determin urme de oligoelemente, puritatea reactivilor trebuie s fie controlat printr-un test martor. n funcie de rezultatele obinute, poate fi solicitat o purificare ulterioar a reactivilor. 2. Orice operaiune care include pregtirea soluiilor, diluarea, cltirea sau splarea, menionate n metodele de analiz, fr indicaie n ceea ce privete natura solventului sau a diluantului ntrebuinat, implic utilizarea apei. Ca regul general, apa trebuie s fie demineralizat sau distilat. n cazuri particulare ce sunt indicate n metodele de analiz, aceasta trebuie s fie supus unor proceduri speciale de purificare. 3. n legtur cu echipamentul aflat n mod normal n laboratoarele de control, metodele de analiz fac referire numai la acele instrumente sau aparate care sunt speciale ori necesit utilizare specific. Acestea trebuie s fie curate, n special atunci cnd urmeaz s fie determinate cantiti foarte mici de substane. C. Aplicarea metodelor de analiz i exprimarea rezultatelor 1. n general trebuie stabilit o singur metod de analiz pentru determinarea fiecrei substane din furaje. Atunci cnd sunt prezentate mai multe metode, trebuie s fie indicat, n raportul de analiz, metoda specific utilizat de laboratorul de control. 2. Rezultatul prezentat n raportul de analiz trebuie s reprezinte valoarea medie obinut de la cel puin dou determinri efectuate pe pri separate n prob i de o repetabilitate satisfctoare. Acest rezultat trebuie s fie exprimat n maniera stabilit de metoda de analiz, cu un numr corespunztor de cifre semnificative, i trebuie s fie corectat, dac este necesar, n funcie de umiditatea probei finale anterioare preparrii. 3. n legtur cu substanele nedorite n sensul normei sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor aprobate prin Ordinul preedintelui Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor nr. 120/2005, ce transpune n legislaia naional Directiva 2002/32/CE, inclusiv dioxinele i derivaii de dioxin PCB, un produs destinat nutriiei animalelor este considerat ca nefiind conform cu coninutul maxim stabilit, dac se consider c rezultatul analitic depete coninutul maxim, inndu-se cont de incertitudinea de msurare extins i de corecia pentru recuperare. Concentraia analizat corectat pentru recuperare i incertitudinea de msurare extins obinut din rezultatul analitic sunt utilizate pentru a stabili conformitatea. Aceast procedur este aplicabil doar atunci cnd metoda de analiz permite estimarea incertitudinii de msurare i corectarea pentru recuperare (de exemplu, nu este posibil n cazul analizelor microscopice). Rezultatul analitic se raporteaz dup cum urmeaz (n msura n care metoda utilizat pentru analize permite s se estimeze incertitudinea de msurare i rata recuperrii): a) sunt indicate corectarea sau necorectarea pentru recuperare, maniera de raportare i nivelul recuperrii; b) " x +/- U", n care x este rezultatul analitic i U reprezint incertitudinea de msurare extins, utilizndu-se un factor de acoperire de 2 care ofer un nivel de ncredere de aproximativ 95%.

II. Determinarea acidului cianhidric 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea nivelului acidului cianhidric, liber i combinat sub forma glicozidelor, n furaje i n special n produse derivate din semine de in, din fin de manioc i din unele specii de fasole. 2. Principiu Proba se introduce n ap. Acidul cianhidric este eliberat prin aciunea enzimelor, antrenat prin distilare cu aburi i colectat ntr-un volum specific de soluie acidifiat de azotat de argint. Cianura de argint trebuie separat prin filtrare, iar excesul de azotat de argint trebuie titrat cu o soluie de tiocianat de amoniu. 3. Reactivi 3.1. O suspensie de migdale dulci: se zdrobesc 20 de migdale dulci confiate n 100 ml de ap la 37C pn la 40C. Se controleaz s nu existe acid cianhidric n cei 10 ml ai suspensiei, utilizndu-se hrtie de picrat de sodiu sau efectundu-se un test martor, aa cum s-a descris la ultimul paragraf al pct. 5.2. 3.2. 10% soluie (m/v) de acetat de sodiu, neutr la fenolftalein. 3.3. Emulsie antispum (de exemplu, Silicon) 3.4. Acid azotic, d:1,40 3.5. Soluie de azotat de argint: 0,02 N 3.6. Soluie de tiocianat de amoniu: 0,02 N 3.7. Soluie saturat de sulfat feric de amoniu 3.8. Amoniac, d:0,958 4. Aparatur 4.1. Etuv cu termostat fixat la 38C 4.2. Aparatur pentru distilare prin antrenare cu aburi, echipat cu un condensator cu o pies extins curbat 4.3. Baloane cu fundul plat de 1.000 ml, cu dop de sticl 4.4. Baie de ulei 4.5. Biurete gradate de 1/20 ml. 5. Procedur 5.1. Se cntresc 20 g din prob, cu o marj de 5 mg, se plaseaz ntr-un balon cu fundul plat de 1 l i se adaug 50 ml de ap i 10 ml de suspensie de migdale dulci prevzut la pct. 3.1. Se adapteaz dopul la balon i se transfer n etuv, timp de 16 ore la 38C. Se rcete apoi la temperatura camerei i se adaug 80 ml de ap, 10 ml de soluie de acetat de sodiu prevzut la pct. 3.2 i o pictur din emulsia antispum prevzut la pct. 3.3. Se conecteaz balonul la aparatura de distilare cu aburi i se plaseaz ntr-o baie de ulei ce a fost mai nti adus la o temperatur cu puin peste 100C. Se distileaz 200 ml pn la 300 ml de lichid, trecnd un puternic curent de aburi prin balon i nclzind uor baia de ulei. Se colecteaz distilatul ntr-un pahar Erlenmeyer protejat de lumin i care conine exact 50 ml de soluie de azotat de argint 0,02 N prevzut la pct. 3.5 i 1 ml de acid azotic prevzut la pct. 3.4. Trebuie s se asigure c piesa extins a condensatorului este imersat ntr-o soluie de azotat de argint. 5.2. Se transfer coninutul din paharul Erlenmeyer ntr-un balon cotat de 500 ml, se completeaz cu ap, se agit i se filtreaz. Se nltur 250 ml din filtrat, se adaug aproximativ 1 ml de soluie de sulfat feric de amoniu prevzut la pct. 3.7 i se titreaz excesul de azotat de argint cu soluie de tiocianat de amoniu 0,02 N prevzut la pct. 3.6, luat dintr-o biuret gradat de 1/20 ml. Un test martor poate s fie efectuat, dac este necesar, aplicndu-se aceeai procedur la 10 ml de suspensie de migdale dulci prevzut la pct. 3.1, omindu-se proba ce trebuie analizat.

6. Calcularea rezultatelor Dac testul martor indic faptul c soluia de azotat de argint 0,02 N a fost consumat, se scade valoarea acesteia din volumul consumat de distilatul probei. 1 ml de AgNO3 0,02 N corespunde la 0,54 mg de HCN. Rezultatul se exprim procentual. 7. Observaii Dac proba conine o cantitate mare de sulfuri (de exemplu, boabe de fasole), se formeaz un precipitat negru de sulfur de argint care este filtrat mpreun cu un depozit de cianur de argint. Formarea acestui precipitat cauzeaz o pierdere de soluie de azotat de argint 0,02 N, volum ce trebuie s fie sczut din volumul utilizat pentru a calcula coninutul de HCN. Pentru a face aceasta, se procedeaz dup cum urmeaz: Se trateaz depozitul rmas pe un filtru cu 50 ml de amoniac prevzut la pct. 3.8, pentru a se dizolva cianura de argint. Se spal reziduul n amoniac diluat i apoi se determin coninutul n argint al acestuia. Se transform valoarea obinut n ml de soluie de azotat de argint 0,02 N. Coninutul n HCN al probei poate fi, de asemenea, determinat prin titrarea filtratului amoniacal acidifiat cu acid azotic. III. Determinarea calciului 1. Scop i domeniu de aplicare Metoda se utilizeaz pentru determinarea coninutului de calciu total din furaje. 2. Principiu Calciul trebuie calcinat, cenua trebuie tratat cu acid clorhidric, iar calciul trebuie precipitat cu oxalat de calciu. Se dizolv precipitatul n acid sulfuric i se titreaz cu o soluie de permanganat de potasiu acidul oxalic format. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a., d:1,14 3.2. Acid azotic p.a., d:1,40 3.3. Acid sulfuric p.a., d:1,13 3.4. Amoniac p.a., d:0,98 3.5. Soluie saturat rece de oxalat de amoniu p.a. 3.6. Soluie 30% (m/v) de acid citric p.a. 3.7. Soluie 5% (m/v) de clorur de amoniu p.a. 3.8. Soluie 0,04% (m/v) de verde brom crezol 3.9. Soluie de permanganat de potasiu 0,1N. 4. Aparatur 4.1. Cuptor electric cu circulaie a aerului i termostat 4.2. Creuzete din platin, siliciu sau porelan pentru calcinare 4.3. Creuzete cu filtru din sticl de porozitate G4. 5. Procedur 5.1. Se cntresc aproximativ 5 g din prob (sau mai mult, dac este necesar) cu o aproximaie de mg, se calcineaz la 550C i se transfer cenua ntr-un pahar de laborator de 250 ml. Se adaug 40 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1, 60 ml de ap i cteva picturi de acid azotic prevzut la pct. 3.2. Se aduce la fierbere i se menine la punctul de fierbere timp de 30 de minute. Se rcete i se transfer soluia ntr-un balon cotat de 250 ml. Se cltete, se completeaz pn la semn cu ap, se omogenizeaz i se filtreaz.

Utilizndu-se o pipet, se transfer ntr-un pahar de laborator de 250 ml o parte alicot ce conine de la 10 pn la 40 mg de calciu, n conformitate cu coninutul n calciu asumat. Se adaug 1 ml de soluie de acid citric prevzut la pct. 3.6 i 5 ml de soluie de clorur de amoniu prevzut la pct. 3.7. 5.2. Se completeaz cu ap volumul pn la aproximativ 100 ml. Se aduce pn la punctul de fierbere, se adaug 8 pn la 10 picturi de soluie de verde brom crezol prevzut la pct. 3.8 i 30 ml de soluie cald de oxalat de amoniu prevzut la pct. 3.5. Dac se formeaz un precipitat, acesta se dizolv adugndu-se cteva picturi de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1. Se neutralizeaz foarte lent cu amoniac prevzut la pct. 3.4, se agit continuu pn la obinerea unui pH ntre 4,4 pn la 4,6 (de exemplu, atunci cnd indicatorul i schimb culoarea). Se plaseaz paharul de laborator ntr-o baie de ap fierbinte i se menine timp de 30 de minute, pentru a permite precipitatului care s-a format s se depun. Se scoate paharul de laborator din baia de ap. Se las ca acesta s stea timp de o or i se filtreaz printr-un creuzet filtrant de G4. Se spal paharul de laborator i creuzetul cu ap, pn cnd excesul de oxalat de amoniu este nlturat complet (absena clorurii din apa de splat indic faptul c acestea au fost splate suficient). Se dizolv precipitatul de pe filtru n 50 ml de acid sulfuric cald prevzut la pct. 3.3. Se cltete creuzetul cu ap cald i se completeaz filtratul pn la aproximativ 100 ml. Se aduce temperatura pn la 70-80C i se titreaz pictur cu pictur cu o soluie de permanganat de potasiu prevzut la pct. 3.9 pn cnd este obinut o culoare roz ce persist timp de un minut. 6. Calcularea rezultatelor 1 ml de permanganat de potasiu 0,1 N corespunde la 2,004 mg de calciu. Rezultatul obinut se exprim procentual. 7. Observaii 7.1. Pentru un coninut foarte sczut de calciu se procedeaz dup cum urmeaz: se filtreaz precipitatul de oxalat de calciu printr-o hrtie de filtru liber de cenu. Dup splare se usuc filtrul i cenua la 550C ntr-un creuzet de platin. Se redizolv reziduul n cteva picturi de acid sulfuric prevzut la pct. 3.3, se evapor pn se usuc, se calcineaz din nou la 550C i se cntrete. Dac M este masa sulfatului de calciu obinut, coninutul de calciu al prii alicote luate ca prob = M x 0,2944. 7.2. Dac proba const numai din substane minerale, aceasta se dizolv n acid clorhidric fr a o calcina mai nti. n cazul produselor precum fosfatul de aluminiu-calciu ce sunt dificil de dizolvat n acid, se topete dup cum urmeaz, printr-un proces alcalin nainte de dizolvare: se amestec proba ce trebuie analizat ntr-un creuzet de platin cu un amestec de cinci ori greutatea acesteia, constnd n cantiti egale de carbonat de potasiu i carbonat de sodiu. Se nclzete cu grij pn cnd amestecul este topit complet. Se rcete i se dizolv n acid clorhidric. 7.3. n cazul n care coninutul n magneziu al probei este ridicat, se precipit oxalatul de calciu a doua oar. IV. Determinarea carbonailor 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea cantitii de carbonai, exprimat convenional drept carbonat de calciu, din furaje. n unele cazuri, trebuie s fie utilizat o metod special (de exemplu, cu carbonat de fier). 2. Principiu Carbonaii trebuie descompui n acid clorhidric. Dioxidul de carbon eliberat trebuie colectat ntr-un tub gradat, iar volumul acestuia, comparat cu cel eliberat n aceleai condiii printr-o cantitate cunoscut de carbonat de calciu p.a. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric, d:1,10 3.2. Carbonat de calciu, p.a.

3.3. Acid sulfuric, aproximativ 0,1 N, colorat cu rou metil. 4. Aparatur Aparatur Scheibler-Dietrich (vezi diagrama) sau aparatura echivalent. 5. Procedura n conformitate cu coninutul n carbonai al probei, se cntrete o parte a probei aa cum se arat n continuare: - 0,5 g pentru produse ce conin de la 50% pn la 100% carbonai, exprimai ca i carbonat de calciu; - 1 g pentru produse ce conin de la 40% pn la 50% carbonai, exprimai ca i carbonat de calciu; - 2 pn la 3 g pentru alte produse. Se plaseaz poriunea probei ntr-un recipient special, prevzut la pct. 4 al aparaturii, echipat cu un tub mic din material indestructibil ce conine 10 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1 i se conecteaz recipientul la aparatur. Se deschide robinetul cu trei ci prevzut la pct. 5, astfel nct tubul (1) se conecteaz cu exteriorul. Se aduce nivelul lichidului pn la semnul zero, utilizndu-se tubul mobil (2) ce este umplut cu acid sulfuric colorat prevzut la pct. 3.3 i conectat la tubul gradat (1). Se deschide robinetul (5) pentru a se conecta tuburile (1) i (3) i se verific dac nivelul este la zero. Se d drumul lent la acid clorhidric prevzut la pct. 3.1 peste prob, aplecndu-se recipientul prevzut la pct. 4. Se egalizeaz presiunea coborndu-se tubul prevzut la pct. 2. Se agit recipientul prevzut la pct. 4 pn cnd se oprete complet eliberarea de dioxid de carbon. Se restaureaz presiunea aducndu-se lichidul din tuburile (1) i (2) napoi la acelai nivel. Se citete dup cteva minute, atunci cnd volumul de gaz a devenit constant. Se efectueaz un test de control n aceleai condiii pe 0,5 g de carbonat de calciu prevzut la pct. 3.2. 6. Calcularea rezultatelor Coninutul de carbonai n grame, exprimat drept carbonat de calciu, ca procent din prob, se calculeaz utiliznduse formula: [V x 100]/[T x 2M], unde: V = ml de CO2 eliberai din prob; T = ml de CO2 eliberai din 0,5 g de CaCO3 p.a.; M = masa, n grame, a prii din prob. 7. Observaii 7.1. Atunci cnd partea din prob cntrete mai mult de 2 g, se plaseaz mai nti 15 ml de ap distilat n recipientul prevzut la pct. 4 i se amestec nainte de a ncepe testarea. Se utilizeaz acelai volum de ap pentru testul de control. 7.2. Dac aparatura utilizat are un volum diferit de cel al aparatului Scheibler-Dietrich, prile prelevate din prob i din substana de control i calcularea rezultatelor trebuie s fie adaptate n consecin. Aparat Scheibler-Dietrich pentru determinarea CO2

Scara 1/8 (msurat n mm) VII. Determinarea clorului din cloruri 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea cantitii de clor din cloruri ce sunt solubile n ap, exprimate convenional drept clorur de sodiu. Aceast metod este aplicabil tuturor furajelor. 2. Principiu Clorurile trebuie dizolvate n ap. Dac produsul conine materie organic, se procedeaz la clarificare. Soluia trebuie uor acidifiat cu acid azotic, iar clorurile precipitate sub form de clorur de argint, prin intermediul unei soluii de azotat de argint. Azotatul de argint n exces trebuie titrat cu o soluie de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard. 3. Reactivi 3.1. Soluie de tiocianat de amoniu 0,1 N 3.2. Soluie de azotat de argint 0,1 N 3.3. Soluie saturat de sulfat feric de amoniu 3.4. Acid azotic, d:1,38 3.5. Eter dietilic p.a. 3.6 Aceton p.a. 3.7. Soluie Carrez I: se dizolv n ap 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2 2H2O i 3g de acid acetic glacial. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.8. Soluie Carrez II: se dizolv n ap 10,6 g de ferocianur de potasiu K4Fe(CN)6 x 3H2O. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.9. Carbon activ p.a., liber de cloruri i neabsorbant al acestora. 4. Aparatur Agitator: aproximativ 35 rpm pn la 40 rpm. 5. Procedur 5.1. Prepararea soluiei n funcie de natura probei, se prepar o soluie aa cum se arat la pct. 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3.

n acelai timp se efectueaz un test martor care omite proba ce trebuie analizat. 5.1.1. Probe libere de materie organic Se cntrete, cu o marj de mg, o prob de cel mult 10 g i care conine cel mult 3 g de clor sub form de cloruri. Se plaseaz mpreun cu 400 ml de ap ntr-un balon cotat de 500 ml, la aproximativ 20C. Se agit timp de 30 de minute n pahar, se aduce la volum, se omogenizeaz i se filtreaz. 5.1.2. Probe ce conin materie organic, excluznd produsele prevzute la pct. 5.1.3 Se cntresc aproximativ 5 g de prob cu o marj de mg i se plaseaz mpreun cu 1 g de carbon activ ntr-un balon cotat de 500 ml. Se adaug 400 ml de ap la aproximativ 20C i 5 ml de soluie Carrez I prevzut la pct. 3.7, se agit i apoi se adaug 5 ml de soluie Carrez II prevzut la pct. 3.8. Se agit timp de 30 de minute ntr-un pahar, se aduce la volum, se omogenizeaz i se filtreaz. 5.1.3. Furaje preparate, turte i fin de in, produse bogate n fin de in i alte produse bogate n mucilagii sau n substane coloidale (de exemplu, amidon dextrinat) Se prepar soluia aa cum s-a descris la pct. 5.1.2, dar nu se filtreaz. Se decanteaz (dac este necesar, se centrifugheaz), se rein 100 ml din lichidul supernatant i se transfer ntr-un balon cotat de 200 ml. Se amestec cu aceton prevzut la pct. 3.6 i se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizeaz i se filtreaz. 5.2. Titrare Utilizndu-se o pipet, se transfer ntr-un pahar Erlenmayer 25 pn la 100 ml din filtratul (n conformitate cu coninutul de clor presupus) obinut aa cum s-a descris n baza pct. 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3. Partea alicot nu trebuie s conin mai mult de 150 mg Cl. Dac este necesar, se dilueaz cu ap la cel puin 50 ml, se adaug 5 ml de acid azotic prevzut la pct. 3.4, 20 ml de soluie saturat de sulfat feric de amoniu prevzut la pct. 3.3 i dou picturi de soluie de tiocianat de amoniu prevzut la pct. 3.1, transferat prin intermediul unei biurete umplute pn la semnul zero. Utilizndu-se o biuret, se transfer soluia de azotat de argint prevzut la pct. 3.2, n aa fel nct este obinut un exces de 5 ml. Se adaug 5 ml de dietil eter prevzut la pct. 3.5 i se scutur puternic pentru a se coagula precipitatul. Se titreaz excesul de azotat de argint cu soluie de tiocianat de amoniu prevzut la pct. 3.1, pn cnd tenta roiebrun dureaz timp de un minut. 6. Calcularea rezultatelor Cantitatea de clor (m), exprimat drept clorur de sodiu, prezent n volumul de filtrat luat pentru titrare, se calculeaz utilizndu-se urmtoarea formul: M = 5,845 (V1-V2) mg, unde: V1 = ml de soluie de azotat de argint conc.1 N adugat; V2 = ml de soluie de tiocianat de amoniu 0,1 N utilizat pentru titrare. Dac testul martor indic faptul c soluia de azotat de argint 0,1 N a fost consumat, se scade aceast valoare din volumul (V1-V2). 7. Observaii 7.1. Titrarea poate fi, de asemenea, efectuat prin poteniometru. 7.2. n cazul produselor care sunt foarte bogate n uleiuri i grsimi, se realizeaz o prim degresare cu dietil eter sau petrol uor. 7.3. n cazul finii de pete, titrarea poate fi efectuat prin metoda Mohr.

VIII. Determinarea lactozei 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea nivelului de lactoz din furaje ce conin mai mult de 0,5% lactoz. 2. Principiu Zaharurile trebuie dizolvate n ap. Soluia trebuie supus fermentaiei cu Saccharomyces cerevisiae ce las lactoza intact. Dup precipitare i filtrare coninutul de lactoz al filtratului se determin prin metoda Luff-Schoorl. 3. Reactivi 3.1. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se introduc 25 g de drojdie proaspt n 100 ml de ap. Suspensia se va ine pentru o perioad maxim de o sptmn ntr-un frigider. 3.2. Soluie Carrez I: se dizolv n ap 21,9 g acetat de zinc Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g de acid acetic glacial. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.3. Soluie Carrez II: se dizolv n ap 10,6 g ferocianur de potasiu K4Fe(CN)6 x 3H2O. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.4. Reactiv Luff-Schoorl Se toarn soluia de acid citric prevzut la pct. 3.4.2 n soluia de carbonat de sodiu prevzut la pct. 3.4.2, agitndu-se cu grij. Se adaug soluia de sulfat de cupru prevzut la pct. 3.4.1 i se completeaz cu ap pn la un litru. Se las s se decanteze peste noapte i se filtreaz. Se controleaz normalitatea reactivului astfel obinut (Cu 0,1N; Na2CO3 2N). Ph-ul soluiei trebuie s fie de aproximativ 9,4. 3.4.1. Soluie de sulfat de cupru: se dizolv 25 g de sulfat de cupru p.a. CuSO4 5H2O, liber de fier, n 100 ml de ap. 3.4.2. Soluie de acid citric: se dizolv 50 g de acid citric p.a. C6H8O7 H2O n 50 ml de ap. 3.4.3. Soluia de carbonat de sodiu: se dizolv 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru p.a. n aproximativ 300 ml de ap cald. Se las s se rceasc. 3.5. Piatr ponce granulat, fiart n acid clorhidric, splat cu ap i uscat 3.6. 30% soluie de iodur de sodiu (m/v) 3.7. Acid sulfuric 6 N 3.8. Soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N 3.9. Soluie de amidon: se adaug ntr-un litru de ap fiart un amestec format din 5 g de amidon solubil i 30 ml de ap. Se fierbe timp de 3 minute, se las s se rceasc i, dac este necesar, se adaug 10 mg de iodur de mercur drept conservant. 4. Aparatur Baie de ap cu termostat fixat la 38-40C. 5. Procedur Se cntrete 1 g de prob cu o marj de mg i se plaseaz aceast poriune de prob ntr-un balon cotat de 100 ml. Se adaug 25 ml pn la 30 ml de ap. Se plaseaz balonul ntr-o baie de ap fierbinte, timp de 30 de minute i apoi se rcete la aproximativ 35C. Se adaug 5 ml de suspensie de drojdie prevzut la pct. 3.1 i se omogenizeaz. Se las balonul s stea timp de dou ore ntr-o baie de ap, la o temperatur de 38-40C. Se las s se rceasc pn la aproximativ 20C. Se adaug 2,5 ml de soluie Carrez I prevzut la pct. 3.2 i se agit timp de 30 de secunde, apoi se adaug 2,5 ml de soluie Carrez II prevzut la pct. 3.3 i se agit din nou timp de 30 de secunde. Se completeaz cu ap pn la 100 ml, se amestec i se filtreaz. Utilizndu-se o pipet, se reine o cantitate de filtrat ce nu depete 25 ml i

care conine de preferin 40 ml pn la 80 mg de lactoz i aceasta se transfer ntr-un pahar Erlenmeyer de 300 ml. Dac este necesar, se completeaz cu ap pn la 25 ml. Se efectueaz n acelai mod un test martor cu 5 ml de suspensie de drojdie prevzut la pct. 3.1. Coninutul de lactoz se determin n conformitate cu metoda Luff-Schoorl, dup cum urmeaz: se adaug exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl prevzut la pct. 3.4 i dou granule de piatr ponce prevzut la pct. 3.5. Se agit manual n timp ce se nclzete deasupra unei flcri libere, la nlime medie, i se aduce lichidul la fierbere n aproximativ dou minute. Se plaseaz imediat paharul Erlenmeyer pe o sit de azbest cu un orificiu de aproximativ 6 cm n diametru, sub care a fost aprins flacra. Flacra trebuie s fie reglat n aa fel nct numai baza paharului Erlenmeyer s fie nclzit. Se potrivete un condensator de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de 10 minute. Se rcete imediat n ap rece i dup aproximativ 5 minute se titreaz dup cum urmeaz: Se adaug 10 ml de soluie de iodur de potasiu prevzut la pct. 3.6 i imediat dup aceea (cu grij, datorit riscului de spumare abundent) se adaug 25 ml de acid sulfuric 6 N prevzut la pct. 3.7. Se titreaz cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N prevzut la pct. 3.8 pn cnd apare o culoare galben tears, se adaug amidon ca indicator, prevzut la pct. 3.9, i se completeaz titrarea. Se efectueaz aceeai titrare pe un amestec msurat cu acuratee de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl prevzut la pct. 3.4 i 25 ml de ap, dup care se adaug 10 ml de iodur de potasiu prevzut la pct. 3.6 i 25 ml de acid sulfuric 6 N, prevzut la pct. 3.7, fr fierbere. 6. Calcularea rezultatelor Utilizndu-se tabelul ataat, se stabilete cantitatea de lactoz, n mg, ce corespunde diferenei dintre rezultatele celor dou titrri, exprimat n ml de tiosulfat 0,1 N. Rezultatul se exprim procentual ca pri de lactoz anhidr. 7. Observaie Pentru produse ce conin mai mult de 40% zahr fermentabil, se utilizeaz mai mult de 5 ml de suspensie de drojdie prevzut la pct. 3.1. Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl ml de Na2S2O3 0,1 N, 2 minute de nclzire, 10 minute de fierbere
Na2S2O3 0,1 N Glucoz, fructoz, zaharuri invertite C6H12O6 Lactoz C12H22O11 Maltoz C12H22O11 Na2S2 0,1 N ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 mg 2.4 4.8 7.2 9.7 12.2 14.7 17.2 19.8 22.4 25.0 27.6 30.3 33.0 diferen 2.4 2.4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.6 2.6 2.6 2.6 2.7 2.7 2.7 mg 3.6 7.3 11.0 14.7 18.4 22.1 25.8 29.5 33.2 37.0 40.8 44.6 48.4 diferen 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 mg 3.9 7.8 11.7 15.6 19.6 23.5 27.5 31.5 35.5 39.5 43.5 47.5 51.6 diferen 3.9 3.9 3.9 4.0 3.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.1 4.1 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

35.7 38.5 41.3 44.2 47.1 50.0 53.0 56.0 59.1 62.2

2.8 2.8 2.9 2.9 2.9 3.0 3.0 3.1 3.1

52.2 56.0 59.9 63.8 67.7 71.7 75.7 79.8 83.9 88.0

3.8 3.9 3.9 3.9 4.0 4.0 4.1 4.1 4.1

55.7 59.8 63.9 68.0 72.2 76.5 80.9 85.4 90.0 94.6

4.1 4.1 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.6

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

IX. Determinarea potasiului 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea nivelului de potasiu din furaje. 2. Principiu Proba trebuie calcinat, iar cenua trebuie dizolvat n acid clorhidric. Coninutul n potasiu al soluiei se determin prin fotometrie cu flacr, n prezena clorurii de cesiu i a azotatului de aluminiu. Adugarea acestor substane elimin n mare msur interferena elementelor perturbatoare. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a., d:1,12 3.2. Clorur de cesiu p.a 3.3. Azotat de aluminiu Al (NO3)3 x 9H2O, reactiv cu scop general 3.4. Clorur de potasiu p.a., anhidr 3.5. Soluie-tampon: se dizolv n ap 50 g de clorur de cesiu prevzut la pct. 3.2 i 250 g de azotat de aluminiu prevzut la pct. 3.3, se completeaz pn la un litru cu ap i se omogenizeaz. Se depoziteaz n sticle de plastic. 3.6. Soluie standard de potasiu: se dizolv n ap 1,907 g de clorur de potasiu prevzut la pct. 3.4, se adaug 5 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1, se completeaz pn la un litru cu ap i se omogenizeaz. Se depoziteaz n sticle de plastic. 1 ml din aceast soluie conine 1,00 mg de potasiu. 4. Aparatur 4.1. Creuzete din platin, siliciu sau porelan, prevzute, dac este necesar, cu capace 4.2. Cuptor electric cu termostat 4.3. Flamfotometru 5. Procedur 5.1. Analiza probei Ca regul general, se cntresc 10 g din prob, cu o aproximaie de 10 mg, se plaseaz ntr-un creuzet i se calcineaz la 450C, timp de 3 ore. Dup rcire, se transfer cantitatea de cenu ntr-un balon cotat de 500 ml, utilizndu-se 250 pn la 300 ml de ap, i se adaug apoi 50 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1. Cnd a ncetat eliberarea de dioxid de carbon, se nclzete soluia i se menine la o temperatur de aproximativ 90C, timp de dou ore, agitndu-se ocazional. Dup rcire la temperatura camerei, se completeaz pn la semn, se agit i se filtreaz. Se transfer ntr-un balon cotat de 100 ml o parte alicot din filtratul ce conine un maxim de 1,0 mg

de potasiu, se adaug 10,0 ml soluie-tampon prevzut la pct. 3.5, se completeaz pn la semn cu ap i se omogenizeaz. n cazul unor niveluri mai mari de potasiu, se dilueaz soluia ce trebuie analizat n proporii potrivite nainte de a se aduga soluia-tampon. Tabelul de mai jos servete ca model pentru o prob de aproximativ 10 g.
Coninut presupus de potasiu din proba (% K) pn la 0.1 0.1 pn la 0.5 0.5 pn la 1.0 1.0 pn la 5.0 5.0 pn la 10.0 10.0 pn la 20.0 Factor de diluie 1:10 1:10 1:20 Parte alicot n ml soluie 50 10 5 10 5 5

Se msoar la flamfotometru, la o lungime de und de 768 nm. Se calculeaz rezultatul prin intermediul curbei de calibrare. 5.2. Curb de calibrare Se plaseaz exact 10 ml de soluie standard prevzut la pct. 3.6 ntr-un balon gradat de 250 ml, se completeaz pn la semn cu ap i se omogenizeaz. Se plaseaz n baloane gradate de 100 ml exact 5,10,15, 20 i 25 ml din aceast soluie, corespunznd respectiv la cantitile de potasiu de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 mg. Se completeaz seriile cu baloane martor ce nu conin soluie standard. Se adaug 10 ml de soluie-tampon prevzut la pct. 3.5 n fiecare balon, se completeaz cu ap pn la semn i se omogenizeaz. Se efectueaz msurtorile, aa cum s-a indicat la pct. 5.1. Curba de calibrare este n general liniar pn la concentraia de potasiu de 1 mg la 100 ml de soluie. 6. Calcularea rezultatelor Rezultatul se exprim procentual. 7. Observaii Soluia-tampon prevzut la pct. 3.5, pentru a se elimina interferena elementelor perturbatoare, se adaug doar dac se consider necesar. X. Determinarea sodiului 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea nivelului de sodiu din furaje. 2. Principiu Proba trebuie calcinat, iar cenua dizolvat n acid clorhidric. Coninutul n sodiu al soluiei se determin prin fotometrie cu flacr, n prezena clorurii de cesiu i a azotatului de aluminiu. Adiia acestor substane elimin n mare msur interferena elementelor perturbatoare. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a, d: 1.12 3.2. Clorur de cesiu p.a 3.3. Azotat de aluminiu Al (NO3)3 x 9H2O, reactiv cu scop general 3.4. Clorur de potasiu p.a. anhidr

3.5. Soluie-tampon: se dizolv 50 g de clorur de cesiu prevzut la pct. 3.2 i 250 g de azotat de aluminiu n ap prevzut la pct. 3.3, se completeaz cu ap pn la un litru i se omogenizeaz. Se depoziteaz n sticle de plastic. 3.6. Soluie standard de sodiu: se dizolv n ap 2,542 g de clorur de sodiu prevzut la pct. 3.4, se adaug 5 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1, se completeaz pn la un litru cu ap i se omogenizeaz. Se depoziteaz n sticle de plastic. 1 ml din aceast soluie conine 1,00 mg de sodiu. 4. Aparatur 4.1. Creuzete din platin, siliciu sau porelan pentru calcinare, prevzute, dac este necesar, cu capace 4.2. Cuptor electric cu termostat 4.3. Flamfotometru 5. Procedur 5.1. Analiza probei Ca regul general, se cntresc 10 g din prob, cu o aproximaie de 10 mg, se plaseaz ntr-un creuzet prevzut la pct. 4.1 i se calcineaz la 450C timp de 3 ore. Se evit supranclzirea (aprinderea). Dup rcire se transfer cantitatea de cenu ntr-un balon cotat de 500 ml, utilizndu-se 250 ml pn la 300 ml de ap i se adaug apoi 50 ml de acid clorhidric prevzut la pct. 3.1. Cnd a ncetat toat eliberarea de dioxid de carbon, se nclzete soluia i se menine temperatura la aproximativ 90C, timp de dou ore, agitndu-se din cnd n cnd. Dup rcire la temperatura camerei, se completeaz cu ap pn la semn, se agit i se filtreaz. Se transfer ntr-un balon cotat de 100 ml o parte alicot din filtrat ce conine un maxim de 1,0 mg de potasiu, se adaug 10,0 ml de soluie-tampon prevzut la pct. 3.5, se completeaz cu ap pn la semn i se omogenizeaz. n cazul unor niveluri mai mari de sodiu, se dilueaz soluia ce trebuie analizat n proporii potrivite, nainte de a se aduga soluia-tampon. Tabelul de mai jos servete ca model pentru o prob de aproximativ 10 g.
Coninut presupus de sodiu din proba (% Na) pn la 0.1 0.1 pn la 0.5 0.5 pn la 1.0 1.0 pn la 5.0 5.0 pn la 10.0 10.0 pn la 20.0 Factor de diluie 1:10 1:10 1:20 Parte alicot n ml soluie 50 10 5 10 5 5

Se msoar la flamfotometru o lungime de und de 589 nm. Se calculeaz rezultatul prin intermediul curbei de calibrare. 5.2. Curb de calibrare Se plaseaz exact 10 ml de soluie standard prevzut la pct. 3.6 ntr-un balon gradat de 250 ml, se completeaz cu ap pn la semn i se omogenizeaz. Se plaseaz n baloane gradate de 100 ml exact 5, 10, 15, 20 i 25 ml din aceast soluie, corespunznd respectiv la cantiti de sodiu de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 mg. Se completeaz seriile cu baloane martor ce nu conin soluie standard. Se adaug 10 ml de soluie-tampon prevzut la pct. 3.5 n fiecare balon, se completeaz cu ap pn la semn i se omogenizeaz. Se efectueaz msurtori, aa cum s-a indicat la pct. 5.1. Curba de calibrare este n general liniar pn la concentraia de sodiu de 1 mg la 100 ml de soluie. 6. Calcularea rezultatelor Rezultatul se exprim procentual. 7. Observaii

7.1. Pentru produse ce conin mai mult de 4% sodiu este preferabil s se calcineze substana timp de dou ore ntrun creuzet cu capac. Dup rcire se adaug ap, se aduce cenua n suspensie prin intermediul unui fir de platin, se usuc i se calcineaz din nou, timp de dou ore, ntr-un creuzet cu capac. 7.2. Dac proba const numai din substane minerale, se dizolv fr o calcinare prealabil. XI. Determinarea zahrului 1. Scop i domeniu de aplicare Aceast metod se utilizeaz pentru determinarea cantitii de zaharuri reductoare i toate zaharurile dup invertire, exprimat ca glucoz sau, cnd este cazul, ca sucroz, convertit prin factorul 0,95. Aceast metod se aplic furajelor combinate. Pentru alte furaje sunt prevzute metode speciale. Cnd este necesar, trebuie s fie msurat separat lactoza i trebuie s se in cont de aceasta atunci cnd se calculeaz rezultatele. 2. Principiu Zaharurile trebuie extrase cu etanol diluat. Soluia trebuie clarificat cu soluiile Carrez I i II. Dup eliminarea etanolului, cantitile dinainte i dup invertire se determin prin metoda Luff-Schoorl. 3. Reactivi 3.1. Etanol 40% (v/v) d: 0,948 la 20C, neutralizat cu fenolftalein 3.2. Soluie Carrez I: se dizolv 21,9 g de acetat de zinc Zn (CH3COO)2 x 2H2O i 3 g de acid acetic glacial n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.3. Soluie Carrez II: se dizolv 10,6 g de ferocianur de potasiu K4Fe(CN)6 x 3H2O n ap. Se completeaz cu ap pn la 100 ml. 3.4. Soluie 0,1% (m/v) de metil oranj 3.5. Acid clorhidric 4 N 3.6. Acid clorhidric 0,1 N 3.7. Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 N. 3.8. Reactiv Luff-Schoorl Amestecndu-se cu atenie, se toarn soluie de acid citric prevzut la pct. 3.8.2 n soluia de carbonat de sodiu prevzut la pct. 3.8.3. Se adaug soluie de sulfat de cupru prevzut la pct. 3.8.1 i se completeaz pn la un litru cu ap. Se las s se decanteze peste noapte i se filtreaz. Se controleaz normalitatea reactivului astfel obinut (Cu 0,1 N; Na2CO3 2 N). Ph-ul soluiei trebuie s fie de aproximativ 9,4. 3.8.1. Soluie de sulfat de cupru: se dizolv 25 g de sulfat de cupru p.a. CuSO4 x 5H2O, liber de fier, n 100 ml de ap. 3.8.2. Soluie de acid citric: se dizolv 50 g de acid citric p.a., C6H8O7 x H2O n 50 ml de ap. 3.8.3. Soluie de carbonat de sodiu: se dizolv 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru p.a. n aproximativ 300 ml de ap fierbinte. Se las s se rceasc. 3.9. Soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N 3.10. Soluie de amidon: se adaug un amestec de 5 g de amidon solubil n 30 ml de ap, la un litru de ap fierbinte. Se fierbe timp de 3 minute, se las s se rceasc i, dac este necesar, se adaug 10 mg de iodur de mercur drept conservant. 3.11. Acid sulfuric 6 N 3.12. Soluie 30% (m/v) de iodur de potasiu. 3.13. Piatr ponce granulat, fiart n acid clorhidric, splat n ap i uscat 3.14. 3-metilbutan-1-ol. 4. Aparatur

Agitator: aproximativ 35 pn la 40 rpm. 5. Procedur 5.1. Extracia probei Se cntresc 2,5 g din prob cu o marj de mg i se plaseaz ntr-un balon cotat de 250 ml. Se adaug 200 ml de etanol prevzut la pct. 3.1 i se amestec ntr-un pahar timp de o or. Se adaug 5 ml de soluie Carrez I prevzut la pct. 3.2 i se agit timp de un minut. Se adaug 5 ml de soluie Carrez II prevzut la pct. 3.3 i se agit din nou timp de 1 minut. Se completeaz la volum cu etanol prevzut la pct. 3.1, se omogenizeaz i se filtreaz. Se rein 200 ml din filtrat i se evapor la aproximativ jumtate din volum, pentru a se elimina majoritatea etanolului. Se transfer ntreaga cantitate din reziduul de evaporare ntr-un balon volumetric de 200 ml, utilizndu-se ap cald, se rcete, se aduce la volum cu ap, se omogenizeaz i se filtreaz, dac este necesar. Aceast soluie va fi utilizat pentru a se determina cantitatea de zaharuri reductoare i dup invertire, a zaharurilor totale. 5.2. Determinarea zaharurilor reductoare Utilizndu-se o pipet, se iau cel mult 25 ml de soluie ce conine mai puin de 60 mg de zaharuri reductoare, exprimate ca glucoz. Dac este necesar, se completeaz pn la 25 ml cu ap distilat i se determin coninutul de zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent al glucozei din prob. 5.3. Determinarea zaharurilor totale dup invertire Utilizndu-se o pipet, se iau 50 ml de soluie i se transfer ntr-un balon cotat de 100 ml. Se adaug cteva picturi de soluie de metil oranj prevzut la pct. 3.4, apoi, cu grij i agitndu-se continuu, se adaug acid clorhidric 4 N prevzut la pct. 3.5, pn cnd lichidul devine un rou accentuat. Se adaug 15 ml de acid clorhidric 0,1 N prevzut la pct. 3.6, se imerseaz balonul ntr-o baie de ap fierbinte i se ine acolo timp de 30 de minute. Se rcete rapid pn la aproximativ 20C i se adaug 15 ml de soluie de hidroxid de sodiu 0,1 N prevzut la pct. 3.7. Se completeaz cu ap pn la 100 ml i se omogenizeaz. Se rein cel mult 25 ml ce conin mai puin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoz. Dac este necesar, se completeaz pn la 25 ml cu ap distilat i se determin coninutul de zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent de glucoz sau, unde este cazul, sucroz, multiplicndu-se cu factorul 0,95. 5.4. Titrare prin metoda Luff-Schoorl Utilizndu-se o pipet, se iau 25 ml de reactiv Luff-Schoorl prevzut la pct. 3.8 i se transfer ntr-un pahar Erlenmeyer de 300 ml. Se adaug 25 ml din soluia clarificat de zahr. Se adaug 2 granule de piatr ponce prevzut la pct. 3.13, se nclzete, se agit manual deasupra unei flcri libere la nlime medie i se aduce lichidul la fierbere n aproximativ dou minute. Se plaseaz imediat balonul Erlenmeyer pe o sit de azbest, cu un orificiu de aproximativ 6 cm n diametru, sub care a fost aprins o flacr. Flacra va fi reglat astfel nct numai baza paharului Erlenmeyer s fie nclzit. Se ataeaz un condensator de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de exact 10 minute. Se rcete imediat n ap rece, iar dup aproximativ 5 minute se titreaz dup cum urmeaz: Se adaug 10 ml soluie de iodur de potasiu prevzut la pct. 3.12 i imediat dup aceea (cu grij, datorit riscului de spumare abundent) se adaug 25 ml de acid sulfuric 6 N prevzut la pct. 3.11. Se titreaz cu o soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N prevzut la pct. 3.9 pn cnd apare o culoare galben tears, se adaug indicatorul de amidon prevzut la pct. 3.10 i se completeaz titrarea. Se efectueaz aceeai titrare pe un amestec msurat cu acuratee de 25 ml de reactiv Luff -Schoorl prevzut la pct. 3.8 i 25 ml de ap, dup ce se adaug 10 ml de soluie de iodur de potasiu prevzut la pct. 3.12 i 25 ml de acid sulfuric 6 N prevzut la pct. 3.11, fr fierbere. 6. Calcularea rezultatelor Utilizndu-se tabelul 2 se stabilete cantitatea de glucoz n mg ce corespunde diferenei dintre valorile celor dou titrri, exprimat n mg de tiosulfat de sodiu 0,1 N. Rezultatul se exprim procentual.

7. Proceduri speciale 7.1. n cazul furajelor ce sunt bogate n melas i al altor furaje ce nu sunt n particular omogene, se cntresc 20 g i se adaug mpreun cu 500 ml de ap ntr-un balon cotat de un litru. Se agit timp de o or. Se clarific utilizndu-se reactivul Carrez I prevzut la pct. 3.2 i reactivul Carrez II prevzut la pct. 3.3, aa cum s -a descris la pct. 5.1, utilizndu-se totui, de data aceasta, de patru ori cantitile din fiecare reactiv. Se aduce la volum cu etanol 80% (v/v). Se omogenizeaz i se filtreaz. Se elimin etanolul, aa cum s -a descris la pct. 5.1. Dac nu exist amidon dextrinizat, se aduce la volum cu ap distilat. 7.2. n cazul melasei i al furajelor simple ce sunt bogate n zahr i aproape libere de amidon (rocove, brichete de sfecl etc.), se cntresc 5 g, se plaseaz ntr-un balon cotat de 250 ml, se adaug 200 ml de ap distilat i se agit, timp de o or sau mai mult, dac este necesar. Se clarific utilizndu-se reactivul Carrez I prevzut la pct. 3.2 i reactivul Carrez II prevzut la pct. 3.3, aa cum s-a descris la pct. 5.1. Se aduce la volum cu ap rece, se omogenizeaz i se filtreaz. Se continu aa cum s-a descris la pct. 5.3, pentru a se determina cantitatea de zaharuri totale. 8. Observaii 8.1. Pentru a se preveni spumarea este recomandabil s se adauge (indiferent de volum) aproximativ 1 ml de 3metilbutan-1-ol prevzut la pct. 3.14 nainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl. 8.2. Diferena dintre coninutul zaharurilor totale dup invertire, exprimat ca glucoz, i coninutul de zaharuri reductoare, exprimat ca glucoz, multiplicat cu 0,95, reflect coninutul procentual de sucroz. 8.3. Pentru a se determina coninutul de zaharuri reductoare, excluznd lactoza, pot fi adoptate dou metode: 8.3.1. Pentru o calculare aproximativ, se multiplic cu 0,675 coninutul de lactoz stabilit printr-o metod diferit de analiz i se scade rezultatul obinut din coninutul zaharurilor reductoare. 8.3.2. Pentru o calculare precis a zaharurilor reductoare, excluznd lactoza, aceeai prob trebuie s fie utilizat pentru cele dou determinri finale. Una dintre analize este efectuat pe o parte din soluia obinut la pct. 5.1, cealalt pe partea soluiei obinute n timpul determinrii lactozei de metoda stabilit pentru acel scop (dup fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri i clarificare). n ambele cazuri cantitatea de zahr prezent se determin prin metoda Luff-Schoorl i se calculeaz n mg de glucoz. Una dintre valori trebuie sczut din cealalt, iar diferena se exprim procentual. Exemplu: Cele dou volume preluate corespund, pentru fiecare determinare, unei probe de 250 mg. n primul caz sunt consumai 17 ml de soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N, corespunznd la 44,2 mg de glucoz. n al doilea caz sunt consumai 11 ml de soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N, corespunznd la 27,6 mg de glucoz. Diferena este de 16,6 mg de glucoz. Coninutul de zaharuri reductoare (excluznd lactoza), calculat ca glucoz, este, de aceea: % Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl ml de Na2S2O3 0,1 N, 2 minute de nclzire, 10 minute de fierbere

Tabelul 2

Na2S2O3 0,1 N Glucoz, fructoz, zaharuri invertite C6H12O6 Lactoz C12H22O11 Maltoz C12H22O11 Na2S2O3 0,1 N ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 mg 2.4 4.8 7.2 9.7 12.2 14.7 17.2 19.8 22.4 25.0 27.6 30.3 33.0 35.7 38.5 41.3 44.2 47.1 50.0 53.0 56.0 59.1 62.2 diferen 2.4 2.4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.6 2.6 2.6 2.6 2.7 2.7 2.7 2.8 2.8 2.9 2.9 2.9 3.0 3.0 3.1 3.1 mg 3.6 7.3 11.0 14.7 18.4 22.1 25.8 29.5 33.2 37.0 40.8 44.6 48.4 52.2 56.0 59.9 63.8 67.7 71.7 75.7 79.8 83.9 88.0 diferen 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.9 3.9 3.9 4.0 4.0 4.1 4.1 4.1 mg 3.9 7.8 11.7 15.6 19.6 23.5 27.5 31.5 35.5 39.5 43.5 47.5 51.6 55.7 59.8 63.9 68.0 72.2 76.5 80.9 85.4 90.0 94.6 diferen 3.9 3.9 3.9 4.0 3.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.6 ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Determinarea vitaminei A (retinol) 1. Scop i domeniu Aceast metod se folosete pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje i premixuri. Vitamina A include toi compuii alcool trans-retinol i izomerii cis. Coninutul de vitamina A este exprimat n uniti internaionale (UI)/kg. O unitate internaional corespunde activitii a 0,300 g a tuturor compuilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 g a tuturor compuilor acetai trans ai vitaminei A ori 0,550 g a tuturor compuilor palmitai trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg. 2. Principiul metodei Proba este hidrolizat cu soluie etanolic de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extras n eter de petrol. Solventul este nlturat prin evaporare, iar reziduul este diluat n metanol i, dac este necesar, diluat pn la

concentraia necesar. Coninutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de nalt performan cu faz invers (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescent. Parametrii cromatografici sunt alei astfel nct s nu existe nicio diferen ntre toi compuii alcoolici trans ai vitaminei A i izomerii cis. 3. Reactivi: 3.1. Etanol, c = 96%, anhidru 3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60C 3.3. Metanol 3.4. Soluie de hidroxid de potasiu, beta = 50 g/100 ml 3.5. Soluia de ascorbat de sodiu, beta = 10 g/100 ml (a se vedea observaiile de la pct. 7.7) 3.6. Sulfit de sodiu, Na2S x H2O (x = 7-9) 3.6.1. Soluie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l n glicerol, beta = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaiile de la pct. 7.8) 3.7. Soluie de fenoftalein, beta = 2 g/100 ml n etanol (pct. 3.1) 3.8. 2-Propanol 3.9. Faza mobil pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) i ap, de exemplu 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite. 3.10. Azot, liber de oxigen 3.11. Acetat de vitamina A trans total, extrapur, cu activitate certificat, de exemplu 2,80 x 106 UI/g 3.11.1. Soluie stoc din vitamina A acetat trans total: se cntresc, cu aproximaie de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A (pct. 3.11) ntr-un balon cotat de 100 ml. Se dizolv n 2-propanol (pct. 3.8) i se completeaz pn la semn cu acelai solvent. Concentraia nominal a acestei soluii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Coninutul exact trebuie determinat n conformitate cu pct. 5.6.3.1. 3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificat, de exemplu 1,80 x 106 UI/g 3.12.1. Soluie stoc din retinol palmitat trans total: se cntresc, cu aproximaie de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) ntr-un balon cotat de 100 ml. Se dizolv n 2-propanol (pct. 3.8) i se completeaz pn la semn cu acelai solvent. Concentraia nominal a acestei soluii este de 1.400 UI vitamina A/ml. Coninutul exact trebuie determinat n conformitate cu pct. 5.6.3.2. 3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaiile de la pct. 7.5). 4. Aparatur: 4.1. Evaporator rotativ cu vacuum 4.2. Sticlrie brun 4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu lif 4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gt ngust, cu capacitate de 10, 25, 100 i 500 ml 4.2.3. Plnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticl 4.2.4. Baloane piriforme din sticl de 250 ml cu lif 4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legtur din sticl, cu adaptator pentru o pip de aprovizionare cu gaz 4.4. Hrtie de filtru pentru separarea fazic, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY1/2 sau similar) 4.5. Lichid cromatografie de nalt presiune (echipament HPLC cu sistem de injecie) 4.5.1. Coloan de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C18, de 5 sau 10 m sau echivalent (criteriu de performan: doar un singur peak pentru toi izomerii retinolului n baza condiiilor HPLC) 4.5.2. Detector UV sau de fluorescent, cu ajustare variabil a lungimii de und 4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuar de 10 mm 4.7. Baie de ap cu agitator magnetic

4.8. Aparat de extracie ce const din: 4.8.1. Cilindru de sticl cu capacitate de 1 l, echipat cu gt i dop rodat; 4.8.2. Muf rodat, echipat cu un bra exterior i un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie s aib un capt n form de U n partea de jos i o parte efilat la partea opus, astfel nct stratul superior de lichid din cilindru s poat fi transferat ntr-un tub de separare. 5. Procedur NOT: Vitamina A este sensibil la lumin (UV) i oxidare. Toate operaiunile trebuie efectuate n absena luminii (folosindu-se sticlrie brun sau sticlrie protejat cu folie de aluminiu) i a oxigenului (a se purja cu azot). n timpul extraciei aerul de deasupra lichidului trebuie nlocuit cu azot (evitai presiunea n exces prin lrgirea dopului din cnd n cnd). 5.1. Pregtirea probei Se mrunete proba astfel nct s treac printr-o sit cu ochiuri de 1 mm, avndu-se grij s se evite generarea de cldur. Mrunirea trebuie efectuat imediat nainte de cntrire i saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A. 5.2. Saponificarea n funcie de coninutul de vitamina A, se cntresc, cu aproximaie de 0,01 g, 2 pn la 25 g din prob, ntr-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaug n continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml soluie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) i 2 ml soluie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potrivete un condensator (pct. 4.3) la balon i se scufund balonul ntr-o baie de ap cu agitator magnetic (pct. 4.7). Se nclzete pn la fierbere i se las la reflux timp de 5 minute. Se adaug apoi 25 ml soluie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) i se las la reflux timp de 25 de minute, agitndu -se sub un flux uor de azot. Apoi se cltete condensatorul cu aproximativ 20 ml ap i se rcete coninutul balonului la temperatura camerei. 5.3. Extracie Se transfer prin decantare ntreaga soluie saponificat, prin cltire cu un volum total de 250 ml ap ntr -o plnie de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3) sau n aparatul de extracie (pct. 4.8). Se cltete balonul de saponificare n continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) i 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) i se transfer soluiile de cltire n plnia de separare sau n aparatul de extracie. Proporia de ap i etanol n soluiile combinate ar trebui s fie de 2:1. Se agit viguros timp de dou minute i se las s se sedimenteze timp de dou minute. 5.3.1. Extracie folosind un tub de separare (pct. 4.2.3) Cnd straturile de lichid s-au separat (a se vedea observaia de la pct. 7.3), se transfer stratul de eter de petrol ntr o alt plnie de separare (pct. 4.2.3). Se repet aceast extracie de dou ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) i de dou ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spal extractele combinate n plnia de separare, de dou ori, prin amestecare uoar - pentru a se evita formarea emulsiilor - cu cantiti de 100 ml ap i dup agitare repetat alte cantiti de 100 ml ap, pn cnd apa rmne incolor la adugarea soluiei de fenoftalein (pct. 3.7) - splarea de patru ori este suficient. Se filtreaz extractul splat printr-un filtru de hrtie pentru separare fazic (pct. 4.4), pentru a se nltura orice cantitate de ap n suspensie, ntr-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spal plnia de separare i filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pn la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) i se amestec bine. 5.3.2. Extracie folosind un aparat de extracie (pct. 4.8) Cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la pct. 7.3), se nlocuiete dopul cilindrului de sticl (pct. 4.8.1) prin inserie din sticl mat (pct. 4.8.2) i se aranjeaz captul de mai jos n form de U al tubului ajustabil, astfel nct s se afle deasupra nivelului interfeei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin braul exterior, se transfer stratul superior de eter de petrol ntr-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaug

100 ml eter de petrol (pct. 3.2) n cilindrul de sticl (al aparatului), se ataeaz dopul i se agit bine. Se las straturile s se separe i se transfer stratul de deasupra n tubul de separare, la fel ca nainte. Se repet procedura extraciei cu nc 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de dou ori cu cantiti de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) i se adaug straturile de eter de petrol n tubul de separare. Se spal extractele combinate din eter de petrol, dup cum este descris la pct. 5.3.1, i se procedeaz dup cum este descris la acel punct. 5.4. Prepararea soluiei prob pentru HPLC Se pipeteaz o cantitate alicot din soluia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) ntr-un balon n form de par de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapor solventul pn aproape de sec, la evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redus, la o temperatur a bii de ap ce nu depete 40C. Se restabilete presiunea atmosferic prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) i se ndeprteaz balonul de pe evaporatorul rotativ. Se nltur solventul rmas n curent de azot (pct. 3.10) i se dizolv imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraia de vitamina A trebuie s fie ntre 5 UI/ml i 30 UI/ml). 5.5. Efectuarea determinrii prin HPLC Vitamina A este separat pe o coloan C18 cu faz invers (pct. 4.5.1), iar concentraia este msurat printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescent (excitaie: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteaz o cantitate alicot (de exemplu 20 l) de soluie metanolic obinut conform pct. 5.4 i se elueaz cu faza mobil (pct. 3.9). Se calculeaz media peak-urilor nlimii mai multor injecii din aceeai soluie de prob i media peak-urilor nlimii mai multor injecii ale soluiilor de calibrare (pct. 5.6.2). Condiii de separare HPLC Sunt oferite urmtoarele condiii pentru instruire; pot fi folosite alte condiii, cu obligaia ca acestea s ofere rezultate echivalente. Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C18 de 5 sau 10 m ori echivalent Faza mobil (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) i ap, de exemplu 980 + 20 (v + v) Rata de curgere: 1-2 ml/min. Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescent (excitaie: 325 nm/emisie: 475 nm) 5.6. Calibrare 5.6.1. Prepararea soluiilor standard de lucru Se pipeteaz 20 ml soluie stoc de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml soluie stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) ntr-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) i se hidrolizeaz dup cum este descris la pct. 5.2, dar fr a se aduga BHT. Se aplic apoi extracia cu eter de petrol (pct. 3.2) n conformitate cu pct. 5.3 i se completeaz pn la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapor 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pn aproape de sec, se nltur solventul rmas cu un curent de azot (pct. 3.10) i se redizolv reziduul n 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraia nominal a acestei soluii este 560 UI vitamina A/ml. Coninutul exact trebuie determinat n conformitate cu pct. 5.6.3.3. Soluia standard de lucru trebuie preparat proaspt, nainte de folosire. Se pipeteaz 2,0 ml din aceast soluie standard de lucru, ntr-un balon cotat de 20 ml, se completeaz cu metanol pn la semn (pct. 3.3) i se amestec. Concentraia nominal a acestei soluii standard de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A/ml. 5.6.2. Prepararea soluiilor de calibrare i a graficului de calibrare: se transfer 1,0; 2,0; 5,0 i 10,0 ml din soluia standard de lucru, diluat ntr-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol (pct. 3.3) i se amestec. Concentraiile nominale ale acestor soluii sunt 2,8; 5,6; 14,0 i 28,6 UI de vitamina A/ml. Se injecteaz 20 l din fiecare soluie de calibrare de mai multe ori i se determin media nlimilor peack -urilor. Folosindu-se media nlimilor peack-urilor, se ntocmete o curb de calibrare, lundu-se n considerare rezultatele obinute n UV (pct. 5.6.3.3). 5.6.3. Standardizarea UV a soluiilor standard

5.6.3.1. Soluie stoc acetat de vitamina A Se pipeteaz 2,0 ml din soluia stoc acetat de vitamina A (pct. 3.11.1) ntr-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) i se completeaz pn la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraia nominal a acestei soluii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteaz 3,0 ml din aceast soluie de acetat de vitamina A ntr-un balon cotat de 25 ml i se completeaz pn la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraia nominal a acestei soluii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se msoar spectrul UV al acestei soluii fa de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de und ntre 300 nm i 400 nm. Extincia maxim trebuie s fie ntre 325 nm i 327 nm. Calcularea coninutului de vitamina A: UI vitamina A/ml = E326 x 19,0 1% (E pentru vitamina A acetat = 1.530 la 326 nm n 2-propanol) 1 cm 5.6.3.2. Palmitatul de vitamina A soluia stoc Se pipeteaz 2,0 ml de vitamina A palmitat din soluia stoc (pct. 3.12.1) ntr-un balon cotat de 50 ml (4.2.2) si se completeaz pn la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraia nominal a acestei soluii este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipeteaz 3,0 ml din aceast soluie diluat de vitamina A palmitat ntr-un balon cotat de 25 ml i se completeaz pn la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentraia nominal a acestei soluii este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se msoar spectrul UV al acestei soluii fa 2-propanolului (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) fixat la o lungime de und ntre 300 nm si 400 nm. Extincia maxim trebuie s fie ntre 325 nm si 327 nm. Calcularea coninutului de vitamina A: UI vitamina A/ml = E326 x 19,0 1% (E pentru vitamina A palmitat = 1.530 la 326 nm n 2-propanol) 1 cm 5.6.3.3. Vitamina A = Soluie standard de lucru. Se pipeteaz 3,0 ml din soluia standard de vitamina A nediluat, preparat n conformitate cu pct. 5.6.1, ntr-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) i se completeaz pn la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipeteaz 5 ml din aceast soluie ntr-un balon cotat de 25 ml i se aduce la semn cu 2propanol (pct. 3.8). Concentraia nominal a acestei soluii este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se msoar spectrul acestei soluii fa de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) la lungime de und ntre 300 nm i 400 nm. Extincia maxim trebuie s fie ntre 325 nm i 327 nm. Calcularea coninutului n vitamina A: UI vitamina A/ml = E325 x 18,3 1% (E pentru retinol = 1.821 la 325 nm n 2-propanol) 1 cm 6. Calcularea rezultatelor Pornindu-se de la nlimea medie a peak-urilor de vitamina A a soluiei de prob, se determin concentraia soluiei de prob n UI/ml, prin referire fa de curba de calibrare (pct. 5.6.2). Coninutul w de vitamina A n UI/kg al probei este dat de urmtoarea formul: x1.000 [UI/kg] n care: beta = concentraia de vitamina A din soluia de prob (pct. 5.4) la UI/ml;

V1 = volumul soluiei de prob (pct. 5.4), n ml; V2 = volumul cantitii alicote luate conform pct. 5.4, n ml; m = masa de prob luat n lucru, n g. 7. Observaii 7.1. Pentru probe cu concentraie redus de vitamina A poate fi util s se combine extractele de eter de petrol din dou ncrcturi de saponificare (cantitate cntrit = 25 g) ntr-o soluie de prob pentru determinare HPLC. 7.2. Cantitatea probei utilizate pentru analiz nu ar trebui s conin mai mult de 2 g grsime. 7.3. Dac separarea fazic nu are loc, adugai aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a ntrerupe emulsia. 7.4. Pentru ulei din ficat de cod i alte grsimi pure timpul de saponificare trebuie s fie extins la 45-60 de minute. 7.5. Poate fi folosit hidrochinon n loc de BHT. 7.6. Folosindu-se o coloan fazic normal, este posibil separarea de izomeri de retinol. 7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic n loc de soluie de ascorbat de sodiu. 7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA n loc de soluia de sulfit de sodiu. 8. Repetabilitate Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele, efectuate pe aceeai prob, nu trebuie s depeasc 15%, valoare relativ fa de cel mai mare rezultat. 9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*) PremixFuraj cu premix Concentrat mineral Furaj proteic Purcel L 13 12 13 12 13 n 48 45 47 46 49 medie [UI/kg] s(r) [UI/kg] r [UI/kg] CV(r) [%] s(R) [UI/kg] R [UI/kg] 17,02 x1,21 106 x 106 0,51 x 10 0,039 x 10 1,43 x 10 0,109 x 10 3,0 3,5
6 6 6 6 6 6

537.100 22.080 61.824 4,1 46.300 129.640

151.800 12.280 34.384 8,1 23.060 64.568

18.070 682 1.910 3,8 3.614 10.119

1,36 x 10 0,069 x 10

6 3,81 x 10 0,193 x 106

CV(R) [%] 8,0 6,2 8,6 15 20 L: numr de laboratoare n: numr de valori singulare S(r): deviaia standard a repetabilitii s(R): deviaia standard a reproductibilitii r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variaie al repetabilitii CV(R): coeficient de variaie al reproductibilitii *) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)

Aparatul de extracie (4.8) PARTEA B:Determinarea vitaminei E (tocoferol) 1. Scop i domeniu Aceast metod se folosete pentru determinarea vitaminei E din furaje i premixuri. Coninutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E). Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg. 2. Principiu Proba este hidrolizat cu soluie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extras n eter de petrol. Solventul este nlturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat n metanol i, dac este necesar, diluat pn la concentraia necesar. Coninutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de nalt performan cu faz inversat (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescent sau UV. 3. Reactivi 3.1. Etanol, c = 96% 3.2. Eter de petrol, fracia 40C - 60C 3.3. Metanol 3.4. Soluie de hidroxid de potasiu, beta = 50 g/100 ml 3.5. Soluie de ascorbat de sodiu, beta = 10 g/100 ml (a se vedea observaiile de la pct. 7.7) 3.6. Sulfit de sodiu, Na2S x H2O (x = 7-9) 3.6.1. Soluie de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l n glicerol, beta = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaiile de la pct. 7.8) 3.7. Soluie de fenolftalein, beta = 2 g/100 ml n etanol (pct. 3.1) 3.8. Faza mobil pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) i ap, de exemplu: 980 + 20 (v + v). Raportul exact trebuie s fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite. 3.9. Azot liber de oxigen 3.10. DL-alfa-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificat

3.10.1. Soluie stoc din DL-alfa-acetat de tocoferol: se cntresc, cu aproximaie de 0,1 mg, 100 mg DL-alfa-acetat de tocoferol (pct. 3.10) ntr-un balon cotat de 100 ml. Se dizolv n etanol (pct. 3.1) i se completeaz pn la semn cu acelai solvent. Astfel, 1 ml din aceast soluie conine 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaiile de la pct. 7.4) 3.11. DL-alfa-tocoferol, extrapur, cu activitate certificat 3.11.1. Se cntresc, cu aproximaie de 0,1 mg, 100 mg de DL-alfa-tocoferol (pct. 3.10) ntr-un balon gradat de 100 ml. Se dizolv n etanol (pct. 3.1) i se completeaz pn la semn cu acelai solvent. Astfel, 1 ml din aceast soluie conine 1 mg DL-alfa-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observaiile de la pct. 7.4). 3.12. 2,6 di-ter-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observaiile de la pct. 7.5). 4. Aparatur: 4.1. Evaporator rotativ cu vacuum 4.2. Sticlrie brun 4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif 4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gt strmt, cu capacitate de 10, 25, 100 i 500 ml 4.2.3. Plnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticl 4.2.4. Baloane piriforme din sticl de 250 ml cu gt rodat 4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legtur din sticl, cu adaptator pentru o pip de aprovizionare cu gaz 4.4. Hrtie de filtru pentru separare fazic, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY sau similar). 4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecie 4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C18, de 5 ori 10 m sau echivalent 4.5.2. Detector UV sau de fluorescent, cu ajustare variabil a lungimii de und 4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuar de 10 mm 4.7. Baie de ap cu agitator magnetic 4.8. Aparat de extracie constnd n: 4.8.1. Cilindru de sticl, de capacitate de 1 l, cruia i se pun un gt i dop de sticl 4.8.2. Muf din sticl mat, echipat cu un bra exterior i cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie s aib un capt n form de U situat n partea de jos i un capt efilat la partea opus, astfel nct stratul superior de lichid din cilindru s poat fi transferat ntr-o plnie de separare. 5. Procedur NOT: Vitamina E este sensibil la lumin (UV) i oxidare. Toate operaiunile trebuie efectuate n absena luminii (folosindu-se sticlrie brun sau sticlrie protejat cu folie de aluminiu) i a oxigenului (a se spla cu azot). n timpul extraciei, aerul de deasupra lichidului trebuie nlocuit de azot (a se evita presiunea prin lrgirea dopu lui din cnd n cnd). 5.1. Pregtirea probei: se mrunete proba astfel nct s treac printr-o sit cu ochiuri de 1 mm, avndu-se grij s se evite generarea de cldur. Mrunirea trebuie efectuat imediat nainte de cntrire i saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E. 5.2. Saponificare: n funcie de coninutul de vitamina E, se cntresc, cu aproximaie de 0,01 g, 2 pn la 25 g din prob ntr-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaug n continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml soluie de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) i 2 ml soluie de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potrivete un condensator (pct. 4.3) la balon i se scufund balonul ntr -o baie de ap cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se nclzesc pn la fierbere i se las la reflux timp de 5 minute. Se adaug apoi 25 ml soluie de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) i se las la reflux timp de 25 de minute,

agitndu-se sub un flux uor de azot. Apoi se cltete condensatorul cu aproximativ 20 ml ap i se rcete coninutul balonului la temperatura camerei. 5.3. Extracie: se transfer, prin decantare, ntreaga soluie de saponificare, prin cltire cu un volum total de 250 ml ap, ntr-o plnie de separare de 1.000 ml, (pct.4.2.3) sau n aparatul de extracie (pct. 4.8). Se cltete balonul de saponificare, n continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) i 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) i se transfer soluiile de cltire n tubul de separare sau n aparatul de extracie. Proporia de ap i etanol n soluiile combinate trebuie s fie 2:1. Se scutur viguros timp de dou minute i se las s se sedimenteze timp de dou minute. 5.3.1. Extracie folosind o plnie de separare (pct. 4.2.3); cnd straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transfer stratul de eter de petrol ntr-o alt plnie de separare (pct. 4.2.3). Se repet aceast extracie de dou ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) i de dou ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spal extractele combinate din plnia de separare de dou ori, prin amestecare uoar (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantiti de 100 ml ap i dup agitare repetat alte cantiti de 100 ml ap, pn cnd apa rmne incolor la adugarea soluiei de fenolftalein (pct. 3.7) (splarea de 4 ori este de obicei suficient). Se filtreaz extractul splat printr -un filtru mpturit, pentru separare fazic (pct. 4.4), pentru a se nltura orice cantitate de ap n suspensie, ntr-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spal plnia de separare i filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple pn la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) i se amestec bine. 5.3.2. Extracie folosind un aparat de extracie (pct. 4.8); cnd straturile s-au separat (a se vedea observaia de la pct. 7.3) se nlocuiete dopul cilindrului de sticl (pct. 4.8.1) cu inserie din sticl mat (pct. 4.8.2) i se aranjeaz captul de jos n form de U al tubului ajustabil, astfel nct s se afle deasupra nivelului interfeei. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin braul exterior, se transfer stratul superior de eter de petrol ntr un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaug 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) n cilindrul de sticl, se ataeaz dopul i se agit bine. Se las straturile s se separe i se transfer stratul de deasupra n tubul de separare ca i mai nainte. Se repet procedura extraciei cu nc 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de dou ori cu cantiti de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) i se adaug straturile de eter de petrol n tubul de separare. Se spal extractele combinate din eter de petrol, dup cum este descris la pct. 5.3.1, i se procedeaz dup cum este descris acolo. 5.4. Prepararea soluiei prob pentru HPLC: se pipeteaz o cantitate alicot din soluia de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) ntr-un balon n form de par, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evapor solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redus, la o temperatur a bii ce nu depete 40C. Se readuce la presiunea atmosferic prin admisie de azot (pct. 3.9) i se ndeprteaz balonul de pe evaporatorul rotativ. Se nltur solventul rmas printr-un curent de azot (pct. 3.9) i se dizolv imediat reziduul cu un volum cunoscut (10100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentraia de L-alfa-tocoferol trebuie s fie ntre 5 g/ml i 30 g/ml). 5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separat pe o coloan cu faz inversat de C18 (pct. 4.5.1), iar concentraia este msurat printr-un detector de fluorescent (excitaie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injecteaz o fracie alicot (de exemplu: 20 l) de soluie metanolic obinut conform pct. 5.4 i se realizeaz o eluie cu faza mobil (pct. 3.8). Se calculeaz media nlimii peak-ului mai multor injecii din aceeai soluie de prob i mediile nlimii peak-ului ale mai multor injecii ale soluiilor de calibrare (pct. 5.6.2). Condiii HPLC: Sunt oferite urmtoarele condiii pentru orientare; pot fi folosite alte situaii, cu condiia ca acestea s ofere rezultate echivalente. Coloan de lichid cromatografic (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C18, ambalaje de 5 m sau 10 m sau echivalent Faza mobil (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) i ap, de exemplu: 980 + 20 (v + v) Debit: 1-2 ml/min Detector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescent (excitaie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)

5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-alfa-tocoferol) 5.6.1. DL acetat de tocoferol standard de referin 5.6.1.1. Prepararea soluiei standard de lucru Se transfer cu o pipet 25 ml soluie de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1) ntr-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) i se hidrolizeaz dup cum este descris la pct. 5.2. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), n concordan cu pct. 5.3, i se completeaz pn la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evapor 25 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) pn aproape de uscare, se nltur solventul rmas cu un curent de azot (pct. 3.9) i se redizolv reziduurile n 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentraia nominal a acestei soluii este 45,5 g DL-alfa-tocoferol/ml, echivalent cu 50 g DL-alfa-tocoferol acetat/ml. Soluia standard de lucru trebuie preparat proaspt, nainte de folosire. 5.6.1.2. Prepararea soluiilor de calibrare sau a curbei de calibrare: se transfer 1,0, 2,0, 4,0 i 10,0 ml din soluia standard de lucru ntr-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol (pct. 3.3) i se amestec. Concentraiile nominale ale acestor soluii sunt: 2,5; 5,0; 10,0 i 25,0 g/ml DL -alfa-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4.55, 9,10 g/ml i 22,8 g/ml DL-alfa-tocoferol. Se injecteaz 20 l din fiecare soluie de calibrare, de mai multe ori, i se determin media nlimii peak-ului. Folosindu-se media nlimilor peak-ului, se ntocmete un grafic de calibrare. 5.6.1.3. Standardizarea UV a soluiei de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) Se dizolv 5,0 ml soluie de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) pn la 25,0 ml cu etanol i se msoar spectrul UV al soluiei fa de etanol (pct. 3.1) cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la o lungime de und ntre 250 nm i 320 nm. Absorbia maxim trebuie s fie la 284 nm: 1% E = 43,6 la 284 nm n etanol 1 cm La aceast diluie trebuie obinut o valoare de extincie de 0,84 - 0,88. 5.6.2. DL-alfa-tocoferol standard de referin 5.6.2.1. Prepararea soluiei standard de lucru Se transfer cu pipeta 2,0 ml soluie de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) ntr-un balon cotat de 50 ml, se dizolv n metanol (pct. 3.3) i se completeaz pn la semn cu metanol. Concentraia nominal a acestei soluii este de 40 g DL-alfa-tocoferol/ml, echivalent cu 44,0 g de tocoferol acetat/ml. Soluia standard de lucru trebuie preparat proaspt nainte de folosire. 5.6.2.2. Prepararea soluiilor de calibrare i a graficului de calibrare Se transfer 1,0; 2,0; 4,0 i 10,0 ml din soluia standard de lucru diluat ntr-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completeaz pn la semn cu metanol (pct. 3.3) i se amestec. Concentraiile nominale ale acestor soluii sunt: 2,0; 4,0; 8,0 i 20,0 g/ml i 22,0 g/ml tocoferol acetat. Se injecteaz 20 l din fiecare soluie de calibrare de mai multe ori i se determin mediile nlimii peak-ului. Folosindu-se mediile nlimii peak-ului, se ntocmete un grafic de calibrare. 5.6.2.3. Standardizarea UV a soluiei DL-alfa-tocoferol (pct. 3.11.1) Se dizolv 2,0 ml pn la 25,0 ml din soluia stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) i se msoar spectrul UV al acestei soluii fa de etanol cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de und ntre 250 nm i 320 nm. Absorbia maxim trebuie s fie la 292 nm: 1% E = 75,8 la 292 nm n etanol. 1 cm

La aceast diluie trebuie obinut o valoare de extincie de 0,6. 6. Calcularea rezultatelor Pornindu-se de la media nlimii peak-ului pentru vitamina E a soluiei de prob, se determin concentraia soluiei de prob n g/ml (calculat ca alfa-tocoferol acetat) fa de curba de calibrare (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2). Coninutul w de vitamina E n mg/kg de prob este dat de urmtoarea formul: w = 500 x beta x V2 [mg/kg]/V1 x m, n care: beta = concentraia de vitamina E din soluia de prob (pct. 5.4) n UI/ml; V1 = volumul soluiei de prob (pct. 5.4), n g/ml; V2 = volumul cantitii alicote folosite la pct. 5.4, n ml; m = masa poriunii de testat, n g. 7. Observaii 7.1. Pentru probe cu concentraie redus de vitamina E poate fi util s se combine extractele de eter de petrol din dou ncrcturi de saponificare (cantitate cntrit: 25 g) ntr-o soluie de prob, pentru determinare HPLC. 7.2. Masa probei utilizate pentru analiz nu ar trebui s conin mai mult de 2 g grsime. 7.3. Dac separarea fazic nu are loc, se adaug aproximativ 10 ml I etanol (pct. 3.1), pentru a ntrerupe emulsia. 7.4. Dup msurarea cu spectrofotometrul a soluiei de tocoferol acetat sau DL-alfa-tocoferol, n conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adaug aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la soluie (3.10.1 sau 3.10.2) i se pstreaz soluia la frigider (perioad de pstrare de maximum 4 sptmni). 7.5. Poate fi folosit hidrochinona n loc de BHT. 7.6. Folosindu-se o coloan fazic normal, este posibil separarea unui a-, beta-, Y i d-tocoferol. 7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic n loc de soluie de ascorbat de sodiu. 7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA n loc de soluie de sulfit de sodiu. 8. Repetabilitate Diferena dintre rezultatele a dou determinri paralele, efectuate pe aceeai prob, nu trebuie s depeasc 15%, valoare relativ fa de cel mai mare rezultat. 9. Rezultatele unui studiu de colaborare*)
Premix L n medie [UI/kg] s(r) [UI/kg] r [UI/kg] CV(r) [%] s(R) [UI/kg] R [UI/kg] CV(R) [%] 12 48 17380 384 1075 2,2 830 2324 4,8 Furaj cu premix 12 48 1187 45,3 126,8 3,8 65,0 182,0 5,5 Concentrat mineral 12 48 926 25,2 70,6 2,7 55,5 155,4 6,0 Furaj proteic 12 48 315 13,0 36,4 4,1 18,9 52,9 6,0 Purcel 12 48 61,3 2,3 6,4 3,8 7,8 21,8 12,7

L: numr de laboratoare n: numr de valori singulare S(r): deviaia standard a repetabilitii

s(R): deviaia standard a reproductibilitii r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variaie al repetabilitii CV(R): coeficient de variaie al reproductibilitii *) Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

Aparatul de extracie (4.8)