BIODEGRADAREA I BIODETERIORAREA MICROBIAN

Conceptul de biodegradare nu are nc un cadru unanim acceptat. n sensul cel mai larg, el se refer la modificarea proprietilor unor materiale, determinat de activitatea biologic a microorganismelor. Acest proces afecteaz, cel mai adesea, materialele organice, dar nu exclude pe cele anorganice. n acest context, biodegradabilitatea reprezint capacitatea unui compus de a fi modificat structural de ctre un agent biologic. Eggins i Allsopp (1975) au fcut unele precizri menite s asigure o delimitare net a proceselor de biodegradare de cele de biodeteriorare. Biodegradarea este un proces ce acioneaz n sens pozitiv, att n natur, ct i n economia societii umane. Procesele biodegradative pot fi accelerate cu efecte benefice. Pe plan global, ele au o contribuie major n circulaia elementelor biologice n natur, iar pe plan local mpiedic acumularea materialelor reziduale, a diferiilor contaminani ai mediului etc. Biodeteriorarea reprezint aciunea prin care microorganismele determin transformarea unui material valoros ntr-unul rezidual. Este, deci, un proces care acioneaz n sens negativ, care trebuie, pe ct posibil, evitat sau ntrziat. Dou exemple ilustreaz diferenele nete dintre cele dou procese. Atacarea hrtiei care polueaz un sol de pdure de ctre Chaetomium globosum sau ntr-un bioreactor, cu scopul recuperrii anumitor constitueni utili, reprezint un proces de biodegradare. Prin contrast, atacul hrtiei nefolosite dintr-un depozit de ctre acelai microorganism, care o convertete la reziduuri nefolositoare, determinnd pagube economice, reprezint un proces de biodeteriorare. n mod asemntor, descompunerea ieiului deversat n apele marine este un proces util, de combatere a polurii prin biodegradare, n timp ce procesele similare dezvoltate n rezervoare sau in situ reprezint o biodeteriorare. ntr-o definiie mai limitativ, aplicabil compuilor organici, biodegradarea este capacitatea de descompunere aerob, complet prin mineralizare pn la CO2, H2O i NH3, sau anaerob, cu produi finali ca H2S, CH4, CO2 i H2O (Painter, 1974). Pentru compuii anorganici, biodegradabili, este greu de formulat un cadru adaptabil la toate circumstanele. El ar corespunde degradrii acestora la compui prezeni n mod normal n ciclul lor natural ca, de exemplu, NH3, NO2, NO3 i mai ales, N2. n general, o anumit substan organic nu este degradat integral de o singur specie de microorganisme. De obicei, atacul microbian este iniiat de o specie care posed enzimele extracelulare necesare unei prime scindri a substanei complexe, n componente mai simple i este continuat, pe msur ce degradarea avanseaz, de alte specii de care metabolizeaz mai departe, mult mai rapid, substratele intermediare rezultate din activitatea de degradare iniial. n alte cazuri, microorganismele se adsorb strns pe substratul nc intact i utilizeaz numai subunitile din structura acestuia .care trec spontan n soluie. n sfrit, substanele anorganice prezente ca atare sau rezultate din degradrile microbiene pot fi degradate nu prin activiti enzimatice, ci sub aciunea unor produi ai metabolismului microbian . Procesele de descompunere microbian implic n unele cazuri (piele, lemn, hrtie, textile), distrugerea unitilor structurale, ceea ce are ca rezultat pierderea proprietilor funcionale i fizice, ale acestor materiale, iar alteori (n special n cazul produselor alimentare) duc la apariia unor produi de catabolism (acizi din

glucide, NH3, baze organice, compui sulfurai din proteine, acizi, aldehide i cetone din lipide), care dau gust i miros neplcut alimentelor sau sunt toxici. Modificri induse de aciunea microorganismelor Dezvoltarea i activitatea metabolic a microorganismelor pe diferite substrate expuse biodegradrii i/sau biodeteriorrii determin: 1) alterri fizice; 2) modificri chimice ; 3) impurificri ; 4) modificri funcionale. 1) Modificrile fizice mbrac o gam foarte larg, n funcie de natura substratului atacat. ntre cele mai caracteristice sunt de menionat: caracterul friabil al hrtiei atacate, decolorarea i modificarea consistenei (vscozitii), vopselelor, caracterul sfrmicios al lemnului, gonflarea i pierderea cauciucului, ruginirea i perforarea conductelor metalice, distrugerea izolatorilor cablurilor electrice. Frecvent, modificrile fizice iniiaz sau sunt asociate cu cele chimice. Fenomenul este evident n cazul microfungilor care perforeaz structurile externe nainte de dezvoltarea hifelor i de declanarea proceselor de biodegradare. 2) Modificrile chimice sunt determinate, n general, pe dou ci : a) Leziunile determinate prin procese de asimilare corespund situaiei n care microorganismele utilizeaz constituenii materialului degradat ca nutrieni: o parte dintre ei sunt convertii la biomas microbian, iar restul sunt degradai pn la CO2 s i ap. Final, materialul originar poate efectiv s dispar. Fenomenul este tipic n cazul celulozei din structura organismelor vegetale: atacat de enzimele extracelulare ale unor bacterii i fungi, celuloza este degradat la celobioz, care, sub aciunea celobiazei este convertit la glucoz. Procesele similare acioneaz cu enzime specifice asupra hemicelulozelor i ligninelor, explicnd pierderea rezistenei fizice, frmiarea i degradarea masiv a lemnului. b) Leziunile produse prin procese de dezasimilare corespund unor procese de degradare cu eliberarea unor substane chimice provenite din materialul supus biodegradrii. i n acest caz exist un anumit grad de asimilare necesar pentru a asigura dezvoltarea microorganismelor i exercitarea efectului de dezasimilare, dar acesta este minor. Ca urmare, densitatea global a hifelor fungice dezvoltate este foarte mic n comparaie cu daunele economice produse prin pierderea rezistenei, prin ptare sau alte aciuni secundare. 3) Impurificarea i ptarea (,,Soiling) au drept cauz principal prezena i dezvoltarea miceliului fungic, capacitatea acestuia de a acoperi mari suprafee i de a forma diferite substane colorate intens. Fenomenul implic ptarea esturilor de bumbac de ctre pigmenii difuzai din hifele de Fusarium sp. sau a celor de nylon de ctre Penicillium gantinellum. Eggins i Allsopp (1975) citeaz, de asemenea, cazul ptrii produs de hifele de Ceratocystis sau de Phialospora ptrunse n lemnul de construcie depozitat necorespunztor, ca i n lemnul recent lucrat. Pierderea n greutate este nensemnat, ns coloraia albastr produs de hifele care infecteaz lemnul determin mari pierderi economice. Biodeteriorarea major rezult din ptare.

4) Modificrile funcionale sunt ntlnite ca o consecin a fenomenelor de fuling. Iniiat de microorganisme, fulingul suprafeelor submerse ale navelor este completat prin depunerea de nevertebrate (Teredo, alte molute, polichete, brahiopode, spongieri, briozoare) i n condiiile de iluminare de micro- i macroalge. Efecte negative sunt directe (degradarea lemnului, a cauciucului, a vopselelor, a unor mase plastice, a materialelor izolatoare, coroziune etc.) sau indirecte (creterea n greutate, mrirea rezistenei la deplasare, diminuarea vitezei navelor i consumul mrit de combustibil). Un rol aparte revine fenomenelor de atacare a izolatorilor cablurilor electrice. Dei concentraia nutrienilor este redus, rspndirea larg a miceliului, ca i capacitatea de a perfora diferitele structuri izolatoare determin distrugerea acestora, cu alterri de conductibilitate i riscuri de scurt circuitare. Factorii care favorizeaz procesele de biodegradare Urmrirea evoluiei proceselor de biodegradare i biodeteriorare a evideniat existena unor factori care condiioneaz sau favorizeaz evoluia acestor procese : Prezena substanelor asimilabile sub forma unor surse adecvate de C, N, S, P, Ca, Mg i a unor factori de cretere reprezint o condiie esenial pentru colonizarea substratului respectiv i a iniierii proceselor de degradare . Starea fizic. Substanele dizolvate sunt mai uor atacate dect cele aflate n suspensie, iar acestea, mai uor dect cele solide (lemn, roc etc.).n atacarea materialelor solide microfungii au un avantaj ecologic major, decurgnd din capacitatea de a ptrunde n substrat, exploatnd substratele respective prin capacitatea de a transloca nutrienii de-a lungul hifelor. Structura chimic. Relaia dintre structura molecular i biodegradare este foarte important. Astfel, alcoolii, aldehidele, aminoacizii, amidele i acizii organici, n general, sunt mai uor atacai dect alcanii, olefinele, cetonele, acizii dicarboxilici. Moleculele complexe, insolubile, cu structur nalt ramificat, cele cu grupri heterociclice i mai ales, diferiii compui de sintez chimic sunt deosebit de rezisteni, iar unii (unele mase plastice)chiar recalcitrante la biodegradare. Umiditatea reprezint un factor cu importan major, deoarece, aa cum s-a demonstrat n cazul fungilor, practic, toate microorganismele au nevoie de o pelicul de ap n jurul celulelor pentru a crete i a competiiona cu alte microorganisme. Relaia microfungilor cu umiditatea este considerat ca decisiv n determinarea capacitii lor de a exploata substratul expus aciunii lor . Eggins i Allsopp (1975) citeaz cazul fungilor aparinnd speciei Serpula (Merulius) lacrymans, care atac lemnul uscat din cldiri, determinnd ,,putregaiul uscat. Iniierea atacului fungic al lemnului se realizeaz ntr-o zon cu un coninut mare n ap. Creterea hifelor este asociat cu utilizarea nutrienilor i a energiei prin producerea de rizomorfe i extinderea infeciei lemnului la o distan de mai muli metri fa de colonie. Dei rizomorfele pot transporta apa, aceasta poate fi produs local, la situsul de aciune, prin utilizarea lemnului i degradarea lui cu producere de CO2 i H2O. Aceast ap apare sub forma unor picturi de lichid pe miceliu, de unde i denumirea de M. lacrymas. Temperatura are un efect mai puin marcat. Dei majoritatea microorganismelor biodegradative sunt active, n special la 200C, exist numeroase cazuri de specii active la temperaturi extreme, la care determin pagube economice enorme. Astfel, Cladosporium sp. i Sporotrichum sp. sunt active la + 40C, degradnd 3

alimentele conservate prin frig. n plus, unele bacterii i microfungi termofili pot genera procese de termogenez (60-800C) n depozitele de cereale, de gunoi de grajd, de crbune i turb, n clile de fn etc. Influena condiiilor de mediu asupra proceselor de biodeteriorare este pregnant evideniat de cazul picturilor murale din petera Lascaux (Dordogne), datnd din Paleolitic. Schimbarea marcant a condiiilor de mediu, prin introducerea ei n circuitul turistic, a determinat schimbarea brutal a condiiilor de microclimat, contaminarea cu diferite microorganisme i apariia unor modificri de culoare, descrise sub denumirea de ,,boala verde (Maladie verde de Lascaux). Examenul direct a evideniat prezena cianobacteriei Oscillatoria, pentru ca, ulterior, s se evidenieze o contaminare complex cu bacterii ( Eubacteriales, Actinomycetes), alge verzi (Palmellococcus sp.), Xanthophyceae (Chlorobotrys) i protozoare (Amoebae, Ciliatae i Flagelatae). Biodeteriorarea picturilor este consecutiv multiplicrii microorganismelor heterotrofe, din solul i de pe pereii peterii, precum i a unora alohtone, provenite de la exterior. Ele au utilizat substanele organice contaminante prezente iniial pe perei, mbogite cu biomasa bacterian, algal i a protozoarelor bacterivore dup moartea acestora (Lefevre i Laporte, 1969).

DEGRADAREA MICROBIAN A SUBSTANELOR XENOBIOTICE Capacitatea microorganismelor de a degrada mai mult sau mai puin uor diferitele molecule complexe existente n natur este recunoscut fr echivoc. n acest sens pledeaz imposibilitatea acumulrii n mediu chiar a celor mai greu degradabile i rennoibile anual (celuloz, hemiceluloze, lignin etc.), precum i rolul esenial al microorganismelor n circulaia elementelor biogene n natur. Atunci cnd s-a realizat (ca n cazul combustibililor fosili), acumularea s-a produs numai n condiii de mediu nefavorabile pentru biodegradare. Aceste observaii au dus la formularea principiului infailibilitii microorganismelor (,,Principle of microbial infaillibility) (Alexander, 1965), conform cruia, n ultim instan, orice substan este degradat de un microorganism sau de un grup de microorganisme, cu condiia existenei unor condiii de mediu favorabile. Obinerea pe cale de sintez a numeroase substane organice cu grade diferite de complexitate i importante utilizri practice n agricultur - ca pesticide necesare pentru combaterea duntorilor, precum i n industrie, medicin - a infirmat aceast doctrin, demonstrnd caracterul refractar la degradarea microbian a multor substane diferite chimic de cele obinuite sistemelor biologice. Substanele xenobiotice (strine de sistemele biologice) sunt substane chimice organice sintetice, care sunt introduse n ecosistemele naturale, fie n mod deliberat, fie accidental. Fiind, n general, rezistente la biodegradare, se pot acumula n concentraii care depesc anumite limite de toleran determinnd efecte negative asupra organismelor vii datorit persistenei i concentrrii lor, precum i dificultii de a fi introduse n circuitul global al elementelor biogene (C, N, S etc.). Numrul substanelor obinute prin sintez chimic este enorm . Dup Jain i Steiller (1986), n anii 1980 erau nscrii n ,,Chemical Abstracts peste 5 milioane de compui chimici, iar producia anual de 4

compui organici de sintez era de 300 milioane tone/ an. Unii dintre ei sunt biodegradabili, dar cei mai muli sunt recalcitrani.

Clasificarea substanelor xenobiotice cu caracter de poluani ai mediului nconjurtor Pe baza compoziiei chimice, substanele xenobiotice poluante sunt grupate n trei categorii majore: 1) compuii organoclorurai ; 2) compuii alchil-benzen-sulfonai; 3) compuii organo-fosforici. Compuii organoclorurai sau mai exact organohalogenai (deoarece unii pot conine i atomi de fluor) reprezint grupul cel mai numeros i mai mult studiat. Este reprezentat de o gam larg de compui cu proprieti fizico-chimice foarte diferite i grade diferite de rezisten la degradare. Cuprinde molecule obinute prin adiia de clor sau fluor la unele hidrocarburi alifatice, aromatice sau heterociclice. Legtura C-Cl sau C-F este foarte stabil i necesit consum de energie pentru clivare. Ea confer stabilitate chimic i biologic, dar agraveaz efectul de poluant deoarece asigur o persisten ndelungat n mediu. Compuii organoclorurai au utilizri multiple n agricultur, medicin i n industrie: a) Substanele insecticide, reprezentate de: - DDT (4,4-diclorfenil-tricloretan), cel mai cunoscut i mai mult studiat, aplicat nc din anul 1943; - Lindan, izomer al hexaclorciclohexanului (HCH), mai activ, avnd o toxicitate pentru insecte de 5- 20 de ori mai mare dect DDT. - Derivai ai ciclopentandienului, ca aldrin, dieldrin, heptaclor, interzii n unele ri datorit toxicitii lor pentru nevertebrate i chiar pentru vertebrate. b) Bifenilii policlorurai (BPC) sunt amestecuri de bifenil, avnd 1-10 atomi de clor per molecul. Au o mare stabilitate biologic i o inerie chimic proporional cu creterea gradului de clorinare. Sunt substane uleioase, cu punct ridicat de fierbere i cu utilizri multiple: ca izolatori sau cu rol de rcire n sistemele electrice nchise (transformatori, condensatori), lichide hidraulice i de transfer de cldur, n ignifugare, industria lacurilor i a vopselelor, a cernelurilor tipografice, ca aditivi, auxiliari n industria textil, pesticide etc. O utilizare mai banal este cea de ulei de imersie pentru microscopie. Produi iniial n anul 1929, au fost sintetizai dup datele lui Reineke i Knackmuss (1988) n cantitate de 750 000 tone din care aproximativ 450 000 tone sunt n serviciu, iar restul aproximativ 300 000 tone au fost larg diseminate n mediu. Muli compui clorinai ai benzenului sunt utilizai curent ca intermediari n sinteza unor chimicale fine i ptrund n mediu fie ca reziduuri, fie c sunt accidental ,,scpate din locurile de producie. Apreciind pierderile la 1-2% din materialul brut, cantitile eliminate n mediu sunt apreciate la cteva sute de tone/an. Dioxinele prezente n aproximativ 60 de formule chimice, au ca reprezentani tipici: 2, 3, 7, 8-tetraclor dibenzo-dioxina (TCDD) i 2, 3, 7, 8-tetra-clor-dibenzen-furanul (TCDF). Sunt substane care apar n cursul fabricrii sau al degradrii termice a clorfenolilor sau clorbifenililor. TCDD este rezistent la degradare i 5

capabil de efecte toxice pentru om n concentraii foarte mici. Efectele negative determinate de contaminrile accidentale (ca n cazul localitii Soveto din Italia) sunt, dup unii autori, exagerate, cel puin sub aspectul efectului teratogen. Dioxina TCDD este degradat de Phanerochaete chrysosporium (Subncr. Basidiomycotina). c) Freonii sau foranii sunt hidrocarburi alifatice cu greutate molecular mic respectiv alcani C 1-C2, n care toi sau aproape toi atomii de H sunt nlocuii de combinaii fluor-clor. Cei mai cunoscui sunt freonii F11 (CCl3F), F-12 (CCl2F2) i foranul 114 (CF2Cl-CF2Cl). Sunt gaze inerte, foarte volatile, utilizate ca solveni sau ca propulsori pentru dispozitive de spray n cosmetic, vopsele, insecticide, precum i n sisteme de rcire (frigidere, aparate de condiionare a aerului). Fotolizai n atmosfer, unde sunt eliminai n cantiti mari (10 6 tone/an), sunt ncriminai n distrugerea parial a stratului de ozon, avnd drept consecin negativ creterea iradierii UV, riscul unor procese de mutagenez i de favorizare a cancerului pulmonar. Exist i preri opuse n sensul c ,,gaura din stratul de ozon observat deasupra Antarcticii exist, probabil, dintotdeauna sau c oricum nu ar fi de dat recent, c un produs fabricat i utilizat mai ales n emisfera nordic nu poate produce efecte negative concentrate n emisfera sudic, c perenitatea stratului de ozon ar fi asigurat de refacerea continu prin bombardamentul permanent cu UV asupra oxigenului din stratosfer etc. (Tazieff, 1989). d) Polimerii sintetici, de tip polietilen, clorur de polivinil, polistiren etc., sunt foarte rspndii datorit utilizrilor lor numeroase, bazate pe elasticitatea, capacitatea de modelare, rezisten mecanic i la aciunea substanelor chimice ca material de mpachetat, precum i n industrie, medicin i agricultur. Rezistena lor la degradare pare s fie asociat cu greutatea molecular mare. Ca dovad, fragmentele mici, obinute prin piroliza polietilenei, sunt succesibile de degradare. Unii polimeri sintetici, ca, de exemplu, polietilena par s reziste la biodegradare indefinit. Sunt produse n cantiti foarte mari anual (7 milioane de tone n anul 1976). Sunt netoxice i, ca atare, nepericuloase pentru organismele din natur, ns prezena lor este nedorit, n primul rnd, din considerente de ordin estetic. Alchil-benzen-sulfonaii (ABS) sunt componeni majori ai detergenilor anionici, datorit capacitii lor de surfactani. Sunt complexe organice cu molecule amfipatice, a cror activitate de suprafa are ca efect muierea, desorbia, emulsionarea, suspendarea i stabilizarea particulelor dislocate de pe o suprafa. Rezultatul acestor efecte succesive este detergena sau curirea. Molecula lor are o structur asimetric, cu o extremitate alchil, hidrofob (deci lipofil), i una sulfonat, hidrofil. Cnd un astfel de agent tensioactiv aflat n soluie apoas vine n contact cu o suprafa lipidic moleculele lui se orienteaz n aa fel nct gruprile lor hidrofobe (alchil) se adsorb pe aceasta, iar cele hidrofile, polare (sulfonat), rmn orientate spre ap. Se creeaz astfel un monostrat de adsorbie, care face legtura ntre cele dou medii insolubile, apa i lipidele determinnd efectul de muiere. Sunt rezisteni la degradare i produc spum la suprafaa apelor poluante. ncepnd din anii 70,unii detergeni sunt primele molecule construite de productori pentru a fi biodegradabile.

EFECTELE ECOLOGICE ALE SUBSTANELOR XENOBIOTICE 6

Substanele xenobiotice pot polua, practic, toate cele trei medii naturale majore, respectiv atmosfera, litosfera i hidrosfera. Dup Reinecke i Knackmuss (1988), exist dou modaliti de poluare cu substane chimice: 1) Poluarea localizat (Point source pollution) realizat pe zone mici, n locuri asociate cu eflueni industriali, accidente de transport sau de utilizare i n care poluantul poate fi eliminat n concentraii relativ mari. 2) Poluarea dispersat (Dispersed pollution) realizat n concentraie mic, n general pe suprafee mai extinse, rezultnd din volatilizare, practici agricole (ca, de exemplu splarea prin iroire a insecticidelor de pe sol i transportul lor n ruri i lacuri sau n pnza freatic etc.). Unele aplicaii i introducerea n mediu sunt intenionate (combaterea duntorilor), altele accidentale sau oricum neintenionate (reziduuri industriale din fabrici, din industria alimentar, accidente n cursul vehiculrii sau prin transport secundar la distan de regiunea-int prin ap, aer, eroziunea solului, infiltrare etc. Efectele poluante sunt agravate de marea diversitate a pesticidelor. Astfel, n anul 1975 se foloseau 1170 de compui, din care 425 erbicide, 410 fungicide i 335 insecticide produse ntr-o cantitate de 725 000 tone/an. Dup Mennecke (1981), n emisfera vestic se foloseau n anul 1979 peste 500 de pesticide diferite, disponibile n peste 5 000 de formule comerciale numai n agricultur. Producia anual a fost de 2 milioane de tone. Ramade (1976), prezint sintetic cile de disperare pe scar global a substanelor xenobiotice. Schema evideniaz contaminarea troposferei prin arderea reziduurilor industriale, administrarea de pesticide, eroziunea eolian asociat cu antrenarea n atmosfer a insecticidelor i a altor substane xenobiotice depuse pe sol i pe frunze. Ele revin, prin ploi, pe suprafaa solului i a apelor prin codistilare cu vaporii de ap, contaminnd solul i suprafaa apelor, de unde provin. Pe de o parte, contamineaz apele freatice, iar pe de alta, prin dizolvare, i apele de iroire, lacurile, rurile, mrile i oceanele. Unele pesticide pot fi degradate n mediu, n timp ce altele sunt rezistente la degradarea sub aciunea microorganismelor i, n consecin, pot persista, uneori, timp ndelungat. Datele privind persistena n mediu sunt foarte variabile nu numai de la un proces la altul, ci i de la un studiu la altul, probabil datorit influenelor complexe ale condiiilor de mediu n care au fost ntreprinse. Conceptul de molecule recalcitrante a fost formulat de Alexander (1965) pentru a caracteriza substanele care pot persista perioade ndelungate n natur, fiind refractare la degradare sau sunt mineralizate foarte lent. De aceea, ele se pot acumula n mediu cu consecinele ecologice negative. n accepia iniial, termenul s-a referit la polimerii din ambalaje i la agenii surfactani de tipul alchilbenzen-sulfonat nalt ramificai, inclui n formula multor detergeni. Dei Horvath (1972) contest valabilitatea conceptului de recalcitran, el este utilizat frecvent, cu meniunea c aceast particularitate nu este limitat exclusiv la substanele de sintez chimic. Exist o serie de substane naturale cu viaa lung n mediu (ani, secole sau chiar milenii), greu de degradat cu cele mai complexe tehnici n vitro (Burns, 1983). Substanele poliaromatice cu greutate molecular pn la 2x106 daltoni i unii constitueni humici au un timp de njumtire, apreciat cu radiocarbon, lung de cteva mii de ani (OBrien i Stout, 1978). Alte materiale de origine biologic (ligninele, taninurile, melaninele etc.), precum i unele materiale paleobiochimice prezint grade importante de recalcitran.

DEGRADAREA COMPUILOR XENOBIOTICI

Termenul de degradare sau biodegradare este folosit, n general, cu o mare doz de ambiguitate, deoarece este folosit fr discriminare pentru orice transformare care are ca rezultat obinerea unui produs cu o molecul mai mic dect cea originar. n cazul substanelor xenobiotice situaia este agravat deoarece degradarea poate duce la apariia unor produi noi, refractari i toxici (uneori chiar mai toxici dect produsul originar) sau cu efect oncogen. Un exemplu tipic este cel furnizat de DDT, convertit de bacterii la DDD i DDE i chiar la produsul final DBP, care este nc recalcitrant i biologic activ (Wedemeyer, 1976). Exist dou mecanisme majore de degradare a substanelor xenobiotice. 1) Mineralizarea Reacia cea mai avantajoas pentru protecia mediului natural (ap, sol etc.) este mineralizarea, care poate fi definit drept consecina unui proces de biodegradare complet. n cazul moleculelor xenobiotice halogenate, ea implic conversia scheletului de C al acestora la intermediari de metabolism i, n final, revenirea substanelor organice halogenate la starea mineral (Reineke i Knackmuss, 1988). Mineralizarea este condiionat de: ptrunderea substanelor strine n celule; existena unor sisteme enzimatice degradative aparinnd metabolismului periferic, cu rolul de ndeprtare a structurilor xenobiotice i de conversie a substanelor ntr-o form natural; existena unor mecanisme de reglare susceptibile s fie activate la nevoie. Procesul de mineralizare permite eliminarea mai mult sau mai puin rapid a pesticidelor (cel mai adesea pe durata unui anotimp). El are urmtoarele caracteristici fundamentale: Secvenele enzimatice sunt caracteristice metabolismului microorganismelor i convertesc, final, substanele organice originare la substane anorganice; parte din carbonul prezent n substrat este convertit la constitueni celulari, iar energia este utilizat pentru sinteza lor. Ca urmare, mineralizarea este asociat cu creterea numrului i a biomasei microorganismelor; Este asociat cel mai adesea cu detoxifierea. n cazul n care unul dintre produii intermediari este tipic, el poate exercita efecte nocive asupra mediului, dar, n general, acetia au via scurt. 2) Co-metabolismul Numeroi compui xenobiotici i, n principal, pesticidele organoclorurate nu pot fi folosite de microorganisme ca unic surs de C i energie, i, ca urmare, nu pot fi ndeprtate n mediu. Dup cum s-a demonstrat ele pot fi ns modificate pe cale biologic, n natur, prin aciunea unor populaii mixte de microorganisme. 8

n aceste cazuri, n cultur pur, nici un organism nu poate folosi substratul respectiv pentru cretere, dar n prezena unei surse alternative de C i energie l poate modifica, transformndu-l chimic, nct, adeseori, poate fi utilizat n continuare de alte organisme (Slater i Sommerville, 1979). Procesul prin care un substrat este modificat, fr s fie utilizat, de ctre un microorganism, care crete pe alt substrat, a fost descris prima dat de Leadbetter i Foster (1958) la Methylomonas methanica. Aceast bacterie utilizeaz pentru cretere metanul i realizeaz, concomitent, un proces de oxidare a diferite alte cosubstraturi prezente n mediu ca, de exemplu, etanul la acid acetic, propanul la acid propanoic i aceton, butanul la acid butanoic i metilaceton etc. Bacteria metanotrof utilizeaz pentru cretere numai substratul (C1) caracteristic tipului su de nutriie. Ea nu poate utiliza ca unic surs de C i energie nici cosubstraturile enumerate i nici produii oxidrii lor. Procesul prin care o bacterie oxideaz o substan fr ca s fie capabil s o utilizeze ca surs de C i energie pentru cretere a fost numit de Foster (1962) co-oxidare. Ulterior, Jensen (1963) a propus termenul de co-metabolism pentru a include i alte reacii (dehalogenri etc.) i pentru a scoate n eviden necesitatea prezenei concomitente a unui substrat menit s asigure creterea. Conceptul de co-metabolism a fost redefinit de Skryabin i colab. (1978), precum i de Stirling i Dalton (1979, 1982) pentru a caracteriza procesul de transformare a unui substrat, care nu permite creterea unui microorganism (Non-growth substrate), n prezena unui substrat de cretere sau a altui compus transformabil. n acest context, degradarea unor compui organici rezisteni la atacul unui microorganism devine posibil dac sistemul substrat-mediu-microorganism este suplimentat cu unul sau cu mai multe substraturi adiionale, utilizabile pentru cretere de ctre microorganismul respectiv. Microorganismul astfel ajutat este capabil s degradeze substratul respectiv, dar rmne n continuare incapabil s-l foloseasc drept surs de C i energie pentru cretere. Conceptul de co-metabolism a fost criticat de ali autori. Holbert i Krawiec (1977) consider c reaciile respective nu reprezint evenimente metabolice noi (aparinnd anabolismului i catabolismului normal), ci doar o abordare metodologic nou, decurgnd din cuplarea la nivel celular a metabolismului a dou substraturi, unul xenobiotic (non-growth) i altul de cretere. Procesele de co-metabolism au urmtoarele caracteristici majore: Au loc numai n medii naturale (ap, sol etc.) nesterile i niciodat n cele sterilizate; Nu se poate izola niciodat un singur microorganism capabil s utilizeze substanele xenobiotice n mod eficient ca surs de nutrieni i de energie; Populaia rspunztoare de degradare nu crete ca numr sau ca biomas n urma introducerii substratului respectiv n ap sau n sol. Explicaia rezid din faptul c populaiile de microorganisme care fac co-metabolism sunt mici, degradarea compuilor expui este lent i rata multiplicrii lor nu crete n timp, cum este cazul microorganismelor care metabolizeaz diferite substraturi pn la mineralizare (Alexander, 1981); Produii rezultai din co-metabolism sunt lipsii, de cele mai multe ori, de orice funcie metabolic, dac nu sunt n continuare de alte enzime aparinnd catabolismului. De aceea, o particularitate

frecvent observat a co-metabolismului este acumularea n mediu compuilor intermediari, care nu mai pot fi metabolizai mai departe de anumite microorganisme (Janke i Fritsche, 1985). Procesul de co-metabolism este activ n degradarea unor pesticide comune (DDT, 2,5-T, aldrin, heptaclor) i a mai multor alte molecule clorinate i neclorinate (Clarke, 1980).

Procesele de co-metabolism n natur Date experimentale i observaii asupra unor procese naturale pledeaz pentru prezena i importana cometabolismului n natur. Astfel, degradarea ligninei la CO2 sub aciunea a doi fungi care produc putregaiul alb ( Phanerochaete chrysosporium i Coriolus versicolor) necesit prezena unui substrat de cretere, ca glucoza sau celuloza. Ceva mai mult, cantitatea de lignin degradat depinde de cantitatea de substrat de cretere adiional (Kirk i colab., 1976), iar creterea fungilor cu lignin, ca unic surs de C i energie, este nensemnat, dei ca substrat nu este toxic. n sol, prezena unei game largi de substane organice excretate de rdcinile plantelor, n particular n rizosfer, creeaz condiii favorabile pentru co-metabolismul substanelor refractare la degradare, n special al celor xenobiotice (Janke i Fritsche, 1985). Viteza de mineralizare a dou pesticide organofosforice (parathion i diazinon) este mai mare sub influena rdcinilor plantelor dect n probele de sol identice ns lipsite de rdcini. Nu s-a demonstrat ns dac stimularea este asociat cu modificarea activitii globale a microorganismelor sau cu selecionarea unor populaii mai active n degradarea compuilor organofosforici (Hsu i Bartha, 1979). Dup Skryabyn (1978), rolul primordial al substratului adiional coninnd C metabolizabil, necesar pentru a realiza co-metabolismul, este de a furniza energie, cofactori sau ali metabolii necesari pentru transformarea substratului recalcitrant. n general, populaiile de microorganisme capabile s co-metabolizeze n natur sunt reduse, iar numrul i biomasa lor nu cresc rapid prin introducerea substratelor recalcitrante n mediu. De aceea, co-metabolismul substanelor xenobiotice n ecosistemele naturale are loc cu o vitez mic, permind acumularea de intermediari nemetabolizai i, n unele cazuri, chiar a unor compui mai toxici dect cei iniiali (Alexander, 1980, 1981). Condiiile existente n multe medii naturale (n special n mediile acvatice), care au concentraii reduse de compui naturali cu carbon uor utilizabil, nu ofer multe avantaje selective microorganismelor capabile s co-metabolizeze substanele xenobiotice (non-growth). Cu toate acestea, fenomenul de co-metabolism este foarte important pentru procesele de biodegradare care au loc n mediu i datorit crora diferite substane eliminate permanent n natur se acumuleaz foarte rar, dei prezint diferite grade de rezisten. Dei este greu de apreciat n prezent ct din biodegradarea moleculelor organice complexe sau recalcitrante revine metabolismului i ct co-metabolismului este evident c foarte multe dintre cele care nu permit creterea nici unui organism individual sunt degradabile n sol i n bazinele acvatice n prezena unor populaii complexe (Beam i Perry, 1974).

10

Mediile naturale impun frecvent condiii restrictive pentru creterea microorganismelor. Aceasta se realizeaz cu o vitez mult mai sczut dect n vitro, n laborator, sau este chiar oprit cnd concentraia nutrienilor este foarte sczut. n aceste condiii, co-metabolismul poate reprezenta o cale alternativ prin care microorganisme importante pot fi aprovizionate cu nutrienii necesari pentru cretere i pentru activitile lor biologice normale.

DEGRADAREA COMPLET A SUBSTANELOR XENOBIOTCE SUB ACIUNEA UNOR ASOCIAII DE MICROORGANISME

Habitatele naturale sunt populate, de regul, de comuniti complexe de microorganisme, alctuite din mai multe specii care interacioneaz. Speciile individuale avnd diverse activiti catabolice acioneaz sinergic, formnd, n ansamblu, o comunitate fiziologic, cu o activitate metabolic concentrat, neexprimat, niciodat, de populaiile individuale care acioneaz izolat. n acest sens, mai multe date experimentale demonstreaz posibilitatea mineralizrii unor substane de sintez rezistente complet la degradarea de ctre specii individuale prin intervenia succesiv a mai multor specii de microorganisme. Aceast interaciune este prezent ntr-o form simpl (Daughton i Hsieh, 1977) n cazul bacteriilor Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas stutzerii, care asociat utilizeaz pesticidul Parathion ca surs de C i energie. n aceast asociaie, Pseudomonas stutzerii produce p-nitrofenol, folosit ca nutrient de Pseudomonas aeruginosa; la rndul su, Pseudomonas stutzerii crete utiliznd produii rezultai din activitatea bacteriei Pseudomonas aeruginosa. Lanul trofic de degradare a pesticidului 3-clorbenzoat, n care sunt implicate cinci specii bacteriene diferite: Clorul eliberat din ciclul aromatic, prin aciunea bacteriei DCB-1, este recuperat n cantiti stoichiometrice ca ion, Cl-. Puterea reductoare necesar pentru declorinarea reductiv este furnizat de oxidarea acetogen a benzoatului. O treime din hidrogenul disponibil este utilizat n declorinarea reductiv, iar dou treimi sunt cedate metanogenilor (Dolfing i Tiedje, 1986; Reineke i Knackmuss, 1988). Microorganismele active Experimental s-a demonstrat c, n anumite condiii, aproximativ 50 de genuri de microorganisme bacterii i microfungi particip la degradarea substanelor xenobiotice n natur (n ap i n sol). Dei datele sunt fragmentare, se poate afirma cu certitudine c Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, unele actinomicete i levuri, precum i unele organisme fitoplanctonice pot realiza metabolizarea anaerob a DDT la DDD, precum i a altor poluani (lindan, heptaclor i posibil aldrin). Procesul ar fi mai activ n lacurile bogate n fitoplancton i s-ar realiza, de asemenea, sub aciunea microorganismelor din mlul de la fundul lacurilor. Dintre alge, Chlorella vulgaris i Chlamydomonas reinhardtii metabolizeaz activ lindanul, prin declorinare la pentaclor ciclohexan (Sweeney, 1968). Parationul i pentaclorfenolul sunt rapid degradate n natur de tulpini de microorganisme adaptate natural. Astfel, o tulpin de Flavobacterium ndeprteaz pentaclorfenolul din lacuri (concentraii pn la 100 11

ppm), reducndu-l la niveluri nedetectabile n 2-3 zile. Aceste tulpini active ar putea fi folosite n tratarea microbian a apelor uzate. Dintre bacterii, cele mai active sunt cele din genurile: Bacillus, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus, Nocardia, Sarcina, Xanthomonas, Achromobacterium, Agrobacterium etc. Dintre microfungi, Penicillium i Aspergillus sp. atac diuronul, manuronul, fenuronul (feniluree), cu producere de anilin, CO2 i NH3, iar Aspergillus fumigatus, Fusarium roseum i Trichoderma sp. degradeaz triazinele (atrazin, simazin etc.).Reaciile chimice efectuate sunt complexe i relativ puin cunoscute. Ele includ: dehalogenri, dezaminri, decarboxilri,metiloxidri, -oxidri, hidroxilri, reacii de oxidare a azotului sau a sulfului, reducerea oxizilor de sulf, reducerea unor duble sau triple legturi etc. Este de menionat c nu toate procesele efectuate de microorganisme sunt degradative. Ele pot realiza doar modificarea limitat a moleculelor originare sau a unor intermediari ai lor cu apariia unor derivai prin metilare, nitrozare, nitratare, acilare, dimerizare, formarea de heterocicluri azotate etc. (Burns, 1980). Importana nrudirii structurale dintre substanele xenobiotice Dup Knackmuss (1981), degradarea xenobioticelor n natur este rezultatul aciunii fortuite a enzimelor preexistente ale catabolismului produilor naturali. Destinate aciunii asupra unor constitueni naturali din mediu, aceste enzime reacioneaz cu unele grupri funcionale analoge structural din compoziia moleculelor xenobiotice. Spre exemplu, erbicidul sintetic 2,4-D (acid 2,4-diclor-fenoxiacetic) seamn structural cu o serie de compui aromatici naturali. Ca urmare, el poate fi degradat n sol de o serie de bacterii aerobe ca: Achromobacter, Arthrobacter, Flavobacterium peregrinum, Pseudomonas etc. Exemplul cel mai documentat este oferit de Bumpus i colab. (1985). Phanerochaete chrysosporium degradeaz DDT, lindanul i ali produi clorurai la CO 2 i H2O sub aciunea sistemelor enzimatice extracelulare implicate n mod normal n degradarea ligninei. Fenomenul este determinat de asemnrile structurale dintre aceste substane i constituenii polimerului de lignin. Pe aceast baz, ei recomand, pentru a face foarte eficient i economic procesul de detoxifiere biologic i de eliminare a reziduurilor chimice periculoase, adugarea unor culturi de P. chrysosporium n sistemele de epurare a efluenilor reziduali. O alt explicaie important decurge din studiile experimentale asupra fenomenului de co-metabolism. Horvath (1972) a demonstrat c Brevibacterium sp. degradeaz pesticidul acid 2,3,6-triclorbenzoic la 3,5diclorcatechol,dac se adaug, ca stimulator n mediu, acid benzoic. Acesta este biodegradabil i favorizeaz creterea bacteriilor care metabolizeaz erbicidul. Generaliznd, se poate spune c mediile naturale contaminate cu substane recalcitrante (organoclorurate sau de alt natur) pot fi mai uor detoxificate i epurate dac li se adaug un analog structural natural, biodegradabil, care stimuleaz multiplicarea microorganismelor active. Pe aceast baz, Horvath (1972) a propus ca aplicarea erbicidelor n ecosistemele naturale s se fac simultan cu o mbogire n analogi (Analogue enrichment) a mediului respectiv, pentru a asigura grbirea procesului de ndeprtare a poluanilor.

12

BAZELE GENETICE ALE DEGRADRII COMPUILOR ORGANICI HALOGENAI

Degradarea substanelor xenobiotice se poate realiza, teoretic, pe dou ci majore: 1. Prin utilizarea echipamentului enzimatic existent n mod normal, n cazul n care substratul nou are ntr-un anumit grad analogii chimice i structurale cu anumite produse naturale. Limitrile cinetice decurgnd din utilizarea unui substrat doar nrudit (nu specific) pot fi depite pe mai multe ci: a) prin supraproducie de enzime; b) prin inhibarea sau modificarea controlului riguros asigurat de genele reglatoare; c) prin producerea de enzime cu specificitate modificat prin mutaie. 2. Prin activiti enzimatice noi, codificate de genele preexistente sau de gene noi heterologe, n urma unor rearanjri i recombinri genetice legitime sau nelegitime i, mai ales, prin aport de gene noi, n special plasmidiale. Bazele genetice ale degradrii substanelor xenobiotice sunt puin cunoscute, dar este evident c n cele cteva cazuri descifrate genele sunt cel mai adesea situate grupat, n structura unor plasmide sau transpozoni, adic ntr-o form mai uor transmisibil de la un genom la altul, intra- sau intercelular. Datorit n special acestui tip de structur genetic, microorganismele din mediile naturale au dobndit capacitatea de a degrada numeroi compui halogenai, n special pe cei cu puini atomi de halogeni (Ghiorse i colab., 1985). Tulpinile de microorganisme din mediile naturale (sol, ap etc.) ar fi caracterizate printr-o mare flexibilitate a materialului genetic, care le-ar asigura o adaptabilitate rapid ca rspuns la variabilitatea substratelor din medii i, decurgnd din aceasta, capacitatea de a sintetiza enzime degradative pentru substane nentlnite n cursul evoluiei lor. Ele s-ar deosebi de tulpinile bacteriene utilizate curent n studiile de genetic bacterian (Escherichia coli, Salmonella typhymurium etc.), limitate la un habitat unic (intestinul) i, prin aceasta, lipsiten de versatilitate catabolic i supuse unor controale foarte riguroase. Tulpinile saprofite prezente n mediile naturale confruntate permanent cu o gam larg i diversificat de nutrieni i de condiii de mediu ar reprezenta un potenial de evoluie mai rapid, care le-ar permite s acioneze asupra unor compui chimici sintetizai de om, care nu au echivaleni n natur. Cauzele rezistenei la degradare Perspectiva obinerii n viitor a unor pesticide biodegradabile este condiionat de cunoaterea aprofundat a mecanismelor complexe, care stau la baza de molecul recalcitrant. 1. Biodegradarea este condiionat de ptrunderea substanelor n celulele microorganismelor, acestea fiind n funcie de mrimea moleculelor. Moleculele organice prea mari sau prea complexe i insolubile, neaccesibile ca atare bacteriilor i fungilor trebuie mai nti sa fie degradate la compui mai mici, care pot fi internalizai i utilizai intracelular n catabolism.

13

Degradarea iniial este efectuat de enzime extracelulare. La modul cel mai concret, aceasta condiie este ilustrat de polimerii sintetici de tipul polietilenei, a crei rezisten cvasiabsolut la degradare este determinat de greutatea molecular mare i de absena enzimelor extracelulare capabile s o fragmenteze n vederea ptrunderilor n celule. 2. Structura molecular pare sa aib ns un rol esenial; modificri chimice minore pot transforma un strat biodegradabil ntr-unul recalcitrant. Erbicidul 2-4D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic) este degradabil n sol, n cteva zile n timp de 2,4,5,T (acidul 2,5,5-triclorfenoxiacetic) care difer printr-un singur atom de clor, rezist cteva luni. Polietilena (polimer sintetic cu formula (CH2CH2)n n care n este un numr mai mare) este refractar la atacul microorganismelor, n timp ce polietilenglicolul (CH2CH2O)n poate fi folosit ca nutrient. Relaia cert dintre structura molecular i rezistena diferit la biodegradare este ilustrat i de referent la degradare a celulozei i a ligninei. n primul caz microorganismele acioneaz prin intermediul celulazelor pentru a cliva n mod repetat acelai tip de legatur chimice ntre subunitai identice. Chiar n cazul proteinelor, legturile peptidice succesive sunt identice, dei leag aminoacizi diferii. Situaia este total diferit n cazul ligninei i a humusului, care sunt lent mineralizate datorit structurii lor alctuite din molecule i legturi diferite ntre blocurile de construcie. Dagley (1975) citeaz un exemplu de valorificare a cunotinelor privind relaia dintre structura chimic i rezisten la degradare: substituirea atomilor de Cl din poziia par n molecula de DDT cu gruparea metoxil (substituient comun al nucleului benzenic n produii naturali) permite obinerea unui pesticid, metoxiclor, foarte uor degradabil n comparaie cu DDT. Complexitatea mare a unui heteropolimer, care poate necesita pentru degradare aciunea concertat a mai multor enzime sau specii de microrganisme pentru a-l aduce ntr-o forma degradabil, prezena unor substituiri neobinuite cu clor sau ali halogeni, existena unor structuri de tip fenoli, solveni, etc.) cu efecte negative asupra microorganismelor sau enzimelor, gruprile ce le confer o mare toxicitate sunt tot atatea cauze ce pot conferi unei molecule organice caracterul de recalcitrant. 3. Absena echipamentului enzimatic necesar pentru biodegradare. Spre deosebire de biopolimeri, care sunt degradai mai mult sau mai puin lent de unul sau de mai multe microrganisme, substanele xenobiotice sunt frecvent refractare la biodegradare din cauza absenei enzimelor active asupra structurii lor. Una din explicaii rezid n faptul c apariia diferiilor polimeri naturali n cursul evoluiei a fost lent, de-a lungul a milioane sau miliarde de ani, permind evoluia paralel a catabolismului microorganismelor i a enzimelor ca surs de material de construcie pentru biosinteze i de energie. Compuii xenobiotici avnd structuri chimice foarte variate i adesea complexe au aprut ntr-un timp scurt, i conin grupri chimice n general nerecunoscute de enzimele microbiene. Unii dintre ei prezint grade diferite de asemnare cu unii compui naturali i ca urmare pot fi degradai mai mult sau mai puin lent. Degradarea celor mai muli necesit ns modificri structurale extensive nainte de a intra n cile centrale ale metabolismului bacterian. n consecin, vor fi parial sau total rezistente la degradare i se vor acumula n mediu.( Janke i Fritsche, 1985). Este probabil ca evoluia biologic a explorat un spectru limitat de ci metabolice i diferiii compui xenobiotici sunt prea ndeprtai de cile respective pentru a putea fi utilizai ca substrat pentru cretere, dei comunitile naturale de microorganisme au mare versatilitate metabolic i un potenial genetic larg, ele nu pot rspunde la marea complexitate i diversitate a substanelor sintetizate de om. De aceea este posibil ca unii 14

compui nu asigur creterea unor microorganisme, nu sunt atacai prin co-metabolism i nu servesc ca baz pentru selecia de noi genotipuri active. Incapacitatea poluanilor de a induce sinteza enzimelor degradative Concentraia foarte mic (ppm, ppb) a unor poluani n mediupoate afecta profund sensibilitatea lor la biodegradare. n aceste habitate exist riscul ca microorganismele capabile s i degradeze s fie prezente, ns concentraia poluantului s nu fie suficient pentru a induce enzimele necesare pentru degradare. Pe plan general evolutiv s-a postulat c apariia microorganismelor capabile s degradeze compuii recalcitrani sintetizai de om are loc numai n niele ecologice n care concentraia lor este suficient de mare pentru a exercita funcia de presiune n selecie. Rezistena la degradare a unor poluani organici poate fi determinat de adsorbia lor pe diferite substraturi din sol i sedimente, care le fac indisponibile pentru preluarea de ctre microorganisme. Frecvent, prin aceast adsorbie este mascat situsul de legare a enzimei de substrat, fapt care poate transforma o molecul biodegradabil n una refractar. Practic, multe pesticide se pot lega de humus, pstrndu-i caracterul xenobiotic atunci cnd snd desprinse de constituenii acestuia, prin degradarea matricei humice nconjurtoare de ctre unele microorganisme din sol. n aceste condiii, pesticidele, legate de humus, mobilizate de microorganisme pot contamina recolta i diferite organisme care nu au fost niciodat expuse anterior la aciunea lor. Rolul factorilor de mediu. Unele substane sunt biodegradabile n anumite condiii de mediu i rezistente n altele. Deci, caracterul recalcitrant nu este totdeauna intrinsec, ci este uneori determinat de intervenia unor condiii de mediu. ntre acestea, Alexander (1977, 1981) citeaz : 1) absena O2, n cazul substanelor mineralizate numai n aerobioz ; 2) prezena unor factori (acizi organici, toxine, sruri), care mpiedic multiplicarea microorganismelor active ; 3) efectul combinat al temperaturilor sczute i al presiunii n adncul mrilor ; 4) sedimentarea compuilor ntr-un situs inaccesibil microorganismelor sau acoperirea lor cu un substrat care interzice accesul acestora ; 5) concentraia extrem de redus a nutrienilor n mediu, care limiteaz multiplicarea microorganismelor active etc.

Consecinele ecologice ale prezenei substanelor xenobiotice n natur Larga utilizare a pesticidelor n practica agricol a determinat un caracter global al rspndirii lor n solurile agricole i de alt natur, n apele interioare i marine etc. Botnariuc i Vdineanu (1983) citeaz datele lui Polizu i colab. (1975) dup care izomerii i ai HCH sunt prezeni n apele celor trei brae principale ale Deltei (Chilia, Sulina i Sf. Gheorghe) n concentraii

15

variind intre 0,38 i 2,52 ppb. Apa canalelor conine cantiti mai mari (0,94-4,12 ppb), deoarece adun apele provenite din zone agricole, iar solurile lutonisipoase conin DDT + HCH n concentraii de 50-122 ppb. Diferite modaliti de rspndire pot determina apariia unor efecte nocive la distane mari de locul de aplicare, cu afectarea unor ecosisteme fragile. DDT a fost gsit n zpezile din Antarctica i n Sahara, la distane mai mari de 6000 km de locul de administrare cel mai apropiat. Toxicitatea pentru microorganisme. Microorganismele au o mare capacitate de absorbie a pesticidelor, n special, din mediile acvatice, dei se gsesc n concentraii foarte mici. Aceast aciune este favorizat n special de doi factori: 1. De suprafaa mare de contactcu mediul nconjurtor, reprezentnd, dup Whitaker, Roan i Ware (1972), 9100 cm2 n cazul unui gram de celule de levuri (8,3x 109 celule). Aceast suprafa este mai mare n cazul bacteriilor (1 g de celule bacteriene de dimensiunile Escherichia coli corespunde la 1,8x1012 celule i respectiv la 56000 cm2); 2. Cele mai multe pesticide i, n mod particular, insecticidele sunt lipofile i au o mare afinitate pentru fosfolipidele din membranele celulare (caracterul lor lipofil rezult i din proprietatea de toxice membranare, precum i din capacitatea de acumulare, la organismele evoluate, n esutul gras). Multe pesticide afecteaz activitatea bacteriilor, diminund fixarea biologic a azotului, amonificarea i nitrificarea, cu efecte perturbatoare ale circuitului N n mediile respective ; inhib, de asemenea, activitatea fotosintetizant i celulozoliza. Ele pot inhiba diviziunea celulelor vegetale i diminu producia primar a ecosistemelor prin aciunea asupra fotosintezei. Majoritatea pesticidelor acioneaz asupra fitoplanctonului (productorii primari) din mediile acvatice, diminund capacitatea lor fotosintetic de producere de C organic. n timpul unei expuneri de 4 ore s-a observatat o diminuare cuprins ntre 7% pentru diazinon i malathion, 77% pentru DDT, 85% pentru aldrin i 94% pentru heptaclor. Numai puine pesticide sunt fr efect. DDT afecteaz negativ fotosinteza chiar cnd este n concentraii foarte mici (0,1ppm). Experimental s-a demonstrat efectul de mpiedicare a creterii fitoplanctonului marin ( Protococcus sp., Chlorella sp., Dunalliela euchlora, Placodactylum tricornutum, Monochrysis lutheri) sub influena unor concentraii diferite de pesticide ca, de exemplu, diuron (0,004 ppm), DDT (60 ppm), lindan (9ppm), dipterex (500 ppm) (Whitaker, Roan i Ware, 1972). Toxicitatea asupra zooplanctonului este, de asemenea, variabil. Doza limit care blocheaz dezvoltarea pentru Daphnia pulex, dup o expunere de 48 de ore, este de 0,4 ppm pentru DDT, 0,9 pentru diazinon, 42 ppm pentru heptaclor, 1400 ppm pentru dieldrin, 3200 ppm pentru 2,4-D i 4 500 ppm pentru fenac. Aceste date demonstreaz existena unei anumite selectiviti de aciune. Efectele negative variate, uneori cu caracter selectiv, se rsfrng asupra unei game largi de animale nevertebrate i vertebrate, inclusiv asupra omului. Ele au baz fenomene de toxicitate asupra membranelor, inhibarea unor activiti enzimatice specifice etc. Ca manifestri se pot include efecte nocive asupra gonadelor i fertilitii unei game largi de organisme, afectarea sistemului nervos central, cu ataxie locomotorie, convulsii i, n unele cazuri, chiar moarte. Unele pot avea efecte teratogene sau chiar oncogene. n unele cazuri exist riscul apariiei unor fenomene de activare n cursul perioadei de remanen, n sensul apariiei unor modificri minore sub aciunea altor organisme prin care un produs puin toxic per se este convertit la un compus mai toxic i mai rezistent la biodegradare. Fenomenul a fost semnalat prima dat de 16

Jernelov i Marlin (1975) n cazul Hg anorganic, cu o toxicitate intrinsec mai mic dect a produilor si de metilare (mono- i dimetilmercur), care,pe lng faptul c sunt mai toxici, sunt mai uor de preluat de organismele acvatice din sedimente. Un fenomen similar a fost semnalat n cazul conversiei 2,4-D, uor degradabil n cteva sptmni, la un produs mult mai rezistent ui mai toxic, 2,4, 4,5-T, pentru care nu au fost evideniate microorganisme active. Persistena mai ndelungat a pesticidelor n sol poate determina efecte nocive n timp, n cazul n care n anul sau n anii urmtori administrrii lor sunt introduse prin rotaie culturi de plante sensibile la erbicide. Fenomenul de bioacumulare. Datorita solubilitii lor reduse n mediile acvatice, pesticidele au tendina de a se localiza n interiorul celulelor vii. Ca urmare microorganismele fitoplanctonului i plantele macrofite ca i fauna de toate dimensiunile pot acumula i stoca n toate n celulele i esuturile lor cantiti importante de pesticide, n concentraii inverse fata de solubilitatea lor n apa. (Code i colab.1966). n acest sens pledeaz numeroase date rezultate din observaii experimentale i/sau din mediile naturale. Gregory i colaboratorii (1969) au expus separat timp de 7 zile, la concentraii de DDT i paration de 1 ppm, cianobacteria Anacystis nidulans, alga verde Scenedesmus obliquus, alga flagelat Euglena gracilis i dou protozoare ciliate Paramecius bursaria i P.multimicronucleatum. Au constatat c microorganismele citate conin, final, concentraii de DDT de 96-964 ori mai mari i de paration de 50-116 ori mai mari dect cele din mediu. n unele cazuri, procesul de concentrare se realizeaz foarte rapid: Agrobacterium tumefaciens acumuleaz dup patru ore de contact 90% din cantitatea de dieldrin prezent n mediu, iar microfungii 75 i respectiv 60-83% din aceast cantitate. Daphnia magna, care reprezint o verig important n lanul trofic acvatic, concentreaz DDT n cantiti variind ntre 16 000- 23 000 fa de cele existente n medii acvatice. Procesul de bioacumulare (Biomagnification) este agravat de faptul c, pe lng concentrarea pesticidelor n celule, acestea nu sunt nici degradate i nici excretate n cantiti semnificative, ci sunt introduse i transmise ca atare n reeaua trofic. n aceste condiii, procesul de concentrare continu de-a lungul diferitelor verigi ale lanului trofic, teoretic cu aproximativ un ordin de mrime pentru fiecare nivel trofic succesiv. Afirmaia are la baz observaia c din biomasa utilizat la un anumit nivel trofic numai 1015% este transferat la nivelul trofic superior, restul de 85-90% fiind disipat n cursul activitilor metabolice prin respiraie. n consecin, la nivelul trofic cel mai nalt (animale carnivore, psri de prad, peti mari prdtori), poluantul poate fi prezent n esuturi n concentraii care depesc de 10 4 _ 106 ori i n cazuri extreme de 2,5x106 ori concentraia sa n mediu natural. Ramade (1976) citeaz un exemplu concret referitor la bioacumularea DDT,prezent n ap n concentraia de 0,014 ppm. nsecticidul este regsit n fitoplancton n concentraie de 5 ppm, n zooplancton i n petii fitofagi de 7-9 ppm, n petii prdtori de 22-221 ppm i n corcodelul vest- american ( Aechmophorus occidentalis) de 2 500 ppm. Aceste date ilustreaz un principiu general al polurii n sensul c cu ct un organism este mai ndeprtat n piramida trofic cu att poluantul este mai concentrat n esuturile sale. Or, dac productorii primari concentreaz poluantul n concentraii mai mari dect n mediu i fiecare nivel trofic succesiv l concentreaz peste nivelul existent n hrana sa, devine evident c un erbivor poate acumula mai mult poluant dect plantele pe care le consum, iar un carnivor din nivelul trofic cel mai nalt acumuleaz o cantitate i mai mare. n felul acesta, unele molecule recalcitrante netoxice n concentraiile existente n natur devin toxice prin acumulare

17

n concentraii mari n esuturi, determinnd efecte negative grave asupra speciilor situate la sau aproape de vrful lanului trofic. Dei omul este mai puin expus dect carnivorele aciunii toxice a acumulrii pesticidelor, deoarece i procur hrana din mai multe surse, Ramade (1976) scoate n eviden caracterul larg al acestui fenomen. n anii 60, americanii neexpui profesional la contactul cu DDT conineau n grsimile corporale 12,9 ppm din acest insecticid, francezii 5,2 iar englezii i germanii 2,3 ppm. La locuitorii S.U.A., concentraia DDT era cu 25% mai mic la vegetarieni dect la nevegetarieni. Fenomenul de bioacumulare are un caracter universal n natur, deoarece la fiecare nivel trofic, n fiecare biocenoz exist organisme concentratoare care mresc concentraia n esuturile lor, comparativ cu dozele infime de pesticid din mediu. Restrngerea biomasei la nivelele trofice superioare este asociat cu acumularea de substane recalcitrante. Aplicaii practice Biodegradarea i ndeprtarea poluanilor recalcitrani, respectiv detoxifierea i mineralizarea lor cu ajutorul microorganismelor reprezint un factor esenial n atenuarea efectelor lor ecologice i a celor ce vizeaz sntatea omului. Cunoaterea mecanismelor biodegradrii produilor naturali i ale rezistenei substanelor xenobiotice au permis introducerea n practic a unor procedee menite s se apropie de acest obiectiv prin: - Producerea de pesticide mai uor degradabile, prin includerea n structura lor a unor grupri chimice cu echivalente naturale sau introducerea unor modificri care le transform n substraturi nutritive pentru populaiile de microorganisme din ap i sol. - Utilizarea unor teste fiabile care s stabileasc biodegradabilitatea lor ntr-un timp rezonabil, precum i lipsa de toxicitate i inocuitatea, n general, nainte de comercializare i aplicarea pe scar mare. Construcia unor tulpini bacteriene cu potenial degradativ nou Pe baza acestor date i a progreselor din genetic i ingineria genetic bacterian, mai muli cercettori au ncercat s construiasc bacterii posednd ci metabolice hibride, ce evit dezavantajele cilor catabolice neproductive care limiteaz degradarea substanelor xenobiotice de ctre microorganismele slbatice. n acest scop s-a recurs att la schimbul de gene natural (prin co-cultivare), ct i la tehnici specifice de inginerie genetic. Pe baza acestor principii, Knackmuss (1984) a construit tulpini de Pseudomonas capabile s degradeze o gam larg de clorbenzoai i clorfenoli. Adugate n fluxul unor staii de epurare a apelor industriale, ele i-au dovedit utilitatea, ameliornd semnificativ coeficientul de ndeprtare a xenobioticelor haloaromatice. Ghossal i colab.(1985) au obinut prin transfer de plasmide o tulpin de Pseudomonas cepacia capabil s catabolizeze erbicidul 2,4, 5-T, dei anterior n mediu nu s-a gsit nici un microorganism capabil s fac aceast degradare. ntroducerea bacteriei reprogramate genetic n solul contaminat cu 2,4,5-T a dus la eliminarea total a acestuia, solul detoxificat permind dezvoltarea plantelor sensibile la erbicid.

18

Nu se tie dac schimbul similar de gene are loc i n ecosistemele naturale (sol, lacuri etc.) contaminate cu substane organice sintetice i nici dac transconjuganii i exercit capacitile degradative fa de xenobiotice i n prezena compuilor organici normali, uor utilizabili. O alt realizare n acest domeniu, datorat lui Hartmann i Knackmuss (1979, 1981), este cea de reunire ntr-o singur bacterie a dou secvene complementare ale unor ci metabolice implicate n catabolismul compuilor aromatici halogenai, prin rearanjarea informaiei genetice, utiliznd deci enzime preexistente. Catabolismul compuilor aromatici i al analogilor lor halogenai depinde, n primul rnd, de aciunea a dou dioxigenaze, care catalizeaz hidroxilarea substratelor primare, ducnd la formarea de catecholi sau de catecholi substituii. La multe organisme, specificitatea acestor enzime este suficient de riguroas pentru a interzice catabolismul anumitor compui halogenai. n exemplul citat, Pseudomonas putida tulpina mt-2 conine o benzoat 1,2-dioxigenaz neselectiv (cu specificiti mai largi).Cu toate acestea, ea nu poate crete pe muli benzoai halogenai, datorit specificitii riguroase a catechol 1,2-dioxigenazei,care face clivarea ciclului benzenic dependent de O2 (o enzim care nu poate metaboliza catecholii substituii. Invers, Pseudomonas sp., tulpina B 13 are o benzoat 1,2-dioxigenaz selectiv (foarte specific) i o catechol 1,2-dioxigenaz neselectiv. Activitatea combinat a celor dou tulpini aduce,mpreun, cele dou enzime neselective pentru substrat. Acionnd mpreun,ele transform compuii inaccesibili (2-clorbenzoat, 3,5-diclorbenzoat etc.) n metabolii intermediari utilizabili. Cultivarea lor continu n amestec a dus la formarea unei a treia tulpini bacteriene cu capaciti catabolice totale. Transformarea s-a realizat i prin transferul plasmidei p WWO (numit anterior TOL), care codific benzoat 1,2-dioxigenaza prin conjungare de la P. putida mt-2 la Pseudomonas sp. B 13.

MICROBIOLOGIA APELOR REZIDUALE

Apele uzate (reziduale) sunt ape evacuate dup utilizare, ncrcate cu o mare cantitate de reziduuri suspendate sau dezvoltate, ndeprtate din locuine, orae, ntreprinderi industriale, uniti agricole sau zootehnice etc. Lsate s se acumuleze ca atare, substanele organice sunt expuse degradrii cu producere de compui volatili ru mirositori. Eliminate n diferite bazine acvatice naturale determin perturbri grave de ordin fizico-chimic i exercit efecte nocive asupra florei i faunei naturale. DE aceea, din raiuni de ordin igienico-sanitar, de protecia mediului, economice i de confort evacuarea lor n natur (pe sol sau n ape) nu este posibil dect dup ce au fost fcute inofensive. n acest scop, apele uzate sunt supuse unor procedee de tratare fizice, chimice i biologice a cror complexitate variaz nu numai n funcie de proveniena lor, ci, mai ales, de soarta lor final (reutilizare, evacuare pe sol sau n ape naturale. Clasificarea apelor reziduale

19

Apele menajere (fecaloid-menajere) sunt ape folosite care conin materiale organice de provenien vegetal sau animal, n stare brut (celuloz, hemiceluloze etc.) sau n diferite grade de descompunere (fecale), urin, ape de splare, grsimi, sruri minerale, detergeni i un numr imens de microorganisme diferite, inclusiv ageni patogeni. Gradul de degradare a substanelor organice este variabil i,n general, corelat cu durata perioadelor de stagnare. Ca stare fizic, substanele coninute pot fi prezente n soluii, suspensii coloidale, suspensii de particule solide cu dimensiuni mai mari. Apele oreneti colecteaz apele menajere i pe cele rezultate din precipitaii ncrcate cu diferite impuriti, cele folosite pentru splarea strzilor* i frecvent ape uzate industriale. Apele uzate industriale difer foarte mult n funcie de provenien. Unele sunt biodegradabile, cum sunt, n special, cele din industria celulozei i a hrtiei i mai ales din industria alimentar (fabrici de zahr, bere, conserve, sucuri, abatoare, industria laptelui). Ele ridic, totui, probleme speciale de la caz la caz, implicnd participarea n epurare a unor microorganisme caracteristice. Apele nedegradabile (industria cauciucului sintetic, ngrminte chimice, petrochimice, n general, siderurgie, metalurgie etc.) conin uleiuri, hidrocarburi, tiocianai, substane aromatice, sruri toxice de Hg, Pb, Cd, As, Cu. Ele sunt tratate prin tehnici complexe nebiologice. Apele uzate industriale ridic probleme specifice, de aceea amestecul lor cu apele oreneti este de nedorit, deoarece procedeele de epurare sunt incompatibile. Frecvent, apele uzate industriale pot conine substane care mpiedic dezvoltarea microorganismelor. Apele reziduale din zootehnie includ ape cu mare ncrcare organic, frecvent cu substane rezistente la degradare (celuloz, hemiceluloze, lignine) i cu specific aparte de epurare. Provin de la cresctorii de porcine, bovine i psri.

MICROBIOTA APELOR UZATE Din punct de vedere ecologic, apele de canal reprezint unul din cele mai complexe medii, n care populaiile totale i diferitele grupuri fiziologice sunt expuse la mari fluctuaii cantitative i calitative, precum i la interaciuni dintre cele mai complexe. Microbiota apelor menajere cel mai mult studiat include un numr mare de bacterii heterotrofe (Pseudomonas fluorescens, P. aeruginosa, Bacillus cereus, B. subtilis, Enterobacter, Zoogloea, Streptococcus faecalis) i numeroase alte specii care degradeaz glucidele, proteinele, grsimile, celuloza etc. Alturi de bacterii sunt prezente numeroase levuri (Saccharomyces sp., Candida sp., Cryptococcus sp., Rhodotorula sp.) sau similare levurilor (Yeast-like microorganisms), precum i spori i hife de Leptomites lacteus i Fusarium aquaeductum. Virusuri i microorganisme patogene

20

Frecvent, apele uzate pot conine diferii ageni patogeni pentru om i animale. Sursa major de impurificare este reprezentat de materiile fecale ale omului sau animalelor bolnave. Un rol important revine purttorilor cronici (eliminatori asimptomatici) cu focare infecioase n splin, ficat, cile biliaresau urinare. Dup Poole i Hobson (1979), anual, 500 de milioane de oameni sunt afectai de boli asociate cu consumul apei infectate. Dintre acestea, aproximativ 10 milioane mor. Principalii ageni patogeni semnalai sunt: Virusuri: Poliovirus, Coxsackie, virusul hepatitei. Bacterii: Salmonella sp. (S. typhi, S.parathyphi), Shigella sp., Brucella sp., Leptospira sp., Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, Mycobacterium tuberculosis, spori de Bacillus anthracis i Clostridium perfringens, C. novyi, C. septicum. Fungi: numeroi fungi imperfeci. Protozoare: Entamoeba histolytica. n general, microorganismele patogene nu se pot dezvolta nici n apele uzate i nici n bazinele naturale (ruri, lacuri, mri) n care sunt deversate. Ele pot gsi aici doar condiii de supravieuire temporar cu meninerea virulenei. n aceast stare, nainte de a fi distruse pot declana epidemii hidrice prin consumul apei contaminate, prin scldat (transcutanat cu Leptospira sp.) sau dup consumul de alimente infectate neprelucrate termic. Tehnicile de tratare apelor uzate vizeaz: 1. mineralizarea materiei organice biodegradabile sub actiunea microorganismelor i eliminarea potenialului lor de producere a polurii; 2. inactivarea agenilor patogeni (virusuri, bacterii, fungi, protozoare); 3. ndeprtarea substanelor minerale produse prin mineralizare. Evacuate ca atare n bazinele acvatice receptoare pot stimula creterea algelor i ulterior, a altor microorganisme. Aceasta etap care include procese de denitrificare (pentru ndeprtarea excesului de nitrai) i de defosfatare, ine de treapta teriar a tratrii i este mai rar practicat (Unz i Davis, 1975; Taber, 1976); 4. reducerea volumului nmolului obinut final i aducerea lui la condiii de stabilitate i inerie biologic. Unele procese asigur conversia substanelor degradate la gaze care se degaj sau sunt colectate i folosite drept combustibil. Epurarea biologic, practicat n situaii specializate, reprezint o etap a unui demers complex, care implic intrarea n aciune a unor mecanisme fizice, chimice i biologice. Prima etap (de tratament preliminar, asigur concentrarea i colectarea materialelor particulare i a celor lichide care sunt tratate separat pentru evitarea suprancrcrii reactorului biologic. n aceasta faz se realizeaz ndeprtarea prealabil a materialelor cu dimensiuni mai mari (nisip, pietre, pri metalice etc.), a celor sedimentabile sau flotante (grsimi, hidrocarburi), utiliznd denisipatoare, grtare, site etc. Totodat este ndepartat i o mare cantitate de substane organice (n cazul apelor menajere 30-40% din CBO, dup Adamse, Deinema i Zehnder, 1984). Etapa a doua (tratament secundar). Apa preluata dup tratamentul initial este expusa, dup caz, interveniei unor microorganisme aerobe sau anaerobe, prezente n suspensie sau ataate de diferite substraturi. Biodegradarea materiei organice este favorizat de tendina substanelor organice solubile sau coloidale de a adera la interfaa diferitelor substraturi. 21

Practic, diferitele metode de epurare biologica reproduc ntr-un spaiu restrns, intr-un ritm accelerat de cteva mii de ori, n condiii pe ct este posibil controlate, fenomene care se produc ca atare i n condiii naturale ns ntr-un ritm lent (ntr-un ru poluat pe un traiect lung de cteva zeci de km). Etapa final recurge la procedee chimice (floculare chimica, dezinfecie) i fizice (filtrare), menite s asigure eliberarea fr riscuri a lichidelor i reziduurilor solide n natur. n cazul apelor destinate refolosirii ca apa potabila (spre exemplu, apa folosit n oraul Piteti asigur, dup epurare i prin intermediul rului Arge, o parte din apa potabil a oraului Bucureti) se recurge la epurarea avansat. Aceasta include procedee fizice, chimice i biologice mai mult sau mai puin complexe (filtrare, coagulri, precipitri, oxidri, denitrificare etc.), care completeaz efectul de ndeprtare a substanelor organice, excesului de N i de P, asigurnd un grad avansat de epurare i condiii optime de securitate pentru consumator. Clasificarea metodelor de epurare biologic a apelor uzate . n functie de condiiile de mediu (prezena sau absena oxigenului) i de natura microorganismelor active, tehnicile de epurare biologic formeaz dou grupuri distincte. Tehnicile aerobe include utilizarea filtrelor biologice, a nmolului activat sau a iazurilor biologice de oxidare. Tehnicile anaerobe recurg la degradarea anaerob (metantancuri) sau la iazurile septice.

22