Microbiologia bolii parodontale

Boala parodontal - cea mai frecvent condiie inflamatorie cu caracter distructiv din patologia uman. Infecie produs de specii bacteriene care interacioneaz cu esuturile i celulele gazdei ducnd la eliberarea de citokine si ali mediatori ai inflamaiei, avnd drept consecin distugerea structurilor parodontale. Clasificarea bolii parodontale 1999 ADA (American Dental Association) 1.Gingivita asociat cu biofilmul bacterian neasociat cu biofilmul bacterian 2.Parodontita cronic (PC) localizat generalizat - >30% din dini sunt afectai 3. Parodontita agresiv (PA) localizat generalizat >30% din dini sunt afectai; Severitatea se apreciaz pe baza adncimii pungii (PD = periodontal pocket depth) i a pierderii de ataament gingival (CAL = clinical attachment level): uoar 1 ~2 mm; medie 3 ~ 4 mm; sever 5 mm; 4. Parodontita din bolile sistemice 5. Boala parodontal necrozant (BPN) gingivita ulceronecrotic parodontita ulceronecrotic 6.Abcese ale esutului periodontal abces gingival abces parodontal abces pericoronal 7.Parodontita asociat cu leziuni endodontice

Etiologia bolii parodontale

Teoria nespecific - boala parodontal este rezultatul elaborrii de produi toxici de ctre ntreaga flora a plcii. Teoria specific - anumite tipuri de plac sunt patogene iar patogenitatea depinde de prezena sau de numrul mare al unor microorganisme specifice. Teoria ecologic

 boala parodontal este rezultatul modificrilor habitatului (nutrieni, pH, potenial redox): selecia bacteriilor patogene este influenat direct de schimbrile de mediu; boala nu are o etiologie specific; orice specie cu anumite caracteristici poate contribui la evoluia bolii. Astfel semnificaia clinic a speciilor nou descoperite poate fi stabilit pe baza caracterelor fiziologice ale fiecreia dintre ele. Boala poate fi prevenit nu numai prin atacul intit asupra patogenilor parodontali ci i prin interferarea cu presiunea selectiv a factorilor de mediu responsabili de nmulirea lor. Microbiologia bolii parodontale Numrul total al bacteriilor din placa subgingival este de 2 ori mai mare n starea de boal comparativ cu starea de sntate, rspunsul imun fiind crescut n prima situaie. i morfotipurile bacteriene difer n cele 2 situaii: n starea de sntate sunt mai puine spirochete, bacili gram negativi dect n starea de boal. Concluzie: - biofilmul dentar subgingival al strii de sntate poate gzdui n cantiti foarte mici patogeni parodontali, ei fiind incapabili s concureze cu bacteriile gram pozitive zaharolitce dominante. La acumularea biofilmului, rspunsul inflamator care apare duce la creterea fluxului lichidului crevicular gingival cu alterarea status-ului nutriional local acesta duce la nmulirea bacteriilor proteolitice gram negative, creterea pH ului i scderea potenialului redox. Proteazele interfer cu controlul gazdei asupra rspunsului inflamator, agravat i prin creterea continu a masei bacteriilor gram negative. Biofilm subgingival stare de sntate domin bacterii gram pozitive zaharolitice; Biofilm subgingival inflamaie domin bacteriile gram negative proteolitice. Trecerea de la gingivit la parodontit depinde de 3 factori: susceptibilitatea gazdei; prezena bacteriilor patogene; prezena bacteriilor protectoare;

Metode de diagnostic microbiologic n boala parodontal

1. Microscopia optic: cu fond luminos cu fond negru cu contrast de faz 2. Cultivarea 3. Tehnici PCR 4. Teste imunoenzimatice ELISA, BANA 5. Imunofluorescena 6. Gaz lichid cromatografie 7. Alte teste 8. Latexaglutinarea 9. Examenul radiologic Diagnostic microbiologic 1. Recoltare: Proba biofilm bacterian subgingival; Etape: izolarea dintelui; ndeprtarea mecanic a plcii supragingivale; uscare; recoltarea probei cu ajutorul conurilor de hrtie de filtru. 2. Transport: - maxim 30 minute; - mediu de transport : bulion thioglicolat cu resazurin 3. Incubare - 37C n anaerobioz, 5-7 zile. Pentru examenul microscopic direct, este prelevat exsudatul inflamator din crevasele gingivale sau punga parodontal (cnd este deja format), dup ndeprtarea plcii bacteriene supragingivale. Cnd punga parodontal lipsete i exist doar detaarea gingiei marginale, prelevarea se face cu ajutorul conurilor din hrtie de filtru sterile, care sunt introduse cu blndee n sulcusul gingival i sunt meninute cca 1 minut. Apoi, sunt retrase cu grij din cavitatea oral i introduse n tuburi cu mediu de transport reductor fluid (e.g., bulion thioglicolat) pentru a asigura viabilitatea bacteriilor anaerobe i microaerofile. Cnd este prezent punga parodontal, este prelevat coninutul acesteia cu ajutorul unei chiurete sterile. Punga chiuretat este introdus ntr-un tub cu mediu de transport reductor.

Pentru examenul bacteriologic, tuburile coninnd probele de la pacieni sunt centrifugate, supernatantul ndeprtat, iar din sediment sunt efectuate: Preparat umed ntre lam i lamel ce va fi examinat la microscopul cu fond ntunecat pentru evidenierea treponemelor orale asociate. Frotiu colorat Gram, pentru examenul citobacterioscopic (prezena i intensitatea reaciei inflamatorii, categorii microscopice prezente n prob). nsmnarea pe medii de cultur selective pentru bacilii gram-negativi anaerobi (e.g., Wilkins-Chalgrene cu vancomicn i acid nalidixic) i pentru Actinobacillus actiomycetemcomitans (e.g., agar-tripcaz-soia-snge, cu neomicin i bacitracin). Culturile sunt incubate anaerob, respectiv microaerofil i urmarite 4 7 zile deoarece majoritatea speciilor implicate au cretere lent. Din coloniile suspectate ca aparinnd patogenilor parodontali (coloniile mici, negre, lucioase pot aparine speciilor de Prevotella, cele mai mari, brune speciilor de Porphyromonas etc.) sunt efectuate: teste de identificare biochimic, cromatografie, PCR (dac sunt posibiliti tehnice) - asigur identificarea rapid i precis a izolatelor din pungile parodontale, antibiograma, prin metoda diluiilor, cu aflarea concentraiei minime inhibitorii, sau prin metode rapide, moderne cu determinarea punctelor de ruptur pentru unul sau mai multe antibiotice. Examenul microscopic Frotiuri colorate Gram rapid, ieftin i util pentru pacient; rol n stabilirea prognosticului; justific continuarea investigaiei microbio-logice. Microscopia cu fond negru i contrast de faz Nu diferentiaz ntre treponeme patogene i comensale - Frotiul Gram: placa bacterian asociat cu starea de sntate parodontal este compus din coci, Gram pozitive. - O cretere relativ a numrului de bacili Gram negativi, de form i dimensiuni variabile este legat de apariia gingivitei iar flora abundent constituit din bacili Gram negativi la care se asociaz un numr mare de spirochete se asociaz la rndul su cu parodontita adultului. - Prezena spirochetelor este direct proporional cu adncimea pungii parodontale, acestea fiind teoretic absente n cazul unui parodoniu sntos.

Recoltarea probele din pungile parodontale de la pacieni cu diagnostic clinic de parodontit marginal cronic. Recoltarea se face cu conuri de hrtie sterile de 20 de mm ce au fost meninute timp de 30 secunde n punga parodontal dup ndeprtarea prealabil a plcii bacteriene supragingivale, pentru a se evita contaminarea probei cu flora supragingival. Conurile se descarc n tuburi sterile cu 0,5 ml ser fiziologic steril. Examinarea microscopic Din suspensia obinut n ser fiziologic, se prelev volume standardizate cu ajutorul unei anse calibrate de 10l, volume care se folosesc pentru prepararea frotiurilor. Frotiurile se coloreaz Gram i se examineaz la microscop. Aspectele oferite de examinarea unui frotiu colorat Gram folosite drept criterii de evaluare pot fi: ncrctura bacterian a probei; prezena florei Gram negative (bacili); prezena treponemelor orale.

Alte sisteme de identificare

Detectare de enzime preformate (constitutive) cu substrate cromogene sau fluorogene Rapid ANA, Rapid ID 32 A, BBL Crystal, API ZYM CDC Presumpto plates I, II, III agar Lombard Dowell Microbe Lynx System spectroscopie de mas TOPAS (Toxic OralPathology Assay) este produs de catre ALT Bioscience U.S.A. i reprezint un test de toxicitate bisecven-ial, colorimetric, care se face extemporaneu, n cabinet i care se bazeaz pe detectarea a doi markeri ai infeciei bacteriene la nivelul fluidului crevicular gingival. 1. Iniial, testul TOPAS este desemnat s detecteze prezena toxinelor bacteriene din lichidul anului gingival. Aceste toxine sunt produi de metabolism ai bacteriilor anaerobe patogene ce apar la nivelul siturilor bolnave, active, de la nivelul anului gingival i al feei dorsale a limbii i includ compui volatili ai sulfului (hydrogen sulfurat i metilmercaptan) i poliamide (putresceina i cadaverina), toxine ce au fost artate a se afla n concentraii extrem de mari la nivelul siturilor parodontale infectate i active. Principiu

Acest test se bazeaz pe reacia dintre toxinele microbiene i un amestec de reactivi chimici din care rezult un produs de culoare galben a crei intensitate colorimetric este direct proporional cu concentraia de toxine microbiene din mostra recoltat. 2. Cea de-a doua parte a testului TOPAS este desemnat s detecteze nivelul crescut al proteinelor totale din lichidul crevicular. Aceste proteine totale includ att proteine bacteriene, ct i proteine inflamatorii de tipul anticorpilor i proteinelor serice umane (albumina seric) i asta se datoreaz faptului c infecia bacterian crete nivelul acestor proteine pe msur ce lichidul anului gingival se transform dintr-un transsudat seric srac n proteine ntr-un exudat seric bogat n proteine, aceast cretere provenind att de la gazd, ct i de la microorganismele ce se dezvolt n numr mare la nivelul sitului infectat. Cu ct nivelul proteinelor totale este mai mare, cu att reacia de culoare albastr va fi mai intens; trebuie remarcat faptul c sngele sau saliva pot contamina mostrele recoltate i afecta rezultatele testului n sensul indicrii unui nivel mai crescut de proteine. TOPAS este calibrat folosind hidrogenul sulfurat (H2S) astfel nct standardele de toxicitate variaza de la 0mM (nu exist toxicitate) i pn la 2 mM (toxicitate sever). n plus fa de H2S, TOPAS detecteaz i prezena altor compui sulfhidrici de tipul mercaptanului (CH3 SH), dimetilsulfidelor (CH3 S CH3) i dimetildisulfidelor (CH3 SS CH3) precum i toxine fungice ce reacioneaz cu thiolul, de tipul gliotoxinei. n plus, TOPAS reacioneaz cu poliamide de tipul cadaverinei i putresceinei, producnd o coloraie galben. TOPAS este de asemenea desemnat s detecteze nivele crescute de proteine de la nivelul lichidului anului gingival i care sunt caracteristice siturilor parodontale active; aceste proteine provin din surse microbiene, surse locale produse de factori ai organismului gazd (de tipul anticorpilor, albuminei serice, aspartat aminotransferazei, betagluconidazei i fosfatazei alcaline) i din protein serice. Aceast a doua faz a TOPAS se bazeaz pe colorarea acestor proteine cu pigmeni albatri, intensitatea culorii fiind direct proporional cu cantitatea de proteine de la nivelul lichidului an-ului gingival. TOPAS este calibrat n acest sens folosind albumina seric uman ca standard proteic, cu nivele de la non-detectabil (<5 microgr.) pn la abundent (>50 microgr.) i asta deoarece albumina seric este considerat ca fiind cea mai abundent protein de la nivelul lichidului anului gingival, att la nivelul situsurilor sntoase, ct i la nivelul celor bolnave.

a. Recoltarea Determinrile cu testul TOPAS se fac obligatoriu nainte de orice alt procedur terapeutic dentar. Se usuc situs-ul din care se va face recoltarea cu mee sterile sau cu un jet de aer de la unitul dentar, cu scopul de a ndeprta orice posibilitate de contaminare extern fluid cu saliv nainte de recoltare. Se scot conurile de hrtie din pachetul steril. Dac suntem interesai de statusul unui anume dinte, atunci recoltarea mostrelor de lichid crevicular gingival se va face la nivelul anului att mesiovestibular ct, i mesiolingual. Dac suntem interesai de o anumit pung parodontal, atunci recoltarea se va face de la nivelul acesteia. Se inser conurile de hrtie n interiorul anului gingival, respectiv al pungii parodontale, direcionnd vrful conului de hrtie apical pn cnd se simte o rezisten uoar. Se las conul de hrtie pe loc timp de 1 minut, dup care se agit uor tubul cu capacul galben pentru determinarea toxicitii n scopul aezrii reactivului din interior pe fundul acestuia. Se desface capacul i se aaz n poziie vertical n stativ. b. Determinarea propriu-zis Dup 1 minut se plaseaz imediat conul de hrtie n tubul cu reactiv asigurndu ne c vrful conului este submers n totalitate n reactivul respectiv. Se nchide tubul cu capacul pentru a mpiedica evaporarea eventualelor toxine volatile, dup care se agit uor tubul n vederea amestecrii compuilor din lichidul anului gingival cu soluia de reactiv. Se las tubul n repaus timp de 5 minute pn cnd se formeaz culoarea galben de reacie, dup care se msoar cu ajutorul scalei de toxicitate; cu ct culoarea galben este mai intens, cu att nivelul de toxine bacteriene din lichidul anului gingival este mai ridicat. Apoi se deschide capacul albastru de la tubul cu reactiv pentru protein e i se toarn n tubul cu capac gaben, cel cu reactiv pentru toxine. Se pune din nou capacul albastru i se agit viguros coninutul tubului, se las timp de 2 minute pentru a se produce colorarea. Este necesar cronometrarea exact la 2 minute, deoarece colorarea continu n timp i depirea termenului poate s duc la obinerea de rezultate false! Dac mostra de lichid crevicular conine proteine, soluia va vira de la o culoare aquamarine (albastru deschis) la o culoare albastru nchis; cu ct mostra c onine mai multe proteine, cu att reactivul va avea o culoare mai intens de albastru nchis iar determinarea se va face cu ajutorul scalei de proteine.

GLC gaz lichid cromatografie

Evideniaz produi finali ai metabolismului bacterian: acizi grai cu lan scurt acizi grai cu lan lung Tehnici de biologie molecular - real time PCR Micro-Ident - PCR standart Micro-Ident - Testul micro-IDent A face posibila determinarea celor cinci markeri importanti parodotogeni: Aggregatibacter actino-mycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus si Treponema denticola). - In unele cazuri de parodontita spectrul de diagnostic poate fi largit prin determinarea altor 6 germeni: Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Eikenella corrodens, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum si Capnocytophaga spp (testul micro-IDent B). Testele micro-IDent sunt utile pentru: - identificarea zonelor cu risc si recunoasterea precoce a recidivelor; - alegerea antibioticului adecvat si documentarea succesului terapeutic; evaluarea riscului de implant nereusit inaintea tratamentului. Interpretarea rezultatelor In cazul deteciilor ADN pozitive, pentru fiecare bacterie patogen rezultatul va fi raportat astfel: - slab pozitiv, - pozitiv, - intens pozitiv. Aceste moduri de comunicare se coreleaza cu cantitatea de germeni identificati in prob. PCR standart- Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare). Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz).

ELISA- pricipiul metodei,indiferent de tipul ELISA ales,este n esen acelai i se bazeaz pe reacia antigen-anticorp.Antigenul sau anticorpul de captur este fixat pe un suport solid dup care este pus n contact cu o imunoglobulin,un antigen sau respectiv orice molecul pentru care are specificitate. O enzim cuplat fie direct de imunoglobulin sau de un alt anticorp antiimunoglobulin degradeaz un substrat cromogen incolor producnd un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de und corespunztoare. BANA Test colorimetric Testul pozitiv indic prezena Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus n prob. TESTUL BANA este o adaptare a testului de hidroliza BANA conceput de Dr. Walter Loesche (Univ. Michigan) care se bazeaza pe detectarea unei enzime care este secretata de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola si Bacteroides forsythus, cele trei bacterii anaerobe frecvent asociate cu parodontita adultului sau cu halena fetida.

Din 60 de specii subgingivale studiate [Manabu M, 2001] doar acestea trei secreta aceasta enzima capabila sa hidrolizeze peptidul sintetic benzoil-DLargininnaftilamida (BANA) cu care este mbibata banda test. - Daca oricare din aceste trei specii este prezenta se produce hidrolizarea enzimei BANA si apare culoarea albastra, indicatorul testului pozitiv. - Cu ct este culoarea mai intensa cu att concentraia microorganis-melor BANA pozitive este mai mare. - Testul BANA poate detecta simultan prezenta uneia, a doua sau a celor trei microorganisme, cu aceeasi acuratee ca si sondele ADN, testul ELIZA sau imunofluorescenta indirecta [Loaesche WJ, 1992]. - Sensibilitatea acestor trei metode este de 90-96 % iar acuratetea de 83-92 %. - n acelasi studiu comparativ efectuat de Loesche metoda detectarii acestor - microorganisme prin culturi microbiene a avut o acuratete de 50-62%. -

Imunofluorescena reprezint o tehnic de imuno histochimie prin marcare cu

compui fl uoresceni,utilizat pentru demonstrarea prezenei anticorpilor fixai la nivelul esuturilor sau circulani n fl uidele organismului. Aceast metod este utilizat n dermatologie att pentru investigarea fi ziopatologiei afeciunilor cutanate, ct i n scop diagnostic n multiple patologii, cu o valoare semnifi cativ mai ales n cazul afeciunilor buloase autoimune i a bolilor auto-imune de esut conjunctiv.Imunofluorescena direct (IFD) este o procedur ce determin identifi carea anticorpilor legai de antigene tisulare utiliznd un fragment de esut ob- inut de la pacient. n mod clasic se descriu dou tipuri de probe ce pot fi examinate prin IFD, respectiv fragmente de tegument sau mucoase prelevate prin biopsie. IFD este o metod extrem de valoroas pentru confi rmarea unui diagnostic de sus piciune i pentru efectuarea diagnosticului diferen ial ntre maladiile imunobuloase. Imunofl uo rescena indirect (IFID) este util n situaiile n care metoda direct este negativ sau nespecific . Alte tehnici - FISH (Fluorescence in situ hybridization) hibridizare fluorescent in situ - Electroforez n gel de poliacrilamid duodecil sulfat Concluzii Cultivarea i PCR cele mai folosite. Nici o metod nu poate fi considerat per se de referin. Combinarea de teste cea mai buna metod.

 Sistemul Vitek si E-Test Indicaii Identificare bacterian AST- testul de susceptibilitate la antibiotice Orientare epidemiologic i raportare Capaciti reduce timpul de identificare a bacteriilor i a susceptibilitii la antibiotice ofer un meniu destul de complex satisface necesitile de laborator n orice mrime

Examenul radiologic
Examenul radiologic este principalul examen complementar utilizat n parodontologie. Examenul radiografic este indispensabil, nu numai pentru precizarea diagnosticului i stabilirea planului de tratament, dar i ca imagine de referinO pentru urmrirea evoluOiei cazurilor n timp. Dezvoltarea vertiginoas a imagisticii medicale, mai ales n ultimele 3 decenii, a deschis calea utilizrii n explorarea patologiei orale i maxilo-faciale, a 4 metode imagistice, toate aceste tehnici fiind complementare: radiologia convenOional, computer-tomografia (CT), imagistica prin rezonanO magnetic (IRM), ecografia. TIPURI DE IMAGISTIC UTILIZATE N PARODONTOLOGIE 1. EXAMENUL RADIOGRAFIC PRIN IMAGISTIC ANALOG -Imagistica cu raze X ( Rntgendiagnostic). Razele X sunt oscilaOii electromagnetice cu lungime de und situat ntre

razele UV i razele (gama) folosite n diagnostic. Producerea lor se face ntr-un tub de raze X, prin frnarea brusc pe anod a unui fascicul de electroni rapizi emanaOi de un catod incandescent, sub acOiunea unui curent de nalt tensiune, aplicat tubului generator. Razele X, emise de tubul radiogen n instalaOii specializate, sunt proiectate pe regiunea anatomic de evidenOiat i trecnd prin corp sunt absorbite diferenOiat n funcOie de compoziOia chimic a structurilor, densitate, grosime i distanOa de emisie a fasciculului. La ieirea din structurile anatomice studiate, fasciculul de radiaOii este atenuat energetic, neomogenitatea sa exprimnd diferenOele de absorbOie ale organelor/Oesuturilor strbtute. Prin efectul ionizant/fotochimic, fotonii X ieiOi din corp vor impresiona filmul radiografic sau ecranul fluoroscopic, realiznd o imagine structurat. Radiologia convenOional a fost i rmne examenul iniOial, care permite depistarea celei mai mari prOi din patologia maxilo-facial, inclusiv parodontal. Tehnicile de radiografiere cu film extraoral sunt: Radiografia panoramic Ortopantomografia Tehnici de radiografiere cu film intraoral: Radiografiile retro-dento-alveolare i bite-wing IncidenOa bite-wing (interproximal) Tehnica bisectoarei (metoda Cieszynski-Dieck) Tehnica planurilor paralele IncidenOe cu film ocluzal 2. IMAGISTICA DIGITAL a. Imagistica digital direct radioviziografia computer-tomografia Computer-tomografia clasic CT de nalt rezoluOie (CT-HR) Computer-tomografia volumetrica (CBCT) b. Imagistica digital indirect imagistica digital prin scanare imagistica indirect cu plci de fosfor fotostimulabile Imagistica prin rezonanO magnetic (IRM)