UMF GR.T.

POPA
FACULTATEA DE MEDICINA DENTARA

Acid production in dental plaque after

exposure to probiotic bacteria

Producerea de acid n
placa dentar dup
expunerea la bacterii
probiotice

Ivanov Ion
Grupa 18, seria B,

MD III -2015

Abstract
Context: Interesul crescator ale lactobacililor probiotici n
meninerea sntii a ridicat problema riscurilor poteniale, pe
care acestea le pot determina. Un posibil efect secundar ar putea fi
o acidogenicitate crescuta n placa dentar. Scopul acestui studiu a
fost de a investiga efectul lactobacililor probiotice asupra formarii
acidului lactic din placa in vitro i in vivo.
Metode: n prima parte (A), suspensii de dou tulpini de
Lactobacillus (L. reuteri DSM 17938, L. plantarum 299v) au fost
adugate la suspensii de placa dentara supragingivala colectata de
la aduli tineri sntoi (n = 25).A fost analizata producerea acidului
lactic dupa fermentare fie cu xilitol, fie cu fructoza. n partea a doua
(B), subiecilor (n = 18) li s-au dat pastile cu lactobacili probiotici
(L. reuteri DSM 17938 i ATCC PTA 5289) sau placebo timp de dou
sptmni ntr-un studiu dublu-orb, randomizat si incrucisat.
Concentraia de AL n probele de plac supragingivala a fost
determinat la momentul iniial i dup 2 sptmni. Cantitatea de
streptococi mutans si lactobacilli din saliva au fost estimate prin
metode *chair-side*
Rezultate: Suspensiile de plac cu L. reuteri DSM 17938 au produs
semnificativ mai puin AL comparativ cu L. plantarum 299v sau de
control (p <0,05). Fructoza a dat concentraii mai mari de AL dect
xilitolul. n partea B, nu au existat diferene semnificative in
producerea de AL ntre momentul iniial i monitorizare n oricare
dintre grupe i nu exist diferene ntre grupul de test i ce cu
placebo. Cantitatea de streptococci mutans nu a fost modificat
semnificativ n timpul interveniei, dar cantitatea de lactobacili a
crescut semnificativ n grupul de test (p <0,05).
Concluzie: Producia de acid lactic n suspensiile de placa si
lactobacili probiotici a fost dependent de tulpina i acest studiu
asigura ca nu exista nici o dovada de cretere a aciditii in placa
prin furnizarea de lactobacilli probiotici dupa fermentare fie cu
fructoz , fie cu xilitol. Protocolul de studiu a fost aprobat de ctre
Comitetul National Danez pentru Biomedical Research Ethics
(Protocolul nr H-2-2010-112).
Anul de nregistrare: NCT01700712

Context:
Bacteriile probiotice au fost mult timp folosite pentru mbuntirea
sntii gastro-intestinale [1], i exist dovezi emergente ca
bacteriile probiotice de asemenea ar putea sa influenteze benefic
asupra sanatatii orale. Mai multe studii au artat o scdere a
numarului de streptococci mutans orali dup consumul pe termen
scurt a L. reuteri [2-5] i L. rhamnosus [6], i cteva au demonstrat
un efect privind prevenirea i controlul [7-9] cariilor. Cu toate
acestea, mai puina atenie a fost acordat riscului potenial de
utilizare a probioticelor. Lactobacilii sunt considerati o parte a
microflorei orale rezidente, dar in urma regimurilor probiotice au
fost raportate cantitati extrem de crescute ale acestora. Lactobacilii
sunt foarte acidogeni si acidurici, dar fiind depistati in principal in
leziunile carioase profunde, nu sunt considerati ca ar fi implicati in
initierea leziunilor carioase. Capacitatea lactobacililor probiotici de a
fermenta zaharuri s-a dovedit a fi dependenta de tipul de zaharuri si
variatia intre diferite tulpini in vitro. [12]. De exemplu, tulpinile de L.
plantarum au produs acizi la o rat rapid, n timp ce L. reuteri a
generat ncet reacii slabe cu glucoza, lactoza, zaharoza, maltoza i
melibioza att n condiii aerobe cat si in cele anaerobe [12]. Cu
toate acestea, relevana clinic a acestor constatri este slab
cercetata. Recent, Marttinen i colaboratorii [13] au raportat c
administrarea de pastile ce contin fie L. rhamnosus GG sau L. reuter
nu afecteaza nivelurile de acid lactic n placa dentara. Prin adugare
de bacterii probiotice la mai multe produse disponibile pe piaa i a
consumului tot mai mare, sunt necesare si importante studii privind
siguranta administrarii orale a lactobacililor. Scopul nostru a fost de
a investiga efectul lactobacililor probiotice asupra producerii de acid
lactic n placa dentar supragingivala in vitro i in vivo. Ipoteza nul
a fost c acidogenicity nu va diferi de la placebo sau control.
Ipoteza nul a fost c acidogenicitatea nu va fi diferita la grupul
placebo sau de control.
Metode

Investigarea a fost realizat n dou directii: un studiu de laborator

i un studiu dublu-orb, randomizat, incrucisat. Pentru partea clinica,
un calcul de putere ( = 0,05 i = 0,20) a fost facut pe baza
constatrilor care au indicat c a fost nevoie de 18 persoane in
grupurile de test si placebo respectiv. Tulpinile probiotice utilizate n
ambele pri sunt toate disponibile comercial i utilizate n buturi
din fructe i sub forma de comprimate. Protocolul de studiu a fost
aprobat de ctre Comisia Naional Danez pe Biomedical Research
Ethics (Protocolul nr H-2-2010-112). Numrul de studii clinice
NCT01700712.

Partea A
Douzeci i cinci de aduli tineri sntoi de ambele sexe (vrsta
medie 27 de ani), cu sntatea oral necompromis (medie DMFT=
4) au fost nscrii dup consimmntul informat. Nici unul dintre
subieci nu au fost consumatori obinuii de produse probiotice. Ei
au fost instruii s se abin de la periajul dintilor timp de 24 de ore
naintea vizitei lor. Placa dentara supragingivala a fost colectata de
la toi dinii cu un explorator bont, comasata i introdusa intr-un tub
de plastic. Probele proaspete a fost suspendate i omogenizate n
PBS (soluie salin tamponat cu fosfat) (pH = 7,2) i ajustate la o
densitate optic de OD = 0,2 la 340 nm. Cinci sute de l de
suspensiile de placi au fost ulterior amestecate cu 500 l de
suspensiile cu densitate egala ale L. reuteri DSM 17938 (Biogaia,
Stockholm, Suedia) sau L.plantarum 299v (Probi AB, Lund, Suedia)
n PBS. Tulpinile Lactobacillus au fost cultivate n Man Rogosa
Sharpe (MRS) bullion (Oxoid Ldt., Basingstoke, Hampshire, Marea
Britanie), introduce in incubator la 37 C in anaerobioza timp de 24
h i apoi splate de dou ori n PBS. 1 ml de suspensie de placi fr
adaos de bacterii probiotice se folosete pentru control. De
asemenea, suspensii de 1 ml de lactobacili cu aceeai densitate
optic ca celelalte probe au fost folosite ca martori. Prin
spectrofotometrie de baz (Genesys 10 uv de scanare, Thermo
Scientific, MA, Statele Unite ale Americii) valorile au fost nregistrate
i suspensiile au fost apoi incubate timp de 1 or la 37 C, fr
agitaie. OD-citirile s-au repetat i producerea de acid lactic a fost
iniiat prin adugarea a 25 l de fructoz (10%) sau xilitol (10%)
la fiecare prob. Dup 30 de minute de continuare de incubare,
fermentaia a fost oprit prin centrifugare timp de 2 minute (10000

rpm) i supernatantul a fost retras pentru analize suplimentare.

Concentraia dintre L- i D- izomeri ai acidului lactic (LA) au fost
determinate enzimatic i exprimate ca pg / ml, cu ajutorul unui kit
comercial (EnzyPlus, Biocontrol) n conformitate cu instruciunile
productorului. Au fost efectuate toate testele n dublu exemplar i
calculate suma medie a L- si D-izomerilor.
Partea B
Treizeci de subieci au fost verificati pentru a detecta prezena
streptococilor salivari mutans i optsprezece au fost eligibili pentru
studiul clinic (14 de sex feminin, 4 - masculin ; vrsta medie = 26
ani; DMFT = 2).
Criteriile de includere au fost :
1)numarul moderat pina la crescut de streptococci mutans salivari
(> 104 UFC) estimat prin testul Dentocult SM
2)absenta leziunilor carioase cavitare vizibile si bolii parodontale
3) nefumatorii.
De asemenea, nici unul dintre subieci nu au fost consumatori de
produse probiotice, si nu au luat antibiotic n ultimele dou luni.
Dup alocarea grupului si efectuarea periajului profesional al
dintilor timp de 3 zile consecutiv, participantii au fost instruiti s ia
trei comprimate pe zi (dimineaa, la prnz i seara) coninnd fie
dou tulpini de L. reuteri (DSM 17938 i ATCC PTA 5289; 1x108 UFC
de fiecare tulpin) sau placebo timp de 2 sptmni (faza 2).
Ambele comprimate au fost furnizate de BioGaia AB (Suedia). Probe
de saliva stimulata au fost colectate dup mestecarea timp de 3
minute a gumei de mestecat parafinice. Probele de placa
supragingivala au fost colectate la momentul iniial i dup
intervenie. Numrul de streptococci mutans si lactobacilli n saliv
a fost determinat cu ajutorul unui set de teste (Dentocult SM Strip
Mutans i Dentocult LB, respectiv, Orion Diagnostica, Finlanda), n
conformitate cu orientrile productorului. Toate probele au fost
colectate ntre orele 10 si 12, nainte de prnz i aproximativ la 3-4
ore dup consumarea ultimului comprimat. Dup trecerea a 3
sptmni - perioada de eliminare (faza 3), intervenia de 2
sptmni a fost repetata cu al doilea comprimat (faza 4). Din nou,
au fost colectate probe la momentul initial si de monitorizare.

Comprimatele au fost furnizate i codificate A sau B (de testare i

placebo), ele fiind produse identic la gust, compoziie i aspect.
Codul nu a fost dezvluit pn dup afisarea rezultatelor analizelor
si calcularii statistice. n timpul tuturor fazelor, subiectii au fost
rugati s menin rutina lor de igien oral, inclusiv periajul dintilor
cu pasta de dinti cu fluor. Cu toate acestea ei au fost solicitati s
evite aportul de oricare produse alimentare suplimentate cu bacterii
probiotice.
Testele de laborator
Toate analizele i numararea bacteriilor s-au fcut fr a cunoaste
alocarea la grup. Probele salivare au fost incubate pe 2 si 4 zile
respectiv, la 37 grade, pentru depistarea prezentei streptococilor
mutans si lactobacililor cu ajutorul a cateva teste selective
(Dentocult SM and LB, respectiv; Orion Diagnostica, Helsinki,
Finland), conform instructiunilor producatorului. Unitatile formatoare
de colonii au fost numrate ntr-un stereomicroscop (12-25 x Keller
i Twetman BMC Sanatate Orala 2012, 12:44 Page 2 din 6
http://www.biomedcentral.com/1472-6831/12/44magnification) de
un singur examinator i marcate n categorii aa cum este descris n
tabelele 1 i 2. Concentraia AL n probele de plac a fost
determinat, n dublu exemplar aa cum este descris mai sus
utiliznd probele de placa proaspete.

Metode statistice
Datele au fost prelucrate cu software-ul IBM SPSS-(versiunea 19,0,
Chicago Illinois, Statele Unite ale Americii). n partea A, diferenele
rezultate ntre tulpinile probiotice au fost comparate cu cele de
control cu ajutorul testului Wilcoxon sign rank. n partea B,
producerea de acid a fost comparata nainte i dup intervenia n
interiorul grupurilor precum i ntre grupuri nainte i dup
intervenie prin testul Wilcoxon. Diferene n lactobacili i
streptococi mutans au fost analizate de ctre Chi square test . O
valoare p <0,05 a fost considerat statistic semnificativ.
Fiabilitatea punctajului bacterian a fost analizata pe un eantion
aleatoriu (20%) din teste i corelaia intra examinatorie a artat o
valoare ICC de 0,97.
Rezultate

Partea A
Toate probele de plac de la cei 25 de subieci au produs niveluri
detectabile de acid lactic i nivelurile iniiate de la fructoz au fost
semnificativ mai mari dect cele de xylitol (Figura 1).Totusi variatii
inter-individuale considerabile s-au observat. Dup fermentare cu
fructoza, suspensiile de plac amestecat cu L. reuteri DSM 17938
au produs n mod semnificativ mai puin AL comparativ att cu
probele de control i probele cu L. plantarum 299v (p <0,05). Nu au
existat diferene semnificative statistice ntre probele de control i
probele cu L. plantarum 299v. Suspensiile de control care conin
doar unul dintre cei doi lactobacili au artat producia de acid de
aceeai amploare ca in proba de control (L. reuteri DSM 17938:
medie 6.0 (4.8) i L. plantarum 299v: medie 9,3 (5,9)). Dup
producerea de acid iniiat cu xilitol, a fost obtinuta o diferenta
semnificativ statistic (p <0,035) ntre proba de control i probele
cu L.reuteri DSM 17938. Cu toate acestea, nu exist diferene
semnificative ntre probele de control i probele cu L. plantarum
299v sau ntre cele dou eantioane cu lactobacili probiotice
adugate. Probele unde xilitolul a fost adaugat in suspensii pure sau
de lactobacili a artat valori uor mai sczute dect suspensia de
plac, dar nu are diferenta semnificativa (L. reuteri DSM 17938:
medie 0,5 (3,4) i L.299v plantarum: medie 3.4 (3.5)).

Partea B
Nu au existat diferene majore n concentraia AL ntre probele
colectate la momentul initial si monitorizare n grupul de test sau
grupul placebo (tabelul 3). Din nou, probele fermentate cu fructoza
afieaz niveluri semnificativ mai mari de acid lactic produs dect
cele cu xilitol adugat. Scorurile lactobacililor salivari din grupul de
test a crescut semnificativ (p <0,05) de la valoarea initiala - la
monitorizare, dar s-au observat diferene n grupul placebo (tabelul
1). La momentul iniial, nou participanti n grupul de test au
prezentat nivele nedetectabile de lactobacilimversus ase n grupul

placebo. Dup dou sptmni, toi subiecii din grupul de test

prezinta nivele detectabile de lactobacilli, n timp ce cinci subieci
din grupul placebo au avut nc niveluri de dincolo de detectare. In
tabelul 2, sunt prezentate scorurile streptococilor mutans. Fr
diferente semnificative statistic au fost observate n timpul
perioadelor experimentale n oricare dintre grupuri. Nici un efect
secundar n urma utilizrii probioticului in comprimate nu a fost
raportat.
Discuie
Interesul sporit n utilizarea de lactobacili probiotice pentru a
imbunatati sanatatea orala a ridicat probleme cu privire la
eventualele sale efecte secundare. Un efect secundar din punt de
vedere cariologic ar fi o cretere a produciei de acizi n placa
dentar. Prin urmare, ne-am dorit sa investigam dac adugarea de
lactobacili probiotice la placa dentara ar influena acidogenicitatea
sa. n partea de laborator, am constatat diferene clare ntre
producia de acid lactic n suspensii de placi reunite i L. reuteri
DSM 17938, pe de o parte, i de plac plus L. plantarum 299v sau
placi de control pure pe de alt parte. Acest lucru a fost similar cu
studiul in vitro a Hedberg i colab. [12], care a gsit L. plantarum
299v s fie cel mai predispus pentru a produce acid dintre ase
tulpini testate,commercial diferite. n schimb, Haukioja i
colaboratorii [14] a constatat c att L. reuteri DSM (fost ATCC
55730) i L. plantarum 299v a redus pH-ul semnificativ dup
fermentarea glucozei i zaharozei. Conform Hedberg i colab. [12],
fermentarea de zaharoz i glucoz prin L. reuteri PTA 5289 a avut
ca rezultat o scdere a pH-ul (pH 5.2-6.8), n timp ce fermentarea cu
fructoza a provocat o cretere minor a pH-ului (pH> 6,8). Acest
lucru, mpreun cu rezultatele noastre actuale, indic faptul c
zahrul ales pentru fermentare are un impact puternic asupra
produciei de AL de a L. reuteri. Astfel, de la prima parte a acestui
studiu, se pare clar c acidogenicitatea suspensiilor de placa si
bacteriilor probiotice este strans-dependenta i foarte influenata de
tipul de zahr disponibil. Mai mult dect att, a fost remarcat faptul
c rezultatele din partea A au fost complet n conformitate cu
constatrile precedente n studiile in vitro [12,14]. Deoarece
producia de acid n suspensii n laborator nu poate s reproduc
condiiile exacte a biofilmului complex in situ, un pas mai departe ar
putea fi studierea pH-ului de placa in vivo cu un micro pH-metru. n

partea clinic a acestui studiu, nu am gasit nici o diferenta n

producia de acid nainte i dup intervenia cu L. reuteri sau
placebo, atunci cnd probele de plac au fost fermentate de
fructoz. Astfel, ipoteza nul nu ar putea fi respins. Constatarile au
fost n conformitate cu Marttinen i colab. [13], care nu a reuit s
demonstreze oricare diferene n producerea de acid lactic dup
intervenia fie cu L. reuteri sau L. rhamnosus GG. Aceasta ar putea
susine c acidogenitatea sczuta a plcii ar putea fi cauzata de
activitatea antibacterian a L. reuteri, dar din cauza perioadei
relativ scurte de administrare noi credem c acest lucru nu a fost
cazul. ntruct xilitolul nu este considerat a fi fermentat de
bacteriile orale [15] concentraiile sczute de AL dup adugarea
de xilitolul au fost de asteptat. Cu toate acestea, trebuie subliniat
faptul c voluntarii acestui proiect au avut condiii orale sntoase
i cel mai probabil nu sunt pe deplin reprezentativi pentru subiecii
cu un biofilm ecologic accentuat i dezechilibrat. n teorie, o astfel
de condiie ar putea crete eficacitatea tratamentului cu probiotice.
Noi i alte grupuri de cercetare am demonstrat c condiiile de pH
sczut pot interfera cu formarea biofilmelor [18]. Astfel, studii
suplimentare cu selectarea pacientilor ce prezinta leziuni carioase
active ar fi interesante. Concluzia pn acum din partea clinic a
fost c n pofida abilitatii acidogene puternice, suplimente zilnice de
lactobacili cu probiotice nu pare s creasc acidogenicitatea placii
dentare atunci cnd este expus la fructoz sau xilitol.
Nu au existat diferene ntre nivelurile de streptococci salivari
mutans ntre cele dou grupuri i nu am nregistrat nici o modificre
dup perioada de intervenie. Acest lucru a fost n contrast la mai
multe studii anterioare [2-5], dar n concert cu alii [9,19,20].
Diferenele ntre tulpini i concentraiile bacteriene, regimurile de
doz i grupele de vrst folosite n studiile anterioare mpiedica
orice comparaie ntre studiile i concluziile astfel ferme. Se crede n
general ca suplimentele cu probiotice pot fi mai eficiente la varstele
prescolare dect la aduli [21], care ntr-o anumit msur poate
explica constatarile noastre negative. Numarul crescut de
lactobacilli n grupul de test a fost logic i sprijinit de constatrile lui
Marttinen i co-lucrtorilor [13], dei nu am putut analiza dac a
fost sau nu determinat de tulpina specific testata. Cu toate
acestea, este puin probabil c o schimbare permanent a
compoziiei microbiene apare [22,23]. Caglar i colab. [22] au
studiat numrul a purttori a L. reuteri ATCC 55730, dup o

perioad de administrare timp de 2 saptamani de comprimate care

conin aceast tulpin. Folosind mediile selective i analizele pentru
producerea de reuterin, bacteria a fost recuperat de la toi
subiecii de test imediat dup perioada de intervenie, dar a fost
eliminata treptat n cteva sptmni. Cu toate acestea, este nc o
problem deschis dac o colonizare a biofilmului oral n sine este o
cerin absolut de aciune a probioticelor.

Concluzie
Rezultatele acest studiu sugereaz c acidogenicitatea suspensiei
de plca dentara i lactobacili probiotice este dependent de
tulpin i influenat de tipul de zahr disponibil. Mai mult dect
att, studiul de fa asigur ca nu exista nici o dovada in ceea ce
priveste cresterea aciditati placii prin administrare de lactobacilli
probiotice in combinatie fie cu fructoza, fie cu xylitol.