Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
FROTIUL 2012 Complet PDF
FROTIUL 2012 Complet PDF
FROTIUL DE SNGE
METODA ETALRII MATERIALULUI BIOLOGIC N MONOSTRAT
1. Obiective ........................................................................................................................................... 2
2. Tehnica efecturii frotiului de snge ................................................................................................ 2
2.1. Prelevarea sngelui prin puncie capilar .................................................................................. 3
2.2. Etalarea efectuarea frotiului propriu-zis ................................................................................. 3
2.3. Fixarea frotiului ......................................................................................................................... 7
3. Colorarea frotiului de snge ............................................................................................................. 7
3.1. Coloraia Leihsman.................................................................................................................... 7
3.2. Coloraia May Grunwald Giemsa .............................................................................................. 7
3.3. Protocoale de lucru .................................................................................................................... 8
3.3.1. Metoda Leihsman ............................................................................................................... 8
3.3.2. Metoda May-Grunwald Giemsa ......................................................................................... 9
4. Examinarea frotiului de snge ........................................................................................................ 11
5. Variaii fiziologice ale numrului elementelor sngelui periferic .................................................. 11
5.1. Hemoleucograma ..................................................................................................................... 11
6. Hematopoieza ................................................................................................................................. 12
7. Morfologia elementelor figurate din sngele periferic ................................................................... 12
7.1. Eritrocitul ................................................................................................................................. 12
7.1.1. Morfologia eritrocitului .................................................................................................... 13
7.1.2. Anomaliile de form ale eritrocitelor ............................................................................... 13
7.1.3. Morfologia leucocitelor .................................................................................................... 16
7.1.4. Morfologia trombocitelor (plachete sangvine) ................................................................. 17
Pag |2
FROTIUL DE SNGE
METODA ETALRII MATERIALULUI BIOLOGIC N MONOSTRAT
Aceast metod cuprinde tehnica frotiului i amprentelor de organe. Prin tehnica frotiului, se
realizeaz ntinderea celulelor n monostrat pe lame de sticl, putnd fi examinate celulele sanguine
(periferice i medulare) celulele epiteliale descuamate sau exfoliate (din piele, cavitate bucal, faringe, ci
respiratorii extra i intrapulmonare, vagin, col uterin, endometru, ci galactofore, lichid cefalo-rahidian,
lichid pleural, lichid de ascit), amprente de organe.
Metoda este mult utilizat n citologie, devenind prioritar att n domeniul cercetrii biologice ct i
ca procedeu de diagnostic n practica medical.
1. Obiective
- definirea optim a substratului recoltat pentru efectuarea unui frotiu (n spe un frotiu de snge
periferic);
- deprinderea tehnicii corecte de efectuare a unui frotiu de snge;
- evaluarea calitilor unui frotiu acceptabil ntr-un laborator clinic;
- definirea principiilor de colorare la nivelul frotiului de snge cu referire special la afinitatea
coloranilor pentru diferitele componente i tipuri celulare;
- colorarea frotiului printr-o tehnic de tip Romanowsky
- evaluarea elementelor celulare pe frotiul de snge, numrtoarea elementelor figurate, date de
morfologie a acestora.
Pag |3
Acest dispozitiv elimin formarea de micropicturi de snge (aerosoli) n timpul efecturii frotiului,
iar tubul de recoltare nu trebuie deschis. De asemenea, elimin necesitatea utilizrii de pipete i poate regla
volumul picturii de snge aplicate. Tehnica de utilizare este prezentat mai jos.
Pag |4
Pictura de snge trebuie s aib circa 30 l pentru a realiza un frotiu de o grosime potrivit i cu o
lungime de 2,5-4 cm.
Pictura trebuie amplasat cam la 1 cm de captul destinat marcrii scriptice sau la circa 2 cm de
marginea unei lame simple, fr spaiu de marcaj scriptic.
Se preia lama de ntindere ntre police i index. Cu cealalt mn se nclin uor lama suport, cu
pictura de snge depus.
Se aplic lama de ntindere, cu marginea lung pe lame suport, n vecintatea picturii, dar dincolo
de aceasta, nspre captul liber al lamei suport.
Pag |5
n momentul contactului cu lama suport, lama de ntindere, nclinat la circa 30-45 grade, este
deplasat spre captul unde este depus pictura. Astfel, marginea lamei de ntindere intr n contact cu
pictura de snge iar aceasta se va ntinde pe lungimea zonei de contact dintre lame.
Lama de ntindere este apoi mpins spre captul liber al lamei suport, realiznd frotiul.
Etalarea se poate face i cu marginea scurt a lamei de ntindere, dar tehnica este mai dificil.
Frotiul este bine executat dac are:
- dou margini laterale i un capt spre zona liber a lamei suport, care se termin n franjuri;
- o grosime potrivit: elementele figurate s nu fie suprapuse i totodat suficient de dese.
Grosimea frotiului de snge depinde de:
- mrimea picturii de snge (pictur mic = frotiu scurt/subire; pictur mare = frotiu lung/gros);
- unghiul dintre lama de ntindere i lama suport (unghi mic = frotiu lung/subire);
Pag |6
viteza de ntindere (vitez mare frotiu scurt).
Pag |7
Pag |8
Materiale necesare
Soluia May-Grunwald, concentrat. Unii autori susin prepararea extemporanee i a soluiei MayGrunwald diluate, care acioneaz ca i colorant. Se prefer ns diluarea soluiei concentrate direct
pe lam, deoarece altfel se poate afecta gradul de colorare a unor granulaii intracelulare.
- Soluia Giemsa, concentrat. Pentru utilizarea ca i colorant, se va realiza o diluie 5% (pentru 1 ml
soluie de lucru 50 l soluie Giemsa + 950 l ap tamponat (pH=7)
- ap distilat neutr;
pipete Pasteur, pipete gradate;
pH-ul apei distilate trebuie s fie 6,8-7,2. Apa distilat este de obicei acid. Neutralizarea ei se obine
adugnd cteva picturi dintr-o soluie alcalin de hidroxid de sodiu, ncercndu-se pH-ul cu un indicator
universal de hrtie sau de preferat cu un pH-metru digital;
-
4. Colorarea cu eozin colorant acid va determina colorarea structurilor bazice din citoplasm
(hemoglobin, granulaii eozinofile), n nuane de roz-rou;
Colorarea cu eozin
scufundri succesive ale lamei
timp de 20 secunde
Pag |9
La final, frotiul colorat se spal la jet redus de ap de robinet. Se aeaz n suportul de uscare, iar dup
uscare se poate examina.
3.3.2. Metoda May-Grunwald Giemsa
1. Recoltarea i etalarea frotiului de snge, aa cum s-a prezentat anterior
2. Uscare (fixare temporar) prin agitare n aer la temperatura laboratorului. Nu se sufl asupra
frotiului.
3. Fixarea chimic a frotiului
- Se poate realiza ca i mai sus, cu metanol pentru completarea fixrii fizice;
- Fixarea direct, cu soluia May-Grunwald concentrat, care conine metanol 99%; fixarea cu
metanol pur se poate ignora.
Aceast tehnic presupune acoperirea frotiului cu soluiile de
fixare/colorare, prin picurare cu o pipet simpl sau automat. Un volum
de circa 1 ml este de obicei suficient pentru a acoperi frotiul
Durata fixrii chimice cu soluia May-Grunwald concentrat este de 2
min:30sec.
4. Colorarea cu soluia May-Grunwald diluat.
Practic, fr a arunca soluia concentrat utilizat n etapa (3) pentru
fixare, peste aceast soluie se adaug un volum egal de ap distilat
tamponat cu pH=7. Atenie! Este important ca volumul iniial de soluie
May-Grunwald s nu fie prea mare, pentru ca adugarea unui volum
similar de ap distilat tamponat s nu duc la deversarea soluiei care
trebuie s acioneze ca i colorant. Astfel, volumul propus iniial pentru
fixare (May-Grunwald concentrat) este de 1 ml, urmnd ca pentru
obinerea colorantului s se adauge 1 ml de ap distilat tamponat.
Timpul de colorare este de 2min:30sec; se poate prelungi dac se remarc
o subcolorare a frotiului.
5. Colorarea cu soluia Giemsa. Se ndeprteaz colorantul May-Grunwald, fr splare, apoi se
acoper frotiul cu soluie de lucru Giemsa.
Soluia de lucru Giemsa se prepar din soluia stoc Giemsa concentrat, diluat cu ap distilat (AD)
tamponat la pH=7 pentru a obine o soluie 5% (exemplu - 50l Giemsa concentrat + 950 l AD, pentru 1
ml colorant Giemsa de lucru); pentru acoperirea unui frotiu este suficient un volum de colorant de lucru
Giemsa de 1 ml; dup ce frotiul este complet i corect acoperit, se ateapt 25-30 min.
6. Se spal lam sub jet redus de ap;
7. Se efectueaz o sugativare uoar, fr a atinge suprafaa colorat;
8. Se aeaz n stativ pentru uscare.
Frotiul trebuie colorat ct mai curnd dup realizare.
Clasa unui element sau gradul lui de maturare se stabilesc pe baza unor criterii ce privesc bazofilia
citoplasmei elementelor tinere, afinitatea tinctorial a granulaiilor granulocitelor i acidofilia eritrocitelor
mature.
Cu ct o celul este mai tnr cu att citoplasma ei este bazofil, dat fiind concentraia mare de acid
ribonucleic. Pe msur maturrii, celula devine tot mai acidofil deoarece scade concentraia n acid
ribonucleic (ex: evoluia eritroblatilor). Termenii de eozinofil, bazofil, acidofil, indic afinitatea fa de
coloranii acizi.
Afinitile pentru diferiii colorani utilizai pentru frotiul de snge sunt:
bazofilia afinitatea pentru albastrul de metil
P a g | 10
azurofilia afinitatea pentru produii de oxidare ai albastrului de metil numii azuri care
determin o coloraie roiatic-violet
acidofilia afinitatea pentru eozin
neutrofilia afinitatea pentru un complex de colorani n amestec (aa cum este soluia Wright gata
preparat) care induce o coloraie lila-palid.
Pentru frotiul de snge
eritrocitele vor cupla eozina datorit hemoglobinei i vor aprea roz-portocalii,
nucleii leucocitelor apar albastru-violei,
granulaiile bazofile sunt colorate albastru-violet nchis,
granulaiile eozinofile sunt colorate rou-portocaliu,
granulaiile neutrofile sunt colorate rou-maroniu spre lila,
trombocitele sunt colorate violet,
citoplasma limfocitelor este colorat albastru palid.
P a g | 11
Reticulocite
Hematii imature, Hematii nucleate
http://en.wikipedia.org/wiki/Reticulocyte
Granulocite bazofile
Limfocite
Monocite
Minim
Maxim
Uniti de msur
Masculin
4.2
5.7
Feminin
3.5
5.1
Copii
3.8
5.5
Valori
medii
26
130
x109/L
Adult
0.5
1.5
% of RBC
Nou-nscut
1.1
4.5
% of RBC
<7 ani
(prescolar)
0.5
3.1
% of RBC
140
400
x1012/L
sau
milioane/mm3 sau per l
P a g | 12
NU UITAI! Exprimarea numeric a elementelor figurate se realizeaz astfel:
nr. celule /L sau
nr. celule /mm3 sau /l
nr. celule /cm3 sau /ml
6. Hematopoieza
Este un proces normal de rennoire a celulelor sngelui periferic.
Prezint dou etape
etapa embrionar
- sac vitelin - z14-z19 intrauterine (IU) hematopoiez mezoblastic RBC nucleate
- ficat S6 IU + splin S12 IU
- centri de osificare cartilaj L4-5 IU mduv osoas hematogen
etapa postnatal
- 4-25 ani - mduv osoas hematogen
- Adult - oasele craniului, coastelor, sternului, scapulelor, claviculelor, vertebrelor, femurului si
humerusului
Sediul
Tipul predominant al
Tipurile principale de
Celula final
eritropoiezei
eritropoiezei
hemoglobin
Sac vitelin
Megaloblastic
Nucleat
Gower I (2 2)
Gower II (2 2)
Portland (2 2)
Ficat fetal
Normoblastic
Macrocit
anucleat
Hemoglobina fetala
(Hb. F. 2 2)
Mduv osoas
fetal
Normoblastic
Macrocit
anucleat
HbF si HbA (2 2)
Numit i hematie sau globul rou, are un diametru de aproximativ 6 m la celula uscat i 8 m la
hematia proaspt circulant. Eritropoieza dureaz 25 ore i are urmtoarea secven
P a g | 13
Reticulocitele rezultate, prsesc mduva i trec n circulaie unde se matureaz dup aproximativ 48
ore trecnd n eritrocite mature.
Eritrocitele umane produse n cadrul procesului de eritropoiez se dezvolt pornind de la celulele stem
ntr-o perioad de 7 zile. Durata de via a eritrocitelor circulante este de 120 zile.
Funcia principal este de transport al gazelor respiratorii (oxigen de la plmni la esuturi i CO2 n
sens invers).
7.1.1. Morfologia eritrocitului
Eritrocitul adult este o celul anucleat, discoidal i biconcav. Este alctuit din citoplasm i
membran celular. n citoplasm se gsesc n special macromolecule proteice structurale i protein-enzime
precum i cantiti mici de lipide, vitamine (mai ales din grupul B) i elementul principal hemoglobina.
Membrana eritrocitului prezint pe suprafaa sa antigeni numii aglutinogeni dup a cror prezen
sau absen, se pot identifica grupele sanguine, de care se ine seama n practica medical cnd se efectueaz
transfuzia de snge. n afara acestora, pe suprafaa extern a membranei eritrocitare s-a evideniat i factorul
Rh.
Eritrocitele au o culoare rou crmiziu pe frotiul de snge colorat cu soluia May-Grumwald Giemsa
i o form rotunjit, vzute din fa i de disc biconcav vzute din profil (discocite).
7.1.2. Anomaliile de form ale eritrocitelor
Anomaliile de form ale eritrocitelor sunt regrupate sub numele de poikilocitoz. Poikilocitele sunt
eritrocite cu forme variate, dar anormale. Aceste forme anormale pot fi permanente sau temporare. Cauzele
apariiei acestor forme anormale in de structura membranei eritrocitare sau de traume ale ntregii celule.
Anomalii de membran eritrocitar
1. Acantocite form ireversibil (engl. spurr/spike cells). Sunt eritrocite ale cror membrane
prezint prelungiri de dimensiuni variabile. Acantocitoza reprezint situaia n care acantocitele domin n
sngele periferic. Acantocitoza se ntlnete n stri patologice precum abetalipoproteinemia, diferite
afeciuni hepatice, unele boli neurologice. Exist forme congenitale ct i dobndite de acantocitoz. Cauza
apariiei acestor deformri este reprezentat de defecte n unele proteine componente structurale ale
citoscheletului cortical.
P a g | 14
2. Codocite form ireversibil (target cells, Mexican hat cells). Sunt eritrocite care apar nite inte.
Celulele prezint un centru ntunecat nconjurat de un inel decolorat i nc un inel exterior ntunecat. In
vivo, aceste celule au form de clopot i numai pe frotiu apar n form de int. Celulele de acest tip prezint
o disproporie ntre suprafaa i volumul celular.
Cauza apariiei acestor celule poate fi determinat de:
- Creteri ale suprafeei membranare, de obicei datorate unor tulburri ale metabolismului lipidic
- Reducerea volumului citoplasmatic este asociat cu reducerea produciei de hemoglobin, n deficitul
de fier sau n diferite hemoglobinopatii, cum este talasemia (sinteza de hemoglobine genetic defecte).
- Mai apar n disfuncii splenice
P a g | 15
4. Eliptocite/ovalocite form reversibil se gsesc n sngele periferic n proporie de 10-15% din
globulele roii, putnd fi ntlnite i n unele boli sanguine (eliptocitoz ereditar, talasemie, deficit de Fe,
anemie megaloblastic).
5. Stomatocitele hematii rotunde ce reprezint ntr-o anumit zon o nfundtur ca o gur (stom); ele
apar la un pH uor sczut sub 7; revenirea pH-ului la normal determin transformarea lor n discocite; n
hemoglobinopatii apar forme ireversibile de stomatocite
6. Drepanocitele hematii n corn sau secer; se ntlnesc n hemoglobinopatii, (hemoglobinoza Sdrepanocitoza), talasemie i deficit de fier n organism.
P a g | 16
Creterea hematiei determin apariia macrocitelor; cnd diametrul depete 10 m, vorbim de
megalocite (acestea apar de obicei n boli sanguine-anemii). Scderea diametrului eritrocitului sub 7 m
determin apariia n snge a microcitelor. Variaiile de diametru eritrocitar poart denumirea de
anizocitoz.
Culoarea eritrocitelor se poate modifica, celulele aprnd fie palide (hipocromie) n anemii, fie diferit
colorate, n tulburrile eritropoiezei.
7.1.3. Morfologia leucocitelor
Leucocitele se mpart n dou clase majore:
a. granulocite (prezint numeroase granule n citoplasm)
b. agranulocite sau leucocite agranulare
P a g | 17
Tipul de celula
Funciile principale
Eritrocite
Granulocite
Neutrofile
Eozinofile
Bazofilul
Monocitele
Trombocitele
Limfocitele