Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Variabilitatea Serologică Şi Moleculară A Unor Izolate Ale Virusului Plum Pox Din Bazinul Central Pomicol Al Transilvaniei
Variabilitatea Serologică Şi Moleculară A Unor Izolate Ale Virusului Plum Pox Din Bazinul Central Pomicol Al Transilvaniei
I MEDICIN VETERINAR,
CLUJ-NAPOCA
FACULTATEA DE HORTICULTUR
VARIABILITATEA SEROLOGIC I
MOLECULAR A UNOR IZOLATE ALE
VIRUSULUI PLUM POX DIN BAZINUL CENTRAL
POMICOL AL TRANSILVANIEI
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Conductor tiinific:
Prof. univ.dr. Doru Pamfil
CLUJ-NAPOCA
2010
CUPRINS
INTRODUCERE.............................................................................................................................6
CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7
DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN ................................................ 7
1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni .......................................................................... 7
1.2 Ptarea inelar la prun .......................................................................................................... 8
1.3 Mozaicul n benzi al prunilor (marmor lineopticum, prunus virus 9 christ) ......................... 8
1.4 Crparea scoarei prunului .................................................................................................... 9
1.5 Mozaicul linear (plum pseudo pox) ...................................................................................... 9
CAPITOLUL II9
ORIGINEA I RSPNDIREA VIRUSULUI..............................................................................9
CAPITOLUL III ............................................................................................................................ 11
PRINCIPALELE TRSTURI ALE PLUM POX-ULUI ........................................................... 11
3.1 Gazde naturale ale virusului ................................................................................................ 11
3.2 Patologia virusului Plum pox .............................................................................................. 12
3.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox ....................................................................... 12
CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 13
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA ............................. 13
4.1 Scopul cercetrii .................................................................................................................. 13
4.2 Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat ............................................. 13
4.3 Materialul biologic .............................................................................................................. 14
4.4 Tehnici i metode de cercetare ............................................................................................ 14
4.4.1 Extracia ARN-ului total .............................................................................................. 14
4.4.2 Reacia de revers transcriere i amplificare.................................................................. 14
4.4.3 Protocolul de amplificare ............................................................................................. 15
4.4.4 Migrarea electroforetic a produilor de amplificare n gel de agaroz ...................... 16
4.4.4.1 Prepararea gelului de agaroz ............................................................................... 16
4.4.4.2 Pregtirea produilor de amplificare n vederea migrrii n gel de agaroz.......... 16
4.4.4.3 Colorarea gelurilor de agaroz i preluarea imaginilor ......................................... 16
4.4.5 Diferenierea tulpinilor virale pe baza profilului PCR-RFLP ...................................... 17
4.4.5.1 Prepararea amestecului de reacie pentru digestia enzimatic .............................. 17
4.4.5.2 Pregtirea gelului de poliacrilamid i separarea fragmentelor de digestie .......... 17
4.4.5.3 Colorarea gelurilor de poliacrilamid ................................................................... 18
4.4.6 Principiul tehnicii DASI-ELISA pentru detectarea prezenei virusului n probe, ct i
pentru diferenierea tulpinilor virale ..................................................................................... 18
CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 19
REZULTATE I DISCUII ......................................................................................................... 19
5.1 Rezultate privind caracterizarea molecular prin RT-PCR a izolatelor recoltate de la SCDP
Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria ......................................................... 19
5.1.1 Diagnosticarea molecular ........................................................................................... 19
5.1.2 Diferenierea molecular a tulpinilor PPV-D i PPV-M cu primeri specifici .............. 20
5.1.3 Detecia tulpinii recombinate PPV-Rec ................................................................... 21
5.1.4 Analizarea regiunii genomice CI.................................................................................. 22
5.2. Rezultate privind caracterizarea molecular prin PCR-RFLP a izolatelor recoltate de la
SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria .............................................. 23
5.2.1. Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M prin digestia
enzimatic cu enzima Rsa I ................................................................................................... 23
5.2.2. Identificarea eventualelor mutaii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de
restricie al regiunii genei care codific proteina capsidal .................................................. 24
I
II
TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION.6
CHAPTER I..7
DESCRIPTION OF MAJOR VIROTIC DISEASES IN PLUM TREE7
1.1 The prune dwarf virus...7
1.2 Plum ring spot..8
1.3 Plums mosaic in bands..8
1.4 Plum bark split...9
1.5 Linear mosaic (plum pseudo pox).9
CHAPTER II.9
THE ORIGIN AND SPREAD OF THE VIRUS..9
CHAPTER III..11
THE MAIN FEATURES OF PLUM POX..11
3.1 Natural hosts of the virus....11
3.2 The pathology of Plum pox12
3.3 Symptoms caused by Plum pox virus..12
CHAPTER IV..13
RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD.13
4.1 Research purpose.13
4.2 Objectives pursued in the PhD Thesis research work.13
4.3 Biological material..14
4.4 Research techniques and methods...14
4.4.1 Extraction of total RNA14
4.4.2 Revers-transcription and amplification reaction...14
4.4.3 Amplification protocol..15
4.4.4 Agarose gel electrophoretic migration of amplification products16
4.4.4.1 Preparation of agarose gel..16
4.4.4.2 Preparation of PCR amplification products for agarose gel migration..16
4.4.4.3 Agarose gel staining and image acquisition.16
4.4.5 Differentiation of virus strains based on PCR-RFLP profile17
4.4.5.1 Mixture preparation for enzymatic digestion.17
4.4.5.2 Polyacrylamide gel preparation and the separation of digestion fragments..17
4.4.5.3 Polyacrylamide gel staining...18
4.4.6 Dasi-ELISA technique for the virus detection in samples and for viral strain
differentiation18
CHAPTER V...19
RESULTS AND DISCUSSION19
5.1 Results regarding the molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj,
Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistria by using RT-PCR.19
5.1.1 Molecular diagnostics...19
5.1.2 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M strains using specific primers20
5.1.3 Detection of PPV-Rec recombinant strain...21
5.1.4 Analysis of CI genomic region.22
5.2 Results regarding molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj,
Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistria by PCR-RFLP..23
5.2.1 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M viral strains by enzymatic digestion
using Rsa I enzyme23
III
IV
INTRODUCERE
Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole
smburoase. Acest fapt se datoreaz scderii calitii fructelor i pierderilor cauzate de cderile
premature ale acestora (Nemeth, 1994).
n Romnia, acest virus este rspndit n toate arealele de cultur ale prunului i
provoac pierderi masive de producie (Minoiu, 1997, Zagrai i colab., 2006).
Motivaia alegerii acestei teme s-a datorat faptului c n ara noastr la momentul
nceperii cerecetrilor nu era cunoscut distribuia tulpinilor virusului Plum pox n
Romnia, ara noastr fiind printre puinele ri europene care nu avea o strategie de
eradicare sau limitare a impactului acestui virus. O astfel de strategie nu poate fi realizat
fr a cunoate gradul de rspndire a PPV-ului i distribuia tulpinilor acestuia.
Teza de doctorat are ca obiectiv principal studierea variabilitii serologice i
moleculare a unor izolate ale virusului Plum pox din trei regiuni pomicole situate n
Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei: Cluj, Mure i Bistria.
Primele cercetri din Romnia privind identificarea i diferenierea tulpinilor virusului
Plum pox, prin tehnici moleculare i serologice au fost realizate la Staiunea de CercetareDezvoltare Pomicol Bistria (SCDP Bistria) (Zagrai i colab., 2005a).
n perioada 2006-2008 SCDP Bistria n colaborare cu SCDP Vlcea i departamentele
de biologie molecular din cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar
(USAMV) i Universitii Babe-Bolyai din Cluj Napoca, au iniiat un proiect ce a avut ca i
obiective: dezvoltarea virusologiei pomicole din ara noastr, aplicarea de tehnici moleculare i
serologice pentru diferenierea tulpinilor virale ale virusului Plum pox i realizarea unei hri cu
distribuia pe regiuni ale acestor tulpini. Rezultatele au artat o situaie dramatic i
necontrolabil n ceea ce privete infeciile masive cu Plum pox din ara noastr
(http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm).
Caracterizrile serologice i moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de
ctre cercettorii din Europa Occidental au permis stabilirea apartenenei acestora la diferite
tulpini virale dar i la identificatea unor forme recombinate.
Pn n prezent au fost identificate i caracterizate serologic i molecular apte
tulpini de PPV: Sua D (dideron) izolat pentru prima dat la cais n sud-estul Franei;
Sua M (marcus) identificat la piersic n nordul Greciei (Kerlan i Dunez, 1979; Myrta i
colab., 1998); Sua Ea (el amar) descris n Egipt la cais (Wetzel i colab., 1991a); Sua
SoC (sour cherry) detectat n Republica Moldova (Kalashyan i colab., 1993); Sua SwC
(sweet cherry) identificat n Italia (Crescenzi i colab., 1996); Sua PPV-Rec rezultat din
recombinarea celor dou tulpini majore (M i D), fiind descoperit n Albania, Bulgaria,
Cehia, Germania i Slovacia (Glasa i colab., 2004).Sua PPV-W(Winona) a fost
identificat n Canada (James i Varga, 2004a). Recombinarea joac un rol important n
evoluia ribovirusurilor, determinnd apariia unor sue noi cu efecte nepredictibile asupra
patogenitii (Worobey i Holmes,1999). Recombinarea natural dintre tulpinile PPV-D i
PPV-M a constituit apariia unei noi tulpini virale, numit PPV-Rec, ce a fost raportat
prima dat de Glasa i colab. (2002 ).
Recentele studii din Turcia efectuate pe 16 izolate au condus la identificarea unei noi
tulpini virale. Secvenierea acestora a condus la observarea unui punct de recombinare n
regiunea viral HC-Pro, la poziia 1566 din genomul viral. Astfel c cercettorii turci propun ca
aceast nou tulpin recombinat s se numeasc PPV-T (Turcia). Urmnd ca studiile ulterioare
s stabileasc distribuia geografic n Turcia i posibil n alte ri (Serce i colab., 2009).
Primul raport privind infecia natural a prunilor cu tulpina recombinat PPV-Rec n
Romnia a fost fcut n anul 2006. Toate izolatele identificate iniial ca fiind tulpina PPV-M sau dovedit aparinnd suei PPV-Rec, n urma analizelor moleculare. n urma secvenierii
6
CAPITOLUL I
DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN
1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni
Pomii atacai de acest virus au habitusul redus, nregistreaz pierderi de 50-82%, iar la
soiurile sensibile se constat sterilitatea florilor.
Simptome.
Virusul afecteaz frunzele, lstarii i florile. Frunzele infectate se alungesc, se ngusteaz
i prezint un luciu sticlos. Lstarii se dezvolt n rozete i prezint internodii scurte. Florile
atacate avorteaz , iar pomul rmne cu fructe puine.
Virusul afecteaz urmtoarele specii de Prunus: P.davidiana, P.fructicosa, P. tomentosa,
P. virginiana, P. tenella, P. triloba, P. spinosa, P. spinosa.
Cele mai sensibile soiuri de prun sunt: Vnt de Italia, Renclod Althan, Lombard,
Standard, Emilia, Tragedy, President. Tolerante sunt urmtoarele soiuri: Victoria, Renclod
Doree, Stanley, Vnt romanesc.
Transmiterea la prun se face prin altoire, semine de mirobolan, portaltoi vegetativi
infectai. Pentru testare biologic se folosesc ca i plante indicator soiurile Vnt de Italia,
Krikon, puieii de piersic GF 305.
Combatere
Selecia materialului de nmulire liber de piticirea prunului se face cu ajutorul plantelor
test ierboase i a indicatorilor lemnoi. La plantele de castravei infectate cotiledoanele manifest
leziuni locale i mozaic pe frunze.
La indicatorii lemnoi virusul se transmite prin grefare de muguri sau scoar de la pomul
de testat. Virusul prune dwarf produce necroze n scoar i n lemn la P. effusa, soiul Krassa
sever i Malus halliana.
Metode de combatere utilizate:
-nfiinarea de plantaii mam productoare de ramuri altoi, butai, marcote i semine
libere de prune dwarf
-aplicarea de tratamente de fitoprotecie la acoperire pe toat perioada de vegetaie n
pepinier i plantaii mam
-defriarea pomilor infectai n cazul n care acetia sunt infectai
-cultivarea de soiuri tolerante la virusul prune dwarf
CAPITOLUL II
ORIGINEA I RSPNDIREA VIRUSULUI
Virusul Plum pox Potyvirus (PPV), face parte din familia Potyviridae fiind
considerat pentru mult timp ca singurul virus din aceast familie care infecteaz speciile
pomicole smburoase. Acest virus a fost identificat pentru prima dat n livezile de prun
din Bulgaria n anul 1918 i menionat de ctre cercettorul Atanasoff (1932). Virusul
10
CAPITOLUL III
PRINCIPALELE TRSTURI ALE PLUM POX-ULUI
3.1 Gazde naturale ale virusului
Speciile afectate de acest virus sunt cele din genul Prunus, cum ar fi: caisul
(P.armeniaca), piersicul (P.persica), prunul (P. Domestica i P. Salicina). Migdalul i
ciresul pot fi infectate cu acest virus, dar simptomele nu sunt foarte evidente (Festic, 1978;
Kalashyan i colab, 1994).
Virusul a fost transmis artificial i la cirei i viini, dar infeciile au rmas locale,
neexistnd dovezi c s-ar fi rspndit (Dosba i colab, 1987). Infecii naturale la specia P.
Cerasus au fost raportate de Kalashyan i colab. (1994), dar infecia cu PPV a cireelor este
considerat extrem de neobinuit, fiind practic neintlnit n cea mai mare parte a
Europei.
Specii slbatice i ornamentale aparinnd genului Prunus pot servi ca a doua gazd
a PPV i pot avea impact asupra epidemiologiei i controlului acestui virus (Polak, 1997).
Astfel c multe din speciile slbatice ale genului Prunus sunt susceptibile: P.bessey,
P.cerasifera, P.insititia, P.tomentosa, P.spinosa, P.mahaleb,
P.pumila,
P.davidana,
P.nigra,
P.maritime, P.americana .
Rezultatele obinute n Iugoslavia infirm faptul c speciile menionate mai sus ar fi
gazde naturale ale virusului, dar s-a descoperit alt virus, virusul necrotic ring spot
(Rankovic i Dulic-Markovic,1992).
Practic toate speciile din genul Prunus cultivate n scop comercial n Europa sunt afectate
mai mult sau mai puin de acest virus. Multe specii ce nu aparin genului Prunus, ce fac parte din
noua familie de plante au fost infectate artificial cu una sau mai multe tulpini ale virusului sau n
unele cazuri s-au gsit plante infectate n mod natural. Multe dintre acestea sunt plante ierboase
anuale, cteva fiind perene sau lemnoase i pot servi ca i gazd: Campanula rapunculoides,
Chenopodium quinoa, C. Species, Lamium album, L. Amplexicaule, L. Purpureum, Lupinus
albus, Lycium barbarum, L.Halimifolium, Medicago lupulina, Trifolium dulcamara, T. pratense,
T. repens, Zinnia elegans.
11
12
CAPITOLUL IV
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA
4.1 Scopul cercetrii
Cercetrile au fost axate pe testele moleculare i serologice pentru toate cele 90 de probe
provenite din cele trei regiuni pomicole situate n Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei
(Cluj, Bistria i Reghin).
Cercetrile s-au axat, n prealabil, pe identificarea unor focare de infecie n regiunile
menionate. Identificarea focarelor de infecie i selecia pomilor infectai au fost efectuate pe
baza simptomelor tipice de PPV iar, ulterior, probe de frunze cu simptome evidente vor fi
prelevate din diferite pri ale coroanelor pomilor cu infecie generalizat i supuse
diagnosticului serologic i molecular.
Diagnosticul molecular s-a realizat prin tehnica RT-PCR folosind perechea de amorse
polivalente P1/P2 care amplific un fragment de 243 bp corespunztor regiunii C-terminus a
proteinei capsidale (Wetzel i colab., 1991 b).
Diferenierea molecular a fost realizat tot prin RT-PCR folosind amorse specifice
regiunilor genomice (Cter)CP (gena pentru proteina capsidal), (C-ter)NIb (gena pentru replicaza
viral)/ (N-ter)CP i CI (gena pentru helicaz). Evidenierea produilor amplificai a fost
realizat prin electroforez n gel de agaroz, benzile colorate cu bromur de etidiu au fost
vizualizate sub lumin ultraviolet.
Produii PCR corespunztori regiunii (Cter)CP au fost ulterior difereniati prin RFLP,
folosind enzimele de restricie Rsa I i Alu I. Produii fragmentai s-au evideniat prin
electroforez n gel de poliacrilamid. Prin tehnica RT-PCR s-a avut n vedere i identificarea
unor poteniale recombinri genetice care pot conduce la apariia unor tulpini virale noi cu efecte
nepredictibile: virulen i agresivitate diferit.
Diagnosticarea i diferenierea serologic a izolatelor PPV a fost realizat prin
intermediul tehnicii imonoenzimatice DASI-ELISA folosind antiseruri monoclonale pentru cele
dou serogrupuri majore - PPV-D (tulpina clorotic) i PPV-M (tulpina necrotic) i protocolul
de lucru recomandat de Cambra i colab., 2004.
4.2 Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat
Cercetrile propuse sunt relevante pentru horticultur deoarece sunt abordate aspecte de
mare actualitate ce asigur acumularea de cunotine avansate i rezultate tiinifice ntr-un
domeniu de mare importan tiinific i economic.
Tulpinile virale pot crea att probleme de identificare ct i de importan practic.
Tulpinile unui virus pot induce simptome diferite i se pot adapta diferit la noile soiuri de plante
fcnd astfel dificil diferenierea lor.
Diferenierea simptomatologic a celor dou tulpini (D si M) este dificil de realizat. n
cazul ambelor tulpini simptomele se manifest prin pete clorotice i mozaicuri pe frunze, pete
inelare pe suprafaa fructelor care, ulterior, devin necrozate i se adncesc n pulp. Tulpina
PPV-D provoac, n general, simptome mai puin severe comparativ cu PPV- M (Damsteeg i
colab., 1997).
Pentru caracterizarea molecular si serologic ale izolatelor PPV recoltate, s-au avut n
vedere urmtoarele obiective:
Identificarea focarelor de infecie i recoltarea de izolate PPV de la pruni care
exteriorizau simptome tipice cu acest virus
Extracia ARN-lui din frunze de prun simptomatice
13
14
X 35 de cicluri
4C
17
CAPITOLUL V
REZULTATE I DISCUII
5.1 Rezultate privind caracterizarea molecular prin RT-PCR a izolatelor recoltate
de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria
5.1.1 Diagnosticarea molecular
Diagnosticarea molecular s-a efectuat folosind amorsele specifice P1 i P2. Aceste
amorse confirm prezena virusului n frunzele cu simptome evidente de PPV. Perechea de
amorse P1 i P2 amplific un fragment de 243 pb, corespunztor regiunii C-terminus a proteinei
capsidale (CP).
19
1000pb
1000pb
1000pb
500pb
500pb
500pb
243 pb
Fig. 2 a, b,c Analizarea migrrii produilor PCR n gel de agaroz pentru identificarea
prezenei virusului PPV la probele (izolatele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9); L-Ladder,
C- control negativ, C+ control pozitiv
n cadrul acestor profile electroforetice L reprezint markerul care ne indic greutatea
molecular a produilor de amplificare. Controlul pozitiv este reprezentat de un izolat, a crei
infecie cu PPV a fost confirmat prin studii serologice i moleculare de ctre dr. ing., Zagrai
Ioan, cercettor la SCDP Bistria. Pentru controlul negativ am folosit un izolat sntos, adic
neinfectat cu virusul PPV.
n Fig. 2 a, b,c sunt prezentate spre exemlificare imaginile gelurilor obinute n urma
migrrii produilor PCR de la probele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9. n imaginea gelurilor se
observ prezena benzii la dimensiunea de 243 pb, ceea ce indic infectarea acestor izolate cu
virusul Plum pox.
Existena benzii la toate cele 90 de izolate denot faptul c toate izolatele au fost infectate
cu virusul Plum pox, deci simptomele prezente pe frunzele recoltate au fost cele de PPV. Faptul
c virusul este prezent n toate izolatele, ne indic o infecie masiv cu PPV n livezile de unde
au fost recoltate probele.
5.1.2 Diferenierea molecular a tulpinilor PPV-D i PPV-M cu primeri specifici
Diferenierea celor dou tulpini virale PPV-D i respectiv PPV-M, s-a realizat cu ajutorul
tehnicii RT-PCR, folosind amorsa P1(sens) pentru ambele tulpini i cte o amors specific
pentru fiecare tulpin n parte, respectiv PD(PPV-D) i PM(PPV-M) ce amplific un fragment de
198 pb, corespunztor genei proteinei capsidale.
Fiecare prob a fost amplificat cu ambele seturi de amorse, att n scopul diferenierii
celor dou tulpini virale ct i pentru determinarea infeciilor mixte. Aceasta a reprezentat doar o
difereniere preliminar deoarece tuplpina PPV-M nu se difereniaz de tulpina PPV-Rec n
regiunea C-ter corespunztoare proteinei capsidale.
Caracteriz area molecular a
iz olatelor PPV re coltate de
la SCDP Cluj
13%
30%
3%
PPV-D
67%
PPV-M
PPV-D+M
27%
80%
PPV-D
PPV-M
PPV-D+M
60%
PPV-D
13%
PPV-M
PPV-D+M
Fig.3a, b,c Diferenierea molecular a tulpinilor D i M prin RT-PCR la izolatele din cele trei
regiuni luate n studiu
20
1000pb
500pb
605 pb
100pb
21
1000pb
500pb
605pbb
100pb
Fig. 5 Produii de amplificare cu mD5/mM3, la probele Reghin 6, 22, 23, 26, 29, 30; LLadder, C- control negativ, C+ control pozitiv
n figura 5 se exemplific detectarea tulpinii PPV-Rec prin prezena benzii la
dimensiunea de 605pb la probele Reghin 6, Regin 22-23, Reghin 26 i Reghin 29-30.
n urma analizelor efectuate pe cele 30 de probe de la Reghin, rezultate prezentate n
tabelul 2 sunt urmtoarele: probele R22-23, R26, R29 sunt PPV-Rec, iar R6, R30 sunt infecii
mixte ntre tulpinile PPV-D+PPV-Rec.
1500pb
1000pb
605 pb
500pb
22
23
7 8 9 10 21 22 23 24 25
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
353pb
243 pb
182 pb
67pb
61 pb
a
b
c
Fig. 7 a, b, c Analiza produilor de amplificare digerai cu enzima de restricie Rsa I la
probele C21-30, R 6-10; 21-25, B8, B12-20, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest
5.2.2. Identificarea eventualelor mutaii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de
restricie al regiunii genei care codific proteina capsidal
Este cunoscut faptul c, n regiunea care codific capsida viral exist un situs de
restricie pentru enzima de restricie AluI. Aceast enzim se poate utiliza n scopul evidenierii
unei eventuale mutaii suferite, de tulpinile virale n acest situs.
Dac virusul a suferit o mutaie, care poate afecta situsul de restricie, enzima nu-l
recunoate i astfel nu va tia catenele de ADN obinute prin RT-PCR. n cazul n care tulpinile
virale nu au suferit mutaii, enzima recunoate situsul de restricie i taie produsul PCR,
obinndu-se astfel dou fragmente de dimensiuni mici.
Analizele obinute n urma digestiei enzimatice, folosind enzima AluI, la toate cele 90 de probe
analizate, au demonstrat faptul c, tulpinile nu au suferit nici o mutaie n regiunea proteinei
capsidale.
5.3 Rezultate privind diagnosticarea i diferenierea serologic a izolatelor cu
proveniena de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria
Diagnosticarea serologic s-a efectuat pentru a evidenia prezena virusului n probe.
Toate cele 90 de izolate au fost supuse analizei prin tehnica DASI-ELISA, cu anticorpul
policlonal universal 5B-IVIA. n urma analizelor efectuate a reieit faptul c toate izolatele au
fost infectate cu PPV.
Diferenierea serologic s-a efectuat prin aceeai metod serologic, folosind anticorpi
monoclonali specifici fiecrei tulpini. Tulpina PPV-D este recunoscut de ctre anticorpul
monoclonal 4DG5 (Cambra i colab., 1994), iar PPV-M de ctre AL (Boscia i colab., 1997).
n urma analizei serologice a celor 30 de izolate de la SCDP Cluj, un numr de 29 (97%)
au fost identificate ca aparinnd tulpinii PPV-D iar un izolat (3%) a fost identificat ca aparinnd
tulpinii PPV-M (fig. 8a).
n figura 8b sunt prezentate procentajele obinute n urma diferenierii serologice la
izolatele de la Reghin. Probele infectate cu tulpinile PPV-D+PPV-M reprezint un procent de
7%, cele infectate cu tulpina PPV-M 13%, cele care predomin fiind cele infectate cu tulpina
PPV-D (80%).n urma diferenierii serologice cu anticorpii monoclonali specifici 4DG5 (PPVD) i AL (PPV-M) rezultatele n cazul izolatelor de la Bistria arat c tulpina PPV-M este
dominant 70%, iar 30% din probe aparin tulpinii PPV-D (fig. 8c).
24
13%
3%
80%
70%
97%
PPV-D
PPV-M
PPV-D
PPV-M
PPV-D
PPV D+M
PPV-M
a
b
c
Fig. 8 a, b, c, Diferenierea serologic a izolatelor PPV recoltate din cele trei regiuni luate n
studiu
Tabel 1
Rezultatele analizelor moleculare i serologice la probele C1-30 bazate pe diferite regiuni ale
PPV-ului
Nr
Crt
Izolatul
RT-PCR
(P1/P2 i P1/PD sau PM)
PPV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Cluj 1
Cluj 2
Cluj 3
Cluj 4
Cluj 5
Cluj 6
Cluj 7
Cluj 8
Cluj 9
Cluj 10
Cluj 11
Cluj 12
Cluj 13
Cluj 14
Cluj 15
Cluj 16
Cluj 17
Cluj 18
Cluj 19
Cluj 20
Cluj 21
Cluj 22
Cluj 23
Cluj 24
Cluj 25
Cluj 26
Cluj 27
Cluj 28
Cluj 28
Cluj 30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVD
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D+M
D+M
D+M
D+M
D+M
M
D+M
D+M
D+M
D+M
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
-
25
PPV
D+M
-
Izolatul
RT-PCR
(P1/P2 i P1/PD sau PM)
PPV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Uila 1
Uila 2
Uila 3
Uila 4
Uila 5
Reghin 1
Reghin 2
Reghin 3
Reghin 4
Reghin 5
Reghin 6
Reghin 7
Reghin 8
Reghin 9
Reghin 10
Reghin 21
Reghin 22
Reghin 23
Reghin 24
Reghin 25
Reghin 26
Reghin 27
Reghin 28
Reghin 29
Reghin 30
Reghin 31
Reghin 32
Reghin 33
Reghin 34
Reghin 35
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
PPV
D+M
+
+
-
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D+M
D
D
D
D
D
M
M
D
D
M
D
D
M
D+M
D
D
D
D
D
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
-
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
PPV
D+M
+
+
-
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
Regiunea (Cter)CP a fost analizat cu setul de amorse P1-P2, astfel c rezultatele au fost
pozitive, prin urmare toate izolatele U1-R35 au prezentat infecie cu Plum pox.
Pentru a putea diferenia tulpinile PPV-D i PPV-M am analizat aceeai regiune CP, dar
cu amorse specifice celor dou tulpini: P1-PD i P1-PM. Rezulatele ne indic o dominare a
infeciei izolatelor cu tulpina PPV-D.
26
PPV
D+M
+
+
-
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Izolatul
Bistria 1
Bistria 2
Bistria 3
Bistria 4
Bistria 5
Bistria 6
Bistria 7
Bistria 8
Bistria 9
Bistria 10
Bistria 11
Bistria 12
Bistria 13
Bistria 14
Bistria 15
Bistria 16
Bistria 17
Bistria 18
Bistria 19
Bistria 20
Bistria 21
Bistria 22
Bistria 23
Bistria 24
Bistria 25
Bistria 26
Bistria 27
Bistria 28
Bistria 29
Bistria 30
RT-PCR
(P1/P2 i P1/PD sau PM)
PP
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVD
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D+M
M
D+M
M
D+M
D+M
D
D+M
D
D
D
D+M
D+M
D+M
D+M
D+M
M
D
D+M
D+M
D
D+M
D+M
D+M
D
D
M
D+M
D+M
D+M
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M s-a realizat prin analizarea
regiunii (Cter)CP cu dou perechi de amorse. Cu setul de amorse P1-PD s-au efectuat amplificri
pentru a putea fi evideniate izolatele infectate cu tulpina D a virusului Plum pox. Aceleai
amplificri s-au efectuat i cu setul de amorse P1-PM pentru evidenierea izolatelor ce aparin
tulpinii PPV-M. Rezultatele obinute demostreaz o concordan ntre tehnicile RT-PCR i
RFLP, infeciile mixte(D+Rec) fiind cele care predomin.
Izolatele B1, B3, B5-6, B8, B12-16, B20, B22-24, B28-30 s-au dovedit a fi infecii mixte
(D+M) n urma analizrii regiunii CP prin RT-PCR i RFLP. n regiunea (Cter)CP se realizeaz
diferenierea ntre tulpinile D i M. n urma analizelor serologice aceste izolate aparin doar
tulpinii PPV-M. Tulpina PPV-D nu a putut fi detectat n respectivele izolate datorit unei
27
PPV
D+M
-
CAPITOLUL VI
CONCLUZII I RECOMANDRI
Cercetrile noastre au permis obinerea unor date privind variabilitatea serologic i
molecular a izolatelor virusului Plum pox n cele trei regiuni luate n studiu, respectiv Cluj,
Reghin i Bistria.
Cunoaterea variabilitii acestui virus este o condiie esenial n elaborarea strategiilor
de eradicare sau limitare a impactului acestuia, avnd n vedere pagubele uriae produse n
culturile de prun din ara noastr.
Studiul variabilitii serologice i moleculare a virusului Plum pox s-a efectuat pe un
numr de 90 de izolate PPV recoltate din 3 livezi comerciale cu infecie mare cu PPV, din
Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei.
Infeciile au fost confirmate n totalitate prin diagnostic serologic (5B-IVIA) i
molecular (P1/P2).
Tehnica serologic DASI-ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect - Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) a permis diferenierea tulpinilor D i M pe baza antiserurilor
monoclonale specifice.
Succesul ei n cazul probelor analizate s-a bazat pe urmtoarele atuuri: acuratee,
specificitate, robustee, simplicitate i cost redus.
Tehnica molecular RT-PCR a permis analizarea a trei regiuni genomice ale PPV-ului, i
anume:(i) (Cter)CP, folosind perechile de amorse P1/PD i P1/PM care disting tulpinile PPV-D
i PPV-M; (ii) (Cter)Nib - (Nter)CP folosind perechea de amorse mD5/mM3 care detecteaz
direct o tulpin recombinat dintre D i M, denumit PPV-Rec; CI, folosind seturile de primeri
CIf/CID sau CIf/CIM pentru a confirma prezena tulpinii PPV-Rec.
Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M n regiunea (Cter)CP s-au dovedit a fi PPVRec n regiunea (Cter) Nib (Nter)CP.
Prin tehnicile RFLP i DASI-ELISA nu s-a putut face o difereniere ntre tulpinile virale
PPV-M i PPV-Rec.
Toate cele trei tehnici utilizate n prezentul studiu au condus la observarea unei
variabiliti ntre tulpinile virale din cadrul populaiei locale a virusului Plum pox.
Rezultatele noastre prezint o rat a infeciei cu PPV foarte ridicat i o situaie critic n
care se gsesc livezile de prun din punctul de vedere al infeciilor cu virusul Plum pox, n
regiunile studiate.
Diferenierea i distribuia izolatelor arat c n regiunile Cluj i Reghin predomin
tulpina PPV-D, cu cel mai mare procentaj la Reghin (80%), iar la Bistria predomin infeciile
mixte (60%). Tulpina PPV-Rec este predominant n regiunile Reghin i Bistria cu acelai
procentaj de 13%.
28
RECOMANDRI
Cunoaterea distribuiei tulpinilor virale pe regiuni pomicole va fi foarte util viitoarelor
programe de ameliorare a rezistenei genetice la PPV, deoarece reacia genotipurilor la infeciile
virale este diferit de la o tulpin viral la alta.
Rezultatele obinute pot avea un rol tehnic i economic n viitoarele strategii de
combatere a acestui virus, n cultura prunului din Romnia.
Din punct de vedere tehnic, metodele de detecie i difereniere a izolatelor pot fi
utilizate: n laboratoarele de carantin fitosanitar, garantnd circulaia materialului sditor liber
de boli virotice; n pepiniere, astfel asigurndu-se producerea materialului sditor pomicol liber
de viroze.
Din punct de vedere economic, cunoaterea distribuiei tulpinilor PPV va permite
elaborarea de strategii de eradicare sau limitare a virusului PPV, care vor conduce la revigorarea
culturii prunului i la creterea competitivitii pe plan extern.
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. ATANASOFF, D., 1932, Plum pox. A new virus disease. Yearbook University of
Sofia, Faculty of Agriculture, 11, 49-69.
2. BOSCIA, D., H. ZERAMDINI, M. CAMBRA, O. POTERE, M.T. GORRIS, A.
MYRTA, 1997, Production and characterization of a monoclonal antibody specific to the M
serotype of plum pox potyvirus. European Journal of Plant Pathology 103, 447-480.
3. CAMBRA, M., M. ASENSIO, M.T. GORRIS, E. PEREZ, E. CAMARASA, J.A.
GARCIA, J.J. MOYA, D. LOPEZ-ABELLA, C. VELA, A. SANZ, 1994, Detection of plum
pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. Bulletin
OEPP/EPPO Bulletin 24, 569-577.
4. CAMBRA, M., M.T. GORRIS, N. CAPOTE, M. ASENSIO, M.C. MARTNEZ, E.
BERTOLINI, C. COLLADO, A. HERMOSO DE MENDOZA, E. MATAIX, A. LPEZ, 2004,
Epidemiology of Plum pox virus in Japanese plums in Spain. Acta Horticulturae, no. 657, 195
200.
5. CERVERA, M.T., J.L. RIECHMANN, M.T. MARTIN, J.A. GARCIA, 1993, 3Terminal sequence of the Plum pox virus PS and o6 isolates: evidence for RNA recombination
within the potyvirus group. Journal of General Virology 74, 329-340.
6. CHRISTOFF, A., 1934, Mosaikkrankheit oder Viruschlorose, bei Apfeln. Eine neue
Viruskrankheit. Phytopath. Z. 7, 521-536.
7. CREE, L.A., 1999, Le potyvirus de la Sharka du prunier. Agence canadienne
dinspection des aliments, 183-190.
8. CRESCENZI, A., L. DAQUINO, S. COMES, M. NUZZACI, P. PIAZZOLLA, A.
HADIDI, 1996, Further caracterisation of sweet cherry isolate of plum pox potyvirus. Proc.
Middle Eur. Meet 96 Plum pox, Budapesta, 99-103.
9. CRESCENZI, A., M. NUZZACI, L. LEVY, P. PIAZZOLLA, A. HADIDI, 1997,
Infezioni di sharka su ciliegio dolce in Italia meridionale. Informatore Agrario, 34, 73-75.
10. DAMSTEEGT, V.D., H.E. WATERWORTH, G.I. MINK, W.E. HOWELL, L.
LEVY, 1997, Prunus tomentosa as a diagnostic host for the detection of plum pox virus and
other Prunus viruses. Plant Disease, 81, 329-332.
11. DOSBA, F., P. MAISON, M. LANSAC, G. MASSONIE, 1987, Experimental
transmission of plum pox virus (PPV) to Prunus mahaleb and Prunus avium. Journal of
Phytopathology 120, 199204.
29
30
31
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL
SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE,
CLUJ-NAPOCA
FACULTY OF HORTICULTURE
Eng. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN
Scientific coordinator:
Prof. univ. dr. Doru Pamfil
CLUJ-NAPOCA
2010
SUMMARY
INTRODUCTION
Plum Pox virus (PPV) is the most destructive viral pathogen of stone species and is
responsible for a serious loss of production particularly for susceptible varieties. This virus is
very dangerous because it reduces the quality and causes the premature fall of fruits. Therefore,
PPV is considered one of the main factors that makes the plum crop to be considered no longer
profitable. The virus has gradually spread to most of Europe, around the Mediterranean basin
and Middle East. Also, the virus was found in India and America (Chile, USA, Canada). In
Romania, Plum pox virus is prevalent in virtually all areas of the plum crop, causing a significant
loss of production particularly for some susceptible varieties. (Minoiu, 1997).
The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) - 1975 proposed
two lists of quarantine viruses for fruit trees. The most important virus, which is the subject to
quarantine fruit trees is Plum Pox Virus. He is also considered a highly dangerous virus by the
Inter-African Plants, and by the North American Plant Protection and is the subject of some
regulations in Australia and USA (Cree, 1999).
So far, seven strains were identified and characterized: D strain (Dideron) isolated for
the first time from apricot in Southeastern of France, M strain (Marcus) identified for peach in
northern Greece (Kerlan and Dunez, 1979, Myrtle et al ., 1998), EA (El Amar) strain described
for apricot in Egypt (Wetzel et al., 1991), SOC (sour cerry) strain detected in Moldova
(Kalashyan et al., 1993), SwC (sweet cerry) stain identified in Italy (Crescenzi et al., 1996).
PPV-Rec (name proposed and accepted) resulted from the recombination of the two major
strains(D and M), the highlight being reported recently in Albania, Bulgaria, Czech Republic,
Germany, Hungary and Slovakia (Glasa et al., 2004) and Romania (Zagrai et. al., 2006, 2008,
2009). The last PPV strain described is Winona (PPV-W) from Canada (James and
Varga,2004), which is genetically distinct from all other viral strains known to date (James and
Varga, 2005).
First report on natural infection of plum recombined strain PPV-Rec in Romania was
presented in 2006. All isolates initially identified as PPV-M strains were found belonging to
PPV-Rec strain following molecular analysis. Also, following sequencing of the PCR
(Polymerase Chain Reaction) corresponding regions (Cter) CP and (Cter) NIB - (Nter) CP
proved that nucleotide alignments correspond to those of Gene Bank, reported by Glas et al., in
2002 and 2004 (Zagrai et al., 2006). Genetic similarity with other PPV-Rec strains suggests a
common evolutionary origin. (Zagros et al., 2006, 2008).
Recent studies performed on 16 isolates from Turkey led to the identification of new viral
strains. Their sequencing has led to an observation point in region recombinant virus HC-Pro, at
position 1566 of the viral genome. The Turkish researchers proposed that this new recombined
strain to be appointed as PPV-T (Turkey) (Serce et al., 2009).
Thanks to modern methods of characterization of PPV viral isolates, it is known that two
strains are most common, (PPV-D) and (PPV-M) (Bousolem et al., 1994). PPV-D, widely spread
in Western Europe, is non-seed transmitted, difficult to be transmitted to experimental hosts and
the vector spread was effectively reduced (Levy et al., 2000). Unlike PPV-D, PPV-M spread
through the seed of necrotic strains (PPV_M) was reported by Nemeth and Koelber in 1983.
Also, it can be easily transmitted through afids. (Levy et al., 2000).
Although PPV is widespread in all plum growing areas from Romania, limited
information about the occurrence of PPV strains are available. A recent study performed in
Transylvania revealed that PPV-D is the prevalent strain followed by PPV-Rec and the mixed
infections (PPV-D + PPV-Rec) (Zagrai et. al., 2008, 2009).
33
RESEARCH OBJECTIVES
The differentiation of symptoms for the two strains (D and M) is quite difficult. The
manifested symptoms for both strains include clorotice spots on leaves and mosaics, ring spots
on fruit surface, which subsequently turn into necrosis. The symptoms caused by PPV-D strain
are generally less severe compared with those associated with PPV-M strain. (Damsteeg et al.,
1997).
The serological and molecular characterization for the collected PPV isolates pursued the
following objectives:
Identification of the infection source and harvesting of PPV isolates from plum which
have the typical symptoms of the virus
Extraction of RNA from symptomatic plum leaves
Performing the molecular diagnostics for establishing the presence of the virus by using
polyvalent primers
Differentiation of viral strains by using specific primers
Differentiation of viral strains by using PCR-RFLP analysis
Performing the serological diagnosis to establish the presence of the virus by using
Dasi-ELISA
Differentiation of viral strains PPV-D and PPV-M by using Dasi-ELISA
MATERIALS AND METHODS
Biological material
Ninety PPV isolates were collected from three fruit-growing centers from Transylvania,
namely: Fruit Research and Development Station Cluj (SCDP Cluj 30-isolates), Fruit Research
and Development Station Bistrita (Bistrita-30 isolated SCDP) and the Reghin area (Farm Uila
and Farm 10-30 isolated). Identification of infections and selection of infected trees has been
done based on of PPV typical symptoms. Then the leaf samples with obvious symptoms were
taken from different parts of the crowns of trees with generalized infection (PPV infection rate
from 20%) and analyzed by using molecular and serological tests.
ARN extraction
For the ARN extraction it was used the usual procedure, deshydration and tissue crushing
them under liquid nitrogen, to a fine powder and tissue resuspendation in a reaction buffer that
protects the RNA which is released from cells.
Extraction of total RNA from leaf plum tree was done using the kit extraction Rneasy Plant Mini
Kit (Qiagen). The protocol used for this procedure was the one recommended by the
manufacturer and the provided for the crossing of ten steps.
Serological and molecular detection
The serological diagnosis has been made by using DASI-ELISA technique and the 5BIVIA polyclonal antibody .
For viral diagnosis primers pair P1/P2 was used, which was designed to amplify a
fragment of 243 bp region corresponding to C-terminus of the protein capsid. With Qiagen OneStep RT-PCR kit we could perform both, reverse transcription (RT) and amplification (PCR) in a
single reaction. Thermal cycles required for RNA reverstranscription and amplification of DNA
fragments were performed in the Corbett Research thermocycler, optimized as follows: RT- 40
min at 500C, activating polymerases- 15 min at 950C followed by 35 cycles: denaturation- 1 min
at 940 C, primer annealing 45 s at 610 C and DNA elongation 1 min at 720 C. Amplified DNA
was elongated for 10 min at 720 C. Amplified products (10 l + 2 l loading dye) were
34
35
36