Variabilitatea Serologică Şi Moleculară A Unor Izolate Ale Virusului Plum Pox Din Bazinul Central Pomicol Al Transilvaniei

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE
I MEDICIN VETERINAR,
CLUJ-NAPOCA
FACULTATEA DE HORTICULTUR
Ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN
VARIABILITATEA SEROLOGIC I
MOLECULAR A UNOR IZOLATE ALE
VIRUSULUI PLUM POX DIN BAZINUL CENTRAL
POMICOL AL TRANSILVANIEI
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Conductor tiinific:
Prof. univ.dr. Doru Pamfil
CLUJ-NAPOCA
2010
Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat
CUPRINS
INTRODUCERE.............................................................................................................................6
CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7
DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN ................................................ 7
1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni .......................................................................... 7
1.2 Ptarea inelar la prun .......................................................................................................... 8
1.3 Mozaicul n benzi al prunilor (marmor lineopticum, prunus virus 9 christ) ......................... 8
1.4 Crparea scoarei prunului .................................................................................................... 9
1.5 Mozaicul linear (plum pseudo pox) ...................................................................................... 9
CAPITOLUL II9
ORIGINEA I RSPNDIREA VIRUSULUI..............................................................................9
CAPITOLUL III ............................................................................................................................ 11
PRINCIPALELE TRSTURI ALE PLUM POX-ULUI ........................................................... 11
3.1 Gazde naturale ale virusului ................................................................................................ 11
3.2 Patologia virusului Plum pox .............................................................................................. 12
3.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox ....................................................................... 12
CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 13
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA ............................. 13
4.1 Scopul cercetrii .................................................................................................................. 13
4.2 Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat ............................................. 13
4.3 Materialul biologic .............................................................................................................. 14
4.4 Tehnici i metode de cercetare ............................................................................................ 14
4.4.1 Extracia ARN-ului total .............................................................................................. 14
4.4.2 Reacia de revers transcriere i amplificare.................................................................. 14
4.4.3 Protocolul de amplificare ............................................................................................. 15
4.4.4 Migrarea electroforetic a produilor de amplificare n gel de agaroz ...................... 16
4.4.4.1 Prepararea gelului de agaroz ............................................................................... 16
4.4.4.2 Pregtirea produilor de amplificare n vederea migrrii n gel de agaroz.......... 16
4.4.4.3 Colorarea gelurilor de agaroz i preluarea imaginilor ......................................... 16
4.4.5 Diferenierea tulpinilor virale pe baza profilului PCR-RFLP ...................................... 17
4.4.5.1 Prepararea amestecului de reacie pentru digestia enzimatic .............................. 17
4.4.5.2 Pregtirea gelului de poliacrilamid i separarea fragmentelor de digestie .......... 17
4.4.5.3 Colorarea gelurilor de poliacrilamid ................................................................... 18
4.4.6 Principiul tehnicii DASI-ELISA pentru detectarea prezenei virusului n probe, ct i
pentru diferenierea tulpinilor virale ..................................................................................... 18
CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 19
REZULTATE I DISCUII ......................................................................................................... 19
5.1 Rezultate privind caracterizarea molecular prin RT-PCR a izolatelor recoltate de la SCDP
Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria ......................................................... 19
5.1.1 Diagnosticarea molecular ........................................................................................... 19
5.1.2 Diferenierea molecular a tulpinilor PPV-D i PPV-M cu primeri specifici .............. 20
5.1.3 Detecia tulpinii recombinate PPV-Rec ................................................................... 21
5.1.4 Analizarea regiunii genomice CI.................................................................................. 22
5.2. Rezultate privind caracterizarea molecular prin PCR-RFLP a izolatelor recoltate de la
SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria .............................................. 23
5.2.1. Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M prin digestia
enzimatic cu enzima Rsa I ................................................................................................... 23
5.2.2. Identificarea eventualelor mutaii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de
restricie al regiunii genei care codific proteina capsidal .................................................. 24
I

5.3 Rezultate privind diagnosticarea i diferenierea serologic a izolatelor cu proveniena de
la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria .......................................... 24
CAPITOLUL VI ........................................................................................................................... 28
CONCLUZII I RECOMANDRI .............................................................................................. 28
BIBLIOGRAFIE SELECTIV .................................................................................................... 29
SUMMARY...32
II
TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION.6
CHAPTER I..7
DESCRIPTION OF MAJOR VIROTIC DISEASES IN PLUM TREE7
1.1 The prune dwarf virus...7
1.2 Plum ring spot..8
1.3 Plums mosaic in bands..8
1.4 Plum bark split...9
1.5 Linear mosaic (plum pseudo pox).9
CHAPTER II.9
THE ORIGIN AND SPREAD OF THE VIRUS..9
CHAPTER III..11
THE MAIN FEATURES OF PLUM POX..11
3.1 Natural hosts of the virus....11
3.2 The pathology of Plum pox12
3.3 Symptoms caused by Plum pox virus..12
CHAPTER IV..13
RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD.13
4.1 Research purpose.13
4.2 Objectives pursued in the PhD Thesis research work.13
4.3 Biological material..14
4.4 Research techniques and methods...14
4.4.1 Extraction of total RNA14
4.4.2 Revers-transcription and amplification reaction...14
4.4.3 Amplification protocol..15
4.4.4 Agarose gel electrophoretic migration of amplification products16
4.4.4.1 Preparation of agarose gel..16
4.4.4.2 Preparation of PCR amplification products for agarose gel migration..16
4.4.4.3 Agarose gel staining and image acquisition.16
4.4.5 Differentiation of virus strains based on PCR-RFLP profile17
4.4.5.1 Mixture preparation for enzymatic digestion.17
4.4.5.2 Polyacrylamide gel preparation and the separation of digestion fragments..17
4.4.5.3 Polyacrylamide gel staining...18
4.4.6 Dasi-ELISA technique for the virus detection in samples and for viral strain
differentiation18
CHAPTER V...19
RESULTS AND DISCUSSION19
5.1 Results regarding the molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj,
Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistria by using RT-PCR.19
5.1.1 Molecular diagnostics...19
5.1.2 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M strains using specific primers20
5.1.3 Detection of PPV-Rec recombinant strain...21
5.1.4 Analysis of CI genomic region.22
5.2 Results regarding molecular characterization of isolates collected from SCDP Cluj,
Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistria by PCR-RFLP..23
5.2.1 Molecular differentiation of PPV-D and PPV-M viral strains by enzymatic digestion
using Rsa I enzyme23
III

5.2.2 The identification of viral strains possible mutations located at the restriction-site
level of the capsid protein encoding gene.24
5.3 Results regarding the serological differentation and diagnostics of isolates provided by
SCDP Cluj, Reghin (Uila and 10 Farm ) and SCDP Bistria...24
CHAPTER VI..28
CONCLUSIONS AND RECCOMANDATIONS..28
SELECTIVE BIBLIOGRAPHY...29
THESIS RESUME32
IV
INTRODUCERE
Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole
smburoase. Acest fapt se datoreaz scderii calitii fructelor i pierderilor cauzate de cderile
premature ale acestora (Nemeth, 1994).
n Romnia, acest virus este rspndit n toate arealele de cultur ale prunului i
provoac pierderi masive de producie (Minoiu, 1997, Zagrai i colab., 2006).
Motivaia alegerii acestei teme s-a datorat faptului c n ara noastr la momentul
nceperii cerecetrilor nu era cunoscut distribuia tulpinilor virusului Plum pox n
Romnia, ara noastr fiind printre puinele ri europene care nu avea o strategie de
eradicare sau limitare a impactului acestui virus. O astfel de strategie nu poate fi realizat
fr a cunoate gradul de rspndire a PPV-ului i distribuia tulpinilor acestuia.
Teza de doctorat are ca obiectiv principal studierea variabilitii serologice i
moleculare a unor izolate ale virusului Plum pox din trei regiuni pomicole situate n
Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei: Cluj, Mure i Bistria.
Primele cercetri din Romnia privind identificarea i diferenierea tulpinilor virusului
Plum pox, prin tehnici moleculare i serologice au fost realizate la Staiunea de CercetareDezvoltare Pomicol Bistria (SCDP Bistria) (Zagrai i colab., 2005a).
n perioada 2006-2008 SCDP Bistria n colaborare cu SCDP Vlcea i departamentele
de biologie molecular din cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar
(USAMV) i Universitii Babe-Bolyai din Cluj Napoca, au iniiat un proiect ce a avut ca i
obiective: dezvoltarea virusologiei pomicole din ara noastr, aplicarea de tehnici moleculare i
serologice pentru diferenierea tulpinilor virale ale virusului Plum pox i realizarea unei hri cu
distribuia pe regiuni ale acestor tulpini. Rezultatele au artat o situaie dramatic i
necontrolabil n ceea ce privete infeciile masive cu Plum pox din ara noastr
(http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm).
Caracterizrile serologice i moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV) efectuate de
ctre cercettorii din Europa Occidental au permis stabilirea apartenenei acestora la diferite
tulpini virale dar i la identificatea unor forme recombinate.
Pn n prezent au fost identificate i caracterizate serologic i molecular apte
tulpini de PPV: Sua D (dideron) izolat pentru prima dat la cais n sud-estul Franei;
Sua M (marcus) identificat la piersic n nordul Greciei (Kerlan i Dunez, 1979; Myrta i
colab., 1998); Sua Ea (el amar) descris n Egipt la cais (Wetzel i colab., 1991a); Sua
SoC (sour cherry) detectat n Republica Moldova (Kalashyan i colab., 1993); Sua SwC
(sweet cherry) identificat n Italia (Crescenzi i colab., 1996); Sua PPV-Rec rezultat din
recombinarea celor dou tulpini majore (M i D), fiind descoperit n Albania, Bulgaria,
Cehia, Germania i Slovacia (Glasa i colab., 2004).Sua PPV-W(Winona) a fost
identificat n Canada (James i Varga, 2004a). Recombinarea joac un rol important n
evoluia ribovirusurilor, determinnd apariia unor sue noi cu efecte nepredictibile asupra
patogenitii (Worobey i Holmes,1999). Recombinarea natural dintre tulpinile PPV-D i
PPV-M a constituit apariia unei noi tulpini virale, numit PPV-Rec, ce a fost raportat
prima dat de Glasa i colab. (2002 ).
Recentele studii din Turcia efectuate pe 16 izolate au condus la identificarea unei noi
tulpini virale. Secvenierea acestora a condus la observarea unui punct de recombinare n
regiunea viral HC-Pro, la poziia 1566 din genomul viral. Astfel c cercettorii turci propun ca
aceast nou tulpin recombinat s se numeasc PPV-T (Turcia). Urmnd ca studiile ulterioare
s stabileasc distribuia geografic n Turcia i posibil n alte ri (Serce i colab., 2009).
Primul raport privind infecia natural a prunilor cu tulpina recombinat PPV-Rec n
Romnia a fost fcut n anul 2006. Toate izolatele identificate iniial ca fiind tulpina PPV-M sau dovedit aparinnd suei PPV-Rec, n urma analizelor moleculare. n urma secvenierii
6

produilor PCR (Polymerase Chain Reaction) corespunztori regiunilor (Cter)CP i (Cter) Nib
(Nter) CP s-a dovedit faptul c aliniamentele nucleotidice corespund cu cele din Gene Bank,
raportate de Glasa et al., n 2002 i 2004 (Zagrai i colab., 2006). Similaritatea genetic cu alte
tulpini PPV-Rec sugereaz o origine evoluionar comun. (Zagrai i colab., 2006, 2008a).
Cercetrile din cadrul tezei de doctorat au presupus utilizarea de tehnici moleculare i
serologice, fr de care nu se puteau identifica i diferenia tulpinile virale ale virusului Plum
pox. Analizele izolatelor PPV luate n studiu s-au realizat cu ajutorul tehnicilor Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), Restriction Endonuclease Length
Polymorfism (RFLP) i DASI-ELISA (Double antibody sandwich Indirect- Enzyme- linked
immunosorbent assay).
CAPITOLUL I
DESCRIEREA PRINCIPALELOR BOLI VIROTICE LA PRUN
1.1 Piticirea prunului prune dwarf, nanus pruni
Pomii atacai de acest virus au habitusul redus, nregistreaz pierderi de 50-82%, iar la
soiurile sensibile se constat sterilitatea florilor.
Simptome.
Virusul afecteaz frunzele, lstarii i florile. Frunzele infectate se alungesc, se ngusteaz
i prezint un luciu sticlos. Lstarii se dezvolt n rozete i prezint internodii scurte. Florile
atacate avorteaz , iar pomul rmne cu fructe puine.
Virusul afecteaz urmtoarele specii de Prunus: P.davidiana, P.fructicosa, P. tomentosa,
P. virginiana, P. tenella, P. triloba, P. spinosa, P. spinosa.
Cele mai sensibile soiuri de prun sunt: Vnt de Italia, Renclod Althan, Lombard,
Standard, Emilia, Tragedy, President. Tolerante sunt urmtoarele soiuri: Victoria, Renclod
Doree, Stanley, Vnt romanesc.
Transmiterea la prun se face prin altoire, semine de mirobolan, portaltoi vegetativi
infectai. Pentru testare biologic se folosesc ca i plante indicator soiurile Vnt de Italia,
Krikon, puieii de piersic GF 305.
Combatere
Selecia materialului de nmulire liber de piticirea prunului se face cu ajutorul plantelor
test ierboase i a indicatorilor lemnoi. La plantele de castravei infectate cotiledoanele manifest
leziuni locale i mozaic pe frunze.
La indicatorii lemnoi virusul se transmite prin grefare de muguri sau scoar de la pomul
de testat. Virusul prune dwarf produce necroze n scoar i n lemn la P. effusa, soiul Krassa
sever i Malus halliana.
Metode de combatere utilizate:
-nfiinarea de plantaii mam productoare de ramuri altoi, butai, marcote i semine
libere de prune dwarf
-aplicarea de tratamente de fitoprotecie la acoperire pe toat perioada de vegetaie n
pepinier i plantaii mam
-defriarea pomilor infectai n cazul n care acetia sunt infectai
-cultivarea de soiuri tolerante la virusul prune dwarf

1.2 Ptarea inelar la prun
Boala este produs de virusul PNRSV, ce reprezint virusul cel mai pgubitor dup
virusul PPV i este prezent aproape peste tot unde sunt cultivate smburoasele. Prima dat a fost
descris, izolat i caracterizat de pe pomii de prun i piersic iar ulterior la cire i viin.
Boala este rspndit n ntrega lume, fiind produs de virusuri izometrice labile ILAR
(izometric labil ring spot).Virusul este reprezentat de numeroase tulpini, dar cele mai frecvente
produc ptarea inelar (Plum ring spot) i declinul (Plum decline). Produce pagube importante
att n pepinierele pomicole ct i n plantaiile comerciale.
Simptome
La prun simptomele se manifest pe frunze sub forma unor pete rotunde, glbui-clorotice
i sub form de inele cu centrul clorotic. Deoarece esuturile necrozate cad, frunzele rmn
ciuruite. Simptome evidente apar n anul urmtor infectrii, apoi infecia rmne n stare latent.
Simptome de ciuruire virotic pe frunze prezint urmtoarele soiuri: Tuleu gras, Vnat
romnesc, Florentina, Santa Rosa, Renclod Oullins, Cambridge Cage.
Combatere
-testarea materialului destinat nmulirii se efectueaz cu ajutorul testului serologic
ELISA
-ca plante indicator sunt folosii puieii de piersic GF 305, puiei de cire franc, Prunus
serrulata var. Shirofugen
-plantaiile tinere de pomi fructiferi vor fi tratate la avertizare pentru a preveni infeciile
spontane, prin vectori
-nainte de nfiinarea unor plantaii mam de ramuri altoi, butai, marcote i semine,
terenurile se vor dezinfecta cu nematocide, iar tratamentele mpotriva vectorilor se vor face cu
insecticide sistemice la acoperire
1.3 Mozaicul n benzi al prunilor (marmor lineopticum, prunus virus 9 christ)
Soiurile infectate prezint o reducere a produciei de pn la 40%, n funcie de
sensibilitatea soiurilor. Virusul se transmite prin nmulire vegetativ: altoire, marcote, butai i
mai puin prin smn i polen. Mozaicul n benzi este ntlnit la prun, piersic, migdal,
microbolan, cais, cire. Producia de fructe la pomii infectai este mai redus, pn la 40%, n
funcie de sensibilitatea soiurilor.
Simptome
La prun simptomele apar pe frunze i se manifest prin desene sub forma frunzei de
stejar, inele i nglbeniri pe frunze. Simptomele sunt evidente primvara, iar vara adeseori
lipsesc. Soiurile ce prezint astfel de simptome sunt: Victoria, Ontario, Cambridge Gage, Emma
Leppermann, Vnt de Italia, Renclod, Lombard.
Combatere
-testarea plantaiilor mam cu indicatori lemnoi: Tuleu dulce, Emma Leppemann,
puiei de piersic i cire F 12/1; plante test ierboase, precum sunt: Nicotiana
Megalosiphon, Vigna cylindrica, Physalis floridana
-producerea materialului sditor pomicol liber de viroze n uniti specializate

1.4 Crparea scoarei prunului
Virusul se transmite prin nmulire vegetativ a pomilor infectai: altoire, marcote i
butai. Producia de fructe la soiurile sensibile este mai redus cu pn la 40-60%.
Simptome
n pepinier pomii prezint la nivelul scoarei crpturi superficiale, ce apoi se adncesc,
necroza putnd ajunge pn la cambiu. La soiurile sensibile din plantaiile de prun se constat
crpturi adnci pe tulpin i ramuri, ajungndu-se la intrarea timpurie n declin.Soiurile ce
prezint sensibilitate sunt: Tuleu dulce, Renclod dAlthan, Stanley, Cambridge Gage, Renclod
Oullins. Tolerante la acest virus sunt urmtoarele soiuri: Renclod Doree, Early Laxton, Anna
Spath i Upal.
Combatere
-depistarea virusului n materialul destinat nmulirii cu ajutorul testului serologic
ELISA
- testarea materialului sditor pomicol cu indicatori lemnoi i ierboi
1.5 Mozaicul linear (plum pseudo pox)
Virusul este acelai ca i la crparea scoarei, dar o alt tulpin care serologic este
nrudit cu prima. Pentru prima dat a fost descris de Christoff, n 1934.
Simptome
Pe frunze apare un mozaic linear verde glbui i uneori i pete clorotice, evidente mai
ales primvara. Pe fructe simptomele se manifest sub forma unor pete uor adncite,
asemntoare cu cele produse de Plum pox, dar mai superficiale. Aceste fructe se maturizeaz
mai devreme i cad n mas. Cele mai sensibile soiuri din cultur sunt: Timpurii de Aiud,
Timpurii Albach, Diana, Superb.
Tulpina viral care produce crparea scoarei induce la Tuleu dulce simptome foliare i
nu provoac sinptome pe Malus pumilla R 12740-7 A. Tulpina de mozaic linear produce
simptome de crpare a scoarei pe Tuleu dulce, iar pe R 12740 7 A determin simptome foliare
tipice virusului Apple chlorotic leaf spot. Ambele virusuri provoac simptome pe frunze la
specia Malus platycarpa.
Combatere
-testarea soiurilor i portaltoilor de prun destinai nmulirii i nfiinrii de plantaii
mam prin dubla inoculare pe puiei de mirobolan cu Tuleu dulce sau pe puiei de Malus
platycarpa i testare pe Chenopodium quinoa. Cea mai indicat metod serologic pentru
depistarea virusului este testul ELISA.
CAPITOLUL II
ORIGINEA I RSPNDIREA VIRUSULUI
Virusul Plum pox Potyvirus (PPV), face parte din familia Potyviridae fiind
considerat pentru mult timp ca singurul virus din aceast familie care infecteaz speciile
pomicole smburoase. Acest virus a fost identificat pentru prima dat n livezile de prun
din Bulgaria n anul 1918 i menionat de ctre cercettorul Atanasoff (1932). Virusul

distruge n asemenea msur fructele pomilor infectai, nct acestea nu pot fi folosite nici
n consumul curent, nici n industria prelucrrii fructelor.
n anul 1994, Levy i Hadidi au descoperit la soiurile de piersic i prun importate n
SUA din Asia de Est un nou virus denumit potyvirusul asiatic latent. Virusul Plum pox
este cel mai distuctiv agent patogen viral al speciilor pomicole smburoase, producnd
grave pierderi de producie mai ales soiurilor sensibile, care pot fi calamitate n proporie
de 100%.
Denumit i Sharka, simptomele bolii au fost pentru prima dat evideniate n
Bulgaria ntre anii 1915-1918, la sfritul Primului Rzboi Mondial (Atanasoff,1932). ns
au existat unele rapoarte ce indicau prezena simptomelor bolii n Macedonia, n anul 1910.
Primul document care descrie virusul ce provoac boala nu a aparut dect n 1932,
cnd virologul Atanosoff l-a numit Sarka po slivite, nsemnnd Pox of Plum. Sharka
reprezint o mare problem n mod particular n arealele cultivate cu smburoase din
Europa Central i de Est.
n ultimii 10 ani virusul s-a rspndit n rile mediteranene, cum ar fi: Spania
(Llacer i colab., 1985), Portugalia (Lourno i Monte Corvo, 1986) i Egipt (Wetzel i
colab., 1991a). De asemenea prezena virusului a fost raportat n India (Thakur i colab.,
1994), Chile (Roy i Smith, 1994), SUA (Levy i colab, 2000) i Canada (James i colab,
2003). Christoff (1934) a observat prezena virusului n livezile de caii din Bulgaria n
1933 i a durat pn n 1960 cnd a fost depistat n Ungaria.
ntre anii 1932-1960 boala s-a mutat la nord i est de Bulgaria ajungnd n
Iugoslavia, Ungaria, Romnia, Albania, Cehoslovacia, Rusia. Pn n 1960 virusul a
infestat doar livezile de prun i cais, niciodat cele de piersic din Bulgaria, pn n 1980,
cnd s-au importat pomi din Bulgaria.
Dup cel de-al Doilea Rzboi Mondial Sharka a progresat spre vestul Europei,
ajungnd n Germania i Austria n anul 1950. La mijlocul anilor60 prezena virusului a
fost semnalat n Olanda, Elveia, Grecia, Anglia i Turcia; mijlocul anilor70 n Frana,
Italia i Belgia; mijlocul anilor80 n Spania i Portugalia; sfritul anilor80 n Egipt,
Siria, Cipru. Levy i colab (2000) ne prezint un tablou al rspndirii plum pox-ului ce
arat astfel:
-rspndire limitat: Albania, Austria, Cipru, Cehia, Frana, Luxembourg, Italia,
Moldova, Norvegia, Slovenia, Spania, Turcia, Ucraina, Anglia, SUA.
-rspndire larg: Germania, Grecia, Bulgaria, Ungaria, Polonia, Romnia,
Slovacia, ex- Iugoslavia
-prezent, probabil eradicat: Suedia, Olanda, Belgia
-prezent, dar neextins: Lituania, India, Egipt, Bosnia-Heregovina
-statutul recent necunoscut: Danemarca i Chile
Cele mai noi date globale n ceea ce privete diferenirea i distrubuia izolatelor din
Romnia (regiunile Transilvania, Moldova i Muntenia) arat o rspndire foarte larg a tulpinii
PPV-D, cu o rat medie de 74% pe cele trei regiuni. Cu o frecven medie sunt tulpinile PPVREC
(12,6%),
urmat
de
infeciile
mixte
(PPV-D+
rec),
cu
13,3%.
(http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm).
Datorit recentului progres i severitii acestei boli a dus la apariia Grupului
Internaional de Lucru n anul 1970 i care mpreun cu Organizaia European i
Mediteranean Pentru Protecia Plantelor (OEPP/EPPO) coordoneaz cercetarea i
schimbul de informaii ntre ri.
nc din anul 1975, virusul Plum pox este consiserat un patogen de carantin pe
deplin justificat, ntruct el reprezint o ameninare grav chiar i pentru regiunile unde nu
este nc rspndit. Este considerat un patogen de carantin i de ctre Consiliul Fitosanitar
10

Inter-African i de ctre Organizaia Nord-American Pentru Protecia Plantelor (Cree,
1999).
Plum pox este o problem serioas la nivel mondial, cu un impact sever asupra
productivitii i calitii fructelor din specia Prunus (PPV), un virus mpotriva cruia nu este
disponibil nici un fel de tratament curativ chimic sau biologic. Soluia actual pe termen scurt
este de eradicare a pomilor infectai i plantarea de material liber de viroze.
SharCo este un proiect FP 7 ce se deruleaz ntre anii 2007-2013 i este cofinanat de U.E
n cadrul acordului de finanare cu nr. 204429. Din acest proiect fac parte 17 institute de
cercetare i universiti din 12 ri europene.
Staiunea de Cercetare-Dezvoltare pentru Pomicultur Bistria SCDP Bistria este una
dintre cele mai importante staiuni de cercetare implicate n investigarea virusului Plum pox n
Romnia. Activitatea la SCDP Bistria se concretizeaz pe impactul PPV asupra productivitii i
calitii fructelor, caracterizarea tulpinilor i epidemiologie. Misiunea global a parteneriatului
ntre SCDP Bistria i SharCo este de a obine informaii suplimentare despre epidemiologia PPV
n Romnia i dezvoltarea unor noi modaliti de limitare a rspndirii PPV.
CAPITOLUL III
PRINCIPALELE TRSTURI ALE PLUM POX-ULUI
3.1 Gazde naturale ale virusului
Speciile afectate de acest virus sunt cele din genul Prunus, cum ar fi: caisul
(P.armeniaca), piersicul (P.persica), prunul (P. Domestica i P. Salicina). Migdalul i
ciresul pot fi infectate cu acest virus, dar simptomele nu sunt foarte evidente (Festic, 1978;
Kalashyan i colab, 1994).
Virusul a fost transmis artificial i la cirei i viini, dar infeciile au rmas locale,
neexistnd dovezi c s-ar fi rspndit (Dosba i colab, 1987). Infecii naturale la specia P.
Cerasus au fost raportate de Kalashyan i colab. (1994), dar infecia cu PPV a cireelor este
considerat extrem de neobinuit, fiind practic neintlnit n cea mai mare parte a
Europei.
Specii slbatice i ornamentale aparinnd genului Prunus pot servi ca a doua gazd
a PPV i pot avea impact asupra epidemiologiei i controlului acestui virus (Polak, 1997).
Astfel c multe din speciile slbatice ale genului Prunus sunt susceptibile: P.bessey,
P.cerasifera, P.insititia, P.tomentosa, P.spinosa, P.mahaleb,
P.pumila,
P.davidana,
P.nigra,
P.maritime, P.americana .
Rezultatele obinute n Iugoslavia infirm faptul c speciile menionate mai sus ar fi
gazde naturale ale virusului, dar s-a descoperit alt virus, virusul necrotic ring spot
(Rankovic i Dulic-Markovic,1992).
Practic toate speciile din genul Prunus cultivate n scop comercial n Europa sunt afectate
mai mult sau mai puin de acest virus. Multe specii ce nu aparin genului Prunus, ce fac parte din
noua familie de plante au fost infectate artificial cu una sau mai multe tulpini ale virusului sau n
unele cazuri s-au gsit plante infectate n mod natural. Multe dintre acestea sunt plante ierboase
anuale, cteva fiind perene sau lemnoase i pot servi ca i gazd: Campanula rapunculoides,
Chenopodium quinoa, C. Species, Lamium album, L. Amplexicaule, L. Purpureum, Lupinus
albus, Lycium barbarum, L.Halimifolium, Medicago lupulina, Trifolium dulcamara, T. pratense,
T. repens, Zinnia elegans.
11

3.2 Patologia virusului Plum pox
Vrsatul prunului este produs de Prunus virus 7 Christoff i aparine grupei
potyvirus, avnd ca i reprezentant virusul Y al cartofului. Criptograma virusului a fost
stabilit de Kerlan i Dunez (1976) i se prezint astfel: R/1; 3,5/5,2; E/E; S/Ap. Din
descifrarea criptogramei rezult c genomul viral este alctuit din acid ribonucleic cu o
singur spiral de nucleotide. Dimensiunea genomului este de 10 kb iar la captul 3` se afl
o regiune poly(A). n captul 5` se leag cu legtur covalent o protein specific.
Proteina rspunztoare pentru proprietile serologice este proteina CP (Coat
protein), ce este implicat i n rspndirea virusului prin afide.
Greutatea molecular a acidului nucleic este de 3,5 x 106 daltoni i constituie 5,2%
din particula viral. Particulele virale se prezint sub form alungit , cu lungime de 750nm
i diametru 15nm. Temperatura de inactivare a virusului este de 550C, diluia limit este de
10-3, iar longevitatea n suc de 35 de ore la temperatura de 200C i de 5-7 zile la
temperatura de 40C.
Perioada de incubaie n livad dureaz 9-10 luni la plantele lemnoase i 1-2 luni n
ser la puiei, iar la plantele ierboase 1-3 sptmni. Viteza de rspndire n esuturi
depinde de vrsta pomilor, sensibilitatea esuturilor i viteza de propagare n ntreg pomul.
La soiul Vnt de Italia n vrst de 4 ani prin inoculare cu muguri infectai, virusul a
cuprins ntreg pomul dup 4-5 ani, iar la soiul Bistria n 1-2 ani.
Viteza de rspndire a virusului n livad depinde de marimea sursei de infecie i
de prezena sa n interiorul su n afara plantaiei.
3.3 Simptomele provocate de virusul Plum pox
Plum pox este o boal foarte grav deoarece produce simptome severe pe fructe,
frunze, smburi, uneori pe trunchi i pe ramurile de schelet (Minoiu, 1997). Simptomele de
PPV sunt foarte evidente pe frunzele de primvar ce se manifest sub forma unor
decolorri de culoare verde deschis, pete clorotice, cercuri concentrice, deformri ale
frunzelor. n unele cazuri se constat o cdere prematur a fructelor bolnave.
Prezena sau intensitatea simptomelor variaz n funcie de specie i soi, tulpina
viral, starea fitosanitar a gazdei cu privire la ali virui, sezon i locaie. PPV
influeneaz ntr-o mic msur vigoarea i longevitatea longevitatea i pomilor infectai.
Nemeth (1986) descrie simptomele la unele soiuri de prun, chiar i moartea unor
pomi, dar nu s-a putut confirma c simptomele au fost induse de PPV. Atanassoff (1932,
1935) a descris simptomele plum pox-ului la diferite specii ale genului Prunus.
OEPP/EPPO (1983), Nemeth (1986) au descris simptomele PPV la prunul european,
cais i piersic. Llacer i colab (1985), Llacer i Cambra (1986) descriu simptomele PPV la
prunul japonez. Simptomele virusului prezent la viin i cire au fost descrise de Crescenzi
i colab (1997), Nemchinov i colab (1998).
Infectarea cu acest virus poate duce la pierderi considerabile. Aproximativ 100 de
milioane de pomi aparinnd speciilor smburoase din Europa sunt infectate , la unele
soiuri sensibile pierderile pot fi de 80-100% (Kegler, 1998). n estul i centrul Europei
soiurile sensibile de prune pot prezenta cderi premature ale fructelor i fisuri pe suprafaa
lor. Nemchinov i colab (1998) descriu simptomele la cire i le prezint astfel: pete
circulare de natur clorotic sau necrotic, cderi premature ale fructelor.
12
CAPITOLUL IV
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA
4.1 Scopul cercetrii
Cercetrile au fost axate pe testele moleculare i serologice pentru toate cele 90 de probe
provenite din cele trei regiuni pomicole situate n Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei
(Cluj, Bistria i Reghin).
Cercetrile s-au axat, n prealabil, pe identificarea unor focare de infecie n regiunile
menionate. Identificarea focarelor de infecie i selecia pomilor infectai au fost efectuate pe
baza simptomelor tipice de PPV iar, ulterior, probe de frunze cu simptome evidente vor fi
prelevate din diferite pri ale coroanelor pomilor cu infecie generalizat i supuse
diagnosticului serologic i molecular.
Diagnosticul molecular s-a realizat prin tehnica RT-PCR folosind perechea de amorse
polivalente P1/P2 care amplific un fragment de 243 bp corespunztor regiunii C-terminus a
proteinei capsidale (Wetzel i colab., 1991 b).
Diferenierea molecular a fost realizat tot prin RT-PCR folosind amorse specifice
regiunilor genomice (Cter)CP (gena pentru proteina capsidal), (C-ter)NIb (gena pentru replicaza
viral)/ (N-ter)CP i CI (gena pentru helicaz). Evidenierea produilor amplificai a fost
realizat prin electroforez n gel de agaroz, benzile colorate cu bromur de etidiu au fost
vizualizate sub lumin ultraviolet.
Produii PCR corespunztori regiunii (Cter)CP au fost ulterior difereniati prin RFLP,
folosind enzimele de restricie Rsa I i Alu I. Produii fragmentai s-au evideniat prin
electroforez n gel de poliacrilamid. Prin tehnica RT-PCR s-a avut n vedere i identificarea
unor poteniale recombinri genetice care pot conduce la apariia unor tulpini virale noi cu efecte
nepredictibile: virulen i agresivitate diferit.
Diagnosticarea i diferenierea serologic a izolatelor PPV a fost realizat prin
intermediul tehnicii imonoenzimatice DASI-ELISA folosind antiseruri monoclonale pentru cele
dou serogrupuri majore - PPV-D (tulpina clorotic) i PPV-M (tulpina necrotic) i protocolul
de lucru recomandat de Cambra i colab., 2004.
4.2 Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat
Cercetrile propuse sunt relevante pentru horticultur deoarece sunt abordate aspecte de
mare actualitate ce asigur acumularea de cunotine avansate i rezultate tiinifice ntr-un
domeniu de mare importan tiinific i economic.
Tulpinile virale pot crea att probleme de identificare ct i de importan practic.
Tulpinile unui virus pot induce simptome diferite i se pot adapta diferit la noile soiuri de plante
fcnd astfel dificil diferenierea lor.
Diferenierea simptomatologic a celor dou tulpini (D si M) este dificil de realizat. n
cazul ambelor tulpini simptomele se manifest prin pete clorotice i mozaicuri pe frunze, pete
inelare pe suprafaa fructelor care, ulterior, devin necrozate i se adncesc n pulp. Tulpina
PPV-D provoac, n general, simptome mai puin severe comparativ cu PPV- M (Damsteeg i
colab., 1997).
Pentru caracterizarea molecular si serologic ale izolatelor PPV recoltate, s-au avut n
vedere urmtoarele obiective:
Identificarea focarelor de infecie i recoltarea de izolate PPV de la pruni care
exteriorizau simptome tipice cu acest virus
Extracia ARN-lui din frunze de prun simptomatice
13
Efectuarea diagnosticului molecular pentru stabilirea prezenei virusului cu

primeri polivaleni
Diferenierea tulpinilor virale cu primeri specifici
Diferenierea tulpinilor virale prin analize PCR-RFLP
Efectuarea diagnosticului serologic pentru stabilirea prezenei virusului prin
DASI-ELISA
Diferenierea tulpinilor virale PPV-D i PPV-M prin DASI-ELISA
4.3 Materialul biologic

n cadrul cercetrilor am efectuat o documentare cu privire la identificarea focarelor de
infecie, diagnosticul molecular, diferenierea i optimizarea protocolului de extracie n vederea
izolarii i purificrii ARN-ului .
Cercetrile au fost axate, n prealabil, pe identificarea unor focare de infecie din trei
zone pomicole situate n bazinul central pomicol al Transilvaniei, i anume: Staiunea de
Cerecetare-Dezvoltare Pomicol Cluj (SCDP Cluj-30 de izolate), Staiunea de CerecetareDezvoltare Pomicol Bistria (SCDP Bistria-30 de izolate) i zona Reghin (Ferma Uila i Ferma
10-30 de izolate).
Identificarea focarelor de infecie i selecia pomilor infectai au fost efectuate pe baza
simptomelor tipice de PPV. Ulterior probe de frunze cu simptome evidente au fost prelevate n
luna iunie a anului 2007, din diferite pri ale coroanelor pomilor cu infecie (rata de infecie cu
PPV de peste 20%) i supuse diagnosticului molecular.
Menionez c pentru fiecare izolat au fost recoltate 10 frunze, ce au fost aezate n pungi
de polietilen. Dup numerotare, n ceea ce privete parcela, rndul i pomul din care s-a
recoltat izolatul pungile au fost depozitate ntr-o lad frigorific i apoi stocate n congelator la 80 0C pn n momentul n care am nceput analizele de laborator. Simptomele pe frunze
constau n pete, benzi, inele de culoare glbuie pn la verde msliniu (uneori roiatice).
4.4 Tehnici i metode de cercetare
4.4.1 Extracia ARN-ului total
Pentru izolarea ARN-ului total, s-a recurs la procedura standard, i anume deshidratarea
esuturilor i zdrobirea lor sub azot lichid, pn la obinerea unei pudre fine i resuspendarea
esutului mojarat ntr-o soluie tampon care protejeaz ARN-ul eliberat din celule.
Extracia ARN-ului total din frunzele de prun, s-a realizat cu ajutorul kit-ului de extracie
Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen).
Protocolul de lucru folosit a fost cel recomandat de productor i a presupus parcurgerea
a zece pai.
4.4.2 Reacia de revers transcriere i amplificare
ARN-ul total extras din frunzele de prun virozate, a fost utilizat pentru RT-PCR, cu
ajutorul kitului Qiagen One-Step RT-PCR kit, ntr-un singur pas. Acest kit, permite efectuarea
revers transcrierii (RT) i a amplificrii (PCR) ntr-o singur reacie.
Pentru diagnostic viral s-a folosit perechea de amorse polivalente P1/P2, care au rolul de
a amplifica un fragment de 243 bp corespunztor regiunii C-terminus a proteinei capsidale.
Diferenierea molecular a izolatelor pe tulpini, respectiv evidenierea eventualelor sue
recombinate s-a realizat folosind amorse specifici regiunilor genomice CP (gena pentru proteina
capsidal) cu P1-PD i P1-PM (Olmos i colab., 1997), regiunea CI (gena pentru helicaz) cu
14

CIF-CID i CIF-CIM (Glasa i colab., 2002) i regiunea NIb (gena pentru replicaza viral) cu
mD5 i mM3 (Subr i colab., 2004) (fig.1).
Fig.1 Seciunile genomice ale PPV-ului vizate pentru caracterizare molecular.

(Zagrai i colab., 2006)
PPV's targeted genomic sections for molecular characterization
Secvena amorselor utilizate n vederea diagnosticarea i diferenierii tulpinilor virale a
fost urmtoarea:
P1: 5`-3` ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC
P2: 5`-3` CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA
PD: 5`-3` CTT CAA CGA CAC CCG TAC GC
PM: 5`-3` CTT CAA CAA CGC CTG TGC GT
CIF: 5` - GCAAAGTAAYGAAGTTGCAC-3` sense
CID: 5` - TCGTGTATCGAACGAGACGA 3`antisense
CIM: 5` - TCGTATAACGAACAAGTCGG 3` antisense
mD5: 5` - TAT GTC ACA TAA AGG CGT TCT C-3`
mM3: 5` - CAT TTC CAT AAA CTC CAA AAG AC-3`
Metoda de lucru:
Amestecul (master-mix) dintre componentele s-a realizat ntr-un tub Eppendorf de 1,5
ml, enzima adugndu-se ultima. Amestecul de reacie PCR a fost preparat n hota steril pentru
a evita contaminarea cu ARN strin.
Dup adugarea enzimei (revers transcriptaza i polimeraza) se vortexeaz tubul uor
timp de cteva secunde, pentru evitarea separrii gravimetrice a componentelor. ntr-un set de
microtuburi de 0.2 ml (Eppendorf) se introduc cte 20 l/tub din amestec, peste care se adaug 5
l ARN din fiecare prob. Se introduce setul de microtuburi n termocycler i se iniiaz ciclu de
revers transcriere i amplificare
4.4.3 Protocolul de amplificare
Ciclurile termice necesare reverstranscrierii ARN-ului i amplificrii fragmentelor de
ADN s-au realizat n aparatul thermocycler (Corbett Research), optimizat dup cum urmeaz:
1. Reverstranscriere:
2. Activarea polimerazei:
50C ................40 minute;

95C ................15 minute;
15

3. Fixarea amorselor:
Denaturare:
94C................1 minut;
Ataarea amorselor: 61C............... .1 minut;
Extensie:
72C.................1 minut;
4. Extensie final:
72C................10 minute;
5. Rcire:
X 35 de cicluri
4C
Temperatura de ataare a amorselor n cazul amorselor CIF-CID/CIM a fost de

60oC, iar n cazul amorselor mD5-mM3 de 470C.
4.4.4 Migrarea electroforetic a produilor de amplificare n gel de agaroz
Metoda electroforetic se bazeaz pe separarea diferitelor specii de particule ncrcate
electric, prin migrarea difereniat sub influena unui cmp electric. Astfel c ntr-un cmp
electroforetic ce se formeaz ntre 2 electrozi, particulele ncrcate electric se deplaseaz spre
electrodul de sarcin opus. Pentru ca migrarea s fie corect, este necesar ca tensiunea i
intensitatea curentului electric s fie constante pe ntreaga durat de migrare.
4.4.4.1 Prepararea gelului de agaroz
Preparerea gelurilor de agaroz s-a realizat prin topirea agarozei 1,4% n cuptorul cu
microunde, n 100 ml tampon de electroforez TAE pn la obinerea unei soluii clare,
transparente. Aceast soluie a fost turnat n matria n care au fost fixai pieptenii pentru
formarea godeurilor. Dup rcirea i ntrirea gelului, pieptenii au fost scoi iar gelul a fost
aezat n cuva de electroforez orizontal, cuv n care anterior s-a turnat tampon de
electroforez TAE.
Soluia tampon, utilizat n electroforez, a fost Tris-acetatul (TAE 1x). Pentru obinerea
acestei soluii se prepar mai nti o soluie stoc cu concentraia de 50X, care are urmtoarea
compoziie: 242 g Tris HCl, 57, 1 ml acid acetic glacial i 100 ml EDTA 0,5M (pH 8.0). Soluia
de lucru TAE 1X se obine prin msurarea a 20 ml soluie stoc de 50X la care se adaug 980 ml
ap distilat astfel nct soluia de lucru (1X) s aib concentraia de 0,004M Tris acetat i
0,001M EDTA.
Produii de amplificare au fost migrai n cuv de electroforez orizontal, ntr-un cmp
electric ce se formeaz ntre doi electrozi, particulele ncarcate electric deplasndu-se spre
electrodul de sarcin opus. Se tie deja c particulele de mrimi mai mici se deplasez mai
repede dect cele de mrimi mari.
4.4.4.2 Pregtirea produilor de amplificare n vederea migrrii n gel de agaroz
Din produsul de amplificare, n alveolele gelului a fost ncrcat un amestec de 10 l
produs PCR, la care s-au adugat 2 l de colorant (loading dye). n primul godeu (alveol) au
fost ncrcai 4 l de marker ADN standard (100pb DNA Step Ladder, Promega).
Pentru ca migrarea s fie corect a fost necesar ca tensiunea i intensitatea curentului
electric s fie constante pe ntreaga durat a migrrii. Sursa de putere a fost programat la
tensiunea de 80V, respectiv 59 mA, iar durata de migrare a fost de 1 or i 30 de minute.
4.4.4.3 Colorarea gelurilor de agaroz i preluarea imaginilor
Pentru a nu contamina cuva de electroforez cu bromur de etidiu, gelurile au fost
colorate dup migrare. Dup ncheierea migrrii, acestea au fost puse la colorat n aproximativ
16

150 ml de ap distilat, timp de circa 15 minute pe o platform agitatoare. n cei 150 ml de ap
distilat, s-a adugat 10 l de soluie de bromur de etidiu, cu concentraia final de 0,5 g/ml.
Aceasta are rolul de a se intercala ntre bazele azotate putnd fi vizualizat n lumina UV.
Deoarece bromura de etidiu i pierde repede fluorescena n lumina UV, gelurile trebuie
examinate imediat dup colorare. Vizualizarea produilor de amplificare s-a realizat n lumina
UV, iar imaginea gelurilor a fost achiziionat cu o camera video Alpha Innotech a aparatului
BioSpectrum AC Imaging Sistem. Preluarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului
VisionWorksLS.
4.4.5 Diferenierea tulpinilor virale pe baza profilului PCR-RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism) sau Polimorfismele Lungimii
Fragmentelor de Restricie, este o metod molecular care detecteaz polimorfismele aprute
datorit mutaiilor punctiforme, inseriilor i deleiilor, toate acestea determinnd modificarea
situsurilor de restricie ale endonucleazelor.
Metoda se bazeaz pe digestia enzimatic a fragmentelor de ADN (produs PCR n cazul
de fa), cu ajutorul enzimelor de restricie, separarea electroforetic a fragmentelor de restricie
i detectarea polimorfismului dintre lungimile fragmentelor astfel obinute. Enzimele de restricie
sunt endonucleaze specifice care recunosc situsuri formate din 4, 6, 8 pb i taie n acel loc dup o
anumit simetrie.
Cu ajutorul tehnicii RFLP au fost difereniate tulpinile virale de Plum pox, folosind
enzimele de restricie Rsa I i Alu I (Wetzel i colab., 1991a). Enzima de restricie Rsa I are rolul
de a diferenia diferite tulpini de Plum pox Virus, de a tia situsul specific recunoscut, iar
enzima de restricie Alu I, are rolul de a determina eventualele mutaii ale acestora.
Metodologia de lucru a presupus parcurgerea urmtoarelor etape de lucru:
1. obinerea prdusului PCR prin reverstranscriere cu ajutorul amorselor P1 i P2
2. digestia enzimatic a produsului PCR obinut folosind enzimele de restricie Rsa I i
Alu I
3. separarea fragmentelor de digestie n gelul de polacrilamid
4. vizualizarea fragmentelor obinute n lumin UV prin colorarea gelurilor cu bromur
de etidiu
4.4.5.1 Prepararea amestecului de reacie pentru digestia enzimatic
Amestecul de reacie a fost centrifugat pentru cteva secunde, cu scopul de a trece toi
produii reaciei spre vrful tubului i imediat probele s-au aezat n incubator, la temperatura de
37C timp de 2 ore. De menionat c att enzima Rsa I ct i Alu I, sunt ultimele care s-au
adugat n amestec, imediat nainte de incubarea probelor.
4.4.5.2 Pregtirea gelului de poliacrilamid i separarea fragmentelor de digestie
Gelul de poliacrilamid se obine prin copolimerizarea acrilamidei i bisacrilamidei.
Polimerizarea este iniiat de persulfatul de amoniu, iar procesul este accelerat de
tetrametilenamida (TEMED).
Metoda de lucru :
Plcile de sticl ntre care s-a preparat gelul, au fost foarte bine splate cu alcool etilic
70% i apoi cu ap distilat, pentru ndeprtarea urmelor de la gelurile anterioare sau a altor
impuriti. ntre ele, lateral, au fost dispuse dou distaniere (0,25 mm) i au fost fixate ntr-un
suport special (cu ajutorul cruia se fixeaz n interiorul aparatului dup realizarea gelului).
17

Pentru prepararea a 10 ml de gel de poliacrilamid s-au adugat urmtorii compui: Ap
bidistilat steril- 7,726 ml; Tris-acetatul (TAE 50x) -200 l; Acrylamida/bis-Acrylamida2 ml; Persulfat de amoniu (PSA)- 70 l; TEMED -4 l.
Componentele enumerate au fost introduse, n ordinea indicat, ntr-un pahar Berzelius de
50 ml. Cu ajutorul unui magnet i pe plita electric, se amestec coninutul paharului, iar cu
ajutorul unei seringi, se introduce amestecul ntre plcile de sticl n aa fel nct s se obin o
linie continu de curgere a lichidului ntre acestea.
Dup umplerea spaiului dintre plcile de sticl cu amestec, acestea sunt dispuse
orizontal, i se introduce ntre plci, n partea superioar, un dispozitiv (pieptene) cu dini,
pentru a forma alveolele (godeurile). Se las minimum o or pentru ntrirea gelului.
Dup expirarea timpului i ntrirea gelului, peste plcile cu gel i n cuva electroforezei
verticale s-a adugat soluie de TAE 1x.
La probele digerate (10 l), nainte de a le ncrca n gel, s-a adugat 2 l Loading Dye
care are rolul de a transporta moleculele de ADN n godeuri. Cei 12 l de produs, au fost
ncrcai n fiecare alveol (godeu), ncepnd cu alveola numarul doi, deoarece n prima
alveol s-a ncrcat 4 l Leadder-ul: pUC18 DNA MspI Digest (Sigma).
Sursa de putere pentru migrarea gelurilor de poliacrilamid a fost programat la o
tensiune de 60 V, durata de migrare fiind de 1or i 30 de minute.
4.4.5.3 Colorarea gelurilor de poliacrilamid
Dup ce fragmentele de ADN digerate au fost separate, gelul de poliacrilamid a fost
trecut de pe suportul acestuia (imersat) n circa 100 ml ap distilat, la care s-a adugat 5 l de
soluie de bromur de etidiu.
Pentru colorare, gelul a fost meninut n aceast soluie pe o platform agitatoare, timp de
5 de minute, iar pentru decolorarea (cltirea) lui s-a trecut ntr-un recipient cu ap bidistilat timp
de 5 minute.
Vizualizarea fragmentelor, obinute prin digestia produsului PCR, s-a realizat n lumin
UV, imaginea gelurilor fiind achiziionat cu o camer video Alpha Innotech. Preluarea
imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului VisionWorksLS.
4.4.6 Principiul tehnicii DASI-ELISA pentru detectarea prezenei virusului n probe, ct
i pentru diferenierea tulpinilor virale
Principiul testului ELISA presupune ca din reacia dintre antigen-anticorp conjugatenzima specific hidrolizeaz substratul, astfel culoarea acestuia se schimb. Aceast reacie de
culoare indicnd prezena virusului n probe. Intensitatea culorii se poate determina fotometric,
iar concentraia viral este msurat prin citirea densitii optice (OD).
Parcurgerea etapelor de lucru, prepararea diluiilor tampoanelor anticorpilor, substratului,
controalele pozitive i negative, precum i pstrarea lor s-a fcut n conformitate cu instruciunile
firmei furnizoare.
nainte de nceperea efecturii testelor s-a realizat o schem care s indice poziia fiecrei
probe i a martorilor n plci. De asemenea s-a calculat volumul diluiilor reactivilor n funcie de
numrul de probe ce urmeaz s fie testate.
Metoda de lucru:
Cptuirea godeurilor cu IgGPPV
S-au pregtit plcile, n care s-au ncrcat cte 200 l din diluia de 1: 100 de IgG PPV i
tampon de cptuire.
Plcile s-au pus la incubat n etuv la temperatura de 370C timp de 4 ore, pentru ca
godeurile s fie cptuite cu IgG (gama imunoglobulin).
18

-Splarea plcilor: Plcile au fost splate de trei ori cu o soluie de PBS + Twen
(tampon fosfat de potasiu) pentru ndeprtarea excesului de reziduri i antigene. Operaiunea s-a
efectuat automat, cu aparatul Tecan, care cu ajutorul unui soft efectueaz trei operaiuni :
-ncrcarea godeurilor cu soluia de splare
- agitarea plcilor
- aspiraia lichidului
Adugarea n godeuri a extractelor vegetale
n fiecare godeu s-a ncrcat 200 l de extract vegetal obinut prin mojararea cu un
omogenizator manual a aproximativ 250 mg de frunze de prun cu simptome de PPV n 5 ml
tampon de extracie (10x) pentru fiecare prob n parte (extracia s-a fcut n pungi Universal
12x14 cm de la Bioreba, ce prezentau n interior o membran filtrant) . Pentru cele 90 de probe
am avut nevoie de 450 ml de E.B (10x).
Concentraia de lucru este de 1x i a fost calculat astfel: 45 ml E.B de 10x + 405 ml de
H2O bidistilat. Dup ncrcarea fiecarei probe n godeu, plcile s-au pus la 4oC timp de 16 ore.
n fiecare plac s-au pus cte dou controale pozitive i negative.
-Splarea plcilor: urmeaz trei splri cu PBS + Twen.
Adugarea anticorpilor monoclonali specifici
Se prepar o diluie de 1: 1000 din IgG PPV-D, IgG PPV-M (anticorpi monoclonali specifici
fiecrei tulpini virale) i PBS + 0.5% B.S.A (bovinum serum albuminum). n fiecare godeu se
ncarc 200 l i se incubeaz 2 ore la 37 oC.
-Splarea plcilor: plcile se spal de trei ori cu PBS + Twen.
Adugarea conjugatului imunoenzimatic
Se prepar o diluie de 1 : 1000 de IgG conjugat (ce conine enzima fosfataza alkalin) n
PBS. Se adaug cte 200 l n fiecare godeu i se ine 2 ore la 37 oC.
-Splarea plcilor: se spal de trei ori cu PBS + Twen.
Adugarea substratului
Se prepar o soluie de 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfatul n tampon de substrat 1X, reacia
producnd o schimbare a culorii ce poate fi apreciat vizual i cu un fotometru. Se ncarc cte
200 l i se in la temperatura camerei timp de 1h-1h30 de minute. Astfel c probele care se
coloreaz n galben nseamn c sunt pozitive, adic aparin fie lui PPV-D, PPV-M sau sunt
infecii mixte (D+M).
Citirea i interpretarea rezultatelor
Un izolat analizat este considerat pozitiv sau negativ n funcie de valoare extinciei
(Do=405nm) raportat la pragul de detecie. Pragul de detecie este ca valoare 2x media
aritmetic a citirilor celor dou repetiii a controlului negativ. Astfel c o prob este considerat
pozitiv dac valoare extinciei (media citirilor celor dou repetiii) este egal sau mai mare cu
pragul de detecie.
CAPITOLUL V
REZULTATE I DISCUII
5.1 Rezultate privind caracterizarea molecular prin RT-PCR a izolatelor recoltate
de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria
5.1.1 Diagnosticarea molecular
Diagnosticarea molecular s-a efectuat folosind amorsele specifice P1 i P2. Aceste
amorse confirm prezena virusului n frunzele cu simptome evidente de PPV. Perechea de
amorse P1 i P2 amplific un fragment de 243 pb, corespunztor regiunii C-terminus a proteinei
capsidale (CP).
19

Aceast pereche de amorse s-a dovedit a fi foarte eficient n diagnosticarea molecular
att la noi n ar (Zagrai i colab., 2006, 2008a), ct i n strintate (Wetzel i colab., 1991b;
Matic i colab., 2006; Kajic i colab., 2008).
1000pb
1000pb
1000pb
500pb
500pb
500pb
243 pb
Fig. 2 a, b,c Analizarea migrrii produilor PCR n gel de agaroz pentru identificarea
prezenei virusului PPV la probele (izolatele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9); L-Ladder,
C- control negativ, C+ control pozitiv
n cadrul acestor profile electroforetice L reprezint markerul care ne indic greutatea
molecular a produilor de amplificare. Controlul pozitiv este reprezentat de un izolat, a crei
infecie cu PPV a fost confirmat prin studii serologice i moleculare de ctre dr. ing., Zagrai
Ioan, cercettor la SCDP Bistria. Pentru controlul negativ am folosit un izolat sntos, adic
neinfectat cu virusul PPV.
n Fig. 2 a, b,c sunt prezentate spre exemlificare imaginile gelurilor obinute n urma
migrrii produilor PCR de la probele C16-C26, Uila 1-5; R1-5, B1-9. n imaginea gelurilor se
observ prezena benzii la dimensiunea de 243 pb, ceea ce indic infectarea acestor izolate cu
virusul Plum pox.
Existena benzii la toate cele 90 de izolate denot faptul c toate izolatele au fost infectate
cu virusul Plum pox, deci simptomele prezente pe frunzele recoltate au fost cele de PPV. Faptul
c virusul este prezent n toate izolatele, ne indic o infecie masiv cu PPV n livezile de unde
au fost recoltate probele.
5.1.2 Diferenierea molecular a tulpinilor PPV-D i PPV-M cu primeri specifici
Diferenierea celor dou tulpini virale PPV-D i respectiv PPV-M, s-a realizat cu ajutorul
tehnicii RT-PCR, folosind amorsa P1(sens) pentru ambele tulpini i cte o amors specific
pentru fiecare tulpin n parte, respectiv PD(PPV-D) i PM(PPV-M) ce amplific un fragment de
198 pb, corespunztor genei proteinei capsidale.
Fiecare prob a fost amplificat cu ambele seturi de amorse, att n scopul diferenierii
celor dou tulpini virale ct i pentru determinarea infeciilor mixte. Aceasta a reprezentat doar o
difereniere preliminar deoarece tuplpina PPV-M nu se difereniaz de tulpina PPV-Rec n
regiunea C-ter corespunztoare proteinei capsidale.
Caracteriz area molecular a
iz olatelor PPV re coltate de
la SCDP Cluj
13%
30%
3%
PPV-D
Caracte riz are a mole cular a

iz olate lor PPV din z ona
Re ghin
7%
67%
PPV-M
PPV-D+M
27%
80%
PPV-D
Caracte rizarea mole cular a

iz olatelor de la SCDP Bistria
prin tehnica RT-PC R
PPV-M
PPV-D+M
60%
PPV-D
13%
PPV-M
PPV-D+M
Fig.3a, b,c Diferenierea molecular a tulpinilor D i M prin RT-PCR la izolatele din cele trei
regiuni luate n studiu
20

n urma analizelor efectuate se poate observa c, din toate cele 30 de izolate recoltate de
la SCDP Cluj, un numr de 20 (67%) aparin tulpinii PPV-D, 9 (30%) izolate sunt infecii mixte,
aparinnd att tulpinii D ct i tulpinii M (D+M), iar un izolat aparine tulpinii PPV-M ( 3%)
conform figurii 3a.
n cazul diferenierii moleculare a izolatelor de la Reghin rezultatele obinute au fost
sintetizate i prezentate n tabelul 2. Astfel se poate observa c, din toate cele 30 de izolate, un
numr de 2 (7%) de izolate au fost identificate ca fiind infecii mixte (D+M) ,4 (13%) izolate
aparin tulpinii PPV-M, iar restul de 24 (80%) sunt D-uri (fig.3 b).
Rezultatele obinute cu probele recoltate de la SCDP Bistria au fost sintetizate i
prezentate n tabelul 3. n urma analizelor efectuate se poate observa c, din toate cele 30 de
izolate, un numr de 8 (27%) aparin tulpinii PPV-D, 18 (60%) izolate sunt infecii mixte,
aparinnd att tulpinii D ct i tulpinii M (D+M), iar 4 izolate aparin tulpinii PPV-M ( 13%)
conform figurii 3c.
5.1.3 Detecia tulpinii recombinate PPV-Rec
Prima apariie privind recombinarea ARN-ului n PPV a fost raportat n fosta Iugoslavie
(izolatul 06) de ctre Cervera i colab., (1993) i n Slovacia (izolatul BOR-3) de ctre Glasa i
colab., (2001).
Analizarea secvenelor din diferite pri ale genomului viral la un numr mare de izolate
a fcut lumin n ceea ce privete rolul recombinrii n evoluia PPV-ului, i au confirmat
prezena unui punct de recombinare ntre PPV-D i PPV-M n regiunea viral Nib. (Glasa i
colab., 2002)
Primul raport privind infecia natural a prunilor cu tulpina recombinat PPV-Rec n
Romnia a fost fcut n anul 2006. Toate izolatele identificate iniial ca fiind tulpina PPV-M sau dovedit aparinnd suei PPV-Rec, n urma analizelor moleculare. n urma secvenierii
produilor PCR (Polymerase Chain Reaction) corespunztori regiunilor (Cter)CP i (Cter) Nib
(Nter) CP s-a dovedit faptul c aliniamentele nucleotidice corespund cu cele din Gene Bank,
raportate de Glasa et al., n 2002 i 2004 (Zagrai i colab., 2006).
n cazul amorselor mD5 i mM3 se obine produs de amplificare numai n cazul n care,
tulpina viral este una recombinat, amplificnd un fragment de 605 pb. Astfel c n cazul n
care se obine un produs PCR din amplificarea cu P1/PM exist posibilitatea ca n urma
amplificrii cu amorsele mD5/mM3 s obinem un produs PCR care ne indic faptul c un izolat
identificat iniial ca fiind tulpina M este n realitate tulpina PPV-Rec.
1000pb
500pb
605 pb
100pb
Fig. 4 Produii de amplificare RT-PCR obinui cu amorsele specifice mD5 i mM3, la

probele Cluj 16- Cluj 26; L- Ladder; C+ control pozitiv; C- control negativ
Controlul pozitiv folosit este un izolat a crei apartenen la tulpina PPV-Rec a fost
stabilit n cercetrile anterioare efectuate de Zagrai i colab. (2006). Faptul c nu am obinut
band la C- demonstreaz lipsa contaminrii cu ARN strin .
21

n profilul electroforetic din figura 4 sunt prezentai produii PCR obinui n urma
analizelor efectuate cu amorsele mD5/mM3 la 11 probe de la SCDP Cluj, respectiv Cluj 16- Cluj
26. Dup cum se poate observa din imaginea gelului, probele Cluj 16- Cluj 20 nu prezint band
la dimensiunea de 605 pb, deci aceste izolate nu aparin tulpunii PPV-Rec. Probele Cluj 21-Cluj
26 prezint band la dimensiunea de 605 pb, deci aceste izolate aparin tulpinii PPV-Rec.
Analiznd toate cele 30 de izolate din regiunea Cluj, doar probele Cluj 21-Cluj 30 au
prezentat band la dimensiunea de 605 pb, restul neprezentnd band, prin urmare, aceste probe
au confirmat apartenena la tulpina PPV-Rec.
1000pb
500pb
605pbb
100pb
Fig. 5 Produii de amplificare cu mD5/mM3, la probele Reghin 6, 22, 23, 26, 29, 30; LLadder, C- control negativ, C+ control pozitiv
n figura 5 se exemplific detectarea tulpinii PPV-Rec prin prezena benzii la
dimensiunea de 605pb la probele Reghin 6, Regin 22-23, Reghin 26 i Reghin 29-30.
n urma analizelor efectuate pe cele 30 de probe de la Reghin, rezultate prezentate n
tabelul 2 sunt urmtoarele: probele R22-23, R26, R29 sunt PPV-Rec, iar R6, R30 sunt infecii
mixte ntre tulpinile PPV-D+PPV-Rec.
1500pb
1000pb
605 pb
500pb
Fig. 6 Analiza produilor PCR obinui prin amplificare cu mD5/mM3 pentru

identificarea tulpinii PPV-Rec la probele Bistria 10-22; L-Ladder, C- control negativ, C+
control pozitiv
n fig. 6 se pot observa probele Bistria 10-Bistria 22 ce au fost amplificate i migrate n
gel de agaroz. n cazul probelor B10, 11, 18, 21 nu s-a obinut produs PCR, nu este prezent
band, nu avem infecie cu PPV-Rec. Probele B12-17, 19, 20, 22 au prezentat band de 605 pb,
deci aparin tulpinii PPV-Rec. Rezultatele au fost sintetizate n tab. 3 de unde se poate
concluziona c din totalul de 30 de probe luate n studiu, 22 sunt recombinate. Probele care s-au
dovedit a fi D+M n regiunea CP i au prezentat band cu mD5/mM3 sunt considerate a fi
infecii mixte, adic PPV-D+PPV-Rec.
5.1.4 Analizarea regiunii genomice CI
Analizarea molecular a acestei regiuni genomice a PPV-ului s-a fcut pentru a confirma
prezena tulpinii PPV-Rec. Aceast regiune a fost analizat molecular i de ctre ali cercettori
22

n studiile lor privind caracterizarea virusului Plum pox (Glasa i colab., 2004; Matic i colab.,
2006; Zagrai i colab., 2006, 2008a).
Folosind amorsele specifice CIF/CID i CIF/CIM (Glasa i colab., 2002),
corespunztoare genei helicazei, s-a observat obinerea de produi PCR numai n cazul
amplificrii probelor cu setul de primeri CIF i CID (cu dimensiunea de 962pb). Acest lucru
confirm faptul c izolatele identificate iniial ca aparinnd suei PPV-M sunt n realitate PPVRec. Dac s-ar fi obinut band i cu amorsele CIF/CIM atunci am fi avut o infecie mixt cu
tulpinile PPV-Rec i PPV-M.
n urma amplificrilor realizate pe toate cele 90 de izolate, doar la probele Cluj 2, 3, 19,
21 nu s-a obinut band cu amorsele CIF/CID. Acest lucru este explicat prin posibila prezen a
unei mutaii la nivelul punctului de alipire a amorselor sau s existe o specificitate mai redus a
amorselor CIF/CID pentru aceste izolate.
5.2. Rezultate privind caracterizarea molecular prin PCR-RFLP a izolatelor
recoltate de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria
5.2.1. Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M prin digestia
enzimatic cu enzima Rsa I
Aceast tehnic molecular a permis diferenierea tulpinilor D i M n multe din studiile
epidemiologice ale PPV-ului iniiate pn la aceast dat pe plan mondial.
Prin digestia enzimatic a produilor PCR obtinui n urma amplificrii regiunii Cterminus a proteinei capsidale, cu ajutorul enzimei de restricie RsaI, cele dou tulpini virale de
PPV (PPV-D i PPV-M), se difereniaz prin prezena sau absena situsului de restricie. n
regiunea proteinei capsidale a tulpinei virale PPV-D se gsete un situs de restricie pentru
enzima RsaI, iar n cazul tulpinii PPV-M acest situs de restricie lipsete pentru aceast enzim.
Totui, odat cu identificarea suei PPV-Rec, aceast tehnic permite doar o difereniere
preliminar deoarece tulpinile M i Rec nu se difereniaz n regiune CP.
n cazul tulpinii PPV-D, enzima de restricie RsaI are situs de restricie, n urma digestiei
obinndu-se dou fragmente mai mici, cu dimensiunea de 182 pb i 61 pb. n cazul tulpinii
PPV-M enzima RsaI nu are situs de restricie, produsul PCR cu dimensiunea de 243pb rmne
nedigerat i apare n gel sub forma unei singure benzi.
Cteva exemple sunt prezentate n figura 7a la probele Cluj 21-25, respectiv Cluj 27-30
unde se observ prezena celor trei benzi la dimensiunile de 61pb, 182pb i 243. n concluzie
aceste probe sunt infectate cu ambele tuplini virale ale virusului PPV.
n cazul probei Cluj 26 produsul PCR cu dimensiunea de 243 pb a rmas nedigerat,
aprnd sub forma unei singure benzi, astfel c proba aparine tulpinii PPV-M.
n fig. 7b se poate observa c probele Reghin 7-10,21, 24, 25 n urma digestiei enzimatice
cu enzima Rsa I i a migrrii n gel de poliacrilamid, prezint dou benzi la dimensiunea de 61
pb respectiv 182 pb. Acest lucru demonstreaz faptul c aceste izolate aparin tulpinii PPV-D.
Proba Reghin 6 prezint n urma migrrii n gel trei benzi, o band de 243 pb nedigerat
i dou benzi de dimensiuni mai mici (61 pb i 182 pb). Aceasta demonstreaz c proba Reghin
6 este mixt, aparinnd tulpinilor PPV-D i PPV-M. Probele Reghin 22 i 23 aparin tulpinii
PPV-M deoarece prezint un singur fragment nedigerat cu dimensiunea de 243 pb.
Din analiza imaginii gelului prezentat n fig. 7c se observ c probele B8, B12-B16, B19
i B20 prezint trei fragmente n urma digestiei enzimatice i migrrii n gel de poliacrilamid
(61, 182, 243 pb), aparinnd tulpinilor PPV-D i PPV-M. Proba B17 prezint o band de 243
pb, deci aparine tulpinii PPV-M. Proba 18 prezint dou benzi, de 61 i 182 pb, n consecin
aparine tulpinii PPV-D.
23

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
7 8 9 10 21 22 23 24 25
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
353pb
243 pb
182 pb
67pb
61 pb
a
b
c
Fig. 7 a, b, c Analiza produilor de amplificare digerai cu enzima de restricie Rsa I la
probele C21-30, R 6-10; 21-25, B8, B12-20, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest
5.2.2. Identificarea eventualelor mutaii suferite de tulpinile virale la nivelul situsului de
restricie al regiunii genei care codific proteina capsidal
Este cunoscut faptul c, n regiunea care codific capsida viral exist un situs de
restricie pentru enzima de restricie AluI. Aceast enzim se poate utiliza n scopul evidenierii
unei eventuale mutaii suferite, de tulpinile virale n acest situs.
Dac virusul a suferit o mutaie, care poate afecta situsul de restricie, enzima nu-l
recunoate i astfel nu va tia catenele de ADN obinute prin RT-PCR. n cazul n care tulpinile
virale nu au suferit mutaii, enzima recunoate situsul de restricie i taie produsul PCR,
obinndu-se astfel dou fragmente de dimensiuni mici.
Analizele obinute n urma digestiei enzimatice, folosind enzima AluI, la toate cele 90 de probe
analizate, au demonstrat faptul c, tulpinile nu au suferit nici o mutaie n regiunea proteinei
capsidale.
5.3 Rezultate privind diagnosticarea i diferenierea serologic a izolatelor cu
proveniena de la SCDP Cluj, Reghin (Ferma Uila i Ferma 10) i SCDP Bistria
Diagnosticarea serologic s-a efectuat pentru a evidenia prezena virusului n probe.
Toate cele 90 de izolate au fost supuse analizei prin tehnica DASI-ELISA, cu anticorpul
policlonal universal 5B-IVIA. n urma analizelor efectuate a reieit faptul c toate izolatele au
fost infectate cu PPV.
Diferenierea serologic s-a efectuat prin aceeai metod serologic, folosind anticorpi
monoclonali specifici fiecrei tulpini. Tulpina PPV-D este recunoscut de ctre anticorpul
monoclonal 4DG5 (Cambra i colab., 1994), iar PPV-M de ctre AL (Boscia i colab., 1997).
n urma analizei serologice a celor 30 de izolate de la SCDP Cluj, un numr de 29 (97%)
au fost identificate ca aparinnd tulpinii PPV-D iar un izolat (3%) a fost identificat ca aparinnd
tulpinii PPV-M (fig. 8a).
n figura 8b sunt prezentate procentajele obinute n urma diferenierii serologice la
izolatele de la Reghin. Probele infectate cu tulpinile PPV-D+PPV-M reprezint un procent de
7%, cele infectate cu tulpina PPV-M 13%, cele care predomin fiind cele infectate cu tulpina
PPV-D (80%).n urma diferenierii serologice cu anticorpii monoclonali specifici 4DG5 (PPVD) i AL (PPV-M) rezultatele n cazul izolatelor de la Bistria arat c tulpina PPV-M este
dominant 70%, iar 30% din probe aparin tulpinii PPV-D (fig. 8c).
24
Dife re nie ra tulpinilor virale

ale iz olate lor de la SC DP
C luj
Dife re nie re a tulpinilor virale

ale iz olate lor Re ghin
7%
13%
3%
Dife re nie re a tulpinilor

virale ale iz olate lor de la
Bistria
30%
80%
70%
97%
PPV-D
PPV-M
PPV-D
PPV-M
PPV-D
PPV D+M
PPV-M
a
b
c
Fig. 8 a, b, c, Diferenierea serologic a izolatelor PPV recoltate din cele trei regiuni luate n
studiu
Tabel 1
Rezultatele analizelor moleculare i serologice la probele C1-30 bazate pe diferite regiuni ale
PPV-ului
Nr
Crt
Izolatul
RT-PCR
(P1/P2 i P1/PD sau PM)
PPV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Cluj 1
Cluj 2
Cluj 3
Cluj 4
Cluj 5
Cluj 6
Cluj 7
Cluj 8
Cluj 9
Cluj 10
Cluj 11
Cluj 12
Cluj 13
Cluj 14
Cluj 15
Cluj 16
Cluj 17
Cluj 18
Cluj 19
Cluj 20
Cluj 21
Cluj 22
Cluj 23
Cluj 24
Cluj 25
Cluj 26
Cluj 27
Cluj 28
Cluj 28
Cluj 30
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVD
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D+M
D+M
D+M
D+M
D+M
M
D+M
D+M
D+M
D+M
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
-
Prin analizarea rezultatelor prezentate n tabelul 1 se observ faptul c toate izolatele

testate s-au dovedit a fi infectate cu PPV. Acest fapt confirm specificitatea perechii de amorse
P1-P2 i arat o excelent polivalen a anticorpului universal 5B-IVIA. Acest fapt este susinut
i de ctre Zagrai i colab. (2008a) prin excelentele rezultate obinute n privina diagnosticrii
serologice cu acelai anticorp universal. Un eec al anticorpului universal 5B-IVIA a fost
25
PPV
D+M
-

raportat n urma unui studiu serologic i molecular efectuat n Croaia, prezena infeciei
neputnd fi confirmat n cazul izolatului Cocanska Rodna (Kajic i colab., 2008).
Aceste probleme au fost raportate de ctre Matic i colab. (2006). Din cele aisprezece
izolate analizate serologic, doar jumtate au putut fi difereniate (toate au fost difereniate
molecular). Un caz similar a fost raportat i de ctre cercettorul Candresse i colab. (1998).
Acesta din urm nu a putut diferenia serologic 33 de izolate din cele 85 analizate.
Izolatele C 21- C25, C 27- C30 s-au dovedit a fi infecii mixte (D+M) n urma analizrii
regiunii CP prin RT-PCR i RFLP. n regiunea (Cter)CP se realizeaz diferenierea ntre tulpinile
D i M. n urma analizelor serologice aceste izolate aparin doar tulpinii PPV-D. Tulpina PPV-M
nu a putut fi detectat n respectivele izolate datorit unei concentraii reduse a acestei tulpini.
Rezultatele analizelor noastre n ceea ce privete diferenierea tulpinilor D i M, prezint
o concordan a tehnicilor RT-PCR i RFLP.
Tabel 2
Rezultatele analizelor moleculare i serologice la probele de la Reghin bazate pe diferite regiuni
ale PPV-ului
Nr
Crt
Izolatul
RT-PCR
PPV
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Uila 1
Uila 2
Uila 3
Uila 4
Uila 5
Reghin 1
Reghin 2
Reghin 3
Reghin 4
Reghin 5
Reghin 6
Reghin 7
Reghin 8
Reghin 9
Reghin 10
Reghin 21
Reghin 22
Reghin 23
Reghin 24
Reghin 25
Reghin 26
Reghin 27
Reghin 28
Reghin 29
Reghin 30
Reghin 31
Reghin 32
Reghin 33
Reghin 34
Reghin 35
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
PPV
D+M
+
+
-
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D+M
D
D
D
D
D
M
M
D
D
M
D
D
M
D+M
D
D
D
D
D
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
-
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
PPV
D+M
+
+
-
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
M
+
+
+
+
+
+
-
Regiunea (Cter)CP a fost analizat cu setul de amorse P1-P2, astfel c rezultatele au fost
pozitive, prin urmare toate izolatele U1-R35 au prezentat infecie cu Plum pox.
Pentru a putea diferenia tulpinile PPV-D i PPV-M am analizat aceeai regiune CP, dar
cu amorse specifice celor dou tulpini: P1-PD i P1-PM. Rezulatele ne indic o dominare a
infeciei izolatelor cu tulpina PPV-D.
26
PPV
D+M
+
+
-

Cercetrile efectuate de Zagrai i colab. (2009) pe 100 de izolate, din care 17 au fost
recolate din zona Reghin, demonstreaz faptul c predomin tulpina PPV-D.
n ceea ce privete diferenierea pe tulpini a virusului se observ o predominare a tulpinii
PPV-D, confirmat prin cele trei tehnici, RT-PCR, PCR-RFLP i DASI-ELISA.
Izolatele detectate ca aparinnd tulpinii PPV-Rec prin analize moleculare sunt
difereniate ca PPV-M n urma analizelor serologice cu anticorpul monoclonal specific.
Tabel 3
Rezultatele analizelor moleculare i serologice la probele B1-B30 bazate pe diferite
regiuni ale PPV
Nr
Crt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Izolatul
Bistria 1
Bistria 2
Bistria 3
Bistria 4
Bistria 5
Bistria 6
Bistria 7
Bistria 8
Bistria 9
Bistria 10
Bistria 11
Bistria 12
Bistria 13
Bistria 14
Bistria 15
Bistria 16
Bistria 17
Bistria 18
Bistria 19
Bistria 20
Bistria 21
Bistria 22
Bistria 23
Bistria 24
Bistria 25
Bistria 26
Bistria 27
Bistria 28
Bistria 29
Bistria 30
RT-PCR
PP
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVD
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Regiunea vizat
PCR-RFLP
DASI-ELISA
Rsa I
CP
Nib
CI
D+M
M
D+M
M
D+M
D+M
D
D+M
D
D
D
D+M
D+M
D+M
D+M
D+M
M
D
D+M
D+M
D
D+M
D+M
D+M
D
D
M
D+M
D+M
D+M
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
Rec
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D+M
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Alu I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PPV
D
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
PPVM
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Diferenierea molecular a tulpinilor virale PPV-D i PPV-M s-a realizat prin analizarea
regiunii (Cter)CP cu dou perechi de amorse. Cu setul de amorse P1-PD s-au efectuat amplificri
pentru a putea fi evideniate izolatele infectate cu tulpina D a virusului Plum pox. Aceleai
amplificri s-au efectuat i cu setul de amorse P1-PM pentru evidenierea izolatelor ce aparin
tulpinii PPV-M. Rezultatele obinute demostreaz o concordan ntre tehnicile RT-PCR i
RFLP, infeciile mixte(D+Rec) fiind cele care predomin.
Izolatele B1, B3, B5-6, B8, B12-16, B20, B22-24, B28-30 s-au dovedit a fi infecii mixte
(D+M) n urma analizrii regiunii CP prin RT-PCR i RFLP. n regiunea (Cter)CP se realizeaz
diferenierea ntre tulpinile D i M. n urma analizelor serologice aceste izolate aparin doar
tulpinii PPV-M. Tulpina PPV-D nu a putut fi detectat n respectivele izolate datorit unei
27
PPV
D+M
-

concentraii reduse a acestei tulpini. Izolatul B19 a fost diagnosticat ca fiind mixt (D+M) prin
analize moleculare, iar prin cele serologice s-a dovedit a fi D. Tulpina M un a putut fi detectat
serologic n acest izolat din aceleai motive de concentraie redus.
Acest fapt a fost raportat i de ctre Zagrai i colab. (2008), unde izolatele Dumitra 10,
Mihaieti 3 s-au dovedit a fi infectate cu tulpinile D+M prin difereniere molecular i s fie
diagnosticate ca fiind M-uri prin analizele serologice.
CAPITOLUL VI
CONCLUZII I RECOMANDRI
Cercetrile noastre au permis obinerea unor date privind variabilitatea serologic i
molecular a izolatelor virusului Plum pox n cele trei regiuni luate n studiu, respectiv Cluj,
Reghin i Bistria.
Cunoaterea variabilitii acestui virus este o condiie esenial n elaborarea strategiilor
de eradicare sau limitare a impactului acestuia, avnd n vedere pagubele uriae produse n
culturile de prun din ara noastr.
Studiul variabilitii serologice i moleculare a virusului Plum pox s-a efectuat pe un
numr de 90 de izolate PPV recoltate din 3 livezi comerciale cu infecie mare cu PPV, din
Bazinul Central Pomicol al Transilvaniei.
Infeciile au fost confirmate n totalitate prin diagnostic serologic (5B-IVIA) i
molecular (P1/P2).
Tehnica serologic DASI-ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect - Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) a permis diferenierea tulpinilor D i M pe baza antiserurilor
monoclonale specifice.
Succesul ei n cazul probelor analizate s-a bazat pe urmtoarele atuuri: acuratee,
specificitate, robustee, simplicitate i cost redus.
Tehnica molecular RT-PCR a permis analizarea a trei regiuni genomice ale PPV-ului, i
anume:(i) (Cter)CP, folosind perechile de amorse P1/PD i P1/PM care disting tulpinile PPV-D
i PPV-M; (ii) (Cter)Nib - (Nter)CP folosind perechea de amorse mD5/mM3 care detecteaz
direct o tulpin recombinat dintre D i M, denumit PPV-Rec; CI, folosind seturile de primeri
CIf/CID sau CIf/CIM pentru a confirma prezena tulpinii PPV-Rec.
Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M n regiunea (Cter)CP s-au dovedit a fi PPVRec n regiunea (Cter) Nib (Nter)CP.
Prin tehnicile RFLP i DASI-ELISA nu s-a putut face o difereniere ntre tulpinile virale
PPV-M i PPV-Rec.
Toate cele trei tehnici utilizate n prezentul studiu au condus la observarea unei
variabiliti ntre tulpinile virale din cadrul populaiei locale a virusului Plum pox.
Rezultatele noastre prezint o rat a infeciei cu PPV foarte ridicat i o situaie critic n
care se gsesc livezile de prun din punctul de vedere al infeciilor cu virusul Plum pox, n
regiunile studiate.
Diferenierea i distribuia izolatelor arat c n regiunile Cluj i Reghin predomin
tulpina PPV-D, cu cel mai mare procentaj la Reghin (80%), iar la Bistria predomin infeciile
mixte (60%). Tulpina PPV-Rec este predominant n regiunile Reghin i Bistria cu acelai
procentaj de 13%.
28
RECOMANDRI
Cunoaterea distribuiei tulpinilor virale pe regiuni pomicole va fi foarte util viitoarelor
programe de ameliorare a rezistenei genetice la PPV, deoarece reacia genotipurilor la infeciile
virale este diferit de la o tulpin viral la alta.
Rezultatele obinute pot avea un rol tehnic i economic n viitoarele strategii de
combatere a acestui virus, n cultura prunului din Romnia.
Din punct de vedere tehnic, metodele de detecie i difereniere a izolatelor pot fi
utilizate: n laboratoarele de carantin fitosanitar, garantnd circulaia materialului sditor liber
de boli virotice; n pepiniere, astfel asigurndu-se producerea materialului sditor pomicol liber
de viroze.
Din punct de vedere economic, cunoaterea distribuiei tulpinilor PPV va permite
elaborarea de strategii de eradicare sau limitare a virusului PPV, care vor conduce la revigorarea
culturii prunului i la creterea competitivitii pe plan extern.
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. ATANASOFF, D., 1932, Plum pox. A new virus disease. Yearbook University of
Sofia, Faculty of Agriculture, 11, 49-69.
2. BOSCIA, D., H. ZERAMDINI, M. CAMBRA, O. POTERE, M.T. GORRIS, A.
MYRTA, 1997, Production and characterization of a monoclonal antibody specific to the M
serotype of plum pox potyvirus. European Journal of Plant Pathology 103, 447-480.
3. CAMBRA, M., M. ASENSIO, M.T. GORRIS, E. PEREZ, E. CAMARASA, J.A.
GARCIA, J.J. MOYA, D. LOPEZ-ABELLA, C. VELA, A. SANZ, 1994, Detection of plum
pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. Bulletin
OEPP/EPPO Bulletin 24, 569-577.
4. CAMBRA, M., M.T. GORRIS, N. CAPOTE, M. ASENSIO, M.C. MARTNEZ, E.
BERTOLINI, C. COLLADO, A. HERMOSO DE MENDOZA, E. MATAIX, A. LPEZ, 2004,
Epidemiology of Plum pox virus in Japanese plums in Spain. Acta Horticulturae, no. 657, 195
200.
5. CERVERA, M.T., J.L. RIECHMANN, M.T. MARTIN, J.A. GARCIA, 1993, 3Terminal sequence of the Plum pox virus PS and o6 isolates: evidence for RNA recombination
within the potyvirus group. Journal of General Virology 74, 329-340.
6. CHRISTOFF, A., 1934, Mosaikkrankheit oder Viruschlorose, bei Apfeln. Eine neue
Viruskrankheit. Phytopath. Z. 7, 521-536.
7. CREE, L.A., 1999, Le potyvirus de la Sharka du prunier. Agence canadienne
dinspection des aliments, 183-190.
8. CRESCENZI, A., L. DAQUINO, S. COMES, M. NUZZACI, P. PIAZZOLLA, A.
HADIDI, 1996, Further caracterisation of sweet cherry isolate of plum pox potyvirus. Proc.
Middle Eur. Meet 96 Plum pox, Budapesta, 99-103.
9. CRESCENZI, A., M. NUZZACI, L. LEVY, P. PIAZZOLLA, A. HADIDI, 1997,
Infezioni di sharka su ciliegio dolce in Italia meridionale. Informatore Agrario, 34, 73-75.
10. DAMSTEEGT, V.D., H.E. WATERWORTH, G.I. MINK, W.E. HOWELL, L.
LEVY, 1997, Prunus tomentosa as a diagnostic host for the detection of plum pox virus and
other Prunus viruses. Plant Disease, 81, 329-332.
11. DOSBA, F., P. MAISON, M. LANSAC, G. MASSONIE, 1987, Experimental
transmission of plum pox virus (PPV) to Prunus mahaleb and Prunus avium. Journal of
Phytopathology 120, 199204.
29

12. FESTIC, H, 1978, Investigation of new sharka virus hosts. Acta Horticulturae No. 74,
233-240.
13. GLASA, M., V. MARIE-JEANNE, G. LABONNE, Z. SUBR, O. KUDELA, J.B.
QUIOT, 2002, A natural population of recombinant plum pox virus is viable and competitive
under field conditions. European Journal of Plant Pathology 108, 843-853.
14. GLASA, M., L. PALKOVICS, P. KOMINEK, G. LABONE, S. PITTERNOVA, O.
KUDELA, T. CANDRESSE, S. SUBR, 2004, Geographically and temporally distant natural
recombinant isolates of Plum pox virus (PPV) are genetically very similar and form a unique
PPV subgroup. Journal of General Virology, 85, 2671 2681.
15. JAMES, D., A. VARGA, D. THOMSON, S. HAYES, 2003, Detection of a New and
Anusual Isolate of Plum pox virus in Plum (Prunus domestica). Plant Disease, 1119 1124.
16. JAMES, D., A. VARGA, 2004, Preliminary Molecular Characterization of Plum pox
potyvirus isolate W3174: Evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657, 177-182.
17. KAJIC, V., S. CERNI, M. KRAJACIC, I. MIKEC, D. SKORIC, 2008, Molecular
typing of Plum pox virus isolates in Croatia. Journal of Plant Pathology 90 (1), 9-13.
18. KALASHYAN J.A., N.D. BILKEY, T.D. VERDEREVSKAYA, E.V. RUBINA,
1993, Detection of plum pox virus in sour cherry from Moldova. Conference sur la Sharka,
Bordeaux, 39.
19. KALASHYAN, J.A., N.D. BILKEJ, T.D. VERDEREVSKAYA, E.V. RUBINA,
1994, Plum pox virus on sour cherry in Moldova. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 645649.
20. KEGLER, H., W. HARTMAN, 1998, Present status of controlling conventional
strains of plum pox virus. Plant Virus Disease Control, 616-628.
21. KERLAN C., J. DUNEZ, 1976, Some properties of plum pox virus and its nucleic
acid protein components. Acta Horticulturae 67, 185-192.
22. KERLAN, C., J. DUNEZ, 1979, Diferenciation biologique et serologique des souches
du virus de la Sharka. Annales de Phytopat., 11, 241-250.
23. LEVY, L., V. DAMSTEEGT, R. WELLIVER, 2000. First report of plum pox virus
(Sharka Disease) in Prunus persica in the United States. Plant Diseases, 84, 202.
24. LLCER, G., M., CAMBRA, A. LAVIA, 1985, Detection of plum pox virus in
Spain. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 15, 325329.
25. LLCER, G., M., CAMBRA, 1986, Occurrence of plum pox virus in Spain in a new
natural host: Prunus salicina Lindl (Japanese plum). Plant Disease 70 (2), 17.
26. LOURNO, D, L. MONTE CORVO, 1986, Occurrence of sharka in Portugal. Acta
Horticulturae No 193, 183-187
27. MATIC, S., M. AL-RWAHNIH, A. MYRTHA, 2006, Diversity of Plum pox virus in
Bosnia and Herzegovina. Journal of Plant Pathology 55, 11-17.
28. MINOIU, N., 1997, Bolile si daunatorii prunului. Prunul. Ed. Conphys, 343-374.
29. MYRTA, A., O. POTERE, D. BOSCIA, T. CANDRESSE, M. CAMBRA, V.
SAVINO, 1998, Production of a monoclonal antibody specific for El Amar strain of plum pox
virus. Acta Virologica 42, 248-250.
30. NEMCHINOV, L., A. CRESCENZI, A. HADIDI, P. PIAZZOLLA, T.
VERDEREVSKAYA, 1998, Present status of the new cherry subgroup of plum pox virus (PPVC). In: Hadidi, A., Khetarpal, R.K., and H. Koganezawa. Plant Virus Disease Control. APS
Press, St. Paul, 629-638.
31. NEMETH, M., 1986, Virus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Akad.
Kiado, Budapest, 25-152.
32. NEMETH. M., 1994, History and importance of plum pox in stone-fruit production.
Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 525-536.
30

33. OLMOS, A., M. CAMBRA, M. A. DASI, T. CANDRESSE, O. ESTEBAN, M.T.
GORRIS, M. ASENSIO, 1997, Simultaneos detection and typing of plum pox potyvirus (PPV)
isolates by heminested-PCR and PCR-RFLP. Journal of Virological Methods 68, 127-137.
34. POLAK, J., I. OUKROPEC, P. KOMINEK, B. KRSKA, M. BITTOOVA, 1997,
Detection and evaluation of apricot and peaches to plum pox virus- progress in the Czech
Republic. Proc. Middle Eur. Meet `96 Plum Pox, Budapesta, 1996, 68.
35. RANKOVIC, M, I. DULIC-MARKOVIC, 1992, Evaluation of Prunus spinosa L as
host of sharka and other viruses. Acta Horticulturae No 309, 151-156
36. ROY, A.S., I.M. SMITH, 1994 Plum pox situation in Europe. Bull. 24, 515- 523.
37. SERCE, C.U., T. CANDRESSE, L. SVANELLA-DUMAS, L. KRIZBAI, M.
GAZEL, K. CAGLAYAN, 2009, Further characterization of a new recombinant group of Plum
pox virus isolates, PPV-T, found in orchards in the Ankara province of Turkey. Virus Res, 142,
121-126.
38. SUBR, Z., S. PITTNEROVA, M. GLASA, 2004, Asimplified RT-PCR- based
detrection of recombinant plum pox virus isolates. Acta Virologica 48, 173-176.
39. THAKUR, P.O., S.W. BHARAWAJ, I.D. GARG, K. KHOSLA, D.R. SHARMA,
1994, Plum pox virus on stone fruits from India. A new record. Plant. Dis. 9, 100-102.
40. WETZEL T., T. CANDRESSE, M. RAVELONANDRO, R.P. DELBOS, H.
HAZIAD, A.E. ABOUL-ATA, J. DUNEZ, 1991a, Nucleotide sequence of the 3- terminal
region of the RNA of the El Amar strain of plum pox potyvirus. Journal of General Virology 72,
1741-1746.
41. WETZEL, T., T. CANDRESSE, M. RAVELONANDRO, J. DUNEZ, 1991b, A
polymerase chain reaction as say adapted to plum pox virus detection. Journal of Virological
Methods 33, 355-365.
42. WOROBEY, M., E.C. HOLMES, 1999, Evolutionary aspects of recombination in
RNA viruses. Journ. Gen. Virol. 80, 2535 2543.
43. ZAGRAI, I., A. MAXIM, ZAGRAI LUMINIA, GABOREANU IOANA, A.
RAICA, 2005, Serological and Molecular Detection and Differentiation of Plum pox virus
isolates in Bistria Area, Lucrrile tiinifice ale USAMV Iasi, Seria Horticultur, Anul XLVIII,
vol. 48, ISSN 1454-7376, 1297-1302.
44. ZAGRAI, I., IOANA GABOREANU, BEATRICE FERENCZ, LUMINIA
ZAGRAI, D. PAMFIL, O. POPECU, M. RAVELONANDRO, N. CAPOTE, KATALIN
KOVACS, 2006, First detection and molecular caracterization of Plum Pox Virus recombinant
stain in Romania. Buletin USAMV-CN 62, 291-298.
45. ZAGRAI, I., N. CAPOTE, M. RAVELONANDRO, M. CAMBRA, ZAGRAI
LUMINIA, R. SCORZA, 2008, Plum pox virus Silencing Of C5 Transgenic Plums Is Stable
Under Challenge Inoculation With Eterologous Viruses. Journal of Plant Pathology ,90 (1), 6371.
46. ZAGRAI LUMINIA, I. ZAGRAI, BEATRICE FERENCZ, IOANA
GABOREANU, KATALIN KOVACS, IOANA PETRICELE, O. POPESCU, D. PAMFIL, N.
CAPOTE, 2008a, Serological and molecular typing of Plum pox virus isolates in the north of
Romania. Journal of Plant Pathology 90 (1), 41-46.
47. ZAGRAI, I., LUMINIA ZAGRAI, LIGIA ION, 2009, The response of different
Prunus genotypes to D and Ree Strains of Plum pox vurus. Bulletin USAMV, no. 66 (1-2)
48. *** http://ceex102ppv.webs.com/rezultate.htm
49. *** OEPP/ EPPO, 1983, Data sheets on quarantine organisms. Plum pox virus.
Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 13, 17.
31
UNIVERSITY OF AGRICULTURAL
SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE,
CLUJ-NAPOCA
FACULTY OF HORTICULTURE
Eng. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN
SEROLOGICAL AND MOLECULAR

VARIABILITY OF SOME PLUM POX VIRUS
ISOLATES FROM TRANSYLVANIAN FRUIT
CENTRAL AREA
(SUMMARY OF THE Ph.D. THESIS)
Scientific coordinator:
Prof. univ. dr. Doru Pamfil
CLUJ-NAPOCA
2010
SUMMARY
INTRODUCTION
Plum Pox virus (PPV) is the most destructive viral pathogen of stone species and is
responsible for a serious loss of production particularly for susceptible varieties. This virus is
very dangerous because it reduces the quality and causes the premature fall of fruits. Therefore,
PPV is considered one of the main factors that makes the plum crop to be considered no longer
profitable. The virus has gradually spread to most of Europe, around the Mediterranean basin
and Middle East. Also, the virus was found in India and America (Chile, USA, Canada). In
Romania, Plum pox virus is prevalent in virtually all areas of the plum crop, causing a significant
loss of production particularly for some susceptible varieties. (Minoiu, 1997).
The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) - 1975 proposed
two lists of quarantine viruses for fruit trees. The most important virus, which is the subject to
quarantine fruit trees is Plum Pox Virus. He is also considered a highly dangerous virus by the
Inter-African Plants, and by the North American Plant Protection and is the subject of some
regulations in Australia and USA (Cree, 1999).
So far, seven strains were identified and characterized: D strain (Dideron) isolated for
the first time from apricot in Southeastern of France, M strain (Marcus) identified for peach in
northern Greece (Kerlan and Dunez, 1979, Myrtle et al ., 1998), EA (El Amar) strain described
for apricot in Egypt (Wetzel et al., 1991), SOC (sour cerry) strain detected in Moldova
(Kalashyan et al., 1993), SwC (sweet cerry) stain identified in Italy (Crescenzi et al., 1996).
PPV-Rec (name proposed and accepted) resulted from the recombination of the two major
strains(D and M), the highlight being reported recently in Albania, Bulgaria, Czech Republic,
Germany, Hungary and Slovakia (Glasa et al., 2004) and Romania (Zagrai et. al., 2006, 2008,
2009). The last PPV strain described is Winona (PPV-W) from Canada (James and
Varga,2004), which is genetically distinct from all other viral strains known to date (James and
Varga, 2005).
First report on natural infection of plum recombined strain PPV-Rec in Romania was
presented in 2006. All isolates initially identified as PPV-M strains were found belonging to
PPV-Rec strain following molecular analysis. Also, following sequencing of the PCR
(Polymerase Chain Reaction) corresponding regions (Cter) CP and (Cter) NIB - (Nter) CP
proved that nucleotide alignments correspond to those of Gene Bank, reported by Glas et al., in
2002 and 2004 (Zagrai et al., 2006). Genetic similarity with other PPV-Rec strains suggests a
common evolutionary origin. (Zagros et al., 2006, 2008).
Recent studies performed on 16 isolates from Turkey led to the identification of new viral
strains. Their sequencing has led to an observation point in region recombinant virus HC-Pro, at
position 1566 of the viral genome. The Turkish researchers proposed that this new recombined
strain to be appointed as PPV-T (Turkey) (Serce et al., 2009).
Thanks to modern methods of characterization of PPV viral isolates, it is known that two
strains are most common, (PPV-D) and (PPV-M) (Bousolem et al., 1994). PPV-D, widely spread
in Western Europe, is non-seed transmitted, difficult to be transmitted to experimental hosts and
the vector spread was effectively reduced (Levy et al., 2000). Unlike PPV-D, PPV-M spread
through the seed of necrotic strains (PPV_M) was reported by Nemeth and Koelber in 1983.
Also, it can be easily transmitted through afids. (Levy et al., 2000).
Although PPV is widespread in all plum growing areas from Romania, limited
information about the occurrence of PPV strains are available. A recent study performed in
Transylvania revealed that PPV-D is the prevalent strain followed by PPV-Rec and the mixed
infections (PPV-D + PPV-Rec) (Zagrai et. al., 2008, 2009).
33
RESEARCH OBJECTIVES
The differentiation of symptoms for the two strains (D and M) is quite difficult. The
manifested symptoms for both strains include clorotice spots on leaves and mosaics, ring spots
on fruit surface, which subsequently turn into necrosis. The symptoms caused by PPV-D strain
are generally less severe compared with those associated with PPV-M strain. (Damsteeg et al.,
1997).
The serological and molecular characterization for the collected PPV isolates pursued the
following objectives:
Identification of the infection source and harvesting of PPV isolates from plum which
have the typical symptoms of the virus
Extraction of RNA from symptomatic plum leaves
Performing the molecular diagnostics for establishing the presence of the virus by using
polyvalent primers
Differentiation of viral strains by using specific primers
Differentiation of viral strains by using PCR-RFLP analysis
Performing the serological diagnosis to establish the presence of the virus by using
Dasi-ELISA
Differentiation of viral strains PPV-D and PPV-M by using Dasi-ELISA
MATERIALS AND METHODS
Biological material
Ninety PPV isolates were collected from three fruit-growing centers from Transylvania,
namely: Fruit Research and Development Station Cluj (SCDP Cluj 30-isolates), Fruit Research
and Development Station Bistrita (Bistrita-30 isolated SCDP) and the Reghin area (Farm Uila
and Farm 10-30 isolated). Identification of infections and selection of infected trees has been
done based on of PPV typical symptoms. Then the leaf samples with obvious symptoms were
taken from different parts of the crowns of trees with generalized infection (PPV infection rate
from 20%) and analyzed by using molecular and serological tests.
ARN extraction
For the ARN extraction it was used the usual procedure, deshydration and tissue crushing
them under liquid nitrogen, to a fine powder and tissue resuspendation in a reaction buffer that
protects the RNA which is released from cells.
Extraction of total RNA from leaf plum tree was done using the kit extraction Rneasy Plant Mini
Kit (Qiagen). The protocol used for this procedure was the one recommended by the
manufacturer and the provided for the crossing of ten steps.
Serological and molecular detection
The serological diagnosis has been made by using DASI-ELISA technique and the 5BIVIA polyclonal antibody .
For viral diagnosis primers pair P1/P2 was used, which was designed to amplify a
fragment of 243 bp region corresponding to C-terminus of the protein capsid. With Qiagen OneStep RT-PCR kit we could perform both, reverse transcription (RT) and amplification (PCR) in a
single reaction. Thermal cycles required for RNA reverstranscription and amplification of DNA
fragments were performed in the Corbett Research thermocycler, optimized as follows: RT- 40
min at 500C, activating polymerases- 15 min at 950C followed by 35 cycles: denaturation- 1 min
at 940 C, primer annealing 45 s at 610 C and DNA elongation 1 min at 720 C. Amplified DNA
was elongated for 10 min at 720 C. Amplified products (10 l + 2 l loading dye) were
34

fractionated onto 1.4% agarose gel electrophoresis in 1 x TAE buffer. Bands were visualized by
ethidium-bromide staining under UV light.
Serological and molecular differentiation
Serological differentiation was performed by the same serological method using speciffic
monoclonal antibodies for each strain. PPV-D strain was recognized by using the monoclonal
antibody 4DG5 (Cambra et al., 1994) and PPV-M by using AL (BOSCOS et al., 1997).
Molecular strain differentiation was done by RT-PCR targeting three genomic regions :
(Cter) CP- using the primers pair P1/PD and P1/PM which was useful to distinguish PPV-D and
PPV-M strain; (Cter) Nib/(Nter) CP by using the primers pair mD5/mM3 that detected a natural
recombination between D and M (PPV-Rec)(Glasa et al., 2004); CI, using CIF/CID and
CIF/CIM primers pair to confirm the presence of PPV-Rec. Reverse-transcription and
amplification was performed with Qiagen One-Step RT-PCR kit. The amplification conditions
were the same as those described above, except the temperature for the primers attachment,
which was 60oC for CIF-CID/CIM primers and 470C for md5-mM3 primers.
PCR products corresponding to (Cter) CP were analyzed with RFLP in order to
distinguish the D and M strains based on Rsa I polymorphism located in this genomic section.
Digested products were fractionated onto 8% polyacrylamide gel electrophoresis in 1 x TAE
buffer and photographed under UV light.
RESULTS AND DISCUSSION
Similar results were obtained for the differentiation of PPV isolates by RT-PCR using PD
and PM specific primers, and by RFLP using Rsa I restriction enzyme which is laso useful to
distinguish PPV-D and PPV-M strains for Plum pox virus.
From 30 isolates collected from SCDP Cluj, a total of 20 (67%) belong to PPV-D strain,
9 (30%) isolates are mixed infections belonging to D and M strain (D + M) and one isolate
belongs to PPV-M strain (3%).
Concerning the molecular differentiation of isolates from Reghin, 2 (7%) isolates were
identified as mixed infection (D + M), 4 (13%) isolates belonging to PPV-M strain and the rest
of 24 (80%) are related to PPV-D strain.
The results obtained using samples from SCDP Bistrita are the following: from 30
isolates, a total of eight (27%) belong to PPV-D strain, 18 (60%) are mixed infections, belonging
to both strain, D and M, and four isolates belong only to PPV-M strain (13%).
The serological differentiation was been made by DASI-ELISA using D and M
monoclonal antibodies.
The serological analysis of the 30 isolates from SCDP Cluj show that 29 (97%) were
identified as belonging to PPV-D strain and 1 isolate (3%) was identified as belonging to PPV-M
strain).
The results obtained by serological differentiation of the isolates from Reghin area are:
samples infected with PPV-D+PPV-M strains represent 7%, the PPV-M strain infected 13% of
the samples and the predominant infection is attributed to PPV-D strain (80%).
Following serological differentiation with specific monoclonal antibodies 4DG5 (PPV-D)
and AL (PPV-M), the results for isolates from Bistrita show that PPV-M strain is predominant
and covers about 70% of the samples and the rest 30% of the samples are attributed to PPV-D
strain infection.
All PPV isolates differentiated as PPV-M in the genomic region corresponding to (Cter)CP, proved to be PPV recombinant (PPV-Rec) when the molecular analysis was performed in
the region corresponding to NIb/CP. By using specific primers to distinguish the two strains D
35

and M in CI region only fragments belonging to PPV-D were detected. This infomation
confirmed the presence of PPV-Rec.
CONCLUSIONS
Our research allowed to obtain data concerning the serological and molecular variability
of Plum pox virus isolates in the three studied regions, namely Cluj, Bistrita and Reghin.
To know the variability of this virus is essential to develop appropriate strategies to
eradicate or limit its impact, given the huge plum crops losses that are a reality in our country.
The study focused on the Plum pox virus serological and molecular variability was done
on a total of 90 PPV isolates collected from three commercial orchards infected with PPV that
are included in the Fruit Central Basin of Transylvania.
Our results provide a very high PPV infection rate and a critical situation for the plum
orchards located in the studied regions.
The differentiation and distribution of isolates indicates that the predominant strain is
PPV-D for Reghin area and Cluj, with the highest percentage being found in Reghin,
respectively 80%. Also, in Bistrita mixed infections are predominant with a procentage of 60
%.PPV-Rec strain has a higher percentage in Reghin and Bistrita (13%).
RECCOMANDATIONS
Knowing the distribution of viral strains according to fruit region will be very useful for
future programs to improve genetic resistance to PPV, as genotype response to viral infection is
different from one viral strain to another.
The detection different methods of isolates can be used in plant quarantine laboratories,
ensuring the circulation of virus free seedlings; in nursery and thus ensuring the production of
virus free fruit-growing seedlings.
The information obtained in this research work is essential for developing some useful
strategies to eradicate or limit the spread of PPV virus. Also, it is hoped that all these strategies
will lead to a revival of plum tree culture and external competitiveness.
36

Variabilitatea Serologică Şi Moleculară A Unor Izolate Ale Virusului Plum Pox Din Bazinul Central Pomicol Al Transilvaniei

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Variabilitatea Serologică Şi Moleculară A Unor Izolate Ale Virusului Plum Pox Din Bazinul Central Pomicol Al Transilvaniei

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE

Ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Efectuarea diagnosticului molecular pentru stabilirea prezenei virusului cu

4.3 Materialul biologic

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Fig.1 Seciunile genomice ale PPV-ului vizate pentru caracterizare molecular.

50C ................40 minute;

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Temperatura de ataare a amorselor n cazul amorselor CIF-CID/CIM a fost de

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Caracte riz are a mole cular a

Caracte rizarea mole cular a

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Fig. 4 Produii de amplificare RT-PCR obinui cu amorsele specifice mD5 i mM3, la

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Fig. 6 Analiza produilor PCR obinui prin amplificare cu mD5/mM3 pentru

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Dife re nie ra tulpinilor virale

Dife re nie re a tulpinilor virale

Dife re nie re a tulpinilor

Prin analizarea rezultatelor prezentate n tabelul 1 se observ faptul c toate izolatele

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

SEROLOGICAL AND MOLECULAR

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

Briciu Alexandru Ciprian- Rezumat tez de doctorat

S-ar putea să vă placă și