LP.

3 Tehnici de evaluare structural i funcional a organitelor

celulare.

Citoplasma este format din dou compartimente:

1.Citoplasma nestructurat sau hialoplasma (substana fundamental a citoplasmei),
2.Citoplasma structurat sau morfoplasma, reprezentat de organitele celulare.
n afar organitelor celulare, n citoplasm se pot gsi incluziuni celulare, produi de secreie i
acumulri ale unor produi exogeni.

Clasificarea organitelor celulare dup funcia lor n celul:

A. Organitele sintezei i secreiei celulare: D. Organitele motilitii celulare:

-reticulul endoplasmic, -microfilamentele,
-ribozomii, -microtubulii,
-complexul Golgi. -centrozomul.

B. Organitele generatoare de energie: E. Incluziuni celulare

- mitocondriile. - substane proteice, de exemplu
hemoglobina;
C. Organitele digestiei celulare: - lipide, sub form de picturi sferice
-lizozomii, - glicogen-
-peroxizomii. - substanele minerale - fier, siliciu

1
A. ORGANITELE SINTEZEI SI SECRETIEI CELULARE:
1. RETICULUL ENDOPLASMIC
Definiie Este un organit membranar, reprezentat de o reea interconectat de canalicule,
vezicule i cisterne delimitate de endomembrane (bistrat fosfolipidic)cu o grosime de
5-6 nm.
Localizare Comun tuturor celulelor cu excepia hematiei adulte
Numr Este prezent n numr mare n celulele angajate n sinteze de proteine,
glucide i lipide, fiind bine dezvoltat n celulele secretorii exo- i endocrine.

Tipuri: - RE neted - RE rugos (granular)

Reprezentare in celule REN este bine reprezentat n celulele care
sintetizeaz hormoni steroizi (glanda
suprarenal, celulele interstiiale din
testicul i ovar), glicogen (hepatocite) i
pigmeni (melanocite).
RER este bine reprezentat n celulele
glandulare (pancreatice), n hepatocite
(unde formeaz corpii Berg), n celulele
nervoase (unde formeaz corpii lui Nissl).

Forma , dimensiuni Este un sistem de canalicule i cisterne
delimitate de endomembrane.
Este un ansamblu de structuri canaliculare
i veziculare membranare, cu diametru de
aproximativ 20 nm, pe suprafaa crora se
gsesc ataai ribozomi, prin subunitatea
mare i care sintetizeaz proteine de
export.

Organizare structurala Nu este vizibil la microscopul fotonic.
-MO
Organizare Apare ca un labirint de canalicule care
ultrastructurala- ME comunic cu sacii RER i la nivelul
crora nu se ataeaz ribozomi.
Membranele REN au structur similar
RER prezintnd fenestrari asemanatoare
porilor nucleari.
Evidentiere
Este vizibil la microscopul fotonic
datorit prezenei ribozomilor
Apare sub form de canalicule, saci
aplatizai sau vezicule delimitate de
endomembrane . Membranele RE se
continu cu membrana extern a
nveliului nuclear, iar lumenul, cu
cisterna perinuclear. (figurile 1, 2)

RE poate fi vizualizat folosind coloraii histologice specifice, tehnici de

imunofluorescen sau microscopie electronic.

2
 Figura 1. Localizarea RER si REN n celul n raport cu nucleul.

a.

b.

c.

Figura 2. Reticul endoplasmic neted si rugos, schema si ME

2. RIBOZOMII sau corpusculii lui Palade (1953)

Definitie Ribozomii sunt organite celulare submicroscopice, nemembranare, formate din

ribonucleoproteine (proteine si ARNr) avnd rol n procesele de sintez a
proteinelor.
Localizare sunt prezeni n citoplasma tuturor celulelor, cu excepia eritrocitelor
Tipuri Pot fi de dou tipuri:
- ribozomi liberi n citoplasm -izolai
- grupai n poliribozomi (polizomi) -ataai
de membranele reticulului endoplasmic i de faa citoplasmatic a nveliului
nuclear

Numar Numrul ribozomilor variaz n funcie de tipul de celul.

3
 Astfel, ei se gsesc n numr foarte mare n celulele secretorii angajate n sinteza de
proteine.

Dimensiuni diametrul este cuprins ntre 15 - 30 nm.

Organizare structurala - ribozomii nu pot fi observai datorit dimensiunilor foarte mici, sub limita puterii de
MO rezoluie. In celulele n care se desfoar procese intense de proteogenez (celulele
foliculare din ovar), ribozomii formeaz zone intens bazofile n citoplasm.
Organizare apar sub form de granule ovalare sau elipsoidale cu diametrul mare de 20-30 nm i
ultrastructurala- ME diametrul mic de 16-17 nm. Prezint dou subuniti inegale ca dimensiune i
diferite ca structur morfologic i biochimic, (figura 3, 4).
- subunitatea mic, cu coeficient de sedimentare de 40SV;
- subunitatea mare de 60SV, prevzut cu un canal prin care trece lanul peptidic
sintetizat

Figura 3. Poliribozomii. Formarea lanturilor sinuoase in care

ribozomii sunt uniti intre ei printr-o molecula de ARNm care are
forma unui filament gros.

Figura 4. Ribozomi atasati reticulului endoplasmic,

ME.
La nivelul poliribozomilor liberi se sintetizeaz
proteinele de structur (procese de diviziune i cretere),
iar la nivelul ribozomilor ataai membranelor RE se
sintetizeaz proteine de export (enzime, hormoni, anticorpi).

4
3. APARATUL GOLGI

Definiie Este un sistem intracitoplasmatic de caviti limitate de citomembrane,

Localizare Este prezent att n celulele vegetale ct i n celulele animale, cu excepia hematiei
adulte. Este diferit n funcie de tipul i activitatea celulei - n neuroni este plasat
perinuclear, n celulele secretorii exocrine se afl supranuclear, iar n celulele
tiroidiene se deplaseaz ntre cei doi poli ai celulei
Organizare structurala Reea de canalicule anastomozate si de vacuole de diferite mrimi, dictiozomi
(formatiuni izolate sau grupate sub forma de tubuli anastomozati intre ei sau sub forma
-MO
de cisterne)
Organizare Corpii Golgi se caracterizeaza ultrastructural prin :
-saci turtiti formati din unitatea membranara , dispui paralel cu extremitatile mai
ultrastructurala- ME
dilatate ce prezinta o fa proximal, de formare, orientat ctre nucleu (cis) si o fa
distal, de maturare, orientat ctre plasmalem (trans) (figura 5).
-vezicule, situate in laextremitatea sacilor, n raport cu faa de maturare, cu diametrul
de 25-50 nm
-vacuole de 0,5-1micron situate lng faa de formare (pe fata concava) a sacilor
paraleli (figurile 6,7,8,9)
Evidentiere Poate fi evidentiat in celula proaspata cu colorantul rosu-neutru, iar in celula fixata
prin colorare cu saruri de osmiu unde apare ca o retea filamentoasa anastomozata,
situata peri sau paranuclear.

Figura 5. Aparatul Golgi - dictiozomi - formai din cisterne aplatizate i vezicule delimitate de membrane lipoproteice
Au rol in formarea endomembranelor, sinteza complexelor de hidrai de carbon, formarea proteoglicani1or i a
glicoproteinelor, maturarea lipoproteinelor, formarea lizozomilor primari.

5
 Figura 6. Aparat Golgi, adenohipofiza, ME

Figura 7. Aparat Golgi, capsula Bowmann Figura 8. Aparat Golgi, epididim, ME

rinichi, ME

Figura 9. Aparat Golgi, Limfocit, ME

6
B. ORGANITELE GENERATOARE DE ENERGIE:

1. MITOCONDRIILE

Definiie Mitocondriile sunt organite membranare ce conin sisteme enzimatice necesare

oxidrii materialelor nutritive, sintezei moleculelor de ATP i cuplarea acestor dou
procese (fosforilarea oxidativ).
Localizare Prezente n toate celulele cu metabolism aerob, cu excepia eritrocitului adult. Sunt
rspndite n ntreaga citoplasm, cu predilecie la polii celulei sau perinuc1ear n
momentele de intens activitate de sintez.
Numr Depinde de gradul activitii celulare, fiind mai numeroase n celulele n care
activitatea funcional este intens (ex. hepatocite).
Dimensiuni Lungimea este de aprox. 7m, iar grosimea de 0,5 m; cu ct o celul este mai activ
cu att mitocondriile sunt mai mari.
Forma - au o mare plasticitate
- alungit n celulele pancreasului exocrin
- granular n hepatocite
Organizare structurala Ia microscopul fotonic n contrast de faz: sub form de granule izolate n citoplasm,
-MO granule dispuse sub forma unui irag de mrgele sau filamente, (figura 10).
Organizare Form sferic, formate din dou membrane: membrana extern i membrana intern
ultrastructurala- ME care trimite n interior prelungiri ce formeaz crestele mitocondriale.
Spaiul dintre cele dou membrane se numete camera extern, iar ntre membrana
intern i crestele mitocondriale se afl camera intern sau matricea mitocondrial
Membrana intern este alctuit din particule elementare - unitile tripartite care sunt
alctuite dintr-un cap sferic, o tij cilindric i o baz patrulater (figurile 11, 12, 13)
Evidentiere Coloraii supravitale cu verde Janus B pentru celulele nefixate i hematoxilin feric
Regaud pentru celulele fixate

Figura 10. Structura mitocondriei, schema. 1. Membrana externa, 2. Membrana interna ce trimite in interior
prelungiri, 3. Cristele mitocondriale, 4. Matricea mitocondriala

7
Figura 11. Criste mitocondriale, ME Figura 12. Tubuli mitocondriali, ME

Figura 13. Mitocondrii intermediare, ME

8
 Metode de studiu ale biologiei celulare
Fracionarea celular

Fracionarea celular este o tehnic de rupere a esuturilor i celulelor ntr-un mod

controlat. Se realizeaz astfel omogenizarea sau distrucia legturilor celulare prin diferite procedee,
separarea fraciunilor celulare fcndu-se n funcie de densitate i volum.

Tehnica de fracionarea celular are dou aplicaii majore:

- studierea compoziiei chimice i a funciilor diferitelor componente celulare. Implic
separarea acestor componente de mediul normal celularntr-o cantitate i puritate suficiente. Ex. :
fracionarea celular a fost folosit pentru nelegerea mecanismului fosforilrii oxidative desfurat
n mitocodrii, sau a evenimentelor care rezult ca urmare a legrii ribozomilor la reticulul
endoplasmatic.
-identificarea localizrii intracelulare a unor molecule specifice, alturi de celelalte tehnici de
citochimie.
Deoarece, morfologia majoritii organitelor se modific dup procesul de omogenizare
tisular/celular, tehnica fracionrii celulare necesit folosirea unor procedee analitice pentru
identificarea fraciunilor celulare, inmd cont nu doar de morfologia organitelor din care ele provin,
ci i de constituenii chimici i enzimatici.

Principiile fracionrii celulare

Primul pas n extragerea unor cantiti suficiente de organite celulare, l reprezint ruperea
membranelor plasmatice, prin diferite procedee mecanice i chimice, urmat de separarea
fraciunilor celulare prin centrifugare, n funcie de volum i densitate.
Pentru a separa prin centrifugare diferite componente celulare se ine cont de diferenele dintre
proprietile lor fizice, din care cele mai importante sunt masa i densitatea.
Centrifugarea diferenial presupune separarea fraciunilor celulare prin sedimentarea intr-un
mediu cu densitatea omogena.
Pentru ruperea membranelor plasmatice, celulele sunt suspendate ntr-o soluie salin cu un pH
apropiat de cel mediului intracelular, de ex. sucroza- izotonic. Ulterior are loc sedimentarea

9
suspensiei celulare la o for centrifugal relativ ce variaz n funcie de tipul organitului celular
care trebuie separat prin centrifugare, sau prin plasarea sa ntr-un cmp sonic de nalt frecven
(ultrasonare).

Izolarea organitelor celulare

Procesul de separare a organitelor celulare presupune::
I. -ruperea membranelor celulare;
II.- separarea componentelor celulare prin centrifugarediferenial sau n gradient de densitate.
Distrugerea membranei celulare are loc n condiii care produc afectarea minim a organitelor
celulare.Cel mai frecvent se realizeaz folosind un omogenizator mecanic.
n funcie de tipul de celule, se cunosc tehnici diferite pentru fragmentarea membranei celulare
(omogenizatorul Dounce este de obicei utilizat pentru culturile de celule, omogenizatorul Potter-
Elvehjem pentru esuturile fragile -ficat).
Omogenizarea celulelor sau a esuturilor cauzeaz de obicei distrugerea parial a unor
organite.
Dup fracionarea peretelui celular, suspensiile respective sunt centrifugate pentru separarea
diferitelor tipuri de componente celulare. Aceste componente sunt purificate din omogenat:
- prin centrifugari succesive la viteze de centrifugare din ce n ce mai mari lundu-se n calcul
masa fiecrei fraciuni (centrifugare diferenial);
- prin centrifugare n gradient de densitate. n tubul de centrifug se genereaz benzi (faze) de
lichid cu densiti diferite, componentele celulare migrnd catre poziia (faza/banda) cu care intr n
echilibru.
Lizozomii i peroxizomii, care au mrimi i densiti asemntoare, sunt mai greu de separat.
De asemenea, fragmentele membranare derivate din REN, complexul Golgi, endozomi i
membranele plasmatice sunt recunoscute prin formarea de vezicule cu suprafee netede, dar care
frecvent sunt greu de separat.
Izolarea unui anumit organit celular poate fi facilitat prin creterea numrului. De exemplu,
cnd cobaii sunt tratai cu clofibrat, numrul peroxizomilor n celulele hepatice crete considerabil.
Creterea numrului de organite celulare, care apare dup administrarea diverilor compui chimici,
are ca rezultat mbuntirea purificrii pe tipuri de organite.

10