Examinarile bacteriologice urmaresc

evidentierea si identificarea bacteriilor din

Studiul morfologiei bacteriene produse patologice.

Coloratia simpla Dintre metodele folosite in acest scop,

studiul caracterelor morfologice este o
Coloratia Gram
etapa foarte importanta.

Bacteriile avind dimensiuni de

ordinul m, nu pot fi vazute cu
ochiul liber, de aceea examinarea
lor se efectueaza cu ajutorul
microscopului.

1
 Anthoni van Leeuwenhoek (1632-1723) a fost primul care a
studiat bacterii si alte microorganisme la microscop

Examenul microscopic se executa fie:

direct din produsele patologice (examen
microscopic direct),
din culturi pure.
Preparatele microscopice sint de 2 feluri:
preparat nativ, cu germeni vii
frotiu sau preparat colorat, cu germeni omoriti

2

Examenul microscopic da indicatii asupra
prezentei microorganismelor in preparat si
asupra proprietatilor morfotinctoriale:
forma (bacili, coci, spirili)
marimea
mobilitatea ( in preparatul nativ )
existenta eventuala a formatiunilor
neobligatorii ( cili, capsula, spori)
asezarea in frotiu ( lant, ciorchine, diplo-,
tetrade, etc)
proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
Examenul microscopic direct din produsele
patologice permit in unele infectii stabilirea
diagnosticului ( gonococ, bacil tuberculos,
stafilococ ) si constituie o etapa esentiala
in identificarea bacteriana.
Preparatul nativ ( cu germeni vii )
Ex. microscopic al preparatului nativ
examinarea directa intre lama si lamela a unei
suspensii de germeni vii
intr-o picatura de ser fiziologic, sau mediu
de cultura lichid, precum si a produsului
patologic (singe, sediment urinar, lcr).
3

Preparatul nativ
Examinarea prep. nativ
are implicatii restrinse
nu da informatii asupra tuturor
proprietatilor morfologice ale bacteriilor,
este obligatorie completarea lui cu
examinarea preparatului colorat.
Timpii de executie a preparatului
colorat
Timpi pregatitori:
etalarea = intinderea frotiului
uscarea
fixarea ( procedee fizice - prin incalzire si
chimice: cu alcool metilic, etilic, alcool -eter,
acid acetic )
Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)
Proprietatile morfotinctoriale ale
bacteriilor pot fi studiate mai detailat
pe preparate fixate si colorate, cu
germeni omoriti . Mai rar se folosesc
coloratii vitale, spre ex. in reactia de
umflare a capsulei .
Fixarea
Scopul fixarii este multiplu:
microorganismele sint omorite=preparat
neinfectios
preparatul adera mai bine de lama
prin omorirea microorganismelor se mareste
permeabilitatea peretelui celular si se produc
modificari ale citoplasmei, care cresc
afinitatea fata de coloranti = detalii fine de
strucura
4
 Coloratia
Definitie:
Procedeu fizico-chimic complex, in care colorantii se
combina cu constituenti celulari, facindu-i vizibili la
microscop.
Colorantul se absoarbe, apoi se dizolva si difuzeaza
in continutul celular , unde are loc formarea unei
combinatii stabile.
Colorarea se executa de obicei prin acoperirea
suprafetei frotiului fixat cu colorant, care se lasa sa
actioneze un timp limitat, la cald sau la rece.
Coloratia simpla
- frotiul fixat
- se acopera complet cu un singur
colorant: albastru de metilen sau fuxina,
timp de 1-2 min.
se spala cu apa si se usuca
in coloratia cu albastru de metilen toate
elementele se coloreaza in albastru
in coloratia cu fuxina, toate elementele se
coloreaza in rosu
Tipuri de coloratii
Coloratia simpla
se executa cu un singur colorant
Coloratia combinata
se realizeaza prin actiunea succesiva sau simultana a
mai multor coloranti, fiecare colorant actionind
independent si fixindu-se pe anumite elemente
- coloratii speciale:
pentru formatiuni morfologice celulare si
extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsula
Coloratia simpla
Permite stabilirea unor proprietati
morfotinctoriale ca:
forma si marimea microorganismelor, precum
si existenta unor elemente celulare
Este utila in diagnosticul prin ex.
microscopic direct din produsul patologic
in
gonoree, meningita cerebrospinala epidemica
etc
5
 Hans Christian Gram (medic
Coloratii combinate: coloratia Gram
danez)
Larg utilizata in microbiologie,
pentru ca deosebeste germenii
gram pozitivi de cei gram negativi,
orientind cercetarea in directia
identificarii lor.

Coloratia Gram
Tehnica de colorare
Frotiul fixat este acoperit cu violet de gentiana : 1-2
min. (Se spal cu ap de la robinet ).
Se acopera cu o solutie de lugol pentru mordansare, 2
min. (Se spal cu ap).
Decolorare cu alcool-acetona timp de 20 sec, pina nu
se mai dizolva colorant. (Se spal cu ap).
Se recoloreaza cu fuxina diluata/ safranina , 2 min.( Se
spala cu apa )
Se usuca frotiul si se examineaza cu imersie.

6
 Germenii gram +
rezista la decolorare si isi mentin
culoarea violet initiala;
Germenii gram
se decoloreaza si se recoloreaza in rosu
cu fuxina/safranina.

Coloratia Gram Principiul coloratiei Gram

Diferenta de comportament in
coloratia Gram se explica prin
structura si compozitia chimica
diferita a peretelui celular la
bacteriile gram+ si gram -.

7
 Christian Gram recognized two different types of bacteria based on
reaction to certain staining procedure.

Coloratia Gram permite constituirea

urmatoarelor grupe de bacterii:
coci gram + : Bacili gram - :
streptococi, stafilococi, pneumococi
E. Coli ( bacilul coli ), Klebsiella,
coci gram - :
Pseudomonas ( bacilul piocianic),
meningococ, gonococ
Salmonella typhi ( bacilul tific )
bacili gram + :
bacillus antracis ( bacilul carbunos), corynebacterium Cococbacili gram - :
diphteriae ( bacilul difteric), listeria monocitogenes,
clostridium botulinum ( bacilul botulinic), clostridium
Haemophilus influenzae, Bordetella
tetani ( bacilul tetanic) pertusis, brucela

8
Coci Gram +, dispusi in gramezi Coci Gram+, dispusi in lanturi

Bacili Gram - Bacili Gram +

9
 Coci Gram +

Cocobacili Gram + Coci Gram + si Cocobacili Gram +

10
Frotiu lcr colorat Gram

Trusa comerciala pt coloratia Gram

11
12