3.2 Imobilizarea enzimelor prin reticulare.

Imobilizarea enzimei se poate realiza şi fără a se utiliza suporturi prin

efectuarea de punţi covalente cu ajutorul unor reactivi polifuncţionali. Se obţin astfel
structuri cu înaltă masă moleculară care devin insolubile. Pentru realizarea unei
astfel de reacţii se pot folosi numeroşi reactivi, dintre care cei mai utilizaţi sunt :

Principalii reactivi polifuncţionali

Nume Structură
Glutaraldehidă
Acid bis-diazobenzidin-2,2’-disulfonic

Acid difenil-4,4’-diizotiocianat-2,2’-
disulfonic

1,5-difluoro-2,4-dinitro-benzen

3-metoxi-4,4’-difenil diizotiocianat-
metan

De departe glutaraldehida este reactivul cel mai utilizat nu numai pentru a se

reticula enzimele ci şi pentru realizarea aşa numiţii imuno-adsorbanţi.
În acest proces enzima este diluată cu o proteină inertă, cum este albumina,
pentru a se limita fenomenele de denaturare şi a creşte eficacitatea metodei de
imobilizare. Derivaţii rezultaţi pot fi şi sub formă de membrane. Observaţii la
microscopul electronic au permis precizarea structurii fine a acestor tipuri de derivaţi.
Pentru obţinerea unor derivaţi cu o structură foarte poroasă asemănătoare
bureţilor, amestecul de enzimă, albumină şi glutaraldehidă este congelat rapid după
care se creşte temperatura până la 40C în mod lent.
Un astfel de proces de reticulare se poate aplica nu numai enzimelor ci şi
celulelor întregi. Acestea prezintă avantajul, mai ales în cazul în care celula conţine o
enzimă uşor accesibilă (cum este cazul enzimelor periplasmatice), că permit
utilizarea activităţii catalitice fără a se efectua procesele de extracţie şi purificare
consumatoare de energie, timp şi bani. În acest caz putem spune că celula este
suportul. De asemenea se evită eliberarea sistemelor care determină
1
autodegradarea celulară printr-o încălzire a sistemului timp scurt la o temperatură de
700- 800C. În plus acest procedeu permite scăderea importantă a costului enzimei
imobilizate şi este utilizat pe larg pentru imobilizarea glucoz izomerazei folosită
pentru producerea de izoglucoză, una dintre cele mai importante aplicaţii industriale
de enzime imobilizată.
De exemplu cu glutaraldehidă firma NOVO a reticulat Bacillus coagulans, iar
GIST-BROCADES micelii de Actinoplanes missouriensis.

Avantaje şi dezavantaje
Avantaje
 Soliditatea legăturii enzimă –suport care permite obţinerea de
compuşrezistenţi la diferite variaţii importante ale condiţiilor de mediu (pH,
tărie ionică) şi, în particular, la spălări repetate cu soluţii concentrate de
clorură de sodiu.
 Există o foarte mare varietate de suporturi şi metode de activare, deşi este
aproape imposibil de a prevedea a priori eficacitatea unei metode de
imobilizare, este întotdeauna posibil să se găsească pentru o enzimă dată o
metodă care să dea un randament de imobilizare bun.
 Stabilitatea legăturilor covalente între enzimă şi suport se poate traduce şi prin
rigidificarea structurii tridimensionale a enzimei. Din aceasta rezultă noi
proprietăţi, în special printr-o creştere generală a rezistenţei la factorii de
denaturare(temperatură, pH, agenţi denaturanţi). Este semnificativ că foarte
multe enzime imobilizate prezintă o temperatură optimă de activitate mai mare
decât a enzimei libere fapt deosebit de important pentru utilizarea enzimei în
flux continuu. Pentru ca rigidificarea enzimei să nu fie totală, fiind necesară o
anumită elasticitate, este obligatoriu să se stabilească condiţiile optime de
imobilizare pentru fiecare enzimă în parte şi pentru fiecare procedură de
imobilizare.

Dezavantaje
 Imobilizarea prin legare covalentă este mult mai complexă decât prin
incluziune sau adsorbţie. Chimia heterogenă aplicată pentru a se ajunge la
imobilizare nu duce întotdeauna la rezultatele aşteptate considerând reacţiile
care au loc în fazele omogene ca urmare a fenomenelor de interferenţă din
micromediul înconjurător prezent în sistemele heterogene.

2
  Formarea legăturilor covalente între diferitele grupări funcţionale ale enzimei şi
suportului conduce la o importantă modificare a structurii enzimei, care deşi
este benefică în ceea ce priveşte ameliorarea rezistenţei la factori de
denaturare, provoacă totuşi o denaturare a structurii moleculei enzimei. De
aceea randamentul de imobilizare exprimat în funcţie de activitatea enzimatică
reziduală poate avea valori procentuale de la câteva unităţi la mai mult de
90%. De exemplu este suficient ca la legătură să participe şi grupări din
situsul catalitic al enzimei ca activitatea sa să fie perturbată. De asemenea pot
fi amintite şi efectele de stânjenire sterică şi de schimbare a sensibilităţii
enzimei la variaţii de pH saiu chiar la modificarea valorii optime de pH.
 Este practic imposibil de a se prevedea, chiar dacă structura enzimei este
cunoscută şi reacţia de cuplare perfect stăpânită, care va fi randamentul de
imobilizare covalentă cu o metodă sau alta, fiind variabil de la o enzimă la alta
pentru aceiaşi metodă şi pentru o enzimă dată diferit pentru diferite metode.
 Cantitatea de enzimă imobilizată per g de suport este în general mai mică
decât în caz de incluziune sau adsorbţie.
 Suporturile organice au adesea inconvenientul că prezintă proprietăţi
mecanice necorespunzătoare şi sunt sensibile la atacul microorganismelor.
Suporturile minerale nu prezintă acest dezavantaj dar capacitatea lor de
cuplare este mai redus.

În prezent tehnica de imobilizare prin legare covalentă a enzimelor este una

dintre cele mai utilizate şi nu prezintă dezavantajele tehnicilor anterioare.