1.

1Acțiunea factorilor fizici asupra microorganismelor(căldura, temperaturi

joase, desicarea, presiunea osmotică, ultrasunetul, radiațiile)

TEMPERATURA. Bacteriile și virusurile suportă relativ temperaturile

joase, de aceea culturile de microorganisme pot fi conservate în stare congelată
în condiții de laborator mai mult de 80 de ani. Totuși, prin acțiunea temperaturii
joase se frânează procesele de putrefacție și fermentație, se produce încetinirea
proceselor metabolice, moartea bacteriilor prin îmbătrânire și subalimentare
distrugerea celulelor sub influența sporirii toxicității ionilor.
Temperaturile ridicate exercită o influență mult mai nocivă, mai ales asupra
formelor asporogene, care se distrug într-un interval de 58-60 g.C. La baza
acțiunii bactericide a temperaturii ănalte rezidă distrugerea ribozomilor,
dezintegrearea structurii terțiare a proteinelor și membranelor celulare,
deteriorarea barierei osmotice.
DESICAREA. Microorganismele rezistă în mod diferit la uscare. Uscarea în
aer este însoțită de deshidratarea citoplasmei și de denaturarea proteinelor
bacteriene.
ENERGIA RADIANTĂ. Radiațiile ultraviolete, Roentgen, alfa, beta,
gamma, cu neutroni, cât și razele solare directe au o înaltă capacitate
bactericidă. Radiația UV favorizează formrea de peroxizi, care au efecte
oxidante asupra microorganismelor, distrugând moleculele de ADN de pe urma
apariției dimerilor pirimidinici. Totodată, razele UV cu lungimea de undă de
260-300 micrometri, inactivează foarte rapid virusurile, fiind absorbite de
acidul nucleic al virusurilor.
Razele de unde scurte sunt utilizate pentru dezinfectarea saloanelor și
materialului contaminat, pentru conservarea produselor, prepararea
vaccinurilor, dezinfectarea sălilor de operație etc.
PRESIUNEA. Hiberbaria. Bacteriile suportă ușor efectele presiunii înalte.
ULTRASUNETUL. Are efecte bactericide, fiind utilizată pentru sterilizarea
produselor alimentarea sau prepararea vaccinurilor etc. Acțiunea sa este
următoarea: în citoplasma bacteriilor din mediul acvatic se formează o cavitate,
care se umple cu vapori, iar presiunea din acea cavitatea atinge 10 000 de atm.,
ceea ce cauzează distrugerea structurilor citoplasmatice.

1.2Mecanisme de acțiune a substanțelor chimice asupra

microorganismelor(fenolul, crezolul, coloranții, oxidanții, sărurile
metalelor grele, formaldehida, alcoolii)

1
 FENOLUL, CREZOLUL. Lezează mai întâi perele celular, apoi și proteinele
celulei. Unele substanțe din acest grup inhibă funcția coenzimei implicate în
dehidrogenarea glucozei și a acidului lactic.
COLORANȚII. Au capacitatea de a frâna creșterea bacteriilor. La baza
acțiunii lor se află afinitatea accentuată a acestora pentru grupele fosforice ale
nucleoproteidelor. Din coloranții bactericizi fac parte verdele briliant, rivanolul,
tripaflavina.
SĂRURILE METALELOR GRELE(Pb, Zn, Ag) coagulează proteine
celulare, în urma interacțiunii are loc formarea albimnatului de metal și un acid
liber. Metale precum aurul, argintul, cuprul au efecte oligodinamice.
Mecanismul de acțiune constă în faptul că ionii metalelor cu sarcină pozitivă
sînt adsorbiți de suprafața cu sarcină negativă a bacteriilor, modificând
permeabilitatea membranei lor citoplasmatice. Au loc dereglări în nutriția și
multiplicarea bacteriilor.
OXIDANȚII. Acționează asupra grupelor sulfhidrice ale proteinelor active. De
asemenea, oxidanții puternici au acțiune și asupra grupelor tioetilice, indolice
sau aminice. Din oxidanții întrebuințați fac parte mai ales clorul, care
denaturează dehidratazele, hidrolazele, proteazele bacteriene, fiind folosit la
dezinfectarea apelor. La fel, tinctura de iod, care oxidează grupările active
proteice, cât și provoacă denaturarea lor. Clorhexidina, este utilizată la
dezinfectarea mâinilor personalului, câmpului operator, instrumentelor.
Oxidanți: permanganatul de potasiu, peroxidul de hidrogen.
ALCOOLI. Etilic, metilic
FORMALDEHIDA. Se asociază cu grupările aminice ale proteinelor,
provocând denaturarea lor. Este eficiență nu doar pentru formele vegetative, ci
și în cazul sporilor. Se utilizează pentru inactivarea exotoxinelor difteriei,
antraxului.

1.3 Noțiune de dezinfecție. Substanțe dezinfectante contemporane, utilizate în

Republica Moldova. Fierberea. Pasteurizarea.
Dezinfecția- măsuri întreprinse cu scopul de a distruge germenii patogeni
din afara organismului, în scopul împiedicării contaminării.
Dezinfecţia reprezintă întrebuinţarea diferitelor metode pentru distrugerea
formelor adulte şi de rezistenţă a microbilor din aer, de pe obiecte, tegumente şi
instrumente.Se folosesc agenţi fizici (raze solare, ultraviolete artificiale) şi
chimici.
Substanțe dezinfectante contemporane
I.Soluţii oxidante – Var cloros, Cloramina, apa oxigenată
II.Soluţii hidrolizante- sodă de rufe
2
 III.Soluţii care produc coagularea proteinelor- Alcoolii
IV.Iodoforii- -Septozol -Soluţie alcoolică cu iod
În prezent sunt utilizate substanţe dezinfectante noi cum ar fi: - Clorhexidin
(Hibisol)1% pentru tegumente şi mucoase - Virkon pentru pavimente, mobilier,
lenjerie (eliberator de oxigen activ), non toxic, dezinfectant cu spectru larg.
FIERBEREA. Metodă de sterilizare a seringelor, sondelor, cateterelor,
penselor, la t-100g.C timp de 45 min.. prin această metodă are loc distrugerea
fomelor vegetative ale bacteriilor, virusurilor, însă sporii de bacilli, clostridia și
fungi, de obicei, persistă.
PASTEURIZAREA. Se utilizează prin eliberarea produselor alimentare de
formele vegetative ale microorganismelor patogene și faculativ patogene, fiind
o metodă de sterilizare parțială. Se aplică pe larg pentru dezinfectarea laptelui
prin încălzirea lui la t- 60-65g.C timp de 30 min., de 70-75g.C timp de 45 sec. ,
la 90g.C- secunde cu răcire bruscă. În cazul sucurlor, vinurilor are loc aplicarea
unei temperature de 85g.C timp de 2 min. cu răcire bruscă. Controlul eficienței
poate fi efectuată prin intermediului termostatului.

1.4 Noțiuni de aseptică și antiseptic. Principalele substanțe antiseptice.

Conservarea chimică. Aplicarea practică.

ASEPTICA- un sistem integru de măsuri îndreptate spre prevenirea

microorganismelor în plăgi. Aseptica se realizează prin sterilizarea
instrumentelor și materialelor chirurgicale, prin toaleta mâinilor chirurgului
înainte de operație, pielii în câmpul operator, prin tratarea cu substanțe aseptice
a aerului și obiecteor din sala de operație.
ANTISEPTICA- complex de măsuri curative- profilactice orientate spre
distrugerea microorganismelor în plagă sau în macroorganism în întregime.
Substanțe antiseptice- apa de clor, azotatul de argint, iodul, fenolul, alcoolul,
apa oxigenata, derivatii de amoniu cuaternar, dorhexidina, derivatii fenolului,
oxidanti, acizi, derivati metalici (mercur, argint, cupru, zinc), coloranti (eozina,
albastru de metilen), hexetidina, hexomedina, iod.

Conservarea (lat. conservare = păstrare) este o metodă de preparare în special a

substanțelor de natură organică (alimente), pentru a putea fi păstrate un timp mai
îndelungat. Conservarea împiedică sau întârzie procesele fizico-chimice (reacția
enzimatică sau de oxidare), de degradare, cauzate de bacterii, mucegaiuri.

3
1.5 Noțiune de sterilizare, obiect steril și nesteril

A face să fie steril, o metodă de conservare, sau dezinfecție prin diferite metode
de distrugere a microorganismelor

Sterilizarea instrumentelor medicale este o operație tehnologică prin care sunt

eliminate forme de viață microbială sau omorâte microorganism

1.6 Metode fizice de sterilizare prin: ardere, vapori sub presiune, aer cald.
Sterilizare prin radiații și ultrasunet.(TABEL P. 15)

1.7 Metoda mecanică de sterilizare. Tipurile de filter și aplicarea practică.

Sterilizarea chimică.(TABEL P. 15)

1.8 Controlul eficienței sterilizării.(TABEL P. 15)

1.9 Metabolismul microbian. Particularitățile

Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii biochimice care au loc în

celula vie.

Căile metabolice: Catabolism – reacţii chimice de descompunere a substanţelor

complexe în elemente simple, însoţită de degajarea energiei (metabolism
energetic)Anabolism – reacţii chimice de sinteză a substanţelor complexe din
elemente simple, necesită energie (metabolism constructiv, de sinteză). Din punct
de vedere funcţional, cele 2 tipuri de căi metabolice sunt interconectate, deoarece
energia şi o parte din produşii rezultaţi din reacţiile de catabolism sunt folosiţi ca
energie şi produşi intermediari în reacţiile de anabolism. Prin urmare, căile
metabolice centrale care eliberează energie, pot furniza şi precursori pentru alte căi
metabolice, aceste căi fiind numite căi amfibolice.

Catabolismul reprezintă o succesiune de reacţii biochimice implicate în

degradarea nutrienţilor şi eliberearea de energie necesară pentru funcţionarea
celorlalte căi metabolice şi altor activităţi fiziologice ale celulei.

Faza 1: macromoleculele sunt descompuse enzimatic în unităţi de bază: proteinele

→AA, lipidele → acizi graşi şi glicerol, glucidele → monoglucide; - are loc
frecvent la exteriorul celulei bacteriene, fiind realizată de exoenzime. Din aceste
reacţii se eliberează ~1% din energia totală a macromoleculei, inaccesibilă celulei,
fiind eliberată sub formă de căldură.

4
Faza 2: moleculele rezultate în faza precedentă sunt degradate incomplet,
eliberand 1/3 din energia totală, cu producerea, în afară de CO2+ H2O, a unui
număr mic de produşi de importanţă esenţială în metabolism, numiţi intermediari
metabolici ai căilor metabolice centrale (de ex., aminoacizii sunt utilizaţi pe căi
diferite şi catabolismul lor conduce la formarea de acetil-CoA sau intermediari ai
ciclului acizilor tricarboxilici = ciclul Krebs).

Faza 3: se derulează diferit, în funcţie de tipul respirator al microorganismului

(respiraţie celulară = procesul de degradare a nutrienţilor prin reacţii de
oxidoreducere biologică).

Anabolismul- Reprezinta totalitatea reactiilor biochimice prin care

microorganismele îşi sintetizează din molecule simple constituenţii celulari proprii.
Pot fi utilizaţi şi intermediari ai căilor metabolice centrale.

Sinteza macromoleculelor este foarte eficientă şi se face sub acţiunea informaţiei

genetice codificată în ADN. Celula bacteriană sintetizează mai întâi monomeri
(AA, baze azotate) pe care îi aranjează ulterior într-o ordine specifică, dictată
genetic, care determină structura primară a macromoleculelor respective.

Specificitatea biologică constă în aranjarea diferită a unui număr limitat de

monomeri (unităţi de structură: 20 AA, 5 baze azotate) pentru a forma un număr
impresionant de macromolecule biologice cu structuri şi funcţii diferite.

Particularităţile metabolismului bacterian:

1. Natura şi diversitatea nutrienţilor folosiţi (substanțe anorganice,

organice), unele chiar cunoscute ca fiind inhibitori ai creşterii: acizi (formic,
oxalic, sulfuric), lignină, chitină, celuloză, antibiotice, fenoli, asfalt, petrol,
parafine, materiale plastice.
2. Plasticitatea metabolismului bacterian – se referă la capacitatea bacteriilor
de a folosi surse alternative de nutrienţi (bacteriile se adaptează rapid la tipul
și cantitatea nutrienților)
3. Diversitatea mecanismelor enzimatice şi a produşilor rezultați –
bacteriile nu au o cale metabolică pentru un produs, ci au căi alternative
multiple pentru a se adapta condiţiilor de mediu variate.
4. Intensitatea reacțiilor metabolice (viteza reacţiilor este mare).
5. Este un metabolism necompartimentat, toate procesele metabolice se
desfăşoară intr-o singură celulă.

5
1.10. Enzimele bacteriene. Clasificarea. Rolul în fiziologia bacteriilor

În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele

 Caractere generale:

- Substanţe proteice
- Active în limite largi de temperaturi (0-75°C) şi de pH (2-9)
- Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu un substrat catalizând
un tip de reacţie)
- Specificitatea este determinată de centrul activ al enzimei, complementar cu
receptorul de pe substrat
- Nu se modifică în cursul reacţiei

CLASIFICARE

I. Constitutive (permanente)
II. Inductibile (adaptative), se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza)
III. Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului
reacţiei catalizate

 După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)

 După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze,
izomeraze, ligaze)
 După impactul asupra ma/o

- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificări patologice ale
ţesuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, colagenaza, elastaza,
plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, etc.

Importanţa practică a studierii enzimelor

1. Rol în identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determină activitatea

biochimică specifică a bacteriilor)
2. Unele substanţe chimice, antibiotice interferează cu activitatea unor enzime,
inhibând creşterea bacteriilor (tratament)
3. Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor (unele enzime sunt
responsabile de producerea leziunilor în ţesutul gazdei)
4. Aplicarea industrială a enzimelor

6
1.10 Nutriția bacteriilor. Tipurile de nutriție și mecanismele transportului
nutrienților în celula bacteriană.
Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele
necesare pentru metabolism.
Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.

Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP pentru a fi antrenate în

metabolismul celulei. Se obţin din alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2)
sau după o digestie prealabilă (proteine, polizaharide, lipide).

La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- şi în spaţiul periplasmic)

 Nutrienţii servesc în calitate de material de construcţie şi sursă de energie

pentru sinteza compuşilor şi menţinerea vieţii bacteriei.

 Transportul transmembranar

1. Difuzie simplă, pasivă (conform gradientului de concentraţie, fără consum de

energie): O2, CO2, acizi graşi, nutrienţi liposolubili

2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) – permite transportul

transmembranar al moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport
specifice integrate in MCP - permeaze.

3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie, necesită energie). Participă

permeazele şi alte proteine de transport /fixare specifice. Nutrienţii nu suportă
modificări.

4. Translocaţie – substratul este modificat chimic (ex.: fosforilat) în timpul

transportului membranar; necesită energie

 Substanţele care au pătruns în citoplasmă sunt descompuse de către enzimele

bacteriene conform căilor metabolice proprii fiecărei specii bacteriene (ex.:
Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul pentozelor, ciclul Krebs, etc).
Celula obţine energie şi precursori care vor fi antrenaţi în biosinteză
(anabolism).

 Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

 Necesităţile nutritive ale bacteriilor

7
 - Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi importante; S, P, Fe,
Ca, Mg, K în cantităţi mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo.

Bacteriile prototrofe sunt capabile a-şi realiza integral sinteza metaboliţilor

esenţiali.

- Necesităţi specifice. Bacteriile auxotrofe solicită suplimentar compuşi organici

preformaţi (factori de creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.: AA, baze
purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în mediul de cultură este
indispensabilă creşterii acestor bacterii.

1.12 Clasificarea microorganismelor după sursele de energie și carbon.

Noțiune de microorganisme saprofite și parazite

Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon

 Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)

 Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide,
acizi graşi, alcooli, etc)

Clasificarea după sursa de energie

 Bacterii fototrofe – utilizează energia solară (fotosint)

 Bacterii chemotrofe – folosesc energia degajată din reacţiile chimice de
oxido-reducere. Ele necesită un substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi un
substrat acceptor de hidrogen. În transfer participă transportori intermediari
de electroni (lanţul respirator, NAD, FAD, etc.)

- Bacteriile chemolitotrofe – donorul de H este o substanţă anorganică

- Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o substanţă organică
(glucoza, lipide...)

Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Tipurile nutriționale de mi/org (Clasificarea bacteriilor după

sursele de energie şi carbon)

I. Bacterii fotoautotrofe (energie solară, CO2)

II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org)
III. Bacterii chemoautotrofe
IV. Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)
8
 - Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea
materiei organice)
- Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii,
aducându-le prejudicii
- Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând
maladie sau moarte.

1.13 Metabolismul energetic la bacteriile chemoorganotrofe. Oxidarea

biologică a substratului(reacții de oxido-reducere). Tipurile oxidării
biologice(respirația, fermentația). Depozitarea și utilizarea energiei.

Mecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul

final de H : Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos (agent oxidant
extern). Calea biochimică de degradare este ciclul Krebs. Implică lanţul respirator
de transport al electronilor asociat MCP. Produs final – H2O, posibil H2O2

 Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S)

 De ex.: bacterii denitrificatoare, SO4-reducătoare, metanogene.
 Transportori specifici de electroni – ferredoxina, rubodoxina, lanțul
respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O2 –
H2O2).
 Sunt bacterii obligat anaerobe sau facultativ anaerobe (dacă pot folosi O2)
 Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent
oxidant extern. Constă în procese de ox-red care realizează numai o oxidare
parţială a substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind substanţe organice.
Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o moleculă mai oxidată (ex.:
fermentare lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc).
Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa O2, dar fără intervenţia acestuia.

Conservarea energiei

O parte din energia eliberată se pierde sub formă de căldură sau poate fi utilizată
direct sub formă de energie electro-chimică (fpm-forta proton motrice) la nivelul
MCP (ex.: rotaţia flagelilor, transport transmembranar) sau stocată în compuşi
chimici macroergici “bogaţi în energie”: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativă
sau fosforilare la nivelul substratului), fosfoenol-piruvat, acetilfosfat şi acetil-CoA.

 În procesele de respiraţie se elimină mai multă energie decât din fermentaţie

(în respirație aerobă dintr-un mol de glucoză - 38 moli ATP, prin fermentaţie
- 2 moli ATP).
9
În procese de fermentare se formează deşeuri rejetate de către celulă.

2.1 Creșterea și multiplicarea bacteriilor. Ciclul celular.

 Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului structurilor bacteriene

ca rezultat al proceselor de sinteză
 Multiplicarea – capacitatea microorganismelor de se autoreproduce, de a
creşterea numărului de celule pe o unitate de suprafaţă sau de volum

- Diviziune binară
- Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)

 Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la

următoarea diviziune

1. Faza C – replicarea ADN

2. Faza G – de latenţă, segregarea cromozomilor
3. Faza D – de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar separarea cromozomilor şi

diviziunea intervin în momentul când celula atinge o lungime – limită.

Viteza de replicație depinde de temperatură și de mediul nutritiv.

 Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de generaţie (TG).

 Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de creştere (condiţii optime –
viteză maximă).

2.2 Cultivarea bacteriilor. Condițiile(principiile) de cultivare(substanțe

nutritive, sursă energetică, apă, temperatura potrivită, pH, oxygen, presiunea
osmotică).

Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare. Se cultivă bacteriile pentru izolarea

lor din medii naturale (prelevate patologice, alimente, apă, etc).

Izolarea bacteriilor se realizează pentru:

1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)

2. Testarea sensibilităţii lor faţă de antibiotice
10
 3. Obţinerea unor produşi de biosinteză (antibiotice, AA), bioconversie
(hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea
vaccinurilor, eubioticelor...

Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii fizico-chimice adecvate.

Condiţiile (principiile) de cultivare

- Sursă nutritivă adecvată

- Sursă de energie
- Apă
- Temperatura potrivită
- pH adecvat
- Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2
- Presiune osmotică adecvată

 Temperatura de creştere

Există temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. În raport

cu temperatura optimă deosebim:

1. Bacterii psichrofile – tº optimă 10-20º C. Cresc şi la 0º C.

2. Bacterii mezofile – optimum 30-37º C (limite 15-45º C)
3. Bacterii termofile – optimum 50-60º C (până la 95º C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70–110º C)

 pH

1. Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5

2. Bacterii acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus)
3. Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

 Presiunea osmotică

1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc în concentraţii reduse de NaCl

(mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) – mi/o patogene
2. Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi,
vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

 Oxigenul

11
1. Bacterii strict aerobe – cresc doar în prezenţa O2 molecular. Obţin energia
prin respiraţie aerobă
2. Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2.
Obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie (Neisseria, Brucella,
Campylobacter)
3. Bacterii strict anaerobe – cresc doar în absenţa O2. Obţin energia prin
fermentaţie sau uneori respiraţie anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2,,
a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le pot
descompune (absenţa catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) –
Clostridium, Bacteroides
4. Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte în prezenţa O2, obţin energia
prin fermentaţie, posedă peroxidază (Lactobacillus, streptococi)
5. Bacterii facultativ anaerobe – cresc în orice condiţii, obţin energia prin
respiraţie sau fermentaţie

2.3 Mediile de cultură pentru bacteriile chemoheterotrofe și cerințele față

de ele.
 Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide care asigură nutrienţii şi
condiţiile fizico-chimice necesare cultivării bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilităţii la antibiotice,
stocarea sau transportul culturilor bacteriene.
 Cerinţele faţă de mediile de cultură
- Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor
- Umiditate optimală
- pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon)
- Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi – rH2>10)
- Să fie izotonice (0,5% NaCl)
- Să fie sterile şi transparente

2.4 Clasificarea mediilor de cultură

 După provenienţă
1. Empirice, naturale. Au la bază produse de origine animală sau vegetală
(sânge, ser, lapte, ouă, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte,
levuri, etc). Compoziţia lor chimică precisă nu poate fi controlată
2. Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia chimică este
cunoscută cu exactitate
3. Semisintetice
 După consistenţă

12
1. Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid
extras din alge roşii, t° topire 80-100°C, solidificare 42°C). Placa
de geloză în cutii Petri este utilizată pentru izolarea culturilor pure, geloza
înclinată (în pantă) – pentru acumularea culturilor pure
3. Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea
activităţii biochimice sau a mobilităţii bacteriilor.
 După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Apă peptonată (apă + 1% peptonă + 0,5% NaCl)
2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă + 0,5% NaCl)
3. Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min
B. Medii complexe
I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care
permit creşterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-
sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)
II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii
fizico-chimice particulare care stimulează creşterea unor specii şi inhibă
creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină - vibrioni,
mediile Ploskirev, SS - Salmonella, Shigella, etc),
Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru
îmbogăţirea florei patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintr-un prelevat
plurimicrobian (ex: materii fecale). Etapă premergătoare însămânţării pe
medii selective.
- Mediul Mueller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit ) – pentru Salmonella
- Mediul Kauffman (mediul Mueller+bilă+verde de briliant) – Salmonella
- Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella
- Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi
- III. Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor
bacteriene în baza activităţii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice,
lipolitice, de oxido-reducere…)
- Sunt construite după următoarea schemă:
- Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)
- Studierea proprietăţilor zaharolitice
13
- Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)
- Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
- Ploskirev / SS agar (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi
biliari+verde de briliant)
- Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-
violete pe Levin) – medii cromogene
- Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi ce conţin soluţii
0,5% de diferite glucide şi indicator.
- Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia bulelor de gaz
(acid şi gaz - AG)
- Studierea proprietăţilor de oxido-reducere
- Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea
sulfitului în sulfura de Bi)
- Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium
diphtheriae (colonii negre)
- Studierea proprietăţilor lipolitice
- Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac
în jurul coloniei
- Studierea proprietăţilor hemolitice
- Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat)
- În cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o zonă clară
- Medii DD multitest
- Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
- Kligler – identic Russel+sulfat de Fe pentru detectarea producerii de H2S
- Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
- Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi
virajul culorii mediului din roşu în galben.
- În pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), în coloană-glucoza
(fermentare).
- Producerea H2S – înnegrirea mediului
IV. Medii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu,
Loewenstein-Jensen –pentru agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi)
V. Medii de transport – destinate transportării sau stocării unui material
(prelevat), care va fi examinat ulterior.
Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerină 30%
- Soluţie tampon-fosfat
- Soluţie NaCl 3%
- Mediul Cary-Blair
14
 - Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) –
pentru anaerobi, neisserii, etc

2.5-2.6 Tehnica de pregătire(tab p 17)

 Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material ce conţine bacterii

(inoculum) se întroduce într-un mediu de cultură (însămânţare, inoculare),
care ulterior va fi incubat în termostat (pentru asigurarea temperaturii
optime).

 În timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o

cultură bacteriană (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un
mediu).

2.7 Manifestarea creșterii și multiplicării bacteriilor în medii lichide și solide.

Coloniile de bacterii, metodele de studiere. Tipurile de colonii și caracteristica
acestora.

Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor

 În mediu lichid

- Turbiditate uniformă

- Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia)

- Formarea unui sediment

la fundul tubului sau pe pereţi

(streptococi, Bacillus anthracis)

 În mediu solid – formarea coloniilor

Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un

grup de celule (UFC - Unitate Formatoare de Colonii) pe suprafaţa unui mediu
solid

 Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util în

identificare)
 Caracteristica coloniilor

Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)

15
Contur (margini) – regulat/neted, ondulat, zimţat, lobat, dantelat, etc

Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată, etc

Formă – circulară, filamentoasă, neregulată

Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc

Densitate – opacă, transparentă, etc

Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă

 Tipurile de colonii

Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase

Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa uscată, rugoasă

Colonii M (mucoase) – mari, bombate, lucioase, caracteristice bacteriilor capsulate

2.8 Noțiuni de specie, cultuă pură și mixtă, tulpină și clonă

 Cultură pură – formată din bacterii de aceeaşi specie (indispensabilă

identificării)
 Cultură mixtă – compusă din bacterii de specii diferite
 Tulpină – populaţie microbiană constituită din descendenţii unei singure
izolări în cultură pură, care va fi studiată ulterior.
 Clonă – populaţie care rezultă din multiplicarea unei singure celule

2.9 Fazele evoluției culturilor periodice de bacterii. Dinamica multiplicării

bacteriilor în cultura continua și discontinue. Importanța practică

Caracterele de cultură ale bacteriilor reprezintă exigenţele nutritive (medii,

temperatură, pH, aerare, etc), timpul apariţiei culturii şi manifestarea creşterii pe
medii lichide şi solide

Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi

În funcţie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone
16
Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor în volum limitat de mediu.
Astfel de culturi sunt obţinute şi utilizate în laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltării unei culturi discontinue

I. Faza de lag (eng. to lag – a întârzia) - faza de adaptare la condiţiile mediului,

bacteriile sunt active metabolic, cresc în dimensiuni, dar nu se divid.

Durata este variabilă (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiţiile mediului, etc

II. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu viteză maximală constantă,

curba evoluează exponenţial. La fiecare diviziune populația bacteriană se dublează.
Bacteriile sunt foarte sensibile la agenţi antimicrobieni (culturi utile pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice).

Durata – 8-10 ore

III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică scade treptat, numărul
celulelor vii rămâne constant mai multe ore.

Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici.

Morfologia bacteriilor este tipică speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru
identificare). Sensibilitatea la agenţii antimicrobieni scade. Durata – 10-12 ore

IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv

17
Cultura continuă – se realizează când mediul de cultură este continuu reînnoit şi
îmbogăţit cu oxigen cu evacuarea unei cantităţi de cultură. Se realizează în
chemostate sau turbidostate, cultura aflându-se permanent în faza exponenţială. Se
utilizează în microbiologia industrială.

În intestin – culturi continue.

Culturi sincrone – culturi în care bacteriile se divid în acelaşi timp

18
 3.1 Metoda bateriologică de diagnostic al bolilor infecțioase. Esența. Scopul

Examenul bacteriologic constă în inocularea (însămânţarea) prelevatelor pe medii

de cultură pentru izolarea culturilor pure de bacterii (tulpini) care vor fi ulterior
identificate, testate la sensibilitate vis-a-vis de antibiotice, eventual conservate.

Examenul bacteriologic constă din câteva etape succesive, de la prelevarea

(recoltarea) probelor biologice până la remiterea rezultatelor.

Faza pre-analitică (responsabilitatea medicului!!!)

 Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele examenului clinic şi

paraclinic). În ordonanţă se fixează identitatea medicului, a pacientului,
scopul analizei, manifestările patologice, data apariţiei, alte date:
imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.
 Prelevarea probelor

- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicării sau/şi din

căile de eliminare ale agentului patogen) şi momentul prelevării

3.2 Prelevate de la pacienți și din mediu ambiant. Regulile de recoltare și

ambalare, condițiile de transportare în laborator. Pregătirea probelor
pentru investigații de laborator
Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi:
- Secreţii rino-faringiene, bronşice
- Spută
- Puroi
- Exsudate, transsudate
- Sânge
- LCR
- Urină, secreţii genitale
- Mase fecale, bilă, suc duodenal
- Bioptate, punctate
- Material cadaveric, etc
Materiale de examinat din mediul extern:
- Apă
- Alimente
- Sol
- Aer
- Lavaje
19
- Vectori, etc
- Modul de prelevare (recoltare)
- În recipiente sterile
- Respectând regulile de autoprotecţie
- La debutul bolii
- Până la administrarea antibioticelor
- Cantitate suficientă
Transportarea
- Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea condiţiilor speciale
după necesitate
- În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- În fişa de însoţire să fie indicată identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura
prelevatului, data, ora prelevării, scopul investigaţiei, ş.a.
3.3 Etapele examenului bacteriologic pentru izolarea culturilor de bacterii
aerobe.
Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a
mirosului, etc) - orientare în diagnostic
După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare,
omogenizare, centrifugare, etc)
Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen,
Loeffler...) – prezenţa mi/o, forma, cantitatea, G+/-.

a) Metode de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Studiul

caracterelor de cultură a bacteriilor. Tipurile de colonii isolate.
Caracterele.
Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule
bacteriene sau dintr-un produs patologic. O colonie separată constituie o
cultură pură.
Tehnici utilizate:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (însămânţare în
striuri paralele, însămânţare în cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii).
2. Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în geloză topită şi răcită la 50º C
(10-1, 10-2,...), apoi turnate în cutii Petri sau eprubete.
Incubare în termostat la 37º C, 18-24 h (în funcţie de TG).
Metode speciale de izolare în culturi pure:
- A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului 80º C – 20 min
- A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabilă a prelevatului cu sol. NaOH
timp de 15 min., neutralizata ulterior cu solutie tampon fosfat

20
 - A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: îmbogăţirea prealabilă a
florei patogene utilizând medii de îmbogăţire
- A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea
prelevatului la animalele de laborator sensibile
b) Acumularea culturii pure

Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)

Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea purităţii

culturii

Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în pantă (înclinată) pentru acumularea

culturii pure

Termostat, 37º C, 18-24 ore

c) Identificarea culturii pure de microorganism aerobe în baza
caracterelor morfologice, tinctoriale, de cultură, enzimatice etc.
Evaluarea rezultatelor, formularea răspunsului.
- Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)
- Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor caractere specifice ale
acestei culturi pentru a o include într-o familie, gen, specie, variantă
Se studiază caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultură
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice
STUDIEREA ACTIVITĂŢII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR
1. Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui, etc)
2. Activitatea proteolitică
- Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat,
peptonizarea laptelui, etc)
- Evidenţierea enzimelor ce intervin în degradarea AA (decarboxilaze,
dezaminaze, desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele finale ale
descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc…

21
- Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de Fe de culoare neagră în
mediile multitest – Kligler, Olkeniţki, etc; utilizarea benzilor de hârtie de
filtru îmbibate cu acetat de Pb care se prind între dopul eprubetei cu BP în
care creşte cultura studiată (formarea sulfurii de Pb înnegreşte hârtia)
- Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) – benzi de hârtie
îmbibate cu acid oxalic. În prezenţa indolului indicatorul virează în roz.
- Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se colorează în albastru.
- Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)
- (cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată – apariţia bulelor de gaz)
- Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei din lanţul
respirator)
- Reactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de hârtie
îmbibate cu reactiv, creioane, etc)
- Oxidarea reactivului – culoare violetă-neagră
- Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
- Oxidazo- : Enterobacteriaceae
- Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% - formarea unui halou
opac în jurul coloniilor
- Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac în jurul coloniilor
(precipitarea acizilor graşi)
- Depistarea hemolizinei – geloză-sânge 5-10% - zonă clară în jurul coloniei
- Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
- Probele sunt incubate la 37º C, 18-24 h
IV etapă – EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI
ELIBERAREA RĂSPUNSULUI
- Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene
cunoscute pentru a găsi asemănări.
Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de
Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibilă la ....,
rezistentă la...
3.4 Particularități de izolare în cultură pură a bacteriilor:
Metode speciale de izolare în culturi pure:
- A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a prelevatului 80º C – 20 min
- A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabilă a prelevatului cu sol. NaOH
timp de 15 min., neutralizata ulterior cu solutie tampon fosfat
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: îmbogăţirea prealabilă a
florei patogene utilizând medii de îmbogăţire
- A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea
prelevatului la animalele de laborator sensibile
22
3.5 Căile și metodele de creare a condiților de anaerobioză, mediile de
cultură special și aparatajul utilizate pentru cultivarea
microorganismelor anaerobe.
Condiţia principală – cultivare în absenţa oxigenului
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100º C, 20 min, răcit,
acoperit cu vazelină; însămânţarea în geloză în coloană)
2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică – utilizarea anaerostatului
- Metoda chimică – în exicator se întroduc substanţe ce fixează oxigenul
(pirogalol+bază); utilizarea gas-pachetelor
- Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi
anaerobilor

3.6 Etapele examenului bacteriologic pentru izolarea culturilor de bacterii

anaerobe.
Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul cu aerul (în seringi, utilizând
medii speciale)
I etapă – ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR
- Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat
- Încălzirea unui tub la 80º C, 20 min – distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37º C, 24-48 h (va avea loc multiplicarea anaerobilor)
II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE
DE ANAEROBI
- Studierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului, descompunerea
bucăţilor de ficat, etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (însămânţarea a 0,1
ml din mediul K-T pe 3 cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv).
Incubarea în anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h
- Metoda Weinberg – diluţii succesive ale culturii în geloză glucozată
lichefiată şi aspirarea în tuburi lungi şi înguste, închise ermetic. Incubarea în
termostat, 24 h
III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopică a coloniilor
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte
- Repicarea în mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure
- Incubarea în termostat, 24 h
3.7 Studiul caracterelor de cultură ale microorganismelor anaerobe isolate.
3.8 Particularități de identificare a culturii de microorganism anaerobe.
Evaluarea rezultatelor, formularea răspunsului
23
 IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI
- Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de
anaerobioză)
V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI
ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

24