1. Identificarea stafilococilor. Hemocultura în diagnosticul infecţiei.

Obiective:
1. Cunoașterea noțiunilor de bacteriemie versus sepsis.
2. Discutarea speciilor bacteriene izolate frecvent din hemocultură.
3. Discutarea particularităţilor hemoculturii.
4. Hemocultura: definiţie, indicaţii, momentul, numărul şi volumul prelevărilor, incubarea şi urmărirea
hemoculturilor, interpretarea rezultatelor.
5. Descrierea etapelor de identificare a stafilococilor.

1. Bacteriemia = prezenţa efemeră a bacteriilor în sânge, urmare a unui pasaj / descărcări unice fără
gravitate particulară.
o tranzitorie – translocare de la nivelul mucoaselor normal colonizate
- după intervenţii terapeutice / exploratorii invazive la nivelul mucoaselor
o intermitentă – descărcare de la nivelul unor focare infecţioase
o continuă – torentul circulator scaldă focarul infecţios (endocardită)

Sepsis = infecţie (în orice parte a corpului) + modificări ale homeostaziei cunoscute sub numele de
sindrom inflamator sistemic (febră, tahicardie, tahipnee, leucocitoză).
Sepsis sever = sepsis + unul sau mai multe disfuncţii de organ (cardio-vasculare, renale, hepatice etc).
Şoc septic = sepsis sever + hipotensiune care nu răspunde la administrarea de lichide în perfuzie.

2. Specii bacteriene izolate frecvent şi cu semnificaţie clinică din hemocultură:

Staphylococcus aureus Enterococi
Bacili gram-negativi fermentativi Haemophilus influenzae tip b
(Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.) Pseudomonas aeruginosa
Streptococi α şi β-hemolitici Bacterii anaerobe
Pneumococi

1
3. Particularităţile hemoculturii:
- numărul mic de bacterii prezente în sânge (efectul bactericid al sângelui)→ ce volum de sânge trebuie
să recoltăm?
- descărcările bacteriene în sânge sunt intermitente → câte probe trebuie să recoltăm? când şi cum ?

4. Definiţia hemoculturii = însămânţarea şi incubarea într-un mediu de cultură adecvat a unei

probe de sânge, în scopul izolării şi identificării bacteriilor pe care le conţine.

Indicaţiile hemoculturii:
- bacteriemii cu mai multe posibile etiologii
- sepsis
- endocardită infecţioasă
- sindrom sugestiv pentru o infecţie sistemică cu bacterii strict patogene: salmonele tifoidice,
Leptospira, Brucella
- sindrom febril de origine neprecizată
- stări febrile după cateterism venos prelungit, dializă peritoneală, etc.
Tehnica hemoculturii:
- prelevarea hemoculturii:
o medii de cultură:
 medii lichide cu valoare nutritivă mare, adecvate pentru creşterea unei game largi de bacterii
 pentru anaerobi: flacoane cu atmosferă anaerobă
 medii difazice: pantă de mediu solid + mediu lichid
 medii pentru sistemele automate de urmărire a hemoculturilor

o volumul prelevărilor
 la adult - 20 ml per probă
 nou-născuţi, sugari şi copii mici – 1-3 ml (concentraţia bacteriilor în sânge este mai mare decât la
adult)
o numărul prelevărilor
 în bacteriemii continue – 2 prelevări
 în bacteriemii intermitente – 3 prelevări în 24 ore, în caz de urgenţă la interval de 30-60 minute
o momentul prelevării
 înaintea instituirii antibioticoterapiei
 cât mai aproape de debutul bolii
 în momentul apariţiei frisoanelor sau în cursul evoluţiei ascendente a curbei febrile
 în bacteriemii continue (endocardita infecţioasă) – oricând în cursul zilei
o tehnica prelevării
 cele 2-3 prelevări trebuie făcute din vene diferite şi de fiecare dată în cel puţin 2 flacoane diferite
 decontaminarea zonei de puncţie → 3 etape: 1) apă şi săpun, 2) alcool iodat, 3) eter – importanţa
uscării tegumentului.
 pregătirea flacoanelor cu medii de cultură – medii preîncălzite la 37ºC ; dezinfecţia membranei de
cauciuc
 recoltăm până la indicatorul de pe flacon / realizăm o diluţie a sângelui în mediul de cultură de aprox.
1/10 pentru a reduce efectul bactericid al sângelui
 agitarea blândă a flaconului
 transportul cât mai rapid la laborator

- incubarea hemoculturilor şi urmărirea lor

o un flacon va fi incubat aerob, iar celălalt anaerob
o urmărire timp de 7 zile cu examinare macroscopică, microscopică şi prin subcultivare
o endocardite infecţioase, pacienţi trataţi cu antibiotice, suspectarea unor microorganisme pretenţioase
nutritiv – urmărire timp de 14-21 de zile
o examenul macroscopic - de 2 ori pe zi în primele 3 zile, apoi zilnic, cu aprecierea semnelor creşterii:
 prezenţa coloniilor sau a unui depozit pe stratul de hematii
 tulburarea mediului
 hemoliza
 coagularea mediului
 prezenţa bulelor de gaz
 colonii pe stratul de geloză al mediilor difazice
o examenul microscopic - frotiuri Gram efectuate din flacoane.
o subcultivarea
 hemocultură cu creştere evidentă – subcultivare pe medii adecvate bacteriei observate la examenul
microscopic, în atmosferă adecvată în funcţie de flaconul în care a apărut creşterea.
 se pot efectua teste de identificare pe cultură primară şi antibiogramă pe cultură primară, ce va trebui
confirmată prin antibiograma standardizată a subculturii.

o identificarea bacteriei izolate

o testarea sensibilităţii la antibiotice

- interpretarea rezultatelor → argumentarea semnificaţiei clinice a bacteriei izolate:

o argumentele bacteriologului:
 izolarea aceleiaşi bacterii în mai multe flacoane ale unui set de hemocultură sau în hemoculturi
repetate din sedii venoase diferite  semnificaţie clinică
 izolarea unor bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acelaşi pacient  contaminare
 izolarea a ≥ 2 specii bacteriene din aceeaşi hemocultură de cel puţin 2 ori în 24 ore  bacteriemie
polimicrobiană
o argumentele clinicianului
 vârsta şi statusul imun al pacientului
 particularităţile focarului septic primar

5. Etapele de identificare ale stafilococilor.

Coci gram pozitivi

Testul catalazei

(+) (-)
Genul Staphylococcus Genul Streptococcus

Testul coagulazei

(+) (-)
S. aureus Stafilococi coagulază negativi
 Testarea sensibilităţii la Novobiocină

R ( < 16 mm) S ( > 16mm)

S. saprophyticus un alt stafilococ
coagulazo-negativ
(spre ex., S. epidermidis)

Identificarea S. aureus

Caractere microscopice: coci gram pozitivi, dispuşi izolat, în perechi, scurte lanţuri, grămezi, imobili,
nesporulaţi.

Caractere de cultivare: colonii S mari, rotunde, bombate, pigmenate diferit (portocaliu, galben, alb).
-pe geloză sânge sunt frecvent hemolitice,
- cresc pe medii cu sare ceea ce permite izolarea din produse patologice contaminate .

Testul catalazei
Principiu: Catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.
Bacteriile care o produc se protejează astfel de efectele letale ale peroxidului de hidrogen apărut ca
metabolit final în metabolismul aerob al carbohidraţilor.
Interpretare: pozitiv :apariţia bulelor de gaz până la efervescenţă
negativ: absenţa bulelor

Pentru S aureus -testul catalazei pozitiv

Testul coagulazei
Principiu peste 96% din tulpinile de S aureus coagulează plasma prin:
-activarea unui factor plasmatic similar trombinei: coagulaza liberă
-acţiunea directă asupra fibrinogenului: coagulaza legată de peretele celular.
Interpretare:
 pentru testul pe lamă pentru coagulaza legată :
pozitiv- aglutinare în 15-20 sec
negativ : absenţa aglutinării în 2-3 minute ( necesită confirmare)
 pentru testul în tub pentru coagulaza liberă:
pozitiv : coagulare , indiferent de gradul ei ( în masă, văl de fibrină)
negativ :absenţa cheagului

Trusa de latex aglutinare pentru identificarea stafilococilor identifică S. aureus prin depistarea: clumping
factor (coagulaza legată), proteina A, polizaharide capsulare.
Control pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC®25923.
Control negativ: Staphylococcus epidermidis ATCC®12228.
 Fig. 1: Identificarea stafilococilor prin latex aglutinare
(https://www.fishersci.co.uk/shop/products/staphytect-plus-latex-agglutination-test/p-6758539)

Legendă: 1 - aglutinare prezentă (S. aureus); 2 - aglutinare absentă (stafilococ coagulază-negativ)

Lizotiparea
Principiu: are la bază fenomenele de lizogenie şi de specificitate a receptorilor faţă de anumiţi
bacteriofagi.
Utilitate- în studiile epidemiologice

În sală se găsesc:
1. 2 seturi de hemoculturi: din ambele flacoane ale unui set am izolat S. aureus / al doilea set =
hemocultură negativă
2. set de transfer
3. frotiuri din hemocultura pozitivă (stafilococi)
4. subcultura pe agar-sânge, din hemocultura pozitivă
5. subcultura pe agar-nutritiv
6. frotiuri din cultură (stafilococi)
7. H2O2, lame de microscop pentru testul catalazei (pozitiv), beţişoare, pipetă
8. testul coagulazei-negativ (+ martor pozitiv şi martor negativ)
9. testul de sensibilitate la novobiocină – pozitiv: S. epidermidis (şi martor negativ)
10. antibiograma difuzimetrică pentru tulpina de testat şi pentru S. aureus ATCC: penicilină, oxacilină,
vancomicină, eritromicină, gentamicină.
11. rigle, tabel cu diametrele zonelor de inhibiţie