Modificări fiziologice, biochimice şi enzimatice induse de plumb la

specia Asplenium scolopendrium L

Abstract. Scopul acestui experiment a fost de a determina modificările fiziologice,

biochimice şi enzimatice induse de plumb la speciaAsplenium scolopendrium L.,
modificări ce ar putea constitui biomarkeri utilizaţi în evaluarea mediului. Dintre
procesele fiziologice au fost analizate fotosinteza şi respiraţia, iar determinările
enzimatice şi biochimice au urmărit activitatea catalazei, concentraţia pigmenţilor
asimilatori, conţinutul de polifenoli, prezenţa Pb în ţesuturi. Substanţa utilizată pentru
încorporarea Pb în sol a fost Pb(C2H3O2)2*3H2O fiind realizate următoarele variante
experimentale: Control= 0 g kg-1 sol, V1=0,2 g kg-1 sol, V2=0,75 g kg-1 sol, V3=1 g kg-
1 sol. Stresul provocat de expunerea la Pb a speciei Asplenium scolopendrium este

compensat prin mecanisme antioxidante: creşterea conţinutului de carotenoizi, a

activităţii catalazei şi a conţinutului total de polifenoli, dar şi prin intensificarea
respiraţiei. Nu s-au înregistrat modificări semnificative în ceea ce priveşte conţinutul
de clorofilă şi activitatea fotosintezei. Răspunsul antioxidant obţinut poate fi utilizat ca
biomarker nespecific pentru evaluarea mediului poluat cu Pb.

Introducere. Prezenţa factorilor de stress în mediu poate induce plantelor

răspunsuri la nivel morfologic, histologic, celular, molecular, enzimatic, biochimic,
fiziologic etc. Aceste modificări măsurabile pot constitui biomarkeri (Depledge, 1994)
ce pot fi validaţi şi utilizaţi în activitatea de biomonitorizare. Determinarea parametrilor
de creştere, a indicatorilor fiziologici şi biochimici fac parte dintre testele de
fitotoxicitate aplicate pentru prezenţa metalelor grele în mediu (Mohan and Hosetti,
1999, Paczkowska et all 2007, Soare et al., 2011), modificarea valorilor acestora în
raport cu mediul lipsit de metale grele constituind biomarkeri nespecifici
(Vangronsveld et al., 2000).
Clorofila are un rol esenţial în fotosinteză, proces care asigură creşterea şi
dezvoltarea plantelor. Modificarea ratei fotosintezei ca urmare a expunerii la un anumit
poluant sau modificarea conţinutului de clorofilă reprezintă potenţiali biomarkeri (Stoltz
and Greger, 2002; Bragato et al., 2006). Popovic et al. (2003) consideră că
fluorescenţa clorofilei a şi b poate fi considerată un biomarker în cazul expunerii la
erbicide şi metale grele (Ayeni et all., 2010). Conform literaturii de specialitate,
respiraţia plantelor terestre este implicată în rezistenţa la metalele grele prin activarea
anumitor enzime, creşterea consumului de energie pentru întreţinerea/reparea
celulelor, sinteza acizilor organici (Vassilev et al. 1997, Greger and Ögren 1991,
Lamoreaux and Chaney, 1978). Metalele grele induc stres oxidativ la nivelul celulelor
şi ţesuturilor prin transferul de electroni, modificarea căilor metabolice, inactivarea
enzimelor (Dietz et al., 1999, Sahw et al., 2004). Plantele deţin mecanisme care au rol
de protecţie împotriva speciilor reactive de oxigen (ROS), ca de ex. sinteza enzimelor
cu rol antioxidant (superoxid dismutaza, catalaza, ascorbat peroxidaza, gluthation
reductaza etc). Acţiune antioxidantă au şi compuşii fenolici datorită rolului lor în
chelarea metalelor dar şi a capacităţii de a înlătura speciile reactive de
oxigen (Michalak, 2006).
Scopul acestui experiment a fost de a determina modificările fiziologice,
biochimice şi enzimatice induse de plumb la speciaAsplenium scolopendrium L.,
modificări ce ar putea constitui biomarkeri utilizaţi în evaluarea mediului. Dintre
procesele fiziologice au fost analizate fotosinteza şi respiraţia, iar determinările
enzimatice şi biochimice au urmărit activitatea catalazei, concentraţia pigmenţilor
asimilatori, conţinutul de polifenoli, prezenţa Pb în ţesuturi.

Materiale şi metode
Materialul biologic utilizat: indivizi maturi de Asplenium scolopendrium L.
colectaţi din Valea Vâlsanului (Argeş County, Romania)(+… GPS) în anul 2014. După
aclimatizarea care s-a realizat timp de 2 luni, plantele au fost transferate în ghivecele
de experienţă.
Solul utilizat pentru experiment a fost de tip Florisol (S.C. Florisol Product
S.R.L.), obţinut prin prelucrare din zăcământul Dersca-Dorohoi, cu următoarele
caracteristici fizico-chimice: substanţă organică în produs uscat-minim 70%, pH 6,5-
7.0, umiditate 60-70%, N: 410 cca, P: 192 ppm, K: 1350 ppm.
Substanţa utilizată pentru încorporarea Pb în sol a fost Pb(C2H3O2)2*3H2O
(XXXX) fiind realizate următoarele variante experimentale: Control= 0 g kg-1 sol,
V1=0,2 g kg-1 sol, V2=0,75 g kg-1 sol, V3=1 g kg-1 sol (referinţă bibliografică ).
Determinarea parametrilor fiziologici s-a realizat cu ajutorul Qubit
systems S151 IRGA Carbon Dioxide (CO2) Analyzer, LabPro Interface, Logger pro
Software. Rata/intensitatea fotosintezei şi respiraţiei au fost exprimate în CO2 în μmol
CO2 m2 s-1.
Determinarea pigmenţilor asimilatori: clorofila a şi b şi a pigmenţilor
carotenoizi s-a realizat spectrofotometric, utilizând formulele lui Holm. Rezultatele
obţinute au fost exprimate în mg g-1 fw.
Determinarea activităţii catalazei din frunze s-a realizat prin titrare cu KMnO4,
rezultale obţinute fiind exprimate în ml KMnO4 g-1 fw.
Conţinutul total de polifenoli din frunze s-a determinat prin
metoda spectrofotometrică, cu reactiv Folin-Ciocâlteu, prin măsurarea absorbanţei la
765 nm (Ortan et al., 2015). Rezultale obţinute au fost exprimate în echivalenti acid
galic/fw.
Determinarea concentraţiei de Pb din sol, din partea subterană şi
supraterană a plantei s-a realizat prin spectrometrie de emisie atomică cu
plasmă cuplată inductiv - ICP-AES, prin masurarea probelor prin metode
dezvoltate in-house. Pentru sol: aproximativ 5 g proba uscata si fin mojarata a fost
partial mineralizata intr-un amestec de acid azotic (67%) : apa distilata 1:1 (10 ml: 10
ml), prin agitare pentru 5 ore. Amestecul a fost filtrat si adus la semn la balon cotat de
100 ml cu apa distilata. For the mineralization of the plant materials a microwave
digestion system Speed wave from Berghof was used. The reagents used were nitric
acid (67% -7 ml) and hydrogen peroxide (3 ml) p.a from Merck for the digestion of the
samples and bi distilled water to bring the volume to volumetric flasks.
Analytical methods. For ICP-AES (inductively coupled plasma atomic
emission spectrometry) analyses was used a Varian, Liberty 110 spectrometer for
quantitative determinations of lead. The wavelength used for the measurement of lead
was 220.353 nm.
UV-Vis analyses were performed using a UV-Vis spectrometer Unicam Helios
α Thermo Orion at the resolution of 1 nm, with 1 nm slit width and automatic scan rate.
The obtained results were processed using specific data analysis software (Origin Pro
8.0).
Experimentul a fost realizat în 3 repetiţii; prelucrarea statistică a rezultatelor s-
a realizat cu ajutorul SPSS program, version 16 iar pentru comparaţia mediilor s-a
utilizat testul Duncan. De asemenea, a fost calculat indicele de corelaţie Pearson.
 Rezultate şi Discuţii
Cantitatea de Pb din sol a fost determinată prin spectrometrie de emisie
atomică cu plasmă cuplată inductiv - ICP-AES, pentru fiecare variantă, la începutul
experimentului, după încorporarea în sol a Pb(C2H3O2)2*3H2O, obţinându-se
următoarele rezultate: Control= 0 mg kg-1, V1=76.25 mg kg-1,V2=332.20 mg kg-
1, V =608.68 mg kg-1 Pb+2.
3
Cantitatea de pigmenţi asimilatori (clorofila a şi b; carotenoizi) a fost
determinată după 4 luni de la iniţierea experimentului.Cantitatea de clorofila a a variat
între 1.05 mg g-1 fw (V2) şi 1.17 mg g-1 fw (V1), cu o valoare de 1.08 mg g-1 fw la
Control. Clorofila b a înregistrat o variaţie între 0.621 mg g-1 fw (V3) şi 0.687 mg g-
1 fw (V ), cu o valoare de 0.69 mg g-1 fw la Control. Indicele de corelaţie Pearson arată
1
o corelaţie negativă între concentraţia de Pb din sol şi conţinutul de clorofilă b (R= -
0.645).
Conform Krupa şi colab. (1996) clorofila şi carotenoizii pot fi utilizaţi cu succes
ca indicatori pentru a determina toxicitatea Pb asupra plantelor
superioare. Cercetările menţionează situaţii în care Pb nu influenţează semnificativ
concentraţia de clorofilă (Rossato et al. 2012; Olivares, 2003), situaţie întâmpinată în
cazul de faţă la variantele cu concentraţii mari de Pb în sol (Fig.1). La cea mai mică
concentraţie, V1, s-a observat o uşoară creştere a conţinutului de
clorofilă a, respectiv b. Acelaşi efect a fost semnalat şi de Shu et al. (2011),
Wiszniewska et al. (2015), Kaznina et al. (2005). Conţinutul de clorofilă a şi b nu a fost
influenţat semnificativ de tratamentul cu Pb la variantele V 2 şi V3
În ceea ce priveşte conţinutul de carotenoizi, la varianta cu cea mai mică
concentraţie de Pb în sol (V1) creşterea a fost mult mai pronunţată faţă de martor (cu
36%)(Fig. 1). Astfel, s-a constatat că Pb induce modificări semnificative ale acestui
parametru. La clorofila a şi la clorofila b, chiar dacă au fost înregistrate modificări,
acestea nu au fost semnificative.
Creşterea concentraţiei carotenoizilor reduce stresul determinat de Pb, aceşti
pigmenţi având rol antioxidant (Patra et al., 2011; Shu et al.,2011, Michalak, 2006).
Rata/Intensitatea fotosintezei. Kalaji şi Loboda (2007) consideră că, deşi
există numeroase lucrări în care este menţionat efectul negativ al metalelor grele
asupra fotosintezei, nu există o regulă clară prin care să se stabilească răspunsul
plantelor la acest tip de stres. Determinările realizate pentru intensitatea fotosintezei
au dus la obţinerea unor valori cuprinse în intervalul 1.27-1.30 μmol CO2 m2 s-1, astfel
încât nu s-au înregistrat diferenţe semnificative între cele patru variante cu Pb în sol
şi Control (Fig. 2). Schwarzauer-Rockett et al. (2013) au constatat că la concentraţiile
de 100 şi 200 mg L-1 Pb(NO3)2 la specia Pueraria montana var. lobata rata
fotosintezei şi concentraţia de clorofila a şi b nu au fost influenţate. Nici la concentraţii
de 10 ori mai mari (1000 şi 2000 mg L-1) Pb nu a influenţat semnificativ conţinutul de
clorofilă a şi b la Robinia pseudoacacia, iar influenţa asupra fotosintezei a fost redusă
(Dezhban şi colab., 2015). Indicele de corelaţie Pearson arată o corelaţie negativă
între concentraţia de Pb din sol şi activitatea fotosintetică (R= -0.652).
Rata/Intensitatea respiraţiei. Dacă în cazul fotosintezei nu au fost obţinute
diferenţe semnificative între variante, pentru respiraţie situaţia a fost total opusă.
Valorile ratei respiraţiei au fost mai mari cu 18% pentru V 1, respectiv cu 26% pentru
V3, faţă de valoarea înregistrată la martor (Fig. 2). Creşterea respiraţiei cu aproximativ
20% la Pisum sativum datorită acţiunii Pb a fost observată de Parys et al. (1998).
Sharma et Dubey (2005) susţin că la concentraţii scăzute Pb stimulează respiraţia,
însă mecanismul de stimulare încă nu este cunoscut. O posibilă explicaţie ar fi nevoia
crescută de ATP rezultat în urma fosforilării oxidative care se acumulează în interiorul
membranei mitocondriale. Respiraţia are un potenţial mare în ceea ce priveşte
capacitatea de compensare a stresului la care sunt supuse plantele, prin consolidarea
sistemului respirator şi a potenţialului energetic al celulelor (Ratushnyak şi colab.
2014) (Vodnik şi colab., 1999). Valoarea 0.794 obţinută pentru indicele de corelaţie
(R) în cazul respiraţiei ne indică, cu o certitudine de 0,01, că există o corelaţie puternic
pozitivă între acest parametru şi concentraţia de Pb din sol.

Activitatea catalazei în frunze. Pb produce stres oxidativ la nivelul plantelor, iar

pentru combaterea acestuia se sintetizează enzime antioxidante care pot elimina
radicalii liberi. Din această categorie face parte şi catalaza, prima enzimă descoperită
şi caracterizată (Mhamdi şi colab., 2010), care descopune H2O2 în H2O şi O2. În Fig.
3 se poate observa o creştere a activităţii catalazei direct proporţională cu
concentraţia de Pb din sol, cea mai mare creştere fiind cu 2.96 unităţi la V3 faţă de
Control; de asemenea există diferenţe semnificative între martor şi V1-3.
Valoarea 0.975 obţinută pentru indicele de corelaţie (R) în cazul catalazei ne indică,
cu o certitudine de 0,01, că există o corelaţie puternic pozitivă între acest parametru
şi concentraţia de Pb din sol. Creşterea activităţii catalazei ca urmare a stresului
determinat de Pb a fost semnalată şi de Shu et al. (2011), Verna et Dubey (2003),
Ravikumar et Thamizhiniyzn (2014), Keser et Saygiderger (2010), Naghavi (2014),
Drăghiceanu et al. (2016). La specia Hibiscus esculentus activitatea catalazei s-a
intensificat ca urma a expunerii la concentraţii de 5, 10, 20, 40 mM Pb 2+ pe o perioadă
de 4 săptămâni (Youssef et Azooz, 2013). Zhu et al. (2012) au studiat efectul Pb
asupra speciei Pteris vittata. Studiile lor au arătat că odată cu creşterea concentraţiei
de Pb (0, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 mg/L) a crescut şi activitatea catalazei, aceasta
atingând maximul la concentraţia de 1000 mg/L (Lin et al., 2015).
Conţinutul de polifenoli din frunze. Un alt mecanism de a combate stresul oxidativ
este creşterea conţinutului de polifenoli care au rol în detoxifiere. Stimularea producţiei
de polifenoli ca urmare a stresului determinat de Pb s-a întâlnit la speciile Tithonia
diversifolia (Olivares, 2003), Spinancea oleracea and Lycopersicum esculentum
(Hameed and all, 2001). În Fig.4 se poate observa că la V1 şi V3 au fost înregistrate
cele mai mari creşteri ale conţinutului de polifenoli, cu 14% respectiv 21% (faţă de
Control), La varianta V2 creşterea a fost cu numai 9% mai mare faţă de Control. Astfel,
nu s-a putut stabili o corelaţie între concentraţia de Pb din frunze şi conţinutul de
polifenoli. Creşterea concentraţiei de polifenoli ca urmare a expunerii la Pb a fost
observată la Albizia procera (Preeti şi Tripathi, 2011) şi la in (Linum) însă fără a exista
diferenţe semnificative între variante (Harangozo et all, 2014).

Conţinutul de Pb din ţesuturi. Determinările privind prezenţa Pb în plantă au arătat

faptul că Pb nu a fost absorbit prin rădăcini ca poi să fie translocat în rizom şi frunze.
Absenţa Pb în ţesuturile plantei, atât din partea subterană (rădăcini şi rizom) cât şi
supraterană (frunze) ar putea fi explicată prin împiedicarea absorţiei acestui metal,
proces influenţat de speciaţie, pH-ul solului, dimensiunea particulelor, schimbul
cationic, suprafaţa rădăcinilor etc. (Pourrut et al., 2011). De asemenea, sistemul
radicular este cel care intră primul în contact cu Pb, iar în cazul în care concentraţia
acestuia nu este distribuită omogen rădăcinile manifestă o tehnică de
evitare, explorând mai puţin zonele care conţin Pb(Whiting et al. 2000). Alte
mecanisme posibile de protecţie, întâlnite la diferite specii, sunt: sinteza de calus care
împiedică pătrunderea Pb în rădăcină, de exemplu la Lemna minor Samardakiewicz
et al. (2012), formarea de plachete la suprafaţa rădăcinilor şi în rizosferă la orezul
cultivat pe solurile cu concentraţii mici sau moderate de Pb (Liu et al 2011),
permeabilitatea selectivă a membranei celulelor rădăcinii care laconcentraţii
mici (932.8 mg/kg) împiedică pătrunderea liberă a metalelor (Atabeyeva, 2016).

Concluzii
Stresul provocat de expunerea la Pb a speciei Asplenium scolopendrium este
compensat prin mecanisme antioxidante: creşterea conţinutului de carotenoizi, a
activităţii catalazei şi a conţinutului total de polifenoli, dar şi prin intensificarea
respiraţiei. Nu s-au înregistrat modificări semnificative în ceea ce priveşte conţinutul
de clorofilă şi activitatea fotosintezei. Răspunsul antioxidant obţinut poate fi utilizat ca
biomarker nespecific pentru evaluarea mediului poluat cu Pb.

Răspunsul antioxidant obţinut poate fi utilizat ca biomarker nespecific pentru

evaluarea impactului Pb asupra plantelor (Asplenium scolopendrium).