DOZAREA PROTEINELOR PRIN METODA BRADFORD

Metoda Bradford este mult mai sensibilă decât metoda Biuretului. Cu ajutorul acestei
metode se pot doza proteine cu o concentraţie cuprinsă între 0,1 – 2 mg/ml.
Principiul metodei. În mediu puternic acid, colorantul Coomassie Brilliant Blue G
(CBBG), se află predominant în formă cationică total protonată, roşie, cu un maxim al
absorbanţei în jurul valorii de 465 nm precum şi în forma de culoare verde cu un maxim al
absorbanţei la 650 nm şi într-o mai mică măsură în forma anionică de culoare albastră cu un
maxim al absorbanţei la 590 nm (Figura 1 şi Figura 2). Dintre formele ionice ale colorantului,
doar forma anionică se leagă la proteine la nivelul resturilor de lizină şi arginină încărcate pozitiv,
formând un complex de culoare albastră. Concomitent cu formarea complexului albastru are loc o
modificare a maximului de absorbţie de la 465 nm la 595 nm (Figura 2). Intensitatea culorii
măsurată la 595 nm este direct proporţională cu cantitatea de proteină din proba de analizat.

Figura 1. Formele ionice ale colorantului CBBG

Figura 2. Modificarea maximului de absorbţie a colorantului CBBG în prezenţa proteinelor de la

465 nm la 595 nm
Reactivi şi soluţii
1. Soluţie standard de albumină serică bovină (BSA) 2 mg/ml preparată extemporaneum
în acelaşi mediu în care s-a efectuat extracţia proteinelor;
2. Reactiv Bradford: 100 mg de colorant CBBG se dizolvă în 50 ml de etanol 95%.
Soluţia alcolică se amestecă cu 100ml de acid fosforic 85% şi se aduce la 1 litru cu
apă distilată;
3. Extract proteic total (EPT);
4. Mediu de extracţie.

Modul de lucru

 se fac diluţii ale EPT a cărei concentraţie în proteine dorim să o determinăm;

 din soluţia stoc de 2 mg/ml BSA se efectuează următoarele diluţii:

Nr μl soluţie μl mediu de Concentraţie D.O.595 nm

eprubetă 2 mg/ml extracţie obţinută
BSA (mg/ml)
1 0 200 0
2 25 175 0,25
3 50 150 0,5
4 75 125 0,75
5 100 100 1
6 125 75 1,25
7 150 50 1,5

 într-o plăcuţă de 96 de godeuri se pipetează în godeuri distincte câte 5 μl din fiecare

probă (constituite din diluţii ale EPT) şi din fiecare etaloan (diluţii ale soluţiei stoc de
BSA din eprubetele 1 – 7) peste care se adaugă 250 μl de reactiv Bradford;
 plăcuţa se agită 30 s şi se lasă în repaus 15 de minute la temperatura camerei;
 la cititorul automat de plăci BioRad 680 se citesc densităţile optice (extincţiile) atât
ale probelor ce conţin EPT, cât şi ale etaloanelor de BSA la o lungime de undă
cuprinsă între 590 – 690 nm;
 se trasează o curbă etalon notând pe abscisă concentraţia proteică în mg/ml iar pe
ordonată valorile D.O.570 nm corespunzătoare etaloanelor de BSA;
 cu ajutorul curbei etalon se transformă unităţiile de D.O.595 nm obţinute pentru
diluţiile EPT în valori de concentraţie (mg/ml) şi se îmulţesc cu factorul de diluţie
corespunzător.