Curs 10.

Lipaze: biosinteză și
metode de izolare și purificare
 Inductori şi inhibitori ai enzimelor lipolitice

• Utilizarea tributerinei, a uleiului de soia şi de floarea soarelui, în calitate de inductori ai activităţii lipolitice,
sporesc acest indice la tulpinile de Pseudomonas sp CNM-PsB-01 cu 98%, iar la Pseudomonas sp CNM-
PsB-02 cu 55%.
• Sărurile de Cu2+, Fe2+, Zn2+ sunt stimulatori cât şi ca inhibitori ai bosintezei lipazelor - rezultate pozitive au fost
obţinute la folosirea sărurilor de Cu2+, Fe2+, Zn2+, în calitate de stimulatori, la cultivarea tulpinii Candida
paralipolytica 739.
• Stimulatori ai biosintezei enzimatice sunt şi unii cationi, dar şi unii anioni. Activitatea crescută a lipazelor, atunci
când sunt adăugaţi în mediul nutritiv ioni de Ca2+, s-a dovedit a fi rezultatul legării acizilor graşi cu ionii de
Ca2+.
• S-a stabilit că ionii de Mg2+, Cu2+, Co2+, Zn2+ manifestă efect inhibitor asupra biosintezei lipazelor în cazul
cultivării tulpinii Pseudomonas fluorescens 2D, în timp ce ionii Mg2+, Ca2+ stimulează biosinteza enzimatică a
tulpinii.
• Efectulul stimulator al ionilor de Ca2+ s-a demonstrat şi în cazul culturilor de Candida cylindracea.
 Influenţa parametrilor de cultivare asupra biosintezei
lipazelor - Influenţa temperaturii de cultivare

• Pseudomonas - temperatura optimă - în general, 20-30°C.

- Pseudomonas mephitica var. lipolytica producţia maximă de lipază s-a observat la 37°
- Pseudomonas fragi randamentul maxim în lipază s-a obţinut menţinând cultura timp de 3 zile la 15°C, la 30°C
neobservâdu-se activitate lipazică.
• În cazul culturilor de Geothricum candidum si Rhizopus nigricans randamentele maxime în lipază s-au
înregistrat la 30°C, iar la Penicillium roqueforti temperatura optimă a fost de 27°C.
• Tulpina bacteriană termofilică Bacillus coagulans BTS-3 produce lipaze alcaline extracelulare cu activitate
maximă la 55°C şi pH = 8.5, şi stabilă la pH = 8.0-10.5 şi la temperaturi ridicate de 70°C. Enzima s-a dovedit a
fi inhibată de ioni de Al3+, Co2+, Mn2+ Zn2+, pe când K+, Fe3+ Hg2+, şi Mg2+ activează activitatea lipolitică.
• S-a observat că lipazele bacteriene sunt inhibate de prezenţa proteazelor sintetizate simultan în mediu, atunci
când Pseudomonas fluorescens este crescută la temperaturi ridicate de 30-40°C.
• Întervalul 22-35°C - optim pentru producerea de lipaze de către A. wentii, M. heimalis, R. nigricans, Mucor
racemosus R. oligosporus si Pseudomonas aeruginosa.
 Influenţa pH-ului mediului de cultură

• În funcţie de pH-ul optim de activitate al enzimei, s-au găsit următoarele tipuri de lipaze produse de diferite
microorganisme:
- lipaze active la pH = 5,5,
- lipaze active la pH = 7,5,
- lipaze active la pH = 5,5 si 7,5,
- lipaze alcaline, active la pH > 9.
Majoritatea tulpinilor microbiene produc lipaze active la pH-uri cuprinse între 5-8, dar o importanţă deosebită a fost acordată
în ultimul timp enzimelor produse de microorganisme alcalofile care au aplicaţii importante în industria detergenţilor. O asfel
de tulpină microbiană este cea de Pseudomonas SD 705, care produce lipaza activa la pH 10-11 si 55-650C
• Maximul activităţii lipolitice la pH > 7,0 pentru Pseudomonas fragi şi la pH = 9,0 pentru Pseudomonas aeruginosa.
• Maximul creşterii activităţii lipolitice la pH acid (4,0 - 7,0) la S. lipolytica, M. caseolyticus, B. licheniformis, A. wentii, M.
hiemalis, R. nigricans., Mucor racemosus, R. oligosporus şi P. aeruginosa EF2.
• pH-ul optim pentru lipaza produsă de Calvatia gigantea este 7, iar temperatura optimă de acţiune a fost 300C.
 Influenţa aerării mediului de cultură
Cercetările au evidenţiat creşterea producţiei de lipază în cazul culturilor aerate, pentru majoritatea microorganismelor
producătoare de lipază, însă gradul de aerare necesar pare să difere de la o specie la alta.
• În cazul lipazei din Mucor mucedo, activitatea lipazei pentru culturi în flacoane agitate a fost mai mare cu 40% decât
în cazul celor neagitate.
• Efectul aerării nu este însă întotdeauna pozitiv asupra productiei de lipază - în cazul culturilor de Pseudomonas
fragi, aerarea intensă determină reducerea activităţii lipazice.
• În cazul microorganismelor Candida lipolytica, Pseudomonas fragi şi Pseudomonas fluorescens s-a observat că,
utilizând culturi agitate, se obţine iniţial o creştere pronunţată a celulelor şi a producţiei de lipază, urmată însă de o
scădere rapidă a activităţii lipazice, în cazul continuării agitării.

Metode de izolare şi purificare a proteinelor enzimatice cu activitate lipolitică

fracţionarea cu sulfat de amoniu, precipitarea cu acetonă, gel-filtrarea,

cromatografia de schimb ionic, cromatografia de afinitate
 Fracţionarea cu sulfat de amoniu

• Fracţionarea cu sulfat de amoniu - prima treaptă de prelucrare post-biosinteză a mediilor de fermentaţie

conţinând lipaze de origine microbiană, indiferent de tulpina producătoare.
= modificarea diferenţiată a solubilităţii acestor proteine enzimatice faţă de a altor proteine de balast, în
funcţie de concentraţia de sulfat de amoniu.
• Solubilitatea unei proteine crește cu concentraţia unei sări neutre (salting-in) și atinge o valoare maximă,
după care scade treptat, până când precipită din soluţie (salting-out). Fiecare proteină precipită la o
anumită concentraţie dintr-o sare - este posibilă precipitarea fracţionată, treptată, a proteinelor dintr-un
amestec şi deci separarea lor.
• Între solubilitatea S şi tăria ionică μ a unei soluţii saline, există relaţia matematică:

unde Ks este constanta de precipitare,

caracteristică pentru o anumită proteină şi pentru
log S = β - Ks ∙ μ
o sare neutră cu care a fost realizată
precipitarea.
 Fracţionarea cu sulfat de amoniu
• Relaţia poate fi reprezentată grafic într-un sistem de axe rectangulare, pe ordonata indicând log S (solubiltate), iar pe
abscisă, tăria ionică μ.
• Se obţin drepte a căror pante permit calcularea valorii Ks şi care intersectează ordonata într-un punct egal cu β. Pentru
aceeaşi proteină P şi pentru aceeaşi sare S se obţin drepte paralele, în funcţie de pH şi temperatura la care are loc
precipitarea.
• De aceea, în experimentele de precipitare fracţionată este necesară menţinerea constantă a pH-ului şi temperaturii.

Variaţia solubilităţii unei proteine P într-o soluţie

salină, în funcţie de tăria ionică
 Fracţionarea cu sulfat de amoniu

Precipitarea proteinelor cu ajutorul concentraţiior mari de sare se datorează faptului că ionii sării îndepartează mare
parte din moleculele de apă care în mod obişnuit hidratează suprafaţa proteinelor, fenomen care conduce în final la
precipitarea acestora din soluţie.
Fenomenul de precipitare este reversibil. Prin reluarea precipitatului într-un volum limitat de apă, aceasta se re-dizolvă -
semn că nu a fost alterată structura terţiară a macromoleculei proteice.
Pentru ca o sare neutră să fie utilizată ca agent de precipitare fracţionată a unui amestec de mai multe proteine,
aceasta trebuie să îndeplinească urmatoarele condiţii:
• să prezinte o mare solubilitate în apă, pentru a permite obţinerea unei game largi de concentraţii la care să precipite
diferenţiat proteinele din amestec;
• prin dizolvarea sării în mediul apos să nu aibă loc procese exoterme, care pot termo-denatura proteinele sau provocă
variaţii de pH;
• sarea nu trebuie să interacţioneze chimic cu proteina, astfel încât să poată fi uşor separată ulterior din precipitatele
proteice
Sarea care corespunde cel mai bine condiţiilor sus-menţionate este sulfatul de amoniu, care, este cel mai des utilizat
agent de precipitare fracţionată în chimia proteinelor. Este o sare deosebit de solubilă (70,6 g la 100 ml, la 0°C) care, în
plus, manifestă un efect protector asupra multor enzime. Utilizarea sulfatului de amoniu prezintă şi unele dezavantaje:
interferă în dozarea proteinelor prin metoda Lowry, iar prin solubilizare, au loc mici variaţii de temperatură şi de pH.
 Fracţionarea cu solvenţi organici

• Solvenţii organici - acetona, metanolul, etanolul, cloroformul etc. - sunt agenţi de precipitare a proteinelor
aflate în soluţie apoasă datorită efectului lor de micşorare a constantei dielectrice a mediului.
• Moleculele proteice = polielectroliţi = solubile în mediul apos; apa are o constantă dielectrică mare
(aproximativ 80) și micşorează forţele de atracţie dintre sarcinile de semn opus de la suprafaţa
moleculelor proteice.
• Adăugând treptat un solvent organic cu constanta dielectrică mai mică decât a apei:
- constanta dielectrică a mediului scade,
- forţa de atracţie dintre moleculele proteice creşte în mod corespunzător,
- acestea se agregă prin interacţii electrostatice şi
- precipită din soluţie.
 Fracţionarea cu solvenţi organici
• În cazul particular al unui amestec de mai multe specii moleculare proteice diferite, cu încărcare electrică şi o distribuţie a
sarcinilor la suprafaţa structurilor tridimensionale distincte, precipitarea lor se va realiza diferenţiat la diferite constante
dielectrice ale mediului şi deci la diferite concentraţii procentuale ale solventului organic utilizat.
• Crescând treptat concentraţia solventului organic în amestecul proteic multicomponent, proteinele vor precipita pe rând,
fiind posibilă separarea lor.
• Dacă sarcina electrică a două proteine este similară, ele vor precipita la aceeaşi concentraţie în solvent şi deci nu va fi
posibilă separarea lor.
• În această situaţie, prin modificarea pH-ului sau/şi a tăriei ionice a mediului se pot realiza diferenţieri în sarcina electrică
globală a proteinelor din amestec şi deci precipitări fracţionate.
• Acţiunea precipitantă a solvenţilor organici este realizată nu numai prin scăderea constantei dielectrice a mediului, ci şi prin
efectul deshidratant asupra moleculelor proteice.
• Moleculele solventului organic interacţionează cu moleculele apei care hidratează macromoleculele proteice prin interacţii
ion-dipol.
• Deoarece interacţia moleculelor de solvent organic cu apa este exotermă, toate operaţiunile de precipitare se efectuează la
temperaturi scazute, sub 0°C.
 Purificarea prin cromatografie de schimb ionic

• Separarea proteinelor prin cromatografie de schimb ionic se bazează pe proprietatea acestora de polielectroliţi
amfoteri, care se pot fixa, prin legături electrostatice şi reversibile de orice schimbător de ioni.
• Schimbătorii de ioni sunt substanţe alcătuite dintr-o matrice hidrofobă, insolubilă în majoritatea solvenţilor, de care sunt
legate grupări ionizate, ce pot da reacţii de schimb ionic cu alţi ioni cu care vin în contact.
• Proteinele fixate reversibil pe schimbătorii de ioni pot fi dezlocuite apoi, tot în urma unor reacţii de schimb ionic, de alţi
ioni, proveniţi din soluţii de electroliţi mai puternici.
• În practica cromatografică există două tipuri de schimbători de ioni: schimbători sintetici (răşini schimbătoare de ioni) şi
schimbători naturali (celuloza şi dextran).
• Schimbătorii de ioni sintetici sunt constituiţi din două părţi:
- o parte hidrofobă, reprezentată de matrice, care este o reţea tridimensională, elastică, fixă, insolubilă în majoritatea
solvenţilor şi inertă chimic,
- o parte hidrofilă, reprezentată de grupări ionizate legate chimic de matrice, ioni activi, mobili care reacţionează chimic.
Dacă o particulă a unui astfel de schimbător de ioni este pusă în contact cu o soluţie apoasă ce conţine ioni, se va
realiza un schimb ionic, astfel că ionii din soluţie vor înlocui ionii mobili din răşină.
 Purificarea prin cromatografie de schimb ionic

• În funcţie de natura grupărilor ionizate ataşate de matrice, schimbătorii de ioni se împart în doua clase:
schimbători de cationi (cationiţi) şi schimbători de anioni (anioniţi).
• Datorită proprietăţilor fizice şi chimice remarcabile răşinile pe bază de vinilbenzen prezintă o serie de
avantaje: sunt insolubile în acizi, baze şi săruri concentrate, sunt rezistente la oxidare, reducere şi radiaţii, au
o înaltă capacitate de schimb (matricea prezintă multe grupări ionice funcţionale).
• Natura schimbătorului de ioni este determinată de natura chimică a grupării ionice fixată pe matrice, astfel,
dacă aceste grupări sunt acizi sau baze puternic ionizate, se obţin schimbători puternic acizi sau bazici, iar
dacă aceste grupări sunt slab ionizate schimbătorii obţinuti sunt slab acizi sau slab bazici.
• În urma copolimerizării acidului metacrilic cu divinilbenzenul se poate de asemenea obţine un alt tip de
schimbator de ioni slab acid.
• Identificarea schimbătorilor de ioni se face pe baza denumirii comerciale, formulei chimice, mărimii
particulelor, gradului de a forma reţea, capacităţii şi naturii ionice a răşinii.
 R.SO-3H+ Cationit puternic acid
Se disting patru tipuri de schimători de ioni:
R’.COO-Na+ Cationit slab acid

Mărimea particulelor unui schimbator de ioni variază R.CH2N+(CH3)Cl- Anionit puternic bazic
de la 1μ la câţiva mm şi se exprimă prin termenul
mesh: (R.NHX2)+Cl- Anionit slab bazic

mesh 16-20 20-50 50-100 100-200 200-400

μ 1168-840 840-297 297-149 149-74 74-38

Pentru procedeele „batch” şi pentru operaţii generale de cromatografie pe coloane se recomandă schimbătorii cu
particule de 100-200 mesh. Particulele cu un diametrul mai mic de 100 mesh se recomandă pentru operaţii pe scară
largă – staţionări rapide şi viteze de eluţie foarte mari. În scopul fracţionării cu putere mare de rezoluţie se recomandă
schimbători de ioni cu particule de 200 - 400 mesh.
Procentajul în divinilbenzen (% DVB) dintr-o răşină se exprimă prin simbolul X urmat de un număr (Amberlite IR-120 X 8
= copolimer cu 8% DVB). Identificarea ionului de schimb trebuie facută înaintea utilizării lui. Schimbătorul poate fi
complet transformat de la o formă ionică necunoscută la o formă cunoscută prin simpla spălare cu o soluţie salină
adecvată. Cationitii sunt ţinuti numai în formele H+ sau Na+, iar anioniţii în forma Cl-. Pe ambalajul unui schimbător de
ioni sunt trecute o serie de date:
 Schimbători de ioni

• Amberlite IRA-400 X 8
• 200-400 mesh
• forma Cl-
• RN(CH3)3+ Cl-
• La schimbătorii de ioni s-a constatat apariţia unui fenomen denumit efect de cernere ionică. Acesta apare în cazul când
porii răşinii sunt de trei ori mai mari decât diametrul ionului. Din această cauză răşinile schimbătoare de ioni nu pot fi
utilizate pentru separarea macromoleculelor mari (peste 500).
• Substanţele cu mase moleculare mari (proteine, acizi nucleici) pot fi separate cromatografic folosind schimbători de ioni
pe bază de dextran şi de celuloză, la care distanţele între situsurile de schimb sunt mai mari, ceea ce scade
probabilitatea formării de legături multiple între macromolecula şi schimbător.
• Datorită mărimii porilor, a suprafeţei mari, a numărului mic de situsuri de schimb şi naturii hidrofile, schimbătorii de ioni
pe bază de dextran şi celuloză sunt cele mai indicate pentru separarea cromatografică a macromoleculelor.
• Proprietăţile schimbătorilor de ioni (afinitate, capacitate de reţinere, rezistenţă mecanică) variază în funcţie de sursa şi
de procedeul de fabricaţie al acestora.
 Schimbători de ioni celulozici

Schimbător de ioni Grupare ionizabilă mechiv./g

ANIONIŢI
AE-celuloză Aminoetil- O CH2 CH2 NH2 0,3-1,0
DEAE-celuloză Dietilaminoetil- O CH2 CH2 N(C2H5)2
0,1-1,1
O CH2 CH2 N(C 2H5)2X
TEAE-celuloză Trietilaminoetil- 0,5-1,0
GE-celuloză Guanidoetil- O CH2 CH2 NH C NH2
0,2-0,5
PAB-celuloză p-aminobenzil O CH2 NH2
NH

Trietanolamină cuplată cu celuloză prin punţi gliceril şi poligliceril

ECTEOLA-celuloză 0,1-0,5
BD-celuloză DEAE-celuloză benzoilată 0,8
BND-celuloză DEAE-celuloză benzoilată şi naftoilată 0,8
Polietilenimină adsorbită pe celuloză sau celuloză slab fosforilată
PEI-celuloză 0,1
CATIONIŢI
CM-celuloză Carboximetil- O CH2 COOH 0,5-1,0
P-celuloză Fosfat O PO3H2 0,7-7,4
SE-celuloză Sulfoetil O CH2 CH2 SO3H 0,2-0,3
 Schimbători de ioni
• Între schimbătorii de ioni celulozici şi polielectroliţi se stabilesc legături de tip electrostatic, care disociază și
se refac continuu datorită prezenței ionilor de sare care concurează şi ei pentru situsurile lor de sorbţie.
• Creşterea concentraţiei saline măreşte şansa ionilor de sare de a ajunge la situsurile de sorbţie, de a câştiga
competiţia cu substanţa de separat – cea din urmă fiind desorbită datorită disocierii simultane a tuturor
legăturilor care o ţin legată de stratul cromatografic. Cu cât concentraţia salină este mai mare, cu atât zona
cromatografică va migra mai repede. În cursul acestei eluţii au loc sorbţii şi desorbţii multiple.
• Desorbţia se poate realiza prin două procedee: în gradient şi în trepte.
• Gradientul trebuie să prezinte o pantă suficient de lină pentru a permite separarea componentelor suficient de
abruptă pentru a împiedica lăţirea picurilor.
• Pentru a obţine o rezoluţie maximă, panta gradientului trebuie să permită atingerea gradientului de sorbţie pe
toată lungimea coloanei. În cazul eluţiei în trepte, coloana este eluată cu mai multe soluţii cu putere de eluţie
crescândă.
• Acest procedeu prezintă dezavantajul că nu permite atingerea unui echilibru de sorbţie, astfel că într-un pic
pot fi eluate două sau mai multe componente, corespunzator intervalului în care a fost crescută puterea de
eluţie.
 Purificarea prin cromatografie de afinitate
• Cromatografia de afinitate = metodă biospecifică de separare a biomoleculelor dintr-un amestec ce se bazează
pe diferenţele caracteristicilor funcţionale ale componentelor ce urmează sa fie separate, prin folosirea unor
interacţiuni specifice între suportul afin şi componentul de separat.

• Ca suporturi pentru cromatografia de afinitate se folosesc diferiţi adsorbanţi modificaţi în mod special prin
fixarea unor liganzi (de exemplu inhibitori, coenzime), faţă de care enzima manifestă forţe de interacţiune
specifice, numite şi forţe de afinitate (legături de hidrogen, interacţiuni polare) care stau la baza funcţiei
biologice a enzimei.

• Desorbţia enzimei de pe suportul afin se realizează prin modificarea condiţiilor experimentale folosite la
absorbţie, de exemplu utilizând ca eluant o soluţie conţinând substratul, sau un inhibitor al enzimei, sau
crescând concentraţia de electrolit.

• Suporturile afine, reprezentând faza staţionară în cromatografia de afinitate, se obţin în mod obisnuit prin
imobilizarea pe un suport inert a unui compus (ligand) capabil să interacţioneze cu componentul ce urmează a
fi separat dintr-un amestec.
 Purificarea prin cromatografie de afinitate
• Compusul imobilizat poate fi apoi utilizat ca sorbent selectiv pentru molecula complementară. Factorul care
controlează separarea compuşilor în cromatografia de afinitate este faza staţionară.
• Există o multitudine de tipuri de liganzi de afinitate, care pot fi clasificaţi în următoarele două categorii:
− liganzi înalt specifici – sunt compuşi care leagă numai una, sau câteva molecule foarte apropiate ca structură;
− liganzi generali – sunt molecule care leagă o familie sau clasă de molecule înrudite structural.

• Macromoleculele des folosite ca suporturi solide: albumina serică bovină, acidul glicoproteic, cheratina,
colagenul, amiloza - tris (3,5 dimetilcarbonat).
În general, obţinerea unui suport afin se realizează prin următoarea succesiune de etape:
1) preparea suportului de baza;
2) activarea suportului de baza;
3) cuplarea liganzilor afini pe suportul activat
 Purificarea prin cromatografie de afinitate

Un suport ideal pentru cromatografia de afinitate trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

• structură poroasă corespunzatoare şi rezistenţă mecanică adecvată pentru a permite fluxuri de
presiune ridicată sau scăzută;
• grupe reactive disponibile (cum ar fi -OH, -NH2, -SH, -COOH) pentru cuplarea mai departe de
braţe („spacer”) sau liganzi;
• stabilitate chimică şi fizică în condiţii dure, temperatură ridicată sau sterilizare chimică, dacă este
cazul;
• o suprafaţă hidrofilă pentru acoperirea înaltă a activităţii proteice.
Obţinerea suportului afin se realizează prin imobilizarea moleculelor de ligand pe un suport de bază.
 Suporturi afine utilizate în cromatografie-Proprietăţile
suporturilor afine
Un suport ideal pentru cromatografia de afinitate trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
• să fie complet insolubil în H2O, dar în acelaşi timp să posede o capacitate bună de umectare şi imbibare;
• să posede o reţea tridimensională suficient de largă, care să permită şi moleculelor mai mari accesul
nestingherit la efectorul imobilizat situat în interiorul reţelei tridimensionale a suportului;
• să fie inert, adică să nu prezinte interacţiuni nespecifice cu substanţele ce urmează a fi separate, dar mai ales
să nu posede fracţiuni schimbătoare de ioni;
• să fie chimic stabil faţă de diferitele condiţii de cuplare si eluare, adică să reziste la un domeniu de pH cuprins
între 2 si 12, la variaţii de tărie ionică şi la acţiunea unor denaturanţi cum sunt: ureea, clorhidratul de
guanidină;
• să dispună de grupări funcţionale care să permită legarea covalentă a efectorului, grupări care să fie
suficiente ca număr şi situate de preferinţă la capătul unor braţe suficient de lungi pentru a evita orice
incomodare sterică între partenerul său afin;
• să posede proprietăţi mecanice bune - dimensiune, formă şi grad de compresiune al particulelor sale să
permită – încărcat în coloana cromatografică – viteze bune de curgere, condiţii care sunt asigurate de un
suport cu particule uniforme, de preferinţă sferice şi în acelaşi timp rigide.
 Tipuri de suporturi

Derivaţii dextranului
• Derivaţii dextranului reticulat (Sephadex) posedă majoritatea proprietăţilor unui bun suport pentru
cromatografia de afinitate, cu excepţia gradului de porozitate. Din acest motiv, derivaţii dextranului nu se
recomandă ca suport pentru purificarea de enzime.
Derivaţii agarozei
• comercializaţi de firma Pharmacia Upsala sub diverse denumiri (Sepharose 2B, 6B, CH-Sepharose 4B, Br-
CN-Sepharose 4B) sau de firma BIO-RAD California (biogeluri), care posedă aproape toate proprietăţile unui
suport ideal. Din această categorie fac parte şi gelurile perlate de agaroză, cu sau fără braţe laterale.
• Gelurile perlate ale agarozei au reţeaua deosebit de largă şi permit difuzia nestingherită prin matricea gelului,
chiar şi a unor molecule cu greutăţi moleculare ce depasesc 106 Da.
 Tipuri de suporturi
Gelurile de poliacrilamidă
• Poliacrilamida, datorită solubilităţii mari în apă şi în soluţii de electroliţi, precum şi a masei moleculare extrem
de mari cu care se poate obţine, se utilizează pentru destabilizarea sistemelor disperse apoase prin floculare,
ca aditiv pentru pasta de hârtie, pentru modificarea şi prelucrarea fibrelor textile, în industria alimentară,
pentru stabilizarea şi îngroşarea dispersiilor, în medicina, cosmetică, etc.
• Copolimerii obtinuţi prin copolimelizarea cu comonomeri bifuncţionali ca de exemplu N, N’ –
metilenbisacrilamida sau polifuncţionali, folosiţi ca agenţi de reticulare, se utilizează ca stabilizatori pentru:
- polimerizarea în emulsie,
- la îngroşarea pastelor şi cernelurilor tipografice,
- la fracţionarea polimerilor solubili în apă prin cromatografie de penetraţie în gel,
- la fracţionarea polimerilor solubili în apă prin electroforeza pe gel de poliacrilamidă sau de poliacrilamidă
dodecilsulfat de sodiu,
- ca suporturi pentru imobilizarea enzimelor sau a altor proteine, etc.
 Tipuri de suporturi
Colagenul cu unitatea structurală de bază tropocolagenul, care poate fi extras din colagenul matur al
ţesuturilor conjunctive tinere. Compoziţia în aminoacizi este caracteristică, predominând glicina şi prolina. În
plus, o parte din prolină şi lizină este hidrolizată şi unităti glucidice se combină cu hidroxilizine.
• Tropocolagenul este format din trei catene polipeptidice, fiecare în formă de spirală foarte alungită,
stabilizată nu prin legaturi de hidrogen intracatenare, ci prin respingeri slabe ale resturilor ciclice de
proline.
• Colagenul prezintă o serie de proprietăţi care îl fac un biomaterial adecvat pentru imobilizarea enzimelor
sau a celulelor microbiene:
- suport relativ ieftin şi accesibil, fiind cea mai abundentă proteină din constituţia vertebratelor animale,
funcţia ei principală „in vivo” fiind structurală, de a susţine celulele în ţesuturi.
- poate fi izolat uşor din numeroase surse biologice şi reconsituit în forme diferite (membrane), fără să-şi
piardă structura nativă.
- Există deja în lume o tehnologie bine dezvoltată pentru extragerea şi prelucrarea colagenului sub formă de
membrane, utilizabile ca înveliş comestibil, cu aplicaţii în industria alimentară şi farmaceutică.
• Colagenul are o structură internă deschisă, conţinând un număr de situsuri de legare, favorabile
fixării enzimelor.
• Grupele funcţionale terminale sau din catenele laterale ale resturilor de aminoacizi polari şi nepolari
din compoziţia colagenului, pot interacţiona cu moleculele enzimatice, prin legaturi ionice, legături
de hidrogen şi forte Van der Waals.
• Accesul enzimei la situsurile de legare ale colagenului este facilitată de caracterul hidrofil al
acestuia. La pH neutru el poate absorbi apa la un nivel de 100% din greutatea sa uscată; la pH-uri
acide sau bazice capacitatea de absorbţie a apei poate creşte la 500%. Această proprietate asigură
mediul apos adecvat pentru enzima legată, micşorând rezistenţa interioară la transport în procesul
de difuzie al substratului şi al produşilor reacţiei enzimatice.
• Natura proteică hidrofilă a suportului matriceal are un efect de stabilizare asupra enzimei conjugate.
• O altă proprietate importantă a colagenului este structura sa fibroasă, care îl face adecvat, din
punct de vedere al rezistenţei şi formei, pentru imobilizarea enzimelor. O dispersie microfibrilară de
colagen poate fi folosită pentru a prepara complexe colagen-enzimă sub formă de membrane. Se
cunosc multe enzime care „in vivo” sunt localizate pe sau în variate structuri membranare ale
celulei. Enzimele ataşate la un material membranar de origine biologică cum este colagenul, pot
constitui un model de sistem real de studiere „in vivo” a reacţiilor enzimatice, precum şi în
construirea diferitelor tipuri de reactoare biochimice.
 METODE DE DOZARE A ACTIVITĂŢII LIPAZELOR

Măsurarea vitezei reacţiilor enzimatice

• O reacţie enzimatică poate fi pusă în evidenţă prin consumarea substratului sau prin apariţia
produsului de reacţie. Viteza unei reacţii enzimatice creşte proporţional numai în cursul primelor
minute de reacţie, după care scade, rămâne constantă, sau creşte neproporţional.
• Aceste abateri pot fi datorate:
- scăderii gradului de saturaţie a enzimei în substrat,
- deplasării echilibrului de reacţie,
- instabilităţii enzimei, inhibiţiei prin produsul final etc.
Pentru aceste motive, se recomandă determinarea vitezei iniţiale a reacţiei, care se realizează
indirect prin calcularea acestui parametru dintr-o curbă care redă variaţia vitezei în timp.
 METODE DE DOZARE A ACTIVITĂŢII LIPAZELOR
Măsurarea vitezei reacţiilor enzimatice
• Pentru a asigura acurateţea rezultatelor, toate soluţiile componente ale amestecului de reacţie trebuie
termostatate la temperatura de lucru, iar reacţia enzimatică trebuie să fie condusă într-o baie
termostat, reglată la această temperatură. Prepararea tuturor reactivilor în soluţii tampon
preîntâmpină orice modificare a pH-ului, ce poate apărea în cursul reacţiei enzimatice, efect ce
conduce la rezultate eronate.
• Metodele de măsurare ale vitezei enzimatice sunt de două feluri: continue şi discontinue.
• Principiul care stă la baza metodelor continue este următorul: enzima şi substratul sunt amestecaţi şi
este urmărită continuu sau periodic o funcţie dependentă de concentraţia produsului sau substratului -
ca de exemplu absorbanţa sau presiunea unui gaz.
• În cazul metodelor discontinue, se recoltează probe din amestecul de reacţie, la diferite intervale de
timp, se stopează reacţia enzimatică cu un agent de precipitare a proteinelor (de exemplu, soluţii de
acid tricloracetic) şi se dozează cantitativ componentul consumat sau eliberat în cursul reacţiei.
• Fiecare probă în care se determină activitatea unei anumite enzime, trebuie însoţită de un martor,
care în general conţine toţi reactivii, cu excepţia enzimei sau mai corect toţi reactivii şi enzima
inactivată.
 Metoda titrimetrică

• Când în cursul reacţiilor enzimatice se formează sau se consumă acizi sau baze şi când se formează
un acid sau o bază mai tare decât substratul, viteza acestor procese poate fi urmărită titrimetric.
• Concentraţia în ioni de hidrogen este menţinută constantă pentru a asigura pH - ul optim de acţiune
al enzimei prin adăugarea cantităţii necesare de agent de titrare, cantitate care este o măsură a
vitezei de reacţie.
• În cazul lipazei, o glicoproteină cu un conţinut de 4,2% glucide şi o cantitate mare de aminoacizi
nepolari, enzima care catalizează hidroliza esterilor emulsionaţi ai glicerolului, se formează acizi graşi
cu catenă hidrocarbonată, care acidifică mediul de reacţie.
• Substratul efectiv al enzimei reprezintă un agregat de molecule de ester, micele sau film
monomolecular la interfaţa cu mediul apos.
• Activitatea enzimei este proporţională cu concentraţia moleculelor de substrat la interfaţă. Activitatea
lipazei se determină prin titrare potenţiometrică, realizată fie cu ajutorul unui titrator automat, fie cu un
pH metru de laborator.
 Metoda titrimetrică
• O unitate de lipază eliberează un micromol de acid gras pe minut, din ulei de măsline emulsionat la 250C şi pH = 8,0, în
condiţii specifice.
• Uleiul de măsline se emulsionează cu guma arabică şi emulsia se menţine cu albumină (în cazul lipazei din drojdie) sau cu
taurocolat de sodiu (în cazul enzimei din pancreas de porc).
• Practic se înregistrează volumul soluţiei folosite pentru titrare (NaOH 0,01 - 0,02 M) necesară pentru a menţine pH-ul
mediului de reacţie la valoarea 8,0 o anumită perioadă de timp, cât enzima acţionează asupra substratului emulsionat.

Metoda spectrofotometrică

În cazul metodelor spectrofotometrice, funcţia cu ajutorul căreia se urmăreşte activitatea enzimatică este
absorbanţa soluţiei ce conţine substratul sau/şi produsul reacţiei enzimatice.

E = log I0 / I = - log T
unde: Io = intensitatea luminii incidente;
I = intensitatea luminii transmise;
T = transmisia.
• În măsurătorile fotoelectrice, unitatea de măsura este extincţia E (densitatea optică D.O.) care este
proporţională atât cu concentraţia c a produsului de dozat cât şi cu drumul optic d.
• Măsurătorile de extincţie trebuie efectuate în domeniul de concentraţii unde este respectată legea
Lambert-Beer:
E = log I0 / I = - log T
unde: Io = intensitatea luminii incidente;
I = intensitatea luminii transmise;
• E=εxcxd T = transmisia.
• unde ε este coeficientul de extincţie molară şi reprezintă extincţia unei anumite substanţe la o
concentraţie egală cu 1 mol/l şi la un drum optic de 1 cm. În ţările germanofone, cantitatea de substanţă
din mediu este raportată la volum, exprimat în cm3 (mol/ml), iar ε are dimensiunile:

În ţările anglofone, concentraţia se exprimă în moli/litru (M), iar ε în M-1۰cm-1.

Coeficientul de extincţie molară, bazat pe mol/ml, este de 1000 ori mai mare decât cel
exprimat prin mol/litru. Cea mai mare sensibilitate pentru determinarea
spectrofotometrică a unui compus există la lungimea de undă unde acesta prezintă o
absorbţie maximă.
• Una din metodele colorimetrice de determinare a activităţii lipazelor se bazează pe determinarea
absorbţiei în VIS a sărurilor de cupru ale acizilor graşi eliberaţi în urma acţiunii enzimelor.
− Substratul utilizat în cadrul acestei metode este trioleina, (triglicerida acidului oleic), care nu poate fi
hidrolizată de alte esterase.
− Emulsia substratului se realizează prin tratare cu un agent tensioactiv (Triton X-100) în tampon
Tris-HCl. Acidul oleic liber, rezultat în urma reacţiei enzimatice, este extras în eter etilic şi apoi în
toluen, iar soluţia toluenică se tratează cu o soluţie de acetat cupric în piridină. Se formează sarea
de cupru, colorată, a acidului oleic, care prezintă absorbţie caracteristică la λ = 715 nm.
• O altă metodă colorimetrică discontinuă de dozare a lipazelor foloseste β-naftilesterul acidului
caproic, ca substrat al reactiei enzimatice şi se bazează pe măsurarea absorbţiei în vizibil a β-
naftolului rezultat în urma acţiunii lipazelor.
• Întrucat această metodă, ca şi precedenta, este foarte laborioasă, ea a fost transformată într-un
procedeu continuu, bazat pe determinarea spectrofotometrică a absorbţiei în UV a β-naftolului
rezultat în urma reacţiei enzimatice. Substratul prezintă o absorbţie nesemnificativă la λ = 233 nm,
în comparaţie cu β-naftolul.
 Metoda fluorimetrică
• Spectrele de emisie se realizează de obicei în conditii de neechilibru termodinamic a substanţei luate în
studiu, utilizându-se diferite metode de excitare (de exemplu, excitarea prin absorbţie de fotoni).
• Excitarea poate fi efectuată cu ajutorul unei radiaţii cu o compoziţie spectrală cunoscută, în particular, cu
ajutorul unei radiatii monocromatice.
• După întreruperea excitaţiei optice este măsurată emisia netermica a atomilor.
• Metodele care folosesc proprietăţile fluorescente sunt deosebit de sensibile, deoarece sunt înregistrate
modificări ale emisiei spectrale, chiar la concentraţii extrem de mici ale substanţei de investigat.

Enzimă Substrat Moleculă de fluorogen

Mecanismul reacţiilor enzimatice cu substraturi fluorogene

• Metodele fluorimetrice de dozare a activităţii enzimatice se bazează pe utilizarea unor markeri fluorogeni
legaţi în mod direct de evoluţia reacţiei enzimatice.
• Deşi folosirea substraturilor fluorogene nu permite testarea directă a reacţiei enzimatice pe un anume
substrat de interes, ele sunt deosebit de utile pentru detectarea claselor de enzime care prezintă anumite
tipuri de reactivitate recurentă. Clasa substraturilor fluorogene include fluorogeni de tip FRET (fluorescence
resonance energy transfer), în care scindarea unei legături interne sau izomerizarea intramoleculară
modifică energia de transfer specifică interacţiunilor dintre perechile de electroni din porţiunea fluorescentă a
substratului.
• Cele mai multe substraturi fluorogene sunt compuşi cu structuri ce conţin grupe funcţionale din care se
poate elibera grupa fenol acidă sau grupa anilină. Exemple tipice de astfel de substraturi sunt nitrofenil-
esterii folosiţi pentru testarea lipazelor. Datorită reactivităţii superioare a esterilor proveniţi de la alcooli
aromatici, aceste substraturi sunt mult mai reactive decât substraturile sintetice conţinând grupe ester
provenite de la alcooli alifatici.
• Aceşti derivaţi fluorogenici au tendinţa de a reacţiona foarte repede şi nespecific, ceea ce nu îi recomandă
în cazul unor condiţii drastice de screening, cum ar fi cele aplicate pentru testarea extractelor impure sau a
celor în care se folosesc valori mari de temperatură sau pH-uri extreme. Datorită acestor particularităţi,
astfel de substraturi pot fi folosite pentru izolarea biocatalizatorilor incapabili de a transforma anumite
substraturi sintetice mai puţin reactive, dar care prezintă interes practic.
• Nitrofenil-esterii acizilor carboxilici pot fi folosiţi pentru detectarea activităţii lipazelor şi prin metode
colorimetrice, întrucât prin hidroliza acestora se formează nitrofenolul, compus de culoare galbenă.
• Dezavantajul substraturilor nitrofenilesterice constă în faptul că ele pot reacţiona chiar şi cu enzima
denaturată sau cu fragmente non-catalitice ale acesteia şi pot hidroliza şi spontan, neenzimatic, prin
încălzire sau în mediu uşor alcalin.
• În ultimul timp s-au realizat progrese semnificatice în proiectarea de noi tipuri de substraturi
fluorogene şi cromogene, care prezintă grupe funcţionale inactive faţă de reactanţii neenzimatici şi
astfel pot fi utilizate pentru determinarea riguroasă a activităţii enzimatice.
• Un triacilglicerol cu catenă lungă care se găseşte în Parinari glaberrimum poate fi utilizat ca
substrat fluorogen pentru lipaze. Întrucât acest substrat este un compus natural, el este recunoscut
cu uşurinţă de lipaze şi permite o dozare extrem de sensibilă, chiar a unor cantităţi foarte mici de
enzimă.
• O soluţie general valabilă de utilizare a substraturilor fluorogene cu grupe funcţionale inactive se
bazează pe cuplarea reacţiilor enzimatice ce urmează a fi analizate cu o secvenţă de reacţii
secundare, secvenţă care are rolul de a transforma primul produs de reacţie într-un compus
fluorescent.
• Hidroliza sub acţiunea lipazelor a substraturilor fluorogene trigliceridice, conduce la eliberarea
unui acid gras conţinând o grupă fluorescentă, cum este, de exemplu, acidul pirendecanoic sau a
unui alcool aromatic flurescent.

• În cazul unui substrat trigliceridic fluorogen ce conţine grupa piren a cărei fluorescenţă este
mascată intramolecular de grupa trinitrofenil, cum este 1-trinitrofenil-amino-dodecanoil-2-
pirendecanoil-3-0-hexadecil-sn-glicerolul, acţiunea lipazelor determină scindarea radicalului
trinitrofenil şi eliberarea grupei piren fluorescente.

• Creşterea intensităţii fluorescenţei la 37°C este proporţională cu activitatea lipazei. Substratul

sus-menţionat nu poate fi hidrolizat de alte esterase sau de fosfolipaza A2.
 Alte enzime: Proteaze
Proteazele, enzime care hidrolizează proteine sau chiar pe ele însele, fac parte din ce mai largă familie de
enzime care reprezintă 2% din genomul uman.

Proteazele sunt clasificate în 6 grupe: aspartat, cistein, glutamat, metalo, serin și

treonin enzime bazate pe caracteristici specifice fiecărui grup. Prin diversitate structurală și funcțională
proteazele au funcții de la reciclarea proteinelor intracelulare la digestia nutrienților la amplificarea în cascadă a
sistemului imunitar.

Diversificarea rolurilor biologice ale proteazelor provine din evoluția nenumăratelor forme structurale pentru a
converge cu geometrii similare ale site-ului activ în vederea recunoașterii substratului. În ciuda diferitelor forme și
funcții, modul scindării legăturii peptidice de către proteazele este același: polarizarea scindării legăturii amidice
C=O și activarea unui grup nucleofil pentru a ataca carbonul carbonil conducând la hidroliză.

Există deja o gamă largă de proteaze utilizate în comerț variind de la aditivii detergenți până la terapiile eficiente.
Proteazele terapeutice au fost recent revizuite în sensul extinderii - alte clase de proteaze comerciale.
• Cele mai multe proteaze care apar în mod natural sunt inițial precursori inactivi numiți zimogene. Zimogenele
sunt activate prin unele schimbări de mediu care induc o conformație pentru modificarea sau legarea unei
molecule/peptide mici pentru a produce o conformație activă.
• O strategie comună pentru activarea unui zimogen implică exprimarea proteazei fuzionate la un segment de
activare, variind în mărime de la 2 la 100 de reziduuri, care previne activitatea proteolitică până când aceasta
este scindată.
• Cele mai activate segmente sunt secvențele N-terminale care blochează steric situsul activ. Pe lângă rolul de
a ascunde situsul activ printr-o anume conformație sterică, activarea segmentelor este importantă pentru
pliere, stabilitate și sortarea proteazei precursoare. În ultimul timp cercetările s-au axat pe mici molecule
activatori de mai multe zimogene, cum ar fi procaspazele și zimogenazele sistemelor fibrinolitice și de
coagulare.
• Proteazele acționează în contextul unor rețele complexe compuse de activatori de molecule mici și inhibitori,
peptide, receptori, substraturi și domenii de legare, care influențează și spațiul și localizarea temporală a
activității lor.
• Genomul uman conține peste 550 de gene de protează presupuse, cele mai abundente din care sunt
reprezentate proteazele metalo, serină și cisteină prin 191, 178 și, respectiv, 161 gene. Treonină și aspartic
proteazele acide au o abundență relativ scăzută, cu doar 27 și, respectiv, 21 de gene.
• Progresele recente în proteomică au permis cercetătorilor să obțină o înțelegere mai cuprinzătoare a
expresiei, reglării și activității proteazelor.
 Ingineria proteazelor în aplicații industriale
• Proteazele au fost aplicate pentru prima dată în industria detergenților, pielăriei și alimentară.
• De exemplu, proteaze alcaline au fost folosite pentru a îndepărta părul de pe piele, extractele de protează
pancreatică pentru detergenți și prelucrarea pieilor, proteazele din cheag de la viței pentru coagularea laptelui
și producția de brânză și papaina din papaia pentru maturarea cărnii. Proprietățile activităților catalitice ale
proteazelor le fac o alegere ieftină pentru hidrolizarea legăturilor peptidice pentru utilizări industriale.
• Aplicațiile proteazelor de uz comercial au nevoie de a se menține o activitate înaltă catalitică în condiții ne-
fiziologice, cum ar fi temperaturi și pH ridicate, agenți de chelare a calciului intensivi și detergenți.
• Absența de presiuni anume selectate în timpul evoluției naturale a proteazelor face ca majoritatea proteazelor
să devină instabile sau inactive în aceste condiții non-fiziologice.
• Ingineria proteazelor prin mutageneză direcționată pe situs sau prin anumite reglaje în evoluție poate genera
proteaze cu funcții îmbunătățite pentru a satisface
• cerințele aplicațiilor comerciale. Enzima proteolitică subtilizina, un biocatalizator important utilizat în multe
detergenți este un model de studiu pentru îmbunătățirea funcțiilor de protează prin inginerie.
• S-a studiat performanța exergetică a berii produse prin procesul convențional în comparație cu cea a berei
produse utilizând un procedeu asistat de enzime. Scopul a fost de a estima dacă utilizarea a unei formulări de
enzime exogene reduce impactul asupra mediului al întregului proces de fabricare a berii.

• Eficiența procesului exergonic de producere a malțului a fost de 77%. Principalele pierderi de exergie rezultă
din utilizarea gazelor naturale pentru degradarea și pierderea amidonului în timpul germinării. Eficiența
procesului exergonic a procesului de producție a enzimei variază între 20% și 42%, în funcție de situația în
care produsele secundare au fost utile. Principala pierdere de energie a fost din cauza cerinței unei puteri
ridicate pentru fermentare. Energia necesară în procesul de producție a enzimelor a fost de 30 de ori energia
standard a enzimei, ceea ce face ca procesul să fie scump.

• Cu toate acestea, cantitatea totală de energie necesară pentru producția a 100 kg de bere a fost mai mare
pentru procedeul convențional (441 MJ) decât pentru procedeul asistat de enzime (354 MJ). În plus, berea
produsă utilizând enzimele a redus utilizarea apei, a materiilor prime și a gazelor naturale cu 7%, 14% și
respectiv 78%.
• În consecință, pierderea de energie în procesul de producție a enzimei este compensată prin prevenirea
exergie în procesul de producere a berii totale.
• Lignina formează o mare parte a biomasei vegetale.
• Este un polimer foarte heterogen al unităților de 4-hidroxifenilpropanoid și este încorporat în polimeri de
poliglucidici care formează lignoceluloză.
• Lignina conferă rezistență și rigiditate plantelor și este destul de rezistent la degradare.
• Pentru a îmbunătăți (bio) prelucrarea materiilor prime lignocelulozice, sunt necesare metode mai eficiente
de degradare a ligninei.
• Natura a găsit modalități de degradare completă a ligninei prin producerea de sisteme enzimatice dedicate,
ligninolitice.
• Bacterii - mai multe tipuri de enzime disponibile care le permit să acționeze asupra ligninei.
• Două mari clase de enzime modificatoare de lignină bacteriene sunt:
- peroxidazele
- lacazele de tip DyP.
Cu toate acestea, recent, au fost descoperite și câteva alte enzime bacteriene care par să joace un rol în
modificările ligninei.
• Biomasa vegetală este cea mai abundentă biomasă regenerabilă de pe pământ și este considerată o sursă
atractivă de bioenergie și bio-chimicale, compusă în principal din lignină, celuloză și hemiceluloză.
• Procentul de lignină în biomasa lignocelulozică este de aproximativ 10-30% și este al doilea polimer organic
cel mai abundent.
• Lignina permite plantelor să genereze structuri rigide și oferă protecție împotriva hidrolizei celulozei și
hemicelulozei.
• Conversia biotehnologică a lignocelulozei în diferiți carbohidrați, incluzând glucoza, este baza producerii de
etanol, carbohidrați și produse aromatice.
• Astfel de produse vegetale derivate din biomasă pot fi utilizate ca combustibil, precursori de polimeri, compuși
alimentari și aromatizanți și blocuri farmaceutice de construcție.
• În timp ce celuloza și hemiceluloza sunt lanțuri de glucoză, lignina este un polimer puternic reticulat
format prin polimerizarea monomerilor 4-hidroxifenilpropanoidici (monolignoli) prin legături eterice și
carbon-carbon.
• Fragmentele fenolice ale unităților monomerice sunt grupele p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) și siringil (S) și
procentul fiecăruia depinde de speciile de plante și de țesuturi.
• Formarea ligninei este declanșată de peroxidaze și/sau lacaze din plante.
• Formarea de dimeri este catalizată prin oxidarea monolignolilor fenolici în radicalii lor fenolici.
• Datorită naturii sale aromatice și a rețelelor de polimeri foarte ramificați, lignina este destul de inertă.
• Ceaiul roșu - conține enzime oxidative extracelulare pentru a ataca și de a descompune lignina.
• Tipuri de peroxidaze de lignină (LiP), peroxidaze de mangan (MnP), peroxidaze versatile (VP) și peroxidaze
colorante (DyP).
• Peroxidaze atacă:
- fragmentele de lignină
- lignina,
Peroxidazele atacă de asemenea lignina de la distanță.

Prin intermediarii de oxidare sunt generați agenți oxidanți mici care pot pătrunde în polimerul ligninic ramificat pentru a
declanșa depolimerizarea prin chimie radială.

Mediatorii cunoscuți sunt compuși aromatici derivați de lignină (de exemplu, formarea radicalului cationic de alcool
veratril) și ioni de mangan.

• Pentru degradarea eficientă a ligninei pe bază de peroxidază, se secretă de asemenea diferite oxidaze fungice
pentru a produce peroxidul de hidrogen necesar.
• Candidații pentru producerea extracelulară de peroxid de hidrogen sunt:
- alcool oxidazele,
- glicoxal oxidazele
- diferite oxidaze carbohidrați.

• Cu excepția peroxidazelor, ciupercile secretă, de asemenea, diferite lacaze oxidante conținând cupru care ajută la
degradarea ligninei.

• Aceleași tipuri de enzime utilizate pentru sinteza ligninei în plante (peroxidaze și lacaze) sunt folosite de ciuperci
pentru a recicla polimerul aromatic.

• Analiza secvenței genomice a ciupercilor ligninolitice a arătat că nu există un set definit de enzime pentru
lignindegradare. Compoziția setului de enzime producătoare de oxidanți depinde de ciuperci.

- degradarea fungică a ligninei,

- capacitatea ligninolitică a bacteriilor a fost mai puțin studiată.
- ciupercile