LECŢIA 11

TRANSFERUL DE EMBRIONI LA ECVINE

CONGELAREA EMBRIONILOR
INTRODUCERE

Cuvinte cheie: alegerea iepelor donatoare şi receptoare,

superovulaţie, recoltare embrioni, transfer embrioni, crioconservare

Transferul de embrioni la ecvine, realizat pentru prima dată

în Anglia, în anul 1972, de ALLEN şi ROWSON, este o tehnică
mai puţin dezvoltată, comparativ cu alte specii. Principalii factori
care limitează transferul de embrioni la ecvine sunt: absenţa unui
tratament superovulator eficient şi dificultatea sincronizării
ciclurilor estrale ale femelelor receptoare cu femelele donatoare de
embrioni. Este dificilă aplicarea în practică a embrio-transferului, în
afara hergheliilor, care oferă un număr suficient de femele
primitoare de embrioni.
Embrio-transferul se aplică la ecvine în următoarele scopuri:
- obţinerea de embrioni (deci de mânji) de la iepele de călărie
care se găsesc în competiţii (ele se reţin totuşi timp de 3 luni);
- obţinerea de gestaţii de la iepele tinere, în vârstă de 3 ani,
destinate să intre în competiţii la vârsta de 4 ani;
- obţinerea de descendenţi de la iepele bătrâne sau cu
afecţiuni genitale grave, dar, de mare valoare genetică;
- valorificarea patrimoniului genetic al iepelor de mare
valoare, dar care îşi cresc greu mânjii;
- sporirea numărului de mânji, obţinuţi într-un an, de la iepele
de elită;
- import-exportul embrionilor congelaţi, ca mijloc de
prevenire a răspândirii unor boli infecţioase;
- conservarea fondului genetic al raselor pe cale de dispariţie
(crearea unor bănci de embrioni).

104
 DEZVOLTARE

7.2. ALEGEREA ŞI PREGĂTIREA IEPELOR

DONATOARE DE EMBRIONI

Cu o lună înaintea începerii tratamentelor de sincronizare a

estrului, femelele donatoare de embrioni sunt supuse unui examen
transrectal, iar dacă este posibil, unui examen ecografic, apreciindu-
se mărimea ovarelor şi a uterului. Iepele potenţial donatoare trebuie
să fie în stare bună de întreţinere, cu ciclul estral manifestat normal,
fără afecţiuni genitale. Eventualele vaccinări şi deparazitări se
efectuează cu cel puţin o lună înaintea începerii tratamentelor de
sincronizare.
Dacă recoltarea embrionilor începe foarte devreme (15
februarie), atunci este necesară iluminarea artificială a
adăposturilor, timp de 16 ore pe zi, între ora 7 şi 23, cu cca. 70 de
zile înaintea începerii sezonului de reproducere la iepe. Pentru
iluminarea artificială se utilizează un bec de 100 w sau un tub
fluorescent de 90 w, pentru fiecare boxă.
Superovulaţia. Marele impediment al transferului de
embrioni la ecvine constă în dificultatea provocării poliovulaţiei. În
mod experimental, TAINTURIER şi colab. (1989) au administrat
extract hipofizar ecvin, în doză de 750 UI, de două ori pe zi, timp
de 14 zile. Dintre iepele tratate, numai de la 60% s-au obţinut mai
mult de doi embrioni (în medie 3,6 embrioni). Numărul mediu al
embrionilor obţinuţi a crescut la 4,9, atunci când s-a administrat
HCG, a doua zi de la terminarea tratamentului cu extract hipofizar.
Ovulaţiile s-au eşalonat pe un interval de 0-4 zile (în medie 1,6
zile).
Sincronizarea estrului. În practica transferului de embrioni
la ecvine, femelele donatoare sunt supuse numai unor tratamente de
sincronizare a ciclurilor estrale. De la 70-75% dintre iepele
donatoare se recoltează unul sau, ocazional, doi embrioni. Ciclurile
estrale la iepe pot fi sincronizate cu ajutorul unui progestagen de
sinteză (Allyltrembolone), în doză de 40 mg/zi, administrat în furaj,
timp de 10 zile. În ziua a 10-a se administrează 0,500 mg
Cloprostenol sau 5 mg PgF2  naturală. Sincronizarea estrului, la
iepele cu ciclul estral cunoscut, se poate realiza printr-o singură
administrare de PgF2  la 7 zile de la ovulaţia precedentă.
Tratamentele de sincronizare se efectuează, de fiecare dată, la o
femelă donatoare şi două femele receptoare de embrioni.
In vederea recoltărilor repetate de embrioni, se practică
tratamente de sincronizare cu o singură administrare de PgF 2 , în

105
ziua recoltării embrionilor sau în următoarele 5 zile. În aceste
situaţii, tratamentele se efectuează în faza luteală sensibilă la
prostaglandine şi anume, în intervalul 7-12 zile de la ovulaţie.
Estrul debutează în intervalul 3-8 zile de la administrarea
prostaglandinei (în medie la 5 zile), iar ovulaţiile se produc în
intervalul 7-12 zile de la administrarea prostaglandinei (în medie la
9 zile).
În urma tratamentelor mixte de sincronizare (progestagene+
PgF2 ), estrul se manifestă după 2-7 zile de la administrarea
prostaglandinei (în medie la 5 zile), iar ovulaţia după 9-13 zile de la
administrarea prostaglandinei (în medie la 11 zile). Pentru fiecare
din tripletele de iepe sincronizate cu progestagene (o donatoare +
două femele receptoare), ovulaţiile au loc într-un interval de maxim
96 de ore (în medie 48 de ore). Momentul ovulaţiei uneia dintre
femelele receptoare poate avea loc cu 48 de ore înainte sau cu 48 de
ore după momentul ovulaţiei femelei donatoare, dar, în 4 cazuri din
5, una dintre femelele receptoare ovulează aproape simultan cu
donatoarea (într-un interval mai mic de 24 de ore).
Depistarea manifestării estrului trebuie începută la 48 de ore
după terminarea tratamentelor de sincronizare, prin trecerea iepelor
la bara de încercare. Pe măsura posibilităţilor, se pot efectua zilnic
examene ecotomografice pentru a se urmării dinamica de creştere a
foliculilor. Monta sau însămânţarea artificială a femelei donatoare
se face atunci când foliculul a atins diametrul de 35 mm şi se repetă
la 48 de ore.
Recoltarea embrionilor se efectuează la 6-8 zile de la
ovulaţie, adică la 16 zile de la terminarea tratamentelor de
sincronizare.

7.3. ALEGEREA ŞI PREGĂTIREA IEPELOR

RECEPTOARE DE EMBRIONI

Iepele tinere, care au aparatul genital sănătos, sunt

considerate ca primitoare ideale de embrioni. Se utilizează iepe
Ardeneze, în vârstă de 3 ani sau iepe de călărie, în vârstă de 4-7 ani,
care nu au fost montate niciodată şi prezintă cicluri estrale normale.
În cazul folosirii iepelor adulte, este necesar un examen transrectal
complet al aparatului genital.
Femelele receptoare de embrioni trebuie să fie în stare bună
de întreţinere, iar vaccinările şi deparazitările se efectuează cu cel
puţin o lună înaintea tratamentelor de sincronizare.
În vederea sincronizării estrului, se procedează ca şi în cazul
femelelor donatoare: 40 mg Allyltrembolone/zi, timp de 10 zile şi

106
0,500 mg Cloprostenol, în ziua a 10-a. Pentru fiecare femelă
donatoare de embrioni, se supun tratamentelor de sincronizare două
iepe potenţial receptoare, din care, cel puţin la una momentul
ovulaţiei este apropiat de cel al donatoarei.
Depistarea estrului începe la 48 de ore de la terminarea
tratamentelor de sincronizare, prin trecerea iepelor receptoare la
bara de încercare. Se recomandă ecografia pentru a monitoriza
creşterea foliculului şi momentul ovulaţiei.
Sincronizarea căldurilor nu este necesară dacă există un grup
suficient de mare de femele receptoare, în care să se găsească două
iepe care să ovuleze în acelaşi timp cu femela donatoare de
embrioni.

7.4. TEHNICA RECOLTĂRII EMBRIONILOR

Embrionul ecvin rămâne în oviduct timp de 5-6 zile după

fecundaţie. El ajunge în cavitatea uterină în stadiul de morulă
compactă sau blastocist tânăr. Foarte mobil, se poate deplasa în mai
puţin de 30 de minute, dintr-un corn uterin în altul, până în ziua a
17-18-a când se fixează la baza unuia din cele două coarne uterine.
Această mobilitate a embrionului impune necesitatea de a "spăla"
întreg uterul, cu o cantitate mai mare de mediu, pentru a fi siguri de
recoltarea acestuia, nefiind suficientă numai perfuzarea cornului
uterin ipsilateral corpului galben.
Succesul în recoltarea nechirurgicală a embrionilor depinde
de ziua recoltării, fiind de 65% atunci când recoltarea se efectuează
la 6 zile de la ovulaţie, de 75%, la 7 zile şi de 82%, la 8 zile de la
ovulaţie. Se recomandă recoltarea embrionilor la 6 zile (în stadiul
de blastocist tânăr) atunci când se congelează. La 8 zile de la
ovulaţie, cu toate că ratele de recuperare a embrionilor sunt cele mai
ridicate, aceştia sunt în stadiul de blastocist expandat, sunt
voluminoşi (1 mm) şi fragili (Tabelul 11). În practica embrio-
transferului, embrionii se recoltează la 7 zile de la ovulaţie şi se
transferă în stare proaspătă.
Tabelul 11

Mărimea embrionilor ecvini, în funcţie de ziua recoltării acestora

Ziua recoltării Număr de embrioni Diametrul (mm)
embrionilor recoltaţi Media Limite
6 121 0,20 0,13-0,75
7 144 0,40 0,13-1,46
8 142 1,13 0,12-3,98

107
 9 41 2,22 0,73-4,52

În vederea recoltării nechirurgicale a embrionilor, iapa se

introduce în travaliu, se contenţionează cu un căpăstru, iar dacă este
cazul şi cu iavaşaua. Se goleşte rectul de materiile fecale, coada se
înveleşte într-un sac de plastic şi se deviază lateral, iar organele
genitale externe şi regiunile învecinate se spală cu apă caldă şi
săpun. TAINTURIER şi colab. (1989) recomandă dezinfecţia
vaginului cu soluţie de Cloramină 4%o sau Clorhexidină 1%o.
Ca medii de recoltare, se utilizează Dulbeco-PBS cu pH 7,2
şi osmolaritate 287,6 mosmoli, suplimentat cu 1-2% ser fetal de
viţel (FCS). Se pot utiliza şi mediile de recoltare pregătite pentru
recoltarea embrionilor la bovine, la care se adaugă 0,4% albumină
serică bovină (BSA).
Embrionii se recoltează cu ajutorul sondelor Foley, Bivona
sau INRA/IMV. Frecvent se utilizează două tipuri de sonde
INRA/IMV: una cu lungimea de 750 mm, cu diametrul exterior de
8 mm şi interior de 4 mm, iar cealaltă cu lungimea de 1060 mm, cu
diametrul exterior de 11 mm şi interior de 8 mm.
Operatorul, echipat cu mănuşi chirurgicale, introduce o mână
în vagin şi dirijează sonda cu degetul prin gâtul uterin. Când sonda
ajunge în corpul uterin, se umflă balonul sondei cu cca 50-60 ml
aer, după care se introduce, prin gravitaţie, un litru din mediul de
recoltare (Figura 15). Mediul se recuperează, tot prin cădere liberă,
în acelaşi flacon, care se coboară încet, iar uterul se masează
transrectal, până la recuperarea în totalitate a mediului introdus în
uter. Se mai fac încă două perfuzări, în acelaşi mod, cu câte un litru
din mediul de recoltare.
IMEL şi colab (1981) consideră că sunt justificate cele trei
perfuzări ale uterului, deoarece în mediul recuperat după prima
perfuzare se găsesc numai 52% din embrionii recoltaţi, 34% la a
doua perfuzare şi 14% la a treia perfuzare.
După recoltarea embrionilor, se efectuează o spălătură a
uterului cu o soluţie antiseptică de Cloramină 4% o În ziua recoltării
embrionilor sau în următoarele 5 zile, donatoarelor li se injectează
0,500 mg Cloprostenol.
Rata de recuperare a embrionilor este în medie de 56%, cu
limite de 47-76%. Sondele de recoltare cu un diametru mai mare
permit rate mai ridicate de recoltare a embrionilor (69%).

108
 Figura 15. Recoltarea nechirurgicală a embrionilor la ecvine

Identificarea embrionilor. După recoltare, flacoanele în

care s-au recoltat embrionii se lasă 15 minute, în vederea
sedimentării embrionului. Supernatantul se sifonează, iar restul se
transvazează într-o plăcuţă Petri, după care se examinează la lupa
binoculară pentru identificarea embrionului. Aceste manipulări se
efectuează la temperatura de +20-250 C. Embrionul nu trebuie să
rămână mai mult de două ore în mediul de recoltare. După
identificare, embrionul se aspiră cu ajutorul unei micropipete şi se
"spală" de 10 ori în mediul PBS steril, la care s-a adăugat 20% ser
fetal de viţel sau 4% albumină serică bovină.
La iepele ciclice, perioada în care se efectuează recoltarea
embrionilor (începutul sau sfârşitul sezonului de reproducere) pare
să nu influenţeze rezultatele recoltării embrionilor. Ciclurile estrale
cu ovulaţii duble au o frecvenţă de 10-20%, sunt mai fecunde decât
ciclurile cu ovulaţii singulare şi de cele mai multe ori se
recuperează ambii embrioni.
Realizarea mai multor recoltări succesive, de la aceeaşi iapă
donatoare, este posibilă la intervale de 17-20 de zile, dacă se
administrează analogi sintetici ai PGF2  în ziua recoltării
embrionilor. Administrarea PgF2 , în ziua recoltării embrionilor,
permite o mai bună sincronizare a femelei donatoare cu femelele

109
receptoare. Repetarea recoltării embrionilor nu pare să modifice
fertilitatea ulterioară a iepelor.

7.5. TEHNICA TRANSFERĂRII EMBRIONILOR

Primele încercări de transfer al embrionilor la ecvine s-au

efectuat chirurgical, prin incizie pe linia mediană sau prin
laparatomie, obţinându-se rate de gestaţie de cca. 66%.
În prezent, în practica embrio-transferului la ecvine, se
utilizează metoda nechirurgicală de transfer (transcervicală).
Femela receptoare se contenţionează la bară, se goleşte rectul de
materiile fecale, după care se spală regiunea ano-genitală cu apă
caldă şi săpun.
Embrionul, împreună cu mediul de cultură, se aspiră într-o
paietă cu capacitatea de 0,25 ml, între două bule de aer. Paieta se
introduce într-un pistolet Cassou, utilizat pentru însămânţarea
artificială la bovine, cu lungimea de 54 de cm, care se protejează cu
o folie de plastic sterilă.
Operatorul foloseşte o mănuşă de exploraţie transrectală,
peste care se trage o mănuşă chirurgicală sterilă. Dosul mâinii se
lubrifiază şi se introduce mâna în vagin, cu indexul se caută
deschiderea gâtului uterin pentru a se uşura introducerea
pistoletului. Acesta este introdus încet în uter până când întâmpină
o uşoară rezistenţă, după care se retrage cca. 2 cm şi se apasă
pistonul pistoletului, in vederea depunerii embrionului. Pentru ca
transferul embrionilor să fie urmat de succes, este necesar să se
respecte regulile de asepsie, ca şi în cazul unei intervenţii
chirurgicale. Respectându-se aceste reguli, la INRA s-au obţinut
rate de gestaţie de 60%.
Reuşita transferului de embrioni la ecvine este influenţată, în
mare măsură, de sincronizarea stadiului ciclului estral al mamei
genetice cu al mamelor purtătoare. Femelele donatoare şi receptoare
de embrioni ar fi de dorit să ovuleze în aceeaşi zi, dar cum acest
fapt nu este întotdeauna posibil, se acceptă ca femelele receptoare
să ovuleze, cel mult cu 24 de ore înainte şi cel mai târziu cu 48 de
ore după femela donatoare (Tabelul 12). BRUYAS şi colab. (1990)
consideră că cele mai bune rezultate se obţin atunci când femela
receptoare ovulează după femela donatoare.
Sincronizarea ovulaţiilor este o problemă majoră în transferul
de embrioni la ecvine, problemă care poate fi rezolvată prin
congelarea embrionilor şi transferul acestora la femele receptoare
cu ciclul estral manifestat natural. Dar, congelarea embrionilor

110
ecvini nu este pe deplin reuşită, mai ales a celor în stadiul de
dezvoltare mai mare de 6 zile.

Tabelul 12

Ratele de gestaţie obţinute după transferul embrionilor ecvini, în

funcţie de gradul de sincronizare dintre femelele receptoare şi
donatoare de embrioni
Momentul ovulaţiei femelei receptoare, în Gestaţii
raport cu femela donatoare de embrioni (%)
- cu o zi înaintea donatoarei 50,0
- în aceeaşi zi cu donatoarea 57,0
- cu o zi după donatoare 44,0
- cu două zile după donatoare 50,0

CONSERVAREA EMBRIONILOR PRIN

CONGELARE

La temperatura ambiantă de 18-200 C, embrionii pot fi

păstraţi cel mult 5 ore (intervalul maxim de timp de la recoltare
până la transfer). La temperatura de 37-38 0 C, într-un mediu de
cultură adecvat, embrionii se pot păstra 12-24 de ore. Embrionii
bovini pot fi păstraţi timp de 24-48 de ore, la o temperatură
cuprinsă între 0 şi +40 C, dar cu preţul unei reduceri semnificative a
viabilităţii acestora.
O stocare pe termen lung a embrionilor nu este posibilă decât
prin congelarea în azot lichid (-1960 C). Aceasta permite ca
operaţiunea de transfer a embrionilor să devină independentă de
recoltarea acestora şi deci o mai bună sincronizare între stadiul de
dezvoltare al embrionilor cu statusul reproductiv al femelelor
receptoare (intervalul de timp de la estru până la transferul
embrionilor). Congelarea embrionilor face posibil transportul
acestora pe distanţa lungi, care se realizează cu mai puţine riscuri şi
cheltuieli, comparativ cu transportul animalelor şi operaţiunile de
carantină. De asemenea, congelarea este importantă pentru crearea
“băncilor de embrioni”, care permit o mai bună utilizare a
potenţialului genetic al femelelor superioare şi conservarea speciilor
sau raselor rare sau pe cale de dispariţie.

111
 8.1. PRINCIPIILE CONGELĂRII EMBRIONILOR

În mod normal, mediul ce conţine embrionii se răceşte sub

punctul de îngheţare, fără formarea cristalelor de gheaţă, fenomen
numit superrăcire. După aceea, la o anumită temperatură scăzută,
se produc cristale de gheaţă, urmată de o creştere rapidă a
temperaturii, datorită eliberării căldurii latente de fuziune.
Spre deosebire de spermatozoid, embrionul este un ansamblu
de celule bogate în apă, are talie mare şi evoluează în timp.
Congelarea embrionilor pune mari probleme datorită influenţei
nefaste a doi factori: gheaţa intracelulară care, în cazul cristalelor
prea mari, lezează membrana citoplasmatică şi deshidratarea
brutală, cu pierderi prea mari de apă pentru celule.
Un alt punct delicat, îl constituie fenomenul de fuziune, care
se produce între -4 şi -200 C, cu eliberarea de căldură, care
determină o reîncălzire a mediului. Pentru a preveni reîncălzirea,
trebuie indusă cristalizarea mediului la o temperatură uşor
inferioară punctului de congelare-seeding.
Pentru a evita deteriorarea embrionului, există viteze optime
de răcire şi substanţe crioprotectoare care reduc agresiunile
celulare, prin atenuarea şocului osmotic. Se pot utiliza două
categorii de crioprotectori:
- crioprotectori penetranţi: glicerol, dimetil sulfoxid
(DMSO), 1,2-propandiol (PROH), etanol şi alţi alcooli;
- crioprotectori nepenetranţi: polivinilpirolidona (PVP)
zaharoză, glucoză, alte glucide.
Gradul de conservare al unui embrion depinde: de
coeficientul de permeabilitate pentru crioprotectori, de gradientul
între concentraţia intra şi extracelulară a crioprotectorului, de
temperatura şi suprafaţa de contact a embrionului. Prezenţa
crioprotectorului înseamnă osmolaritate sporită, care poate afecta
viabilitatea embrionilor.
Principiul de bază al congelării embrionilor constă în
extragerea apei din celule cu ajutorul crioprotectorilor şi scăderea
treptată a temperaturii. De la temperatura laboratorului, până la -7 0
C, scăderea temperaturii se face cu 10 C/minut. La temperatura de
-70 C, se induce cristalizarea mediului de congelare (seeding) cu
ajutorul unei baghete metalice, ţinute, în prealabil, în azot lichid.
După aceea, temperatura continuă să fie coborâtă cu 0,3 0 C/ minut,
până la minus 30-350C, după care paietele cu embrionii se
imersează în azot lichid (-1960 C).

112
 8.2. PROCEDEE DE CONGELARE A EMBRIONILOR

În ultimii ani, procedeele de congelare a embrionilor au fost

îmbunătăţite, ceea ce a permis ca ratele de supravieţuire a
embrionilor de bovine, ovine, caprine (în stadiile de morulă şi
blastocist) să ajungă la 90-100%, iar ratele de gestaţie, după
transferul nechirurgical al embrionilor, să fie de 50-60%. Ovocitele,
embrionii în stadii timpurii de dezvoltare embrionii
micromanipulaţi (bisecţie, biopsie, clonare) şi embrionii de suine nu
sunt congelaţi cu succes, înregistrându-se rate foarte scăzute de
supravieţuire.
Bazate pe principiile criobiologiei, s-au dezvoltat patru
procedee de congelare a embrionilor: congelarea controlată, metoda
“un pas”, vitrificarea şi congelarea ultrarapidă. Aceste procedee
permit aproape aceleaşi rate de gestaţie, în urma transferului
embrionilor congelaţi/decongelaţi, ca şi în cazul embrionilor
proaspeţi (50%). În prezent, primele două metode sunt aplicate mai
frecvent. Vitrificarea şi congelarea ultrarapidă sunt procedee mai
noi, care pot scurta timpul necesar congelării embrionilor, fără să
fie nevoie de instalaţii costisitoare de congelare.
Congelarea/decongelarea controlată a embrionilor constă
în următoarele etape:
-introducerea embrionului într-o soluţie de 1,4 M glicerol şi
echilibrarea osmotică timp de 20 de minute, la temperatura camerei;
-aspirarea în minipaiete de 0,25 ml: soluţia de congelat este
aspirată în paietă, în trei segmente, separate prin două bule de aer
(segmentul mijlociu conţine embrionul);
- închiderea paietei cu un dop;
-răcirea treptată cu 10 C/minut, până la temperatura de -70 C;
-inducerea cristalizării (seeding) la temperatura de -70 C, timp
de 5 minute;
-scăderea lentă a temperaturii, cu 0,30 C/minut, de la -70 C
până la -280 C;
-scăderea temperaturii, cu 0,10 C, de la -280 C până la -350C;
-imersarea în azot lichid (-1960 C);
-decongelarea în aer la temperatura camerei (aprox. +20 0 C)
sau în apă la temperatura de + 350 C;
-îndepărtarea crioprotectorului cu ajutorul zaharozei.
Crioprotectorii trebuie îndepărtaţi din embrionii decongelaţi
din cauza toxicităţii lor la temperaturi înalte. După decongelare,
embrionii sunt transvazaţi într-un amestec de 0,7 M zaharoză şi 0,7
M glicerol, timp de 10 minute, după care se transferă, pentru 5-10
minute, într-o soluţie de 0,7 M zaharoză. După îndepărtarea

113
crioprotectorului, embrionii sunt transferaţi într-un mediu de
cultivare PBS şi se apreciază viabilitatea acestora după criterii
morfologice.
Se consideră că glicerolul este mai puţin toxic decât DMSO,
de aceea este utilizat mai frecvent ca agent crioprotector în
congelarea embrionilor.
Congelarea controlată a embrionilor de bovine este urmată de
rate de supravieţuire de 95-100%, iar ratele de gestaţie depăşesc
50%, după transferul nechirurgical al embrionilor.
S-a constatat că viabilitatea embrionilor după decongelare
poate fi influenţată de mai mulţi factori, printre care: calitatea
embrionilor, stadiul embrionar de dezvoltare şi nivelul plasmatic în
progesteron al femelei receptoare în momentul transferării
embrionilor. Rate superioare de supravieţuire se obţin în urma
congelării embrionilor clasificaţi morfologic foarte buni şi buni.
Embrionii de bovine în vârstă de 7 zile (morule compacte,
blastocişti) rezistă mult mai bine la congelare decât embrionii în
alte stadii de dezvoltare.
Metoda “un pas” (one step) este o modificare a metodei de
congelare controlată, care omite diluţia crioprotectorului şi
evaluarea morfologică a embrionilor după decongelare. Etapele
congelării sunt aceleaşi ca şi în cazul congelării controlate.
Principiul metodei constă din introducerea în aceeaşi paietă,
atât a mediului de congelare, cât şi a mediului de diluţie
(decongelare), separate prin bule de aer: segmentul mijlociu conţine
mediul de congelare cu embrionul, iar segmentele laterale conţin
mediul de diluţie (zaharoză). După decongelare, prin scuturarea
paietei, se amestecă cele două medii, iar embrionul vine în contact
cu mediul de diluţie.
Prin aplicarea acestui procedeu de congelare, ratele de
gestaţie sunt mai scăzute (30-50%), deoarece, după decongelare, nu
se mai evaluează calitatea embrionilor şi nu se elimină cei care nu
au supravieţuit congelării. S-a experimentat congelarea embrionilor
într-un amestec de glicerol (1,36 M) şi zaharoză (0,25 M),
obţinându-se rate de gestaţie de 50%.
Metoda de congelare “un pas” are avantaje practice atunci
când embrionii sunt transferaţi în ferme mici, unde nu există
laboratoare cu echipament necesar cultivării şi evaluării calităţii
embrionilor.
Vitrificarea este o metodă mai simplă de congelare, care se
răspândeşte din ce în ce mai mult. Principiul constă din faptul că la
anumite soluţii, atunci când se răcesc excesiv, se produce o creştere

114
însemnată a vâscozităţii, fără formarea cristalelor de gheaţă,
soluţiile trec într-o stare amorfă, cu aspect sticlos (vitros).
Acest procedeu de congelare necesită concentraţii mari de
crioprotectori şi viteze mari de răcire şi reîncălzire (decongelare).
Principalul inconvenient este acele că, în general, crioprotectorii
concentraţi sunt toxici pentru embrioni. Mediul de vitrificare este
un amestec de glicerol şi 1,2-propandiol.
În vederea echilibrării termice şi osmotice, embrionul este
introdus într-o soluţie salină (PBS) cu 10% glicerol, 20%
propandiol şi 20% ser fetal de viţel (FCS), timp de 10 minute, la
temperatura camerei. După aceea se transvazează în mediul de
congelare ce conţine 25% glicerol şi 25% propandiol. În paietă se
aspiră 1 M zaharoză, se lasă o bulă de aer, se aspiră mediul de
congelare cu embrionul, se lasă o bulă de aer şi se aspiră 1 M
zaharoză, după care se închide paieta şi se imersează direct în azot
lichid.
În vederea decongelării, paieta se introduce în baie de apă la
0
+20 C. După decongelare, conţinutul paietei se colectează într-o
plăcuţă Petri şi se lasă 10 minute, după care se transvazează în altă
plăcuţă cu 1 M zaharoză. După această ultimă diluţie, embrionul
este trecut în mediu de cultivare la +370 C, în vederea examenului
morfologic. Se pare că embrionii în stadiul de morulă rezistă cel
mai bine la acest procedeu de congelare.
După decongelare, se poate agita paieta, în aşa fel încât
mediul cu embrionul să ia contact cu zaharoza, iar după 10 minute
se poate transfera direct, fără transvazare în alte soluţii de zaharoză.
Prezintă dezavantajul că embrionii nu mai sunt examinaţi după
decongelare, nefiind posibilă eliminarea celor care nu au
supravieţuit congelării.
Embrionii de şoricioaică au fost vitrificaţi cu succes într-un
mediu compus din 40% etilen glicol, 30% ficoll şi 0,5 M zaharoză.
Ficoll-ul reprezintă componenta macromoleculară a soluţiei de
vitrificare. Acest mediu de congelare pare să fie mai puţin toxic
pentru embrioni şi nu mai necesită echilibrarea termică şi osmotică
înainte de congelare.
Congelarea ultrarapidă. Studii recente, au relevat faptul că
embrionii de bovine (morule şi blastocişti) pot supravieţui şi unei
congelări rapide. Astfel, mediul de congelare cu embrionii a fost
răcit cu 120 C/minut, până la -300 C, după care paietele au fost
imersate direct în azot lichid. Ratele de supravieţuire a embrionilor
după decongelare au fost destul de scăzute (33%).
În vederea congelării ultrarapide, este necesar un
crioprotector permeabil (2-3,5 M glicerol) şi zaharoză (0,25-0,50

115
M). Ca şi în cazul vitrificării, datorită concentraţiei mari de
crioprotectori, este necesară echilibrarea termică şi osmotică
prealabilă a embrionilor.
Embrionii altor specii de animale (ovine, caprine, ecvine) au
fost congelaţi cu succes, mai ales prin metoda de
congelare/decongelare controlată. Ratele de supravieţuire după
congelare au ajuns la 90%, iar ratele de gestaţie sunt de cca. 50%.
La fel ca şi la bovine, embrionii în stadiile de morulă şi blastocist
tânăr se pretează cel mai bine la congelare.
Embrionii de suine sunt mult mai sensibili la temperaturi
scăzute, aceştia degenerează la temperaturi mai mici de 15 0 C.
Cauza majoră a sensibilităţii la congelare, se pare că, o constituie
conţinutul ridicat în lipide al embrionilor, care duce la formarea
unor cristale de gheaţă intracelulară.
Blastociştii în stadii mai evoluate au o toleranţă mai bună la
temperaturile scăzute şi pot supravieţui la +6 0 C. Blastociştii
eclozaţi pot supravieţui, la -200 C, în proporţie de 60-80%. În urma
congelării/decongelării controlate a blastociştilor expandaţi s-au
obţinut rate de gestaţie de 45%.
Deşi în urma congelării/decongelării controlate a
embrionilor, ratele de gestaţie sunt asemănătoare cu cele obţinute în
urma transferării embrionilor proaspeţi, aproximativ 5-10% din
embrionii apreciaţi ca foarte buni şi buni, după evaluarea
morfologică, nu rezistă operaţiunilor de congelare.

REZUMARE

Femelele donatoare de embrioni sunt supuse unui examen

transrectal, iar dacă este posibil, unui examen ecografic, apreciindu-
se mărimea ovarelor şi a uterului. Iepele potenţial donatoare trebuie
să fie în stare bună de întreţinere, cu ciclul estral manifestat normal,
fără afecţiuni genitale. Eventualele vaccinări şi deparazitări se
efectuează cu cel puţin o lună înaintea începerii tratamentelor de
sincronizare.
Succesul în recoltarea nechirurgicală a embrionilor depinde
de ziua recoltării, fiind de 65% atunci când recoltarea se efectuează
la 6 zile de la ovulaţie, de 75%, la 7 zile şi de 82%, la 8 zile de la
ovulaţie. Se recomandă recoltarea embrionilor la 6 zile (în stadiul
de blastocist tânăr) atunci când se congelează. La 8 zile de la
ovulaţie, cu toate că ratele de recuperare a embrionilor sunt cele mai
ridicate, aceştia sunt în stadiul de blastocist expandat, sunt
voluminoşi (1 mm) şi fragili. În practica embrio-transferului,

116
embrionii se recoltează la 7 zile de la ovulaţie şi se transferă în stare
proaspătă.
În prezent, în practica embrio-transferului la ecvine, se
utilizează metoda nechirurgicală de transfer (transcervicală).
Femela receptoare se contenţionează la bară, se goleşte rectul de
materiile fecale, după care se spală regiunea ano-genitală cu apă
caldă şi săpun.
Embrionul, împreună cu mediul de cultură, se aspiră într-o
paietă cu capacitatea de 0,25 ml, între două bule de aer. Paieta se
introduce într-un pistolet Cassou, utilizat pentru însămânţarea
artificială la bovine, cu lungimea de 54 de cm, care se protejează cu
o folie de plastic sterilă.
La temperatura ambiantă de 18-200 C, embrionii pot fi
păstraţi cel mult 5 ore (intervalul maxim de timp de la recoltare
până la transfer). La temperatura de 37-38 0 C, într-un mediu de
cultură adecvat, embrionii se pot păstra 12-24 de ore. Embrionii
bovini pot fi păstraţi timp de 24-48 de ore, la o temperatură
cuprinsă între 0 şi +40 C, dar cu preţul unei reduceri semnificative a
viabilităţii acestora.
O stocare pe termen lung a embrionilor nu este posibilă decât
prin congelarea în azot lichid (-1960 C). Aceasta permite ca
operaţiunea de transfer a embrionilor să devină independentă de
recoltarea acestora şi deci o mai bună sincronizare între stadiul de
dezvoltare al embrionilor cu statusul reproductiv al femelelor
receptoare (intervalul de timp de la estru până la transferul
embrionilor).

CHESTIONAR

1. Care sunt criteriile de alegere a iepelor donatoare şi

receptoare de embrioni?
2. În ce constă pregătirea iepelor donatoare şi receptoare de
embrioni?
3. Cum se procedează pentru recoltarea nechirurgicală e
embrionilor la ecvine?
4. care sunt criteriile de apreciere a calităţii embrionilor?
5. Cum se procedează pentru transferul nechirurgical al
embrionilor?
6. Care sunt principiile congelării embrionilor?
7. Care sunt procedeele de congelare a embrionilor?

117