❑ CE AM ÎNVĂȚAT ÎN CURSUL 1

VERDE ROȘIE, ALBASTRĂ

Curs 2. Culturi de microorganisme.

Consideratii generale despre cinetica
 Culturi de microorganisme și medii de cultură

Cultura = creștere controlată a unui microorganism.

▪ Cultura microorganismelor este utilizată pentru a crește numărul de celule
care se dorește a fi studiate.
▪ Microorganismele sunt adăugate în mediul de cultură care conține nutrienți
pentru creștere.
▪ Cultura este incubată una sau mai multe zile, la temperatura optimă a
fiecarui organism. În multe cazuri, microorganismele sunt crescute pe plăci
cu agar. Microorganismele se multiplică formând colonii. O colonie crește
în locul în care o singură celulă a fost inoculată. O colonie este ca o clonă.
Ea poate fi pură dacă nu există în jurul ei alte tipuri de microorganisme în
colonii care o pot contamina.
 Culturi de microorganisme și medii de cultură
Un mediu de cultură = amestec de substanțe care asigură toate
componentele necesare pentru metabolismul celulei și anume:
- surse de carbon;
- azot;
- substanțe minerale;
- factori de creștere;
- Substanțele dizolvate - la o concentrație corespunzătoare a presiunii
osmotice celulare;
- cu valori de pH și rH optime creșterii și multiplicării microoranismelor de
cultivat.
▪ Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea și conservarea
microorganismelor sau pentru obținerea, prin cultivare, a produselor de
biosinteză microbiană. Mediile pot fi procurate de la firme producătoare sau
pot fi preparate în laborator.
▪ Mediile de cultură pot fi:
- generale sau
- selective.
Cele generale sunt folosite pentru cultura tuturor bacteriilor, drojdiilor sau
mucegaiurilor.
Mediile selective sunt special pregătite de a inhiba anumite microorganisme și a
favoriza pe cele care se doresc a fi studiate.
▪ culturile lichide - microorganisme anaerobe. Prezența celulelor de
microorganisme este evidențiată prin apariția unei tulbureli a lichidului, care se
intensifică în timp ce cantitatea de masă celulară crește.
▪ culturi pe medii solide se obțin prin adăugarea în mediile lichide a unor agenți de
solidificare ca: agar-agar (geloza), un poliglucid obținut din alge ale genului
Gelidium având în stuctura molecule de galactoza și acid D-galacturonic legate
prin legaturi 1,2 si 1,3 glicozidice. În stare purificată se prezintă sub formă de
pulbere sau fibre la care se adaugă 0,5 până la 2% mediu lichid. Se solubilizează
la temperatura de fierbere și gelifică la temperatura de 42-45ºC.
▪ Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura proteică, extrasă din țesuturi colagenice.
Se folosește în cantitate de 12-15%. Se fluidifică la temperaturi mai mari de 35ºC și gelifică
lent sub temperatura de 30-35ºC.
▪ Cultivarea microorganismelor necesită tehnici și materiale sterile.
▪ Sterilizarea este un proces de eliminarea a tuturor microorganismelor. Sterilizarea se poate
face prin încălzire în cuptoare, etuve, autoclave etc. De asemenea, pentru sterilizare, se
pot folosi filtre microbiologice, care sunt, în general, scumpe și substanțe chimice
(dezinfectanți, antiseptici, antibiotice) care, împreună cu sterilizarea prin încălzire sunt cele
mai folosite.
▪ Și radiațiile pot fi agenți de sterilizare. Nivele ridicate de radiații pot omorâ microorganismele
prin distrugerea materialului genetic (ADN si ARN).
▪ Mediile de cultură generale utilizate frecvent sunt: bulionul de carne lichid sau gelozat
(BCA), mediul triptona-extract de drojdie-glucoza-agar (TEGA) pentru cultivarea bacteriilor și
mustul de malț – agar (MMA) pentru cultivarea drojdiilor și mucegaiurilor.
▪ Mediile de cultură generale pot fi definite când în compoziția lor intră substanțe chimice
pure, precis dozate conform rețetei și medii complexe în care intră compuși naturali cu o
compoziție variabilă (ex. soia su drojdiile).
▪ Medii de cultură selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziție chimică
definită care permit dezvoltarea unui numâr restrâns de microorganisme sau chiar a unei
specii. Aceste medii conțin pe lângă substanțe nutritive și inhibitori ai altor microorganisme
insoțitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se dorește a fi selecționată.
▪ De exemplu, multe bacterii gram negative nu pot crește la concentrații
mari de sare în timp ce bacteriile gram pozitive pot. Mediile cu conținut mare
de sare selecteză bacteriile gram pozitive de cele gram negative.
▪ Medii de cultură de diferențiere permit separarea speciilor în funcție de
anumite caractere biochimice atunci când acestea au fost selectate dintr-o
microbiotă eterogenă. De exemplu, mediu de agar cu sânge de oaie poate fi
întrebuințat pentru a diferenția specii din cadrul genului Streptococcus. Toate
speciile cresc pe acest tip de mediu, dar coloniile lor arată diferit.
▪ Medii de cultură de diferențiere și selective pot selecta anumite
microorganisme și, în același timp, diferenția diferite tipuri de bacterii. De
exemplu, pot selecta bacteriile gram negative și a le alege pe cele care
fermentează lactoza, în scopul producerii de acid lactic. Acidul produs prin
fermentație colorează indicatorul de pH în roșu-portocaliu, deci coloniile cu
aceasta culoare sunt identificate ca cele care fermentează lactoza.
▪ Medii de îmbogățire, fortifiate sunt destinate microorganismelor
pretențioase din punct de vedere nutritiv și care se află în număr redus în
produsul analizat din punct de vedere microbiologic.
▪ Pentru a le evidenția, se fac treceri din produsul alimentar în mediul de
îmbogățire, steril și se asigură înmulțirea celulelor izolate. De aici se face
transferul pe medii de diferențiere iar rezultatul se exprimă prin absența
sau prezența lor. De exemplu la determinarea bacteriilor din genul
Salmonella, normele microbiologice stabilesc absența lor în 25 grame de
produs.
▪ Mediile naturale sunt foarte folosite deoarece reproduc condițiile
ambientale în care se dezvoltă microorganismele. Ele pot fi sucuri sau
piureuri de fructe sau legume, mustul de malț, infuzii de plante, lapte,
sânge, zerul, carnea, bulionul de carne, ficat, ouă.
▪ Medii fermentative sunt medii de cultură industriale. În compoziția lor
intră ca surse de carbon melasa, zaharoza, făinuri, cereale, zer, amidon
etc. Ca sursă de azot, în aceste medii, pot fi folosite făinuri proteice de
soia, sulfatul de amoniu, uree și îngrășământ complex. Pentru
îmbogățirea în săruri minerale se folosesc: fosfați, sulfați, cloruri.
▪ Nu toate microorganismele pot fi crescute în cultură.
▪ Sunt multe bacterii, fungi, virusuri sau protozoare din mediul înconjurător
care nu pot fi cultivate în laborator. Acestea trebuie observate direct la
microscop. Ne referim aici, în special, la unele microorganisme patogene
și la cele care se dezvoltă în interiorul organismului animal sau uman
(visuri și protozoare).
Prepararea mediilor de cultură
1. Cântărirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)
2. Dizolvarea și omogenizarea pulberii prin încălzire până la fierbere
3. Corectarea pH-ului în funcție de specia care urmează a fi studiată
4. Repartizarea mediului în baloane de sticlă, eprubete sterile cu dop
5. Sterilizarea la 120°C, 20 min.
6. Depozitarea la 4° C.
▪ Fermentația = obținerea unui produs cu ajutorul biomaselor de culturi de
microorganisme.
▪ Produsul poate fi:
− Celule de microorganisme: producție de biomasă;
− Metaboliți ai microorganismelor: ca produs obținut de la tulpini naturale sau
modificate genetic;
− Un microorganism străin: ca produs rezultat din tehnologia ADN
recombinant sau de inginerie genetica.
Produs Utilizare Organism
Bacitracina Antibiotic Bacillus subtilis
Cloramfenicol Antibiotic Streptomyces venezuelae
Acid citric Aromatizant Aspergillus niger
Eritromicina Antibiotic Streptomyces erythaeus
Invertaza Bombonerie Saccharomyces cerevisiae
Lactaza Digestiv Escherichia coli
Neomicina Antibiotic Streptomuces fradiae
Pectinaza Suc de fructe Aspegillus niger
Penicilina Antibiotic Penicillium notatum
Riboflavina Vitamina Ashbya gossypii
Streptomicina Antibiotic Streptomyces griseum
Subtilizina Detergent de rufe Bacillus subtilis
Tetraciclina Antibiotic Streptomyces aureofacies

PRODUSE OBTINUTE PRIN FERMENTATIE, DE

CATRE MICROORGANISME NATURALE
 Activitate microbiană
În procesul de replicare – microorganismele - macromolecule complexe (100 de unități
monomerice); celula procariotă (bacteriană) utilizează în căile metabolice peste 1000 de
enzime diferite, iar în celula eucariotă acest număr de enzime poate fi dublu.
▪ căile anabolice - sintentizează molecule complexe și precursori intermediari
▪ căile catabolice - furnizează energia necesară pentru procesele anabolice.
▪ două activități divergente sunt puternic legate.
Microorganisme aerobe
Microorganisme pot substitui oxigenul cu azotat, sulfat sau ion feric și deci se pot
dezvolta în absența oxigenului - anaerobe.
Microorganisme psihrofile (<20ºC);
Microorganisme mezofile (20-40ºC);
Microorganisme termofile (45-60ºC).
▪ Multe microorganisme cresc în jurul pH-ului 7.
▪ bacteriile acetice, tiobacilii și bacteriile ce descompun ureea < 7
▪ alge - pH mai mare de 10.
Cinetica microbiană
▪ Fermentare în flux - un sistem închis.
1. t=0 mediul nutritiv sterilizat în fermentator;
2. mediul este inoculat cu microorganisme și apoi incubat
- se adaugă oxigen (în cazul microorganismelor aerobe), agent antispumant și
acid sau bază pentru reglarea pH-ului.
- metabolismul celulelor este influențat de compoziția mediului de cultură,
concentrația biomasei și concentrația metaboliților.
▪ Faza lag - se realizează un echilibru între microorganisme și mediu, existând
totuși și o creștere foarte mică biomasei celulare.

▪ Faza log – creșterea masei celulare poate fi descrisă prin dublarea numărului
de celule pe unitatea de timp pentru bacterii și drojdii, sau dublarea biomasei
pe unitatea de timp pentru fungi filamentoși (mucegaiuri).

▪ Deși celulele modifică mediul prin consumul substratului și excreția de

compuși metabolici, rata de creștere rămane constantă în timpul fazei log.
Rata de creștere este independentă de concentrația substratului atâta timp cât
există un exces de substrat.
▪ substratul este metabolizat - viteza de creștere a celulelor scade sau este
complet stopată.
▪ Faza staționară - biomasa crește puțin sau rămâne constantă (compoziția
celulelor se poate schimba).
▪ Liza celulelor - elibereaza noi nutrienți care devin surse de energie pentru o
creștere (lentă) și supraviețuire.
▪ se formează diferiți metaboliți cu o mare importanță biotehnologica.
▪ Durata de timp între faza staționară și cea a morții celulelor este dependentă de
tipul microorganismului și de procesul utilizat. Fermentația este de obicei
întrerupta la sfârșitul fazei log sau înainte ca faza morții să înceapă.
Fermentare semicontinuă

▪ substratul este adăugat treptat pe parcusul fermentării, este adăugat în

concentrații mici la începutul fermentării și continuă să fie adăugat în cantități mici
pe toată durata procesului. (la varianta prezentată anterior, substratul este
adăugat tot la începutul fermentării)

Fermentare continuă

- sistem deschis.
▪ Mediul nutritiv este adăugat continuu în bioreactor și o cantitate echivalentă de
mediu nutritiv convertit în microorganisme este simultan scoasă din sistem.
▪ Pentru omogenitate, bioreactorul poate fi un chemostat sau un turbidistat.
- În chemostat, în stare staționară, creșterea celulelor este controlată prin
ajustarea concentrației unuia dintre substrate.
- În turbidistat, creșterea celulelelor este menținută constantă prin utilizarea
turbidității, pentru a monitoriza concentrația biomasei și rata de alimentare cu
nutrienți, care este ajustată corespunzător.
Necesar de nutrienți
▪ Glucide - utilizate de către toate microorganismele (glucoza). Majoritatea fungilor -
diglucide.
▪ Unele (bacterii și fungi) au nevoie de steroizi și acizi grași ca: acidul linoleic, acidul
oleic. Toți fungii - ergosterol.
▪ În general, vitaminele A, C, D și vitamina K nu sunt necesare pentru creșterea mo
▪ Aminoacizii nu sunt necesari algelor (câteva specii sunt capabile să îi metabolizeze).
▪ Unele microorganisme sunt capabile să utilizeze toți aminoacizii, forme L, exceptând
drojdiile.
▪ Sunt câteva bacterii care utilizează și forme D.
▪ Sunt fungi care necesită amoniac, azotați și azotiți.
▪ Microorganismele au nevoie de săruri minerale; sunt specii dependente de Fe, K, Mg
și Mn. Altele necesită pentru creștere S, N, Ca, Cu, P, Zn.
▪ Anumite specii de drojdii pot utiliza sulful elementar sau sulfatul.
▪ Bacteriile necesita glutation și acid tioacetic în timp ce drojdiile necesită tioacetați,
tiocarbonați, tioglicolați și glutation.
Sisteme de fermentare
▪ O fermentație microbiană poate fi descrisă ca un sistem în 3 faze, implicând
reacții lichid-solid, gaz-solid și gaz-lichid.
▪ Faza lichidă conține nutrienți dizolvați, substrat și metaboliți dizolvați.
▪ Faza solidă este formată din celule individuale, substrat insolubil sau produși
metabolici prec
Amestecare și agitare = Pentru transferul energiei nutrienților, substratului și
metaboliților în bioreactor.
Efecte:
- dispersia aerului în soluția de nutrienți;
- omogenizarea temperaturii și a concentrației nutrienților în fermentator;
- suspensia microorganismelor și a nutrienților solizi;
- dispersia lichidelor imiscibile.
▪ Viteza relativă dintre mediul nutritiv și celulele individuale - 0,5 m/sec.
▪ Mediul nutritiv - în funcție de modul de comportare la agitare:
- Soluții vâscoase cu proprietăți newtoniene și ne-newtoniene;
- Soluții vâscoelastice în care proprietățile stării lichide normale nu sunt observate
în vasele de agitare.
 Lichide newtoniene si nenewtoniene
Dacă vâscozitatea nu depinde de viteza de deformare fluidul se numeşte
newtonian.
Apa, uleiurile minerale pure şi alte lichide larg utilizate în tehnică
satisfac această condiţie.
Numeroase lichide funcţionale, îndeosebi cele sintetice conţin aditivi cu
greutăţi moleculare mari, care conferă un caracter nenewtonian
comportării vâscoase
Vâscozitatea = abilitatea materialului de a rezista la deformare (afectează cel mai
mult comportamentul fluidului). Acest comportament afectează pomparea,
malaxarea, transferul de căldură, transferul de masă și aerarea
Soluțiile de polizaharide și ale câtorva antibiotice rezultate prin fermentare sunt
lichide nenewtoniene.
Majoritatea soluțiilor de fermentare se comportă ca un lichid nenewtonian.
Soluțiile neinoculate și culturile de bacterii se comportă ca un lichid newtonian.
Schimb de gaze și transfer de masă

▪ oxigenul este cel mai important substrat gazos

▪ bioxidul de carbon este cel mai important produs metabolic gazos.
Oxigen - factor de limitare al fermentării.
Oxigenul are solubilitate mică: 9 mg care se dizolvă într-un litru de apă la 20ºC într-
un amestec aer/apă. (cantitate consumată în câteva secunde). Alimentarea cu
oxigen se face continuu.
▪ Majoritatea proceselor microbiene aerobice sunt limitate de oxigen – evidențiat
transferul de oxigen.
▪ De exemplu, solubilitatea la 33ºC este 7,2 mg oxigen/l.
▪ Pentru ca oxigenul să fie transferat din bulele gazose în celule, exista câteva
obstacole:
- rezistența dintre gaz și faza limită;
- penetrarea fazei limite dintre bulele de gaz și lichid;
- transferul de la fază limită la lichid;
- mișcarea în cadrul soluției de nutrienți;
- transferul către suprafața celulei.
REZISTENTA TRANSFERULUI DE OXIGEN DINTRE
BULELE DE AER SI CELULA MICROBIANA
▪ Cel mai important factor care controlează rata de transfer = rezistența fazei
limită dintre bulele de gaz și lichid (pt fermentatoarele având un singur
microorganism ca bacterii sau drojdii)
▪ Celulele microbiene care sunt în apropierea bulelor de gaz pot absorbi direct
oxigen prin faza limită cu o rată de transfer a gazului crescută.
▪ În celulele aglomerate, transferul de oxigen poate fi un factor limitativ. Transferul
de masa al oxigenului în lichid poate fi caraterizat prin:
- rata de transfer de oxigen
- coeficient de transfer volumetric al oxigenului.
= parametri critici pentru funcționarea bioreactorului dependenți de:
▪ Diametrul și capacitatea vasului;
▪ Proprietățile de amestecare;
▪ Sistemul de aerare;
▪ Soluția de nutrienți: compoziție, densitate, vâscozitate;
▪ Microorganism: morfologie, concentrație;
▪ Agent antispumant utilizat;
▪ Temperatura.
▪ Agentii antispumare reduc rata de transfer a oxigenului în apa pură;
▪ Microorganismele acționează ca o barieră
▪ Bulele de gaz dispar în locațiile bioreactorului unde există presiune negativă, cum ar fi în
spatele lamelor de la agitator.
▪ La aerare mică se formează bule mari în spatele turbinei. Energia este mai mică cu o
treime decât la sistemele nearate. La rate mari de aerare, multe bule mari de gaze aderă
una de alta rezultând o dispersie mică a gazelor.
▪ Concentrația critică de oxigen este termenul utilizat care indică valoarea ratei
consumului de oxigen sau rata de absorbție a oxigenului.
▪ În general, concentrațiile critice de oxigen sunt de 5-25% din valoarea de saturație a
oxigenului în culturi.
▪ La rata de absorție a oxigenului care este mai mică decât concentrația critică, rata
respirației este corelată cu concentrația de oxigen din soluție.
▪ Peste această valoare nu există nici o dependență între rata respirației și oxigenul
dizolvat.
▪ În fluidele newtoniene, cum sunt sunt cele ale fermentației drojdiilor sau bacteriilor,
concentrația critică de oxigen este constantă și nu este afectată de condițiile de
fermentare.
▪ În soluțiile nenewtoniene, cum ar fi acelea ale microorganismelor filamentoase,
concentrația critică de oxigen este dependentă de condițiile de fermentare.
Încălzire
▪ Producție optimă: fermentatoarele trebuie să aibă o temperatură constantă.
▪ Rata de încălzire din cauza agitării, aerarii și din cauza activitătii metabolice trebuie să fie
balansată de pierderea căldurii rezultată din evaporare și radiație, sistem de răcire.
▪ Metabolismul: evoluția încălzirii este o consecință a termodinamicii activității microbiene - în
relație cu utilizarea carbonului și a sursei de energie.
▪ sursa de carbon este încorporată activ în biomasă, prin anabolism, în timpul creșterii
microorganismelor, circa 40-50% din entalpia disponibilă în substrat este conservată în
biomasă, restul fiind eliberată sub formă de căldură.
▪ sursa de carbon este catabolizată, toată entalpia asociată cu oxidarea substratului este
eliberată sub forma de căldură.

Sterilizare
▪ Toate procesele de fermentare au un anumit grad de contaminare în toate stadiile, de la
cultura preliminară până la fermentator.
▪ Un fermentator poate fi sterilizat prin distrugerea microorganismelor, cu agenți letali, cum ar
fi: temperatura, radiația, substanțele chimice, sau prin înlăturarea microorganismelor viabile
prin proceduri fizice, ca filtrarea.
▪ Pentru a asigura sterilizarea corespunzătoare, în timpul fermentației este
necesar să se urmărească:
- sterilizarea mediului de cultură;
- sterilizarea aerului intrat și ieșit;
- Construcția corespunzătoare a bioreactorului pentru sterilizare și pentru
prevenirea contaminării în timpul fermentarii.

Sterilizarea mediului de cultură

▪ Mediul de cultură conține diferite varietăți de celule vegetative și spori,
derivate ai componenților mediului de cultură, apă și vasul de cultură.
▪ Anumiți factori influențează succesul sterilizării prin căldură: numărul și
tipul microorganismelor prezente, compoziția mediului de cultură,
valoarea pH, mărimea particulelor suspendate. Celulele vegetative sunt
rapid eliminate la o temperatură relativa mica, 60ºC, 5-10 minute, dar
pentru distrugerea sporilor, temperatura este de 121ºC timp de 15 minute.
▪ În timpul sterilizării există întotdeauna posibilitatea distrugerii ingredientelor din
mediu.
▪ Un fenomen comun care apare des este reprezentat de reacțiile de îmbrunare
tip Maillard, reacții care conduc la schimbări ale culorii mediului și la pierderi de
nutrienți. Aceste reacții sunt cauzate de grupele carbonil, din reducerea
glucidelor, care interacționeaza cu grupele aminice din aminoacizi și proteine.
▪ Soluția existentă pentru a preveni aceste reacții este sterilizarea separată a
glucidelor din mediu .
▪ Sterilizarea filtrantă este adesea utilizată pentru mediile nutritive sensibile la
temperaturi ridicate. Glucidele, vitaminele, antibioticele sau componentele
sângelui sunt exemple de compuși termolabili care necesită să fie sterilizați prin
filtrare.
▪ Majoritatea nutrienților de mediu sunt sterilizați în bioreactor la 121ºC. Timpul de
sterilizare poate fi calculat în funcție de natura mediului și de mărimea
fermentatorului. Sterilizarea trebuie să aibă în vedere și alte elemente care intră
în contact cu mediul nutritiv: fitinguri, valve și electrozi.
▪ Timpul de sterilizare este semnificativ mai mare decât cel calculat și trebuie
determinat empiric pentru nutrienții specifici din mediul nutritiv existent în
fermentator.
▪ Pentru fermentatoarele mai mici, sterilizarea mediului nutritiv se face în
autoclav, în timp ce pentru fermentatoarele mai mari, sterilizarea se face cu
injecție de abur.
Sterilizare aer
▪ Majoritatea fermentatoarelor operează în condiții de aerare iar aerul trebuie
sterilizat.
▪ Numărul microorganismelor din aer variază în funcție de locație, mișcarea
aerului și tratamentul anterior al aerului.
▪ în medie, aerul conține 10-100.000 particule pe m3 și 5-2000 microorganisme
pe m3. Dintre acestea, 50% sunt spori de mucegaiuri și 40% sunt bacterii gram
negative.
▪ Fermentatoarele lucrează în general cu rate de aer de 0,5-2 volume aer/volum
de lichid pe minut.
▪ Metodele disponibile pentru sterilizarea gazelor includ filtrarea, injectia de gaz,
radiația (UV) și temperaturile înalte. Dintre acestea, numai filtrarea și utilizarea
temperaturilor înalte sunt utilizate.
 Schema tehnologică a procesului de fermentare
▪ Conservarea inoculului
▪ Pregătirea inoculului
▪ Inocularea în fermentator
1. Conservare inocul = menținerea tulpinilor cât mai mult posibil fără ca celulele să se divizeze.
Pentru conservare se folosesc 3 tehnici:
▪ depozitare la temperaturi scăzute (2-6ºC);
▪ depozitare la temperaturi de congelare (18, -80 sau -196ºC);
▪ liofilizare.
▪ Cea mai des utilizată metoda este congelarea. Proporția de celule vii este critică deoarece
până la 95% dintre microorganisme mor în timpul congelării și decongelării.
2.Creștere inocul
▪ Cultura depozitată este revitalizată prin creștere în balon Erlenmeyer pe un agitator sau un
mediu solid. Pentru a obține un inocul suficient pe un mediu solid, trebuie obținute în
paralel o serie de culturi.
▪ După liofilizare, creșterea inoculului se face în 4-10 zile; după congelare în 4-48 ore pentru
bacterii și 1-7 zile pentru fungi, iar după refrigerare 1-5 zile pentru fungi și 4-24 ore pentru
bacterii.
3. Inoculare și creștere a celulelor în fermentator
Mediul nutritiv pentru producție trebuie optimizat nu numai în ceea ce priveste ingredientele
utilizate ci si modul in care mediul este preparat si sterilizat precum si valoarea pH-ului dinainte
si dupa sterilizare.
Cei mai importanți parametri în timpul fermentării sunt: temperatura, aerarea și agitarea.
Managementul procesului constă în:
▪ Setarea conditiilor inițiale ale procesului;
▪ Monitorizarea procesului;
▪ Elaborarea unui manual de corectare a parametrilor procesului;
▪ Decizia când se termină, transferă sau se obține producția de biomasa;
▪ Calcularea masei și balanței termice, ale ratelor de reacție, cineticile și producțiile;
▪ Inregistrările statistice și arhivare;
▪ Monitorizarea contaminării și procesului de igienă.
▪ Măsurătorile care se fac pentru a verifica buna funcționare a procesului:
Masuratori directe Date de proces
pH formarea produsilor acizi
oxigenul dizolvat rata de transfer a oxigenului
oxigen evacuat cu gazele rata consumului de oxigen
rata fluxului de gaz
bioxidul de carbon evacuat cu gazele rata evolutiei bioxidului de carbon
rata fluxului de gaz
rata de consum a oxigenului coeficient de respiratie
rata evolutiei bioxidului de carbon
nivelul glucidelor productie, densitate celulara
rata de alimentare cu glucide
rata evolutiei bioxidului de carbon
 Este necesar un plan de controlul parametrilor tehnologici:

Masuratori Control
viteza agitarii, rpm schimbare a agitarii, rpm
puterea agitarii -
temperatura, ºC incalzire/racire
rata fluxului, l/min schimbare a ratei fluxului, l/min.
oxigen dizolvat, % schimbarea a agitarii, rpm
schimbare a ratei fluxului, l/min.
schimbare a compozitiei gazului, %
schimbare a presiunii, bar
pH adaugarea de acid sau baza
rata de alimentare cu sursa de carbon
Spuma adaugare de agent antispumant
Analiza gazelor eliminate schimbare a ratei de alimentare
Presiune schimbare a presiunii, bar
Greutate schimbare a ratei fluxului, l/min.
schimbare a ratei de alimentare
Redox adaugare de aditivi de schimbare a
potentialului redox
Turbiditate schimbare a ratei de alimentare
Măsurători într-un fermentator și metode de măsurare utilizate
▪ Fermentarea = cultivarea pe scară largă a celulelor
▪ Optimizarea producției:
- maximum de produs;
- în cel mai scurt timp;
- cât mai puține costuri
- descrierea cantitativă a sistemului culturii celulelor. Determinarea cineticii
sistemului – previziuni pentru:
- producție;
- timpii de reactie;
- marimea bioreactorului.
▪ Cinetica reacțiilor - înainte de costrucția sistemului la scară dorită (industrială,
pilot).
▪ Sistemele de culturi de celule:
- multe intrări;
- multe ieșiri;
- Reacțiile catalitice proprii se propagă singure
▪ Cuantificarea sistemelor de culturi celulare - modele matematice.
▪ Model matematic = descrierea matematica a unui sistem fizic.
▪ Modelul matematic – aspectele importante ale proceselor.
 Ex. reacția chimică de ordinul 1, în care o moleculă de reactant (S) este
convertit la produsului (P), are următoarea ecuație:
1

care poate fi exprimată ca o ecuație diferențială cu forma:

în care [S] este concentrația reactantului și k este o rată constantă

Se observă că pentru aceasta reacție, o ecuație diferențială a formării produsului este:

3 sau 4

[P] = concentrația produsului;

n = constantă stoechiometrică ce descrie relația dintre consumul lui S și formarea lui P.
- descreșterea concentrației lui S conduce la creșterea lui P și de aici semnul negativ în ecuațiile 4
și 5.
Prin rezolvarea celor două ecuații este posibil să se afle valorile lui S și a lui P în orice timp.
Ecuația Michelis Menten este un model matematic ce descrie activitatea diferitor
enzime:

▪ [S] este concentrația substratului;

▪ V este rata de consum a substratului;
▪ Vmax este maximum al ratei specifice;
▪ Km este constanta de saturație.

Ecuația Michaelis Menten descrie rata de substrat degradată de enzime și care poate fi
scrisă și sub forma:

6
Rata de formare a produsului [P] din această reacție este:

6
7

[P] = este concentrația produsului;

Y = un coeficient stoichiometric de producție.
Din modelele matematice prezentate mai sus se pot observa urmatoarele:

Utilizarea ecuațiilor diferențiale

- descriu ratele de schimb în cadrul unui sistem.
- fiecare ecuație conține variabile și parametri
▪ Variabilele în modelul Michaelis Menten sunt: [S] și [P];
▪ Valorile lor se schimbă în timp;
▪ Variabilele sunt exprimate deobicei în concentrații (g/l).
▪ Vmax, Km si Y sunt parametri si nu se schimba in timp.
▪ Parametrii sunt termeni constanti in anumite conditii date. Pentru fiecare conditie (pH, T,
catalizatori) sunt necesari un set diferit de parametri.
▪ In modelul Michaelis Menten (ecuatiile 6-8), temperatura si pH-ul raman constante.
▪ Aceasta inseamna ca modelul va fi aplicat numai in acele conditii de pH si temperatura.
Modelul presupune de asemenea ca temperatura este cea corepunzatoare activitatii
enzimei (nu este prea mare pentru a nu cauza denaturarea enzimei).
▪ Temperatura si pH-ul pentru care modelul este aplicat sunt exemple de factori limitativi in
cadrul carora modelul este valid.
 Stoichiometria reactiilor biochimice
▪ Modelele reactiilor chimice si biochimice descrise, folosesc coeficienti stoechiometrici
pentru a determina cantitatea de produs sau biomasa ce urmeaza a se obtine din fiecare
unitate de reactant sau substrat utilizat.
▪ Coeficientii descriu, de asemenea, cat de eficient este convertit un reactant in biomasa.
▪ Exemplu: formarea acidului lactic din glucoza in timpul activitatii musculare mai intense se
face dupa urmatoarea ecuatie:
1 mol de glucoza = 2 moli de lactat
▪ Productia de lactat din glucoza (YLG) este de 2 moli de lactat (L) pe mol de glucoza (G).
Relatia dintre formarea lactatului si utilizarea glucozei este:

Modelul matematic pentru descrierea utilizarii glucozei de catre celulele musculare si ale ficatului
este totusi mult mai complex. In realitate, productia va fi mai mica decat 2 moli/mol deoarece unii
dintre atomii de carbon vor fi folositi la respiratie sau in alte activitati celulare.
Factorii de productie trebuie determinati experimental, ecuatia 10 reprezentand o stoechiometrie
ideala, care poate fi utilizata doar ca ghidare.
 Bioreactoare
▪ Cultivarea pe scara larga se face in vase de reactie specializate numite
bioreactoare sau fermentatoare. Termenul de fermentatie este adesea utilizat
pentru a descrie cultivarea celulelor in fermentatoare. Exista 3 mari categorii de
bioreactoare: discontinua, in sarje; semicontinua si continua

Bioreactorul este umplut cu mediu

proaspat si apoi inoculat. La sfarsitul
fermentarii continutul este indepartat iar
reactorul este curatat, spalat, sterilizat si
reumplut pentru urmatoarea fermentare.

Dintre cele 3 sisteme, cel semicontinuu este cel

mai utilizat pentru a produce produsi biologici.
Reactoarele discontinui sunt pe locul doi. Desi
cele continui sunt foarte rar utilizate in
productia industriala, ele sunt folosite in
tratamentul deseurilor.
Bioreactoare continui = mediul proaspăt
este continuu adăugat și în același timp
parte din fluidul din bioreactor este în
continuu îndepărtat. celulele se propagă
continuu, în mediul proaspăt ce este
introdus continuu și în același timp,
produșii metabolici (deșeuri) și celulele
care sunt îndepărtate continuu. Celulele
pot fi imobilizate pentru a maximiza
reținerea lor și astfel pentru a crește
productivitatea.

La acest tip de bioreactoare mediul proaspăt

este adăugat fără o continua îndepărtare.
Când volumul reactorului este plin,
fermentatorul este golit, parțial sau complet
și procesul reîncepe.
Curba de creștere exponențială
Când celulele cresc în cultură, ele trec prin
4 faze: faza lag, faza exponențială log, faza
staționară și faza morții.

Realizand un grafic al logaritmului

concentrației de celule funcție de timp va
rezulta o linie dreaptă pentru secțiunea
reprezentând faza exponențială
▪ Faza exponentiala - are loc cresterea concentratiei de celule si cresterea ratei de
crestere a celulelor.
▪ Celulele se autocatalizeaza: ele catalizeaza reactiile si se reproduc pentru a produce
mai multi catalizatori.
▪ Considerand o singura celula in reactor, aceasta se divide la fiecare ora.
▪ Populatia celulara la fiecare timp de generatie poate fi
determinat astfel:

▪ Cu fiecare generatie, concentratia celulelor in reactor se dubleaza.

▪ Daca numarul de celule este trecut pe un grafic functie de timp, se obtine o curba
exponentiala. Daca conditiile raman constante, rata de crestere a celulelor (sau a
biomasei) este dependenta de concentratia celulelor prezente in reactor care va fi
mai departe descrisa prin relatia:
dX/dt = αX
unde X = concentratia de biomasa din bioreactor. Concentratiile de biomasa sunt
exprimate in g/l de substanta uscata.

10
▪ Acest model reprezinta cresterea microbiana si se
refera la modelul cresterii exponentiale. 10
▪ Rata specifica de crestere (μ) descrie cat de repede
se reproduc celulele.
▪ Cu cat valoarea ratei specifice de crestere este mai Ecuatia 10 prezinta o
mare, cu atat celulele cresc mai repede. relatie intre concentratia
biomasei (X) si timp (t).
▪ Cand celulele nu cresc, rata specifica de crestere este
zero. Rearanjata, devine,
ecuatia 11:
▪ In timpul fazei exponentiale rata specifica de crestere
este relativ constanta.
11

si integrand-o in intervalul de timp t0 – t1, daca la timpul t0 concentratia biomasei in bioreactor

este reprezentata de X0 si la t1 concentratia biomasei este reprezentata de X1, ecuatia 11
devine:

12
 ▪ Cand µ este constant in timpul fazei exponentiale:

13

Integrand ambele parti, se obtine: 14

15

In final: 16

Ecuatia 14 descrie relatia exponentiala intre concentratia biomasei si timp.

14

Rata specifica de crestere

Ecuatia 14 reprezentata grafic, ln x functie de timp se va obtine o linie dreapta.

Panta liniei este echivalenta cu

rata specifica de crestere (µ).

16

Limitari ale modelului de crestere exponentiala

▪ In derivarea ecuatiei 16 se presupune ca rata specifica de crestere este constanta.
▪ Aplicarea ei se poate face numai in faza de crestere exponentiala si cand cresterea celulelor
inceteaza, µ=0.
▪ Modelul de crestere exponentiala arata ca biomasa nu se opreste din crescut.
▪ Cand nutrientii disponibili scad in cantitate, rata de crestere a celulelor va fi mai lenta sau eventual se
opreste. In acelasi timp, celulele vor produce produsi finali metabolici care vor inhiba cresterea celulelor.
▪ Cresterea exponentiala nu va exista daca exista oxigenul ca factor limitativ sau conditiile de amestecare
nu sunt corespunzatoare. In acest caz, cresterea va limitata de transferul de masa.
▪ Cresterea non-exponentiala va apare cand divizarea celulelor nu este la o rata constanta. Acest fenomen
este comun mucegaiurilor si altor organisme multicelulare. Cresterea non-exponentiala a fost observata
la multe tipuri de celule animaliere si la cateva organisme care se reproduc prin inmugurire.
 Relatia dintre dublarea timpului si rata specifica de crestere
▪ Dublarea timpului (tD) este o expresie utilizata de catre microbiologi pentru a descrie
rata de crestere a celulelor. Ea reprezinta timpul necesar ca populatia celulara sa se
dubleze.
▪ In timpul fazei exponentiale, tD va fi aproape constant. Relatia dintre dublarea
timpului si rata pecifica de crestere este descrisa mai jos. Daca concentratia
biomasei se dubleaza de la X1 la 2 X1 peste dublarea timpului tD (= t2-t1), ecuatia
15 devine:

15 17

18

Astfel vom obtine o relatie dintre dublarea timpului si rata specifica de crestere:

19
 Limitarea creșterii de către nutrienți

Disponibilitatea nutrientilor are o influenta majora in rata specifica de crestere.

Daca un nutrient este disponibil in concentratii care limiteaza cresterea celulelor
atunci este numit nutrient limitativ de crestere.
Cand nutrientul care limiteaza cresterea este carbonul si sursa de energie atunci
ne referim la un substrat limitativ de crestere.
Cateva medii de fermentatie sunt realizate astfel incat la sfarsitul fermentatiei
numai sursa de carbon sa fie furnizata limitativ. Altele sunt realizate astfel incat
azotul sa fie factorul limitativ.
In cateva fermentatii, disponibilitatea nutrientilor altii decat carbonul si sursa de
energie este intentionat controlata, astfel incat sa se incetineasca sau previna
cresterea celulelor. Aceasta este realizata pentru a se asigura ca celulele
catalizeaza conversia substratului la un produs si substratul nu este utilizat
pentru sinteza blocurilor celulare.
https://www.youtube.com/watch?v=yS_rg7rzkSQ