DOZAREA ACTIVITATII TRANSAMINAZELOR SERICE

Transaminazele sunt enzime din clasa transferazelor mai exact “amino transferaze”, ele
transferand o grupare amino de pe un amino- acid pe un ceto-acid, favorizand formarea unui nou
amino acid necesar unei bune functionari a organismului. Transaminazele au drept coenzimă
vitamina B6 (in forma fosforilata la nivelul carbonului 5, adica piridoxal-5-fosfat sau PLP). Dupa
fosforilarea vitaminei B6 alimentare la nivelul mucoasei jejunului, coenzima va participa activ in
mecanismul de transaminare, prin legarea gruparilor amino ce vor fi transferate (se formeaza
niste compusi speciali numiti baze Schiff).
Se disting doua tipuri de transaminaze : Alanin-aminotransferaza (ALAT, ALT) numită și
GPT (TGP) cu o distribuție predominantă la nivelul ficatului și Aspartat-aminotransferaza
(ASAT, AST) numită și GOT (TGO) cu o distribuție la nivelul muschiului scheletic, dar mai ales
al cordului.

DOZAREA ENZIMATICĂ A ACTIVITĂȚII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI

(ALAT)

Principiul metodei:

1. Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie:

COOH COOH
CH2 CH3 CH2 CH3

CH2 + ALAT CH2 + C O

CH NH2
C O COOH CH NH2 COOH

COOH COOH

Acid  -cetoglutaric Alanina Acid glutamic Acid piruvic

2. Deoarece reactia din pasul 1 nu genereaza nici un compus care sa poata fi masurat,
este nevoie si de o a doua reactie care este cuplata cu prima. Piruvatul format mai sus
este transformat în lactat de către NADH+H+ în reacţia catalizata de LDH (lactat
dehidrogenază) conform reacţiei:

LDH
CH3 C COOH CH3 CH COOH
O NADH+H+ NAD OH

Acid piruvic Acid lactic

1
 NADH+H+ este o coenzima specifica multor reactii de hidrogenare/dehidrogenare (se
obtine din vitamina PP) si are drept caracteristica fizica importanta o buna absorbtie a luminii
UV, mai ales la 340 nm. Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH+H + pe măsură
ce trece în NAD+, prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea
ALAT. Se prefera citirea in timp a absorbantei NADH+H + (metoda cinetica) si nu o singura
citire la final (metoda end-point) deoarece s-a observat ca rezultatele obtinute in cazul
masuratorilor enzimatice sunt mult mai precise daca se folosesc metode cinetice.

Deoarece este vorba de o determinare enzimatica, rezultatul final nu se poate da in mg,

mmoli sau g/dL pentru ca metoda de determinare nu cuantifica enzima din punct de vedere al
masei ci din punct de vedere al activitatii. Este universal acceptat ca unitatea de masura pentru
enzime sa fie U/L (unitati internationale/litru). O unitate internationala enzimatica reprezinta
numarul de micromoli de substrat transformati intr-un minut (de obicei la 37 0C si pH optim) de
catre enzima.

Reactivi:

1. Soluţie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat 100 mM şi pH=7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH++H+ 0,2 mM, LDH 10mg/l în tampon
fosfat 100 mM, pH=7,4
Mod de lucru:
În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000

Ser (µl) 50
Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 340 nm. Citirea se face
după un minut și apoi la 3 minute la temperatura de 370 C

Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se
notează cu (A/min).

Activitatea ALAT în UI/l =(A1-A3)/(t3-t1) x3333 (factor de corecție)

Observaţii: dacă valoarea (A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1
ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

2
 Intervale de referinţă:

37 C
Bărbaţi pînă la 40 UI/l
Femei pînă la 31 UI/l

DOZAREA ENZIMATICĂ A ACTIVITĂȚII ASPARTAT

AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)

Structura:

PLP is found in the active site of the enzyme, circled in this

image

Sursa: https://study.com/academy/lesson/.

Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizează următoarea reacţie:

COOH COOH
COOH
CH2 CH2 COOH
CH2 ASAT
CH2 CH2 CH2
CH NH2
C=O HC NH3 C=O
COOH
COOH COOH COOH

Acid Acid Acid Acid

α cetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic

3
 Oxalacetatul format este transformat în malat de către NADH ++ H+ în reacţia catalizată
de MDH (malat dehidrogenază) conform reacţiei:

COOH COOH
C=O MDH HC OH
CH2 CH2
NADH+H+ NAD
COOH COOH

Acid oxalacetic Acid malic

Se măsoară viteza de diminuare a cantităţii de NADH+H+ pe măsură ce trece în NAD+,

prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea enzimei ASAT.
Reactivi:

1. Soluţie substrat: aspartat 200 mM în tampon fosfat 100 mM şi pH =7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH++H+ 0,2 mM, LDH 10mg/l, MDH
10 mg/l în tampon fosfat 100 mM pH=7,4
Mod de lucru:
În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1
parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000

Ser (µl) 50
Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 340 nm. Citirea se face
după un minut și apoi la 3 minute la temperatura de 370 C

Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se
notează cu (A/min).

Activitatea ALAT în UI/l =(A1-A3)/(t3-t1) x3333 (factor de corecție).

4
 Intervale de referinţă:

37 C
Bărbaţi pînă la 37 U/l
Femei pînă la 31 U/l

Interpretarea rezultatelor:

Enzimele din clasa transaminazelor sunt enzime nefuncționale plasmatic, avand activitate
metabolică în interiorul celulei. Cunoaşterea localizării enzimelor la nivelul diferitelor organite
celulare este extrem de utilă nu numai pentru intelegerea modului de dirijare a proceselor
metabolice, ci şi pentru interpretarea rezultatelor furnizate de laboratorul clinic. Pentru practica
medicală este important de reţinut că alaninaminotransferaza (ALAT) este localizată doar la
nivel citoplasmatic (unilocular) fiind un indicator al afecţiunii acute pe cînd
aspartataminotransferaza (ASAT) este localizată atît la nivel citoplasmatic şi mitocondrial
(bilocular) indicînd mai fidel o afectare cronică (de ex., tehnici imunologice diferenţiază intre
cASAT şi enzima mASAT).
Transaminazele prezinta utilitate clinică în afecțiuni ale ficatului, cordului și muschiului
scheletic. Sunt enzime de citoliză, prezența lor crescută în ser fiind un indicator al lezării
membranei hepatocitelor și implicit a creșterii permeabilității membranei celulare. Nivelul seric
al acestor enzime de leziune, variază în funcţie de numărul de hepatocite afectate, de gravitatea
lezării fiecărei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea şi de viteza de eliminare din ser (t
1/2) a enzimelor respective.

Valori crescute:

Valori crescute ale transaminazelor se întalnesc în două tipuri majore de afecțiuni:

A. Afecțiuni hepatice:
- - Afectiuni acute: hepatite (virale, toxice (ex alcool), intoxicație cu tetraclorură de
carbon) valorile pot atinge ordinul sutelor sau chiar miilor de unități.Valoarea ALAT
poate fi corelata cu cea a ASAT prin folosirea raportului De Rittis: ASAT/ALAT =
1,3 – 1,5 in mod normal. Cresterea acestui raport (util doar daca transaminazele au
valori crescute) indica uneori o afectare mai severa a ficatului sau etiologie
alcoolica. Monitorizarea în dinamică este extrem de utilă pentru aprecierea gradului
de refacere a permeabilității membranare.
- Afecțiuni cronice: se remarcă în hepatitele cronice cu virus B sau C, hepatite
alcoolice sau cauzate de medicamente, valorile pentru transaminaze în aceste cazuri
sunt moderat crescute. Este de remarcat ca hepatitele cronice inactive (persistente)
vor genera valori mult mai mici ale transaminazelor (chiar apropiate de normal) pe
cand hepatitele cronice active (agresive) vor genera valori mari ale TGP si TGO
(uneori apropiate de hepatitele acute).
- In ciroza (afectiune grava hepatica cu un grad ridicat de distrugere a hepatocitelor)
transaminazele vor fi evident crescute. In aceasta situatie, o normalizare a

5
 transaminazelor poate sa arate terminarea rezervei functionale hepatice, indicand
practic ca pacientul se afla intr-un stadiu terminal al bolii.
B. Afecțiuni cardiace: creșterea independentă a lui ASAT fără modificarea activității
ALAT apare în infarctul de miocard (blocarea unei artere coronare cu necroza
tesutului deservit) și în unele afecțiuni ale mușchiului striat (de exemplu in
traumatisme musculare). În cazul infarctului de miocard valorile ating un maxim în
primele 48 de ore de la producerea evenimentului, revenind la normal în 3-5 zile.

Valori scăzute :

 deficit de piridoxal fosfat (vitamina B6)

 afecțiuni renale

OBS. Trebuie să reținem că nu totdeauna creșterea moderată a valorilor transaminazelor

este sinonimă cu patologia, pot apărea creșteri în urmatoarele situații (obezitate, activitate fizică
intensă, consumul unor medicamente cum ar fi contraceptivele orale sau antiepilepticele). Exista
si posibilitatea unor valori fals crescute (daca serul folosit pentru analiza este hemolizat) sau fals
scazute (daca serul de analizat se lucreaza cu intarziere si enzimele devin inactive).