ACADEMIA DE ŞTIINŢE A REPUBLICII MOLDOVA

INSTITUTUL DE GENETICĂ ŞI FIZIOLOGIE A PLANTELOR

Cu titlu de manuscris

CZU:581.8:581.19: 576.311:576.535:581.145.2:633.88

CALALB TATIANA

STRUCTURA ŞI COMPOZIŢIA BIOCHIMICĂ A FRUCTELOR

DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT
IN VIVO ŞI IN VITRO

SPECIALITATEA: 03.00.05 – BOTANICA

Teza de doctor habilitat în biologie

Consultanţi ştiinţifici: Boris Matienco , academician,

doctor habilitat în biologie,
profesor universitar
Anatol Jacotă ,academician,
doctor habilitat în biologie,
profesor universitar

Autorul:

CHIŞINĂU, 2010
© Calalb Tatiana, 2010

2
 CUPRINS
ADNOTARE........................................................................................................................... 7
LISTA ABREVIERILOR..................................................................................................... 10
INTRODUCERE................................................................................................................... 11
1. ASPECTE ANATOMICE, ULTRASTRUCTURALE, BIOCHIMICE ŞI
BIOTEHOLOGICE ALE FRUCTELOR SUCULENTE IN VIVO ŞI IN VITRO.......... 21
1.1. Consideraţii botanice privind specia Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot................ 21
1.1.1. Încadrarea sistematică şi etimologia speciei Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot 21
1.1.2. Aspecte ecologice şi particularităţi biologice............................................................. 22
1.2. Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot – trecut, present şi perspective......................... 24
1.3. Compoziţia biochimică şi virtuţile terapeutice ale fructelor de aronie..................... 26
1.4. Localizarea şi rolul biologic al compuşilor fenolici în plante...................................... 29
1.4.1. Localizarea flavonoidelor, acizilor fenolici, taninurilor.......................................... 30
1.4.2. Rolul biologic al compuşilor fenolici......................................................................... 31
1.5. Culturi celulare şi tisulare in vitro la fructe ................................................................ 32
1.6. Acţiunea factorilor chimici şi fizici asupra dezvoltării culturilor in vitro................. 33
1.7. Acţiunea factorilor chimici şi fizici asupra acumulării metaboliţilor secundari în
culturi in vitro........................................................................................................................ 36
1.8. Studii histoanatomice şi ultrastructurale ale fructelor suculente in vivo.................. 39
1.9. Studii morfologice, anatomice şi ultrastructurale ale biomaselor in vitro............... 41
1.10. Avantaje, necesităţi şi perspectivele dezvoltării biotehnologiilor culturilor celulare
şi tisulare in vitro.................................................................................................................. 43
1.11. Concluzii la capitolul 1 ................................................................................................ 45
2. CARACTERISTICA MATERIALULUI FITOBIOLOGIC ŞI METODE DE
CERCETARE....................................................................................................................... 47
2.1. Materialul fitobiologic de studiu.................................................................................. 47
2.2. Schema experimentelor biotehnologice....................................................................... 47
2.3. Metode microscopice de cercetare................................................................................ 48
2.4. Metode biochimice de analiză........................................................................................ 49
2.5. Metoda de analiză a activităţii antioxidante................................................................ 54
2.6. Metoda de analiză a activităţii antimicrobiene............................................................ 54
2.7. Metode de analiză statistică........................................................................................... 55
3. PARTICULARITĂŢILE ANATOMICE ALE FRUCTELOR DE ARONIA
MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT .............................................................................. 56

3
3.1. Organizarea histoanatomică a pericarpului în ontomorfogeneza fructului.............. 56
3.2. Dinamica transformărilor indicilor structurali în ontomorfogeneza fructului........ 65
3.3. Caracteristica histoanatomică a pericarpului fructului matur.................................. 72
3.4. Modificările structurale ale fructului în funcţie de gradientul ecologo-geografic al
Republicii Moldova .............................................................................................................. 76
3.5. Structuri citoanatomice – suport potenţial în asigurarea calităţii fructelor
suculente de aronie................................................................................................................ 83
3.6. Concluzii la capitolul 3.................................................................................................... 86
4. STUDII BIOTEHNOLOGICE ŞI PARTICULARITĂŢILE STRUCTURALE ALE
CARPOMASELOR PIGMENTATE DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.)
ELLIOT.................................................................................................................................. 88
4.1. Optimizarea compoziţiei chimice a mediului nutritiv pentru inducerea şi
acumularea carpocalusului la aronie ................................................................................... 88
4.1.1. Acţiunea balanţei hormonale a mediului nutritiv asupra carpocalusogenezei...... 88
4.1.2. Acţiunea gradientului concentraţiei zaharozei asupra iniţierii şi
intensităţii carpocalusării .................................................................................................... 89
4.2. Criteriile biologice ale expresiei potenţei proliferative a carpoexplantului ............. 91
4.2.1. Vârsta optimă a fructului donator de explant pentru inoculare .......................... 91
4.2.2. Originea histogenică, dimensiunile şi poziţia explantului în raport cu mediul
nutritiv.................................................................................................................................... 95
4.3. Acţiunea regimului de lumină asupra calusogenezei ................................................. 98
4.4. Perioada calusogenezei şi dinamica acumulării carpomasei .................................... 101
4.5. Frecvenţa şi condiţiile subcultivărilor ........................................................................ 103
4.6. Reacţia morfogenetică a carpoexplantelor în funcţie de regimul nutriţional
al mediului............................................................................................................................. 106
4.7. Studiul citomorfologic al carpomaselor pigmentate ................................................. 111
4.7.1. Carpomasa violacee .................................................................................................. 112
4.7.2. Carpomasa crem-roză............................................................................................... 114
4.7.3. Carpomasa crem-albă................................................................................................ 115
4.7.4. Carpomasa verde....................................................................................................... 116
4.8. Concluzii la capitolul 4.................................................................................................. 119
5. STUDII BIOCHIMICE COMPARATE ALE FRUCTELOR ŞI CARPOMASELOR
PIGMENTATE IN VITRO DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT.......... 121
5.1. Screening-ul biochimic al fructelor şi carpomaselor in vitro ..................................... 121

4
5.2. Studiul calitativ şi cantitativ al acidului ascorbic....................................................... 123
5.3. Studiul biochimic al compuşilor fenolici în fructele in vivo şi carpomasele in vitro. 126
5.3.1. Studiu calitativ şi cantitativ al flavonoidelor............................................................ 126
5.3.2. Studiul calitativ şi cantitativ al antocianilor............................................................. 132
5.3.3. Studiul calitativ şi cantitativ al compuşilor fenilpropanici .................................... 134
5.3.4. Studiul calitativ şi cantitativ al taninurilor.............................................................. 136
5.3.5. Determinarea cantitativă a totalului polifenolic ...................................................... 138
5.4. Studiul compuşilor fenolici în fructe şi carpomasele pigmentate prin metoda
cromatografie de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă..... 140
5.5. Concluzii la capitolul 5................................................................................................. 145
6. ULTRASTRUCTURA FRUCTULUI IN VIVO ŞI CARPOMASELOR IN VITRO
DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT ŞI PRINCIPIILE EVOLUTIVE 147
6.1. Ultrastructura pericarpului în ontomorfogeneza fructului ..................................... 147
6.1.1. Ultrastructura celulelor pericarpului imatur........................................................... 147
6.1.2. Ultrastructura celulelor pericarpului matur............................................................ 150
6.2. Ultrastructura celulelor carpomaselor pigmentate in vitro....................................... 156
6.2.1. Carpomasa violacee.................................................................................................... 156
6.2.2. Carpomasa crem-roză................................................................................................ 159
6.2.3. Carpomasa crem-albă................................................................................................ 162
6.2.4. Carpomasa verde........................................................................................................ 163
6.3. Ultrastructura celulelor fructului şi carpomaselor pigmentate in vitro şi principiile
evolutive ................................................................................................................................ 168
6.4. Concluzii la capitolul 6................................................................................................... 170
7. ASPECTE CITO-, HISTOCHIMICE, ULTRASTRUCTURALE, BIOCHIMICE
ŞI ACTIVITATEA BIOLOGICĂ A COMPUŞILOR FENOLICI ÎN CARPOMASELE
ŞI FRUCTELE DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT............................ 172
7.1.Studiul histochimic şi biochimic al compuşilor fenolici în ontomorfogeneza
fructului................................................................................................................................ 172
7.1.1. Studiul histochimic al compuşilor fenolici în ontomorfogeneza fructului........... 172
7.1.2. Dinamica acumulării compuşilor fenolici în ontomorfogeneza fructului............ 176
7.2. Aspecte citochimice şi ultrastructurale ale biosintezei, localizării, translocării şi
acumulării compuşilor fenolici............................................................................................ 179
7.3. Conţinutul polifenolic şi activitatea biologică a extractelor fructelor in vivo şi
carpomaselor in vitro de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot ....................................... 187

5
7.3.1. Activitatea antioxidantă a extractelor din carpomasele in vitro şi fructele de
aronie.................................................................................................................................... 187
7.3.2. Activitatea antimicrobiană a extractelor din carpomasele in vitro şi fructele de
aronie.................................................................................................................................... 193
7.4. Concluzii la capitolul 7................................................................................................... 196
CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI ........................................................... 197
BIBLIOGRAFIE................................................................................................................... 200
ANEXE................................................................................................................................... 228
Anexa 1. Studii biotehnologice la fructe suculente............................................................ 228
Anexa 2. Particularităţile anatomice ale fructelor de Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot...................................................................................................................................... 230
Anexa 3. Studii biotehnologice şi structurale ale carpomaselor de Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot...................................................................................................................... 242
Anexa 4. Studii biochimice comparate ale fructelor in vivo şi carpomaselor pigmentate
in vitro de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot.................................................................. 259
Anexa 5. Particularităţile ultrastructurii celulelor carpomaselor pigmentate in vitro
Şi pericapului fructului de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot ...................................... 275
Anexa 6. Model biotehnologic de obţinere a carpomasei in vitro de Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot pe suprafaţa mediilor nutritive semisolide.............................................. 288
Anexa 7. Brevetele MD3763, MD83, MD46 .................................................................... 289
Anexa 8. Acte de implemenetare........................................................................................ 308
DECLARAŢIA RIVIND DREPTUL DE AUTOR........................................................... 311
CURRICULUM VITAE al AUTORULUI........................................................................... 312

6
 ADNOTARE
Calalb Tatiana, “Structura şi compoziţia biochimică a fructelor de Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot in vivo şi in vitro”, teza de doctor habilitat în biologie, Chişinău, 2010.
Structura tezei: Introducere, 7 capitole, concluzii, bibliografie din 388 titluri, 199 pagini text de
bază cu 30 tabele, 102 figuri, 8 anexe cu 15 tabele şi 123 figuri. Rezultatele obţinute sunt
publicate în 57 lucrări ştiinţifice. Cuvinte-chee: anatomie, ultrastructură, fruct, Aronia
melanocarpa, biochimie, carpomasă, compuşi fenolici, in vitro, in vivo. Domeniu de studiu:
Botanica. Scopul lucrării: Elucidarea criteriilor de inducere şi acumulare a biomaselor in vitro
din fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot şi evaluarea structurală, ultrastructurală şi
biochimică a carpomaselor in vitro, comparativ cu fructele in vivo. Obiectivele: studiul
histoanatomic în eco- şi carpogeneza fructelor; optimizarea condiţiilor de inducere şi acumulare
a carpomaselor; elucidarea factorilor-vectori în stimularea biosintezei compuşilor fenolici în
carpomase; cercetarea comparată a structurii şi ultrastructurii carpomaselor in vitro şi a fructelor
in vivo; studiul conţinutului fenolic în corelaţie cu activitatea antioxidantă şi antimicrobiană a
carpomaselor in vitro şi a fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot. Noutatea ştiinţifică şi
originalitatea lucrării: Pentru prima dată a fost obţinută carpomasa in vitro din pericarpul
suculent al fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot şi realizată evaluarea comparată
morfologică, anatomică, ultrastructurală, biochimică; determinată activitatea antioxidantă şi
antimicrobiană a carpomaselor in vitro şi fructelor in vivo. Semnificaţia teoretică: Rezultatele
studiului citomorfologic şi biochimic comparativ al carpomaselor in vitro şi fructelor in vivo de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot se înscriu în concepţia carpoecogenezei şi confirmă principiile
evolutive ale transformărilor structurale. Valoarea aplicativă: S-au stabilit condiţiile de iniţiere
şi acumulare a carpomaselor in vitro şi s-au determinat factorii-vectori de obţinere a
carpomaselor, bogate în compuşi fenolici. S-a stabilit corelaţia activităţii antioxidante şi
antimicrobiene cu conţinutul fenolic din carpomasele şi fructele de aronie. Carpocultura in vitro
la A.melanocarpa (Michx.) Elliot poate servi ca model la elaborarea schemei biotehnologice de
producere dirijată a biomaselor ca sursă de materie primă de alternativă. Implimentarea
rezultatelor ştiinţifice: Sunt incluse în: programul de studii la disciplina Botanica farmaceutică
pentru studenţi şi în ciclu de perfecţionare a farmaciştilor „Utilizarea plantelor medicinale şi a
fitopreparatelor autorizate în R.Moldova” cu tematica „Microtehnici de culturi in vitro la plante
medicinale”, catedra Farmacognozie şi Botanică farmaceutică, USMF „Nicolae Testemiţanu”;
manualul „Botanică farmaceutică”, Calalb T., Bodrug M., 2009; „Indicaţii metodice la lucrări
de laborator la Botanica farmaceutică” Calalb T., 2005; cursul universitar „Morfologie şi
anatomie comparată” pentru masterat, catedra Biologie, Facultatea Ştiinţe ale naturii, UnAŞM.

7
 ANNOTATION
Calalb Tatiana, „Structure and biochemical composition of Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot fruits in vivo and in vitro”, a thesis of doctor habilitat in biology, Chisinau, 2010.
The thesis consists: of introduction, 7 chapters, conclusions, 199 text pages with 30 tables and
102 figures, 8 attachments with 15 tables and 123 figures, 388 bibliography references. Results
of the study were published in 57 scientific works. Key words: Aronia melanocarpa, anatomy,
ultrastructure, fruit, biochemistry, carpomass, phenolic compounds, in vitro, in vivo. Domain of
study: Botany. Aim of the study: Identification of the indices for induction and accumulation of
carpomass of A.melanocarpa (Michx.) Elliot fruits, investigation of their structure, ultrastructure
and biochemical composition in comparison with their analogs, obtained in vivo. Tasks:
histoanatomical study in eco- and carpogenesis; optimization of the conditions for carpocallus
induction and accumulation; elucidation of vector-factors for stimulation of phenol biosynthesis
in carpomass; comparative study of structure and ultrastructure of carpomass in vitro and fruits
in vivo; qualitative and quantitative determination of phenols; carry out a correlation analysis
between phenol content of A. melanocarpa (Michx.) Elliot carpoextracts, obtained in vivo and in
vitro and its antioxidant and antibacterial activities. Scientific innovation and originality: For
the first time was obtained carpomass in vitro from succulent fruit of A. melanocarpa, which was
evaluated with morphological, celullar and biochemical methods, also were determinated its
antioxidant and antibacterial activities in comparison with fruits in vivo. Theoretic significance:
Comparative cytoanatomical and biochemical results of investigation of carpocallus cells in vitro
and fruit of A. melanocarpa reflect the carpogenesis and ecocarpogenesis conception and
confirm principles of the structure modifications in evolution. Application value: The
conditions of carpomass induction and accumulation in vitro were established and the vector-
factors to obtain the carpomass-rich in phenol compounds were determined. The correlation
between antioxidant, antibacterial activity against virulent microorganisms, and phenolic
content of A. melanocarpa was established. A. melanocarpa carpoculture in vitro may be the
model of the biotechnological scheme for manipulating produce of biomass as a source of
alternative raw material. Application of the scientific results: The results are applied in: the
Program of pharmaceutical education of the students of SUMP „Nicolae Testemiţanu”; manual
„Pharmaceutical Botany”, Calalb T., Bodrug M., 2009; „Indications for laboratory works of
Pharmaceutical Botany”, Calalb T., 2005; the Program of raising the level of one’s skill of
pharmacists of SUMP „Nicolae Testemiţanu” with the course „Medicinal plant cell and tissue
culture in vitro”; Universitary course „Comaparative mophology and anatomy” for masterat,
Biology chair, Nature science Faculty of University of Academy of Sciences of Moldova.

8
 РЕЗЮМЕ
Калалб Татьяна, «Структура и биохимический состав плодов Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot in vivo и in vitro», диссертационная работа на соискание ученой степени
доктора хабилитат биологических наук, Кишинэу, 2010.
Структура работы: Введение, 7 глав, выводы, 388 библиографических источников, 199
страниц текста, 30 таблиц, 102 рисункa, 8 приложений (15 таблиц, 123 рисункa).
Полученные результаты опубликованы в 57 научных работах. Ключевые слова: Aronia
melanocarpa, анатомия, ультраструктура, плод, биохимия, карпомасса, фенолы, in vitro, in
vivo. Область исследований: Ботаника. Цель работы: Выявление критериев индукции и
накопления карпомасс in vitro у A. melanocarpa и их структурное, ультраструктурное и
биохимическое изучение в сравнении с плодами in vivo. Задачи: Гистологическое
изучение околоплодника в эко- и карпогенезе; оптимизация условий индукции и
накопления карпомасс; выявление вектор-факторов для стимуляции биосинтеза фенолов в
карпомассе; сравнительное изучение структуры и ультраструктуры карпомассы in vitro и
плодов in vivo; количественное и качественное изучение фенольного состава, поиск
корреляции между содержанием фенолов и их антиокислительной и противомикробной
активностью карпомасс и плодов. Новизна и оригинальность работы: Впервые
получена карпомасса in vitro из плодов аронии и проведено комплексное сравнительное её
изучение (морфологическое, анатомическое, ультраструктурное, биохимическое,
антиоксидантное и противомикробное) с плодами. Теоретическое значение: Результаты
сравнительного цитоанатомического и биохимического изучения клеток карпомасс in vitro
и плодов отражают концепцию карпогенеза и подтверждают принципы эволюции
структурных преобразований. Прикладное значение: Установлены условия инициации и
аккумуляции карпомасс in vitro и определены вектор-факторы для получения карпомассы,
обогощённой фенолами. Установлена корреляция между содержанием фенолов и
антиокислительной и противомикробной активностью в карпомассах и плодах аронии.
Карпокультура аронии можеть послужить в качестве модели для создания
биотехнологической схемы регулируемого производства биомасс, как альтернативного
источника сырья. Внедрение научных результатов: B: учебную программу для
подготовки студентов и повышения квалификации фармацевтов, курс лекций „Культура
клеток и тканей in vitro у лекарственных растений” в USMF „Nicolae Testemiţanu”;
„Методические указания для занятий по фармацевтической ботанике”, Калалб Т., 2005;
учебник „Botanica farmaceutică”, Calalb T., Bodrug M., 2009; курс „Сравнительная
морфология и анатомия ” для магистратуры, Университет Академии Наук Молдовы.

9
 LISTA ABREVIERILOR

AIB – acidul indolilbutiric;

AIA – acidul indolilacetic;
ANA – acidul naftilacetic;
B5 – mediul nutritiv Garborg;
BA – benziladenină;
BAP – benzilaminopurină;
CF – compuşi fenolici;
CLIP – cromatografia de lichide de înaltă performanţă;
CLIP-SM – cromatografia de lichide de înaltă performanţă cuplată cu spectrometria de masă;
CSS – cromatografie pe strat subţire;
2,4-D – acid 2,4-diclorfenoxiacetic;
K – kinetină;
KD – kinetină şi acid 2,4- diclorfenoxiacetic;
KN – kinetină şi acid naftilacetic;
MN – mediul nutritiv;
MO – microscopie optică;
MS – Murashighe şi Scoog;
PA – principii active;
PV – produs vegetal;
RE – reticul endoplasmatic;
R.Moldova – republica Moldova;
SBA – substanţe biologic active;
SEM – microscopie electronică de baleiaj (Scanning Electron Microscope);
SH – Schenk şi Hildebrandt;
SM – spectrometrie de masă;
T – temperatură;
TEM – microscopie electronică prin transmisie (Trasmition Electron Microscope);
UV – raze ultraviolete.

10
 INTRODUCERE
Actualitatea temei. La răspântia dintre mileniile II şi III a crescut interesul faţă de fructele
bogate în compuşi naturali. Valoarea alimentară şi terapeutică a fructelor de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot este oferită de principiile biologic active, reprezentate prin diferite clase de CF,
acizi organici, vitamine, substanţe minerale, hidraţi de carbon [11, 320]. Graţie acestei
compoziţii chimice, produsul medicinal vegetal Aroniae fructus reprezintă o sursă de
medicament cu valoroase virtuţi terapeutice: vasoprotectoare [68], hipotensivă, antioxidantă
[247, 326]; chimiopreventivă [315], antiinflamatoare [11], antiarterosclerotică, antimutagenică
[119], hipoglicemiantă, antimicrobiană şi antivirală [325, 328].
În ultimile decenii fructele de aronie sunt solicitate pe piaţa mondială în calitate de
produs comercial dietetic, binevenit în raţia alimentară zilnică pentru profilaxia, fortificarea
organismului şi promovarea modului sănătos de viaţă [63, 129, 171, 186] şi ca sursă de coloranţi
naturali alimentari [151]. Studiile medico-biologice şi evidenţa statistică recentă arată, că fructele
de aronie au fost cele mai frecvente obiecte de investigaţii pe parcursul ultimilor 15 ani [325].
Conform informaţiei „Mintel International’s Global New Product Database”, în ultimul deceniu
A. melanocarpa (Michx.) Elliot, fiind considerată plantă producătoare de fructe, bogate în
substanţe fenolice cu cele mai mari perspective în alimentaţia sănătoasă [124, 129, 171, 176,
310], a fost introdusă în multiple proiecte interstatale de cercetare într-o continuă ascensiune, de
la 2, în 1997, până la 30, în anul 2008.
A. melanocarpa (Michx.) Elliot este o plantă originară din America de Nord şi graţie
calităţilor gustative şi curative ale fructelor a fost cultivată pe arii extinse atât în ţările europene
(Finlanda, Danemarca, Belgia, Norvegia, Olanda, Anglia, Lituania, Letonia, Estonia, Polonia,
Bulgaria, Germania, România, Moldova, Rusia), cât şi în cele asiatice (Japonia, China). Pentru
satisfacerea necesităţilor mereu crescânde cu fructe de A. melanocarpa (Michx.) Elliot au fost
fondate plantaţii, adaptate la tehnologii mecanizate de îngrijire şi recoltare a fructelor, care, cu
regret, au impact negativ asupra viabilităţii plantelor.
În R.Moldova plantaţiile de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în ocolurile silvice ocupă o
suprafaţă de 157,8 ha. Conform Agenţiei de Stat pentru Silvicultură “Moldsilva” anual se
colectează circa 1900 chintale de aronie, iar în ultimii ani recolta este destul de modestă [219].
Deşi, aronia nu este o plantă problematică [283], totuşi colectarea fructelor calitative şi în
proporţii mari nu este posibilă din diferite motive, observate în ultimul timp: factorii climatici
sunt într-o continuă schimbare; cataclismele naturale tot mai frecvente (îngheţurile şi ploile reci
de primăvară în perioada de înflorire; seceta, caniculele estevale îndelungate, vânturile uscate pe
parcursul maturării fructelor); aspectele ecologice (ploile acide, gazul de seră, prezenţa

11
elementelor nocive în sol şi atmosferă etc.) se manifestă negativ asupra dezvoltării biologice a
plantei; lucrările sezoniere agrotehnice, de profilaxie şi protecţie sunt anevoioase şi costisitoare;
inconvenientele şi dificultăţile la colectarea, transportarea şi păstrărea fructelor etc [15].
Aceste impedimente pot fi înlăturate prin aplicarea microtehnicilor de culturi celulare şi
tisulare in vitro cu avantaje evidente: independenţa de factorii ecologo-climatici şi rotaţia
sezonieră; posibilitatea manipulării factorilor fizici şi chimici; producerea în proporţii, flux
continuu şi condiţii ecologic controlate; vectorizarea direcţiei metabolice şi dirijarea acumulării
metaboliţilor utili; reducerea riscului contaminării cu microbi sau insecte; izolarea şi purificarea
mai eficace a compuşilor chimici utili [159, 189]. Culturile celulare şi tisulare vegetale in vitro,
induse din organele cormofitelor, sunt capabile să sintetizeze metaboliţi secundari în cantităţi
egale sau mai mari, decât planta producătoare [48, 188]. Setul de enzime din culturile in vitro
poate fi modificat pentru catalizarea biotransformării anumitor substraturi naturale în compusi
biologici activi valoroşi, astfel, sporind calitatea culturilor in vitro [179]. De aceea, una din
preocupările majore ale ştiinţei biologice moderne este valorificarea surselor şi căilor noi de
obţinere a materiei prime prin culturi de celule şi ţesuturi in vitro cu rezultate marcante în
prezent şi mari perspective în viitorul apropiat [187, 189]. Astăzi, se acordă o deosebită atenţie
studierii culturilor celulare şi tisulare in vitro la diferite plante, bogate în metaboliţi secundari cu
proprietăţi terapeutice, în calitate de sursă potenţială de aliment şi medicament [48, 137, 272].
Cercetătorii din acest domeniu consideră inepuizabile posibilităţile şi oportunităţile oferite de
culturile vegetale in vitro pentru obţinerea compuşilor vegetali utili [186, 206], alternativă la
culturile tradiţonale în câmp.
Lucrări ştiinţifice, unde în calitate de sursă de explant pentru iniţierea culturilor in vitro
servesc fructele cu pericarp suculent, sunt puţine. Fructele, ca şi alte organe, îndeplinesc în
cadrul organismului vegetal mai multe funcţii, inclusiv funcţia specială de perpetuare a speciei.
Fructele sunt considerate organe cu un nivel sporit de autoreglaj, realtiv autonome, deoarece ele
pot păstra vitalitatea în condiţii extramaterne o perioadă îndelungată, graţie tendinţei de
acumulare a rezervei trofice, care constituie una din particularităţile fundamentale specifice,
formate pe parcursul evoluţiei [378]. Carpocultura in vitro, în viziunea academicianului B.
Matienco, reprezintă un nou domeniu de cercetare în biotehnologia vegetală, cu perspective
aplicative promiţătoare [45].
Fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot aparţin carpotipului specific, suculent
pommum cu particularităţi histoanatomice şi specializare metabolică fenolică, de aceea necesită
precauţii şi microtehnici individuale biotehnologice. Pentru antrenarea fructelor de aronie în

12
culturi in vitro sunt necesare studii biologice complexe, care prevăd investigaţii structurale la
nivel celular, tisular, organospecific şi organismal prin prisma căilor metabolice de biosinteză.
Anatomia fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot este studiată puţin, ceva găsim în
lucrările lui Gh.Rotaru [380], lipsesc date privind: particularităţile structural-biochimice în
carpoontomorfogeneză; modificările structural-biochimice ale fructului în funcţie de gradientul
geoecologic; structurile anatomice ce asigurară integritatea fructului suculent de aronie. Nu este
studiată ultrastructura pericarpului la fructul de aronie şi nu sunt dezvăluite suficient
mecanismele ultrastructurale de biosinteză, translocare şi acumulare a CF.
Lucrări stiinţifice, consacrate studiului microscopic şi ultramicroscopic al celulelor
calusale, în general, şi al celor carpocalusale, în special, sunt puţine. Datele anatomice,
ultramicroscopice şi biochimice comparate ale celulelor in vitro şi in vivo la fructele de aronie
sunt necesare pentru explicarea mecanismelor biologice ale carpogenezei. Particularităţile
structurale şi bochimice ale carpocelulelor de aronie in vitro şi in vivo ilustrează corealaţia
structural-metabolică, care serveşte la elucidarea diferitor aspecte ale morfogenezei şi evoluţiei
fructelor suculente [206, 378].
Dezvăluirea aspectelor structurale şi biochimice ale carpoculturilor tisulare in vitro,
generate de la fructele suculente de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, servesc în calitate de suport
argumentat la elaborarea unui model biotehnologic pentru producerea metaboliţilor secundari de
natură fenolică cu valoare farmaceutică, alimentară şi tinctorială în condiţii controlate, ce
constituie alternativă reală de producere prin tehnologii tradiţionale in vivo.
Scopul lucrării. Elucidarea criteriilor biologice, chimice, fizice pentru elaborarea strategiilor
biotehnologice de inducere şi acumulare a carpomaselor calusale in vitro din fructele suculente
de A. melanocarpa (Michx.) Elliot şi evaluarea anatomică, ultrastructurală şi biochimică
comparativ cu fructele, crescute in vivo.
Obiective:
• Studiul anatomic, ultrastructural, histo- şi citochimic al pericarpului fructului în
ontomorfogeneză şi în funcţie de gradientul ecologo-geografic al R.Moldova;
• optimizarea condiţiilor biologice, chimice, fizice, biotehnologice pentru inducerea şi
acumularea carpomaselor in vitro şi elucidarea factorilor-vectori în stimularea acumulării
celor cu conţinut fenolic;
• studiul comparat al particularităţilor morfoanatomice şi ultrastructurale ale celulelor fructelor
in vivo şi carpomaselor in vitro;

13
• evaluarea ultrastructurală a incluziunilor polifenolice în vederea elaborării schemei
verosimile de biosinteză, translocare şi acumulare intra- şi extracelulară;
• efectuarea screening-ului biochimic calitativ al extractelor fructelor şi carpomaselor in vitro
de A. melanocarpa (Michx.) Elliot si in vivo şi analiza calitativă şi cantitativă a principalelor
grupe de CF: flavonoide (antociani); compuşi fenilpropanici; taninuri; totalul polifenolic;
• determinarea activităţii antioxidante şi antimicrobiene a extractelor fructelor in vivo şi
carpomaselor in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.
Postulatele ştiinţifice înaintate pentru susţinere:
• Strategiile biotehnologice de obţinere a biomasei frutiere din pericarpul fructului suculent de
aronie ca direcţie non-embriogenică de dezvoltare tisulară in vitro;
• Specificul anatomiei, activitatea complimentară şi sinergistă a epi- şi endostructurilor
pericarpului în carpoontomorfogeneză şi carpoecogeneză şi în asigurarea integrităţii fructului
suculent de aronie;
• Paralelismul modificărilor ultrastructurale prin prisma principiilor evolutive în procesul
maturării carpocelulelor in vivo şi in vitro;
• Schema fenilpropanoidă a implicării organitelor celulare în biosinteza, translocarea şi
depozitarea CF;
• Corelaţia potenţialului fenolic cu activitatea antioxidantă şi antimicrobiană la carpomasele
pigmentate in vitro şi fructele in vivo de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.
Noutatea ştiinţifică a rezultatelor obţinute:
• Pentru prima dată a fost obţinută carpomasa in vitro din fructul suculent de aronie în baza
optimizării MN, histogenului şi vârstei fructului donator de explant [1].
• Au fost determinaţi factorii-vectori (calitatea luminii, balanţa hormonală, adiţionată MN) în
obţinerea carpomaselor pigmentate de aronie cu caracteristici biochimice valoroase [2].
• Studiul în carpoontogeneză şi carpoecogeneză a pus în evidenţă un complex de indici
histoanatomici cu rol de suport structural în asigurarea rezistenţei şi integrităţii pericarpului
suculent la acţiunea factorilor externi în procesele de recoltare, transportare şi păstrare.
• Pentru prima dată carpomasele generate in vitro la A. melanocarpa (Michx.) Elliot au fost
evaluate la diferite nivele de organizare a materiei vii: morfologică, celulară şi
ultrastructurală.
• S-a stabilit corelaţia distribuirii spaţiale a diferitor grupe de CF cu histogenul pericarpului
fructului şi dinamica acumulării lor în carpoontogeneză.

14
• În baza studiului ultrastructural comparativ s-a determinat evoluţia transformărilor
ultrastructurale în dezvoltarea carpomaselor in vitro şi maturarea fructelor in vivo prin prisma
principiilor evolutive.
• S-a elaborat schema verosimilă de includere selectivă şi consecventă a organitelor celulare
implicate în biosinteza, translocarea şi acumularea CF.
• Pentru prima dată au fost evaluate valorile biochimice cantitative şi calitative în baza
screening-ului biochimic comparativ al carpomaselor in vitro şi fructelor de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot şi realizat studiul calitativ şi cantitativ al CF prin metode biochimice
complexe (spectrofotometrice, spectroscopice, titrimetrice, CLIP-MS şi CSS).
• S-a determinat corelaţia activităţii antioxidante şi antimicrobiene ale carpomaselor
pigmentate in vitro cu conţinutul fenolic, comparativ cu cea din fructele de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot in vivo [3].
Importanţa teoretică a lucrării:
Rezultatele studiului citomorfologic şi biochimic comparativ la fructele de A.
melanocarpa (Michx.) Elliot in vitro şi in vivo se înscriu în concepţiile carpogenezei,
carpoecogenezei şi principiile evolutive ale modificărilor structurale şi ultrastructurale;
Zonalitatea histoanatomică, stabilită în baza cercetărilor anatomice şi ultrastructurale, este
specifică carpotipului pommum, iar caracteristicile ei servesc în calitate de reper teoretic în
selectarea histogenului pentru culturi biotehnologice; Adaptarea structurilor histoanatomice e
bazată pe intercorelaţia compensator-sinergistă a epi- şi endostructurilor în ontomorfogeneza
fructului; Rolul biologic al deponentei imobilizate de rezervă a pericarpului în determinarea
longevităţii fructului în perioada de post-maturare şi a capacităţii de proliferare a carpoculturii in
vitro; Noţiunea de biontitate organospecifică la baza totipotenţei culturilor in vitro; Modificările
structurale şi ultrastructurale la fructele de aronie reprezintă un complex de indici, care poate fi
aplicat în elucidarea problemelor carpogenezei şi carpoecogenezei; Este stabilită acţiunea
principiiilor evolutive la nivel ultrastructural: intensificării funcţiilor (Severţov), substituţiei de
funcţii (Dorn); diversificării funcţiilor (Plate); compartimentalizării organelor sau funcţiilor
(Severţov); compensaţiei funcţiilor şi ritmul diferit al modificărior organelor (Voronţov);
integrităţii fragmentare în organizarea celulară (Matienco); autonomizării în dezvoltarea
organelor (Scripcinskii), care confirmă paralelismul evoluării modificărilor structural-funcţionale
în dezvoltarea celulelor fructelor in vivo şi carpomaselor in vitro la A. melanocarpa (Michx.)
Elliot.

15
Importanţa aplicativă a lucrării:
• S-au optimizat condiţiile biologice, chimice, fizice, biotehnologice de iniţiere şi acumulare a
carpoculturilor in vitro la planta medicinală A. melanocarpa (Michx.) Elliot [1].
• S-au determinat factorii-vectori de dirijare a acumulării carpomaselor in vitro îmbogăţite cu
CF utili [2].
• Rezultatele studiului sunt incluse în: programa de studii la disciplina Botanica farmaceutică
pentru pregătirea şi educaţia biotehnologică a studenţilor şi în cadrul ciclurilor de
perfecţionare a farmaciştilor „Utilizarea plantelor medicinale şi a fitopreparatelor autorizate
în R.Moldova” cu tematica „Microtehnici de culturi in vitro la plante medicinale”, catedra
Farmacognozie şi Botanică farmaceutică, USMF „Nicolaie Testemiţanu”; manualul
„Botanică farmaceutică”, Calalb, Bodrug, 2009 şi „Indicaţii metodice la lucrări de laborator
la Botanica farmaceutică” Calalb, 2005; cursul universitar pentru masterat a disciplinei
Morfologie şi anatomie comparată, catedra Biologie, Facultatea Ştiinţe ale naturii, UnAŞM.
• Carpocultura in vitro la A. melanocarpa (Michx.) Elliot serveşte ca model la elaborarea
strategiei biotehnologice de producere dirijată a biomaselor imbogăţite cu PA polifenolice
pentru industriile farmaceutică, alimentară, cosmetică şi constituie o sursă de materie primă
de alternativă la tehnologiile tradiţionale, independent de condiţiile pedo-climatice, rotaţia
sezonieră şi aspectele ecologice.
• Proprietăţile antioxidante şi antimicrobiene ale fructelor in vivo faţă de Staphylococcus
aureus (t.209-P), Enterococcus faecalis, Escherichia coli (t.ATCC 27853), iar a
carpomaselor in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot şi faţă de Pseudomonas aeruginosa
(t.TCC 27853), Proteus vulgaris (t.MX 19222), caracterizate printr-o rezistenţă sporită [3]
servesc ca temei argumentat pentru valorificarea lor în noi remedii farmaceutice.
Aprobarea rezultatelor investigaţiilor ştiinţifice: au fost prezentate şi discutate la lucrările
ştiinţifice ale diferitor foruri ştiinţifice internaţionale şi naţionale, dintre care cele mai importante
sunt: Conferinţa a VI-a Republicană de Microscopie Electronică (Chişinău, 1998); The Xth
Congress of Federal Sociation of Plant Physiology (Varne, 1998); The 14th International
Congress on Electron Microscopy, (Mexico,1998); Conferinţa Ştiinţifico-didactică Anuală,
ULIM “Symposia Professorum”, Seria Medicină, (Chişinău, 1998, 1999, 2000, 2002);
Mеждународный симпозиум “Нетрадиционное растeниеводство. Эниология. Экология и
здоровье”, (Симферополь, 2003, 2004); Congres XII Naţional de Farmacie cu participare
internaţională, (Bucureşti, 2002); Conferinţa “Bilanţul activităţii ştiinţifice a USM, (Chişinău,

16
2003); Congresul II, „Fiziologia şi biochimia plantelor la început de mileniu: realizări şi
pespective”, (Chişinău, 2002); Conferinţa „Ziua medicamentului” (Chişinău, 2003); Conferinţa
Societăţii de medici şi naturalişti din Iaşi (2003); The 8th National Symposium „Medicinal plants
– present and perspetives”, (Piatra Neamţ, 2003); Conferinţa anuală a USMF „Nicolae
Testemiţanu”, (Chişinău, 2004, 2005, 2007, 2008, 2009); The 12th Eurasia Environment
Conference with the support of the Nippon Foundation, (Istanbul, 2005); Conferinţa Naţională
cu participare Internaţională “Probleme actuale ale geneticii, fiziologiei şi ameliorării plantelor”,
(Chişinău, 2008), inclusiv comunicări ştiinţifice în şedinţele plenare ale: Simpozionului a ХI
Internaţional „Нетрадиционное растиниеводство. Эниология. Экология и здоровье”,
(Симферополь, 2002); Conferinţei anuale a USMF ”Nicolae Testemiţanu”. Probleme medico-
biologice, farmaceutice, de sănătate publică şi management, (Chişinău, 2003); Conferinţei
ştiinţifice internaţionale «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии
растений», (Минск, 2008); Congresului Internaţional “The XXXth Balcan Medical Week”
(Chişinău, 2008).
Cercetările ştiinţifice experimentale au fost realizate în laboratorul Structură şi
Ultrastructură a Plantelor şi Baza Experimentală Carpotron ale Institutului de Fiziologie a
Plantelor al AŞM; Laboratorul Genetica şi fiziologia rezistenţei plantelor al Institutului de
Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM; în laboratorul Biotehnologic al Departamentului de
Medicină, ULIM; catedra de Farmacognozie şi Botanică farmaceutică a USMF „Nicolae
Testemiţanu”; Centrul de Tehnologii Biologice Avansate al Institutului de Genetică şi Fiziologie
a Plantelor al AŞM; laboratorul ştiinţific al Catedrei de Epidemiologie şi boli infecţioase
itraspitaliceşti a USMF „Nicolae Testemiţanu”; Laboratorul Departamentului Tehnologic şi
Catedra Botanică farmaceutică ale Universităţii de Medicină şi Farmacie „Iuliu Haţieganu”,
Cluj-Napoca.
Publicaţii la tema tezei: Rezultatele cercetărilor ştiinţifice au fost editate în 57 titluri ştiinţifice,
inclusiv: 4 monografii; 1 manual; 4 articole ştiinţifice în în reviste internaţionale; 10 articole în
reviste naţionale recenzate; 8 articole în culegeri naţionale recenzate; 7 articole în culegeri
internaţionale; 4 articole în culegeri naţionalei; 14 rezumate ale comunicărilor ştiinţifice la
conferinţe şi simpozioane ştiinţifice; 3 brevete de invenţii şi 3 articole în alte publicaţii.
Cuvinte cheie: Aronia melanocarpa, anatomie, ultrastructură, fruct, biochimie, carpomasă,
compuşi fenolici, in vitro, in vivo,
Structura şi volumul tezei: introducere, 7 capitole, concluzii generale şi recomandări,
bibliografie din 388 titluri ştiinţifice, 199 pagini text de bază cu 30 tabele şi 102 figuri, 8 anexe
cu 15 tabele şi 123 figuri.

17
 Sumarul compartimentelor tezei
Introducerea prevede informaţia ştiinţifică privind actualitatea temei, scopul şi
obiectivele investigaţiilor, inovaţia ştiinţifică, semnificaţia teoretică şi aplicativă, aprobarea
rezultatelor investigaţiilor ştiinţifice, publicaţii la tema tezei, cuvintele-chee, structura şi volumul
tezei.
Capitolul 1. Aspecte anatomice, ultrastructurale, biochimice şi biotehnologice ale
fructelor suculente in vivo şi in vitro include datele privind sinteza analitică a studiilor
ştiinţifice naţionale şi mondiale în acest aspect şi expunerea sugestiilor propii. Sunt materiale
referitoare la taxonomia, etimologia, aspectele ecologice şi biologice ale speciei. Este evaluată
informaţia recentă asupra compoziţiei chimice a fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în
corelaţie cu virtuţile terapeutice şi valoarea aplicativă. Sunt analizate lucrările, privind rolul
diferitor factori în inducerea culturilor in vitro din diferite organe ale plantelor cu CF şi, în
special, a celor iniţiate din fructe suculente. Este efectuată analiza studiilor morfoanatomice şi
ultramicroscopice ale fructelor suculente şi a rezultatelor obţinute de diferiţi autori referitoare la
morfologia, anatomia şi ultrastructura biomaselor acumulate in vitro.
Capitolul 2. Caracteristica materialului fitobiologic şi metode de cercetare include
informaţia privind caracteristica şi zonele de provenienţă a materialui biologic pentru cercetare.
Sunt descrise: procedeele biotehnologice; reacţiile cito- şi histochimice aplicate; metodele
biochimice (CSS, CLIP-SM, spectrofotometrie, titrimetrie), microscopice (fotonică, electronică
prin transmisie şi cu baleiaj), de analiză morfometrică a electronomicrografiilor, de determinare
a capacităţii de captare a radicalilor liberi şi antimicrobiene (bacteriostatice şi bactericide),
prelucrare statistică a rezultatelor, utilizate în investigaţii.
Capitolul 3. Particularităţile anatomice ale fructelor de Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot include date privind zonalitatea histoanatomică şi structurile anatomice specifice
pericarpului suculent de tip pommum. Sunt determinate modificările succesive histoanatomice în
carpoontogeneză şi transformările structurale ale pericarpului în funcţie de gradientul ecologic al
factorilor pedoclimatici ai zonelor ecologo-geografice ale R. Moldova. Este elucidată
intercorelaţia sinergistă a epi- şi endostructurilor pericarpului, care constituie un complex de
indici citoanatomici cu rol adaptiv în asigurarea rezistenţei fructelor la acţiunea factorilor externi
şi în calitate de suport structural în asigurarea integrităţii fructelor suculente.
Capitolul 4. Studii biotehnologice şi particularităţile structurale ale carpomaselor
pigmentate de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot prevede rezultatele screening-ului MN,
suplimentate cu diferite doze de zaharoză şi tipuri de hormoni de creştere pentru optimizarea
condiţiilor de inducere şi acumulare a carpomaselor in vitro, bogate în CF. Sunt obţinute date

18
referitor la acţiunea regimului de lumină asupra iniţierii şi intensităţii proliferării carpocalusului
de aronie. Sunt relatate rezultatele: multiplelor tatonări privind determinarea vârstei optime a
fructului donator de explant şi histogenului, utilizat în calitate de inocul; stabilirii perioadei şi
etapelor de carpocalusogeneză, frecvenţei subcultivărilor şi rolului regimului nutriţional în
vederea asigurării viabilităţii şi acumulării carpomaselor pigmentate. În baza optimizării
criteriilor biologice ale explantului şi fructului-donator de explant şi manipulării factorilor
chimici şi fizici s-au obţinut patru carpomase pigmentate in vitro: violacee, crem-roză, crem-albă
şi verde. Sunt prezentate rezultatele studiului morfoanatomic al carpomaselor pigmentate in
vitro, efectuat pe multiple micropreparate şi prin aplicarea citoreacţiilor chimice specifice. Este
determinat complexul de parametri pentru descrierea şi caracterizarea morfo-anatomică a
carpomaselor in vitro. Sunt dezvăluite caracteristicile morfoanatomice specifice ale
carpomaselor în corelaţie cu pigmentaţia (violacee, crem-roză, crem-albă şi verde), determinată
de regimul de lumină şi balanţa hormonală, adiţionată MN.
Capitolul 5. Studii biochimice comparate ale fructelor şi carpomaselor pigmentate
in vitro de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. Sunt expuse rezultatele screening-ului
biochimic calitativ comparativ al fructelor in vivo şi carpomaselor in vitro în scopul identificării
grupelor principale de compuşi chimici. Sunt prezentate rezultatele studiului calitativ şi cantitativ
al flavonoidelor (inclusiv al antocianilor), acizilor fenilpropanici, taninurilor şi totalului
polifenoic din extractele fructelor in vivo şi carpomaselor in vitro, obţinute printr-un complex de
metode: reacţii calitative generale şi specifice de identificare, CSS, spectrofotometrice,
titrimetrice, CLIP-SM. Sunt puse în evidenţă caracteristicile biochimice valoroase ale
carpomaselor pigmentate in vitro, comparativ cu fructele, obţinute în condiţii in vivo.
Capitolul 6. Ultrastructura fructului in vivo şi a carpomaselor in vitro de Aronia
melanocarpa (Michx.) Elliot şi principiile evolutive. Sunt expuse rezultatele studiului
ultrastructural, bazat pe analiza morfometrică a electronomicrografiilor, realizat în premieră la
pericarpul imatur (60 zile de la înflorire) şi matur al fructelor şi carpomaselor pigmentate,
generate in vitro de A.melanocarpa (Michx.) Elliot. Sunt elucidate criteriile transformărilor
ultrastructurale atât în evoluţia maturării carpocelulelor in vivo, cât şi pe parcursul dezvoltării
carpomaselor in vitro. S-au determinat fluctuaţiile utrastructurale ale celulelor carpomaselor in
vitro şi fructelor in vivo pe parcursul maturării prin prisma principiilor evolutive ale
trasformărilor structurale. Sunt exemplificate şi argumentate şapte principii evolutive, la nivelul
ultrastructural de organizare a celulei vegetale, care denotă existenţa paralelismului în evoliţia
transformărilor ultrastructurale ale carpocelulelor in vivo şi carpomaselor in vitro.

19
 Capitolul 7. Aspecte cito-, histochimice, ultrastructurale, biochimice şi activitatea
biologică a compuşilor fenolici în carpomasele şi fructele de Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot. Sunt prezentate rezultatele studiului histochimic al CF, prin aplicarea reacţiilor chimice
specifice pentru diferite grupe de CF pe multiple micropreparate ale pericarpului, în funcţie de
histogen şi etapa ontomorfogenetică a fructului de aronie. Prin metode biochimice este stabilită
dinamica acumulării diferitor grupe de CF în carpoontomorfogeneză. Citochimic şi
ultrastructural sunt dezvăluite organitele, implicate în biosinteza, translocarea şi acumularea CF
în carpocelulele in vitro şi in vivo de aronie. În baza studiului complex al incluziunilor fenolice a
fost stabilită calea fenilpropanoidă de biosinteză, translocare şi acumulare a CF, exprimată în
schema verosimilă a traficului fenolic intra- şi extracelular.
Sunt expuse rezultatele ştiinţifice privind activitatea antioxidantă a extractelor fructelor
de aronie, crescute in vivo, comparativ cu a extractelor din carpomasele pigmentate, generate in
vitro, în corelaţie cu conţinutul totalului polifenolic. Sunt determinate proprietăţile
bacteriostatice şi bactericide ale extractelor etanolice din celulele fructelor in vivo şi
carpomaselor in vitro faţă de diferite tulpini de microorganisme patogene şi virulente.
Concluzii generale sunt în număr de 14
Recomadările prevăd: utilizarea rezultatelor studiului structural şi biochimic ale fructelor
de A. melanocarpa (Michx.) Elliot in vivo şi in vitro în calitate de model în elaborarea
strategiilor biotehnologice de producere a biomaselor in vitro ca materie primă de alternativă
tehnologiilor tradiţionale de interes farmaceutic, alimentar, tinctorial; introducerea în programele
de studii ale studenţilor facultăţilor de biologie, tehnologie alimentară, farmaceutică şi cosmetică
etc.; valorificarea proprietăţilor antioxidante şi antimicrobiene ale carpomaselor in vitro şi
fructelor in vivo de aronie în elaborarea noilor forme farmaceutice de origine vegetală.
Biblografia include 388 de titluri bibliografice.
Anexele sunt în număr de 8, care includ 15 tabele, 123 figuri, 3 brevete şi 3 acte de
implementare.

20
 1. ASPECTE ANATOMICE, ULTRASTRUCTURALE, BIOCHIMICE ŞI
BIOTEHOLOGICE ALE FRUCTELOR SUCULENTE IN VIVO ŞI IN VITRO
1.1. Consideraţii botanice privind specia Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot
1.1.1. Încadrarea sistematică şi etimologia speciei Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot
Conform diferitor nomeclatoare botanice de prestijiu aronia a putut fi întâlnită cu diferite
denumiri ştiinţifice: Pyrus arbutifolia Linnaeus (1782), Mespilus arbutifolia var. melanocarpa
Michx. (1803); Pyrus melanocarpa (Michx.) Willd. (1809); Pyrus arbutifolia var. melanocarpa
(Michx.) Hook. (1834); Sorbus melanocarpa (Michx.) Heynh. (1841); Pyrus nigra Sargent,
(1890); Aronia nigra Britton, (1894); Adenorachis melanocarpa (Michx.) Nieuwl, (1915);
(Michx.) (1991), Photinia melanocarpa Robertson (1991).
Genul Aronia din punct de vedere morfologic, histoanatomic, embriologic este foarte
apropiat de g. Pyrus, Sorbus. Botaniştii, timp îndelungat, includeau speciile de aronie în diferite
genuri Pyrus, Sorbus sau Aronia [128, 274]. Mai târziu, în lucrările lui K.Robertson, consacrate
familiei Rosaceae [280], speciile de aronie apar în g. Photinia. La sfârşitul secolului XX, în
baza miltiplelor investigaţii şi date ştiinţifice acumulate, speciilor de aronie le revine genul
Aronia Pers. Graţie acestui istoric, în literatura ştiinţifică contemporană, putem întâlni speciile
Aronia melanocarpa, Pyrus melanocarpa, Sorbus melanocarpa şi Photinia melanocarpa, care
sunt acceptate ca sinonime. Genul Aronia, conform sistemului de clasificare al academicianului
A.Taktajean, aparţine la subfamilia Maloideae (Pomoideae), familia Rosaceae, ordinul Rosales,
subclasa Rosidae, clasa Dicotyledones, filumul Magnoliophyta.
Iniţial, au fost cunoscute 2 specii, morfologic şi ecologic apropiate: A. arbutifolia (L.)
Elliot cu fructe roşii şi A. melanocarpa (Michx.) Elliot cu fructe negre. Aceste specii, diferite,
preponderent, prin culoarea fructelor, sunt capabile să hibridizeze, rezultând forme intermediare
[274]. Curând, în lucrările botanice, apare a treia specie A. pruizifolia (Marsh.) Rehder, întâlnită
mai târziu ca A. prunifolia, care, în opinia unor savanţi, este un hibrid cu fructe purpurii,
considerat apomictic [128]. Datele ştiinţifice ale Universităţii Carolinei de Nord (or.Asheville)
denotă, că America de Nord este centrul nativ de formare al acestor 2 specii: A. melanocarpa
(Michx.) Elliot cu fructele negre, întâlnită în habitatele naturale silvice, ce constituie 79% şi A.
arbutifolia (L.) cu fructele roşii, care predomină în locurile mlăştinoase şi alcătuiesc 31% din
suprafeţe [128]. A. arbutifolia (L.) este specifică coastelor stâncoase, mlăştinoase ale regiunilor
montane ale Carolinei de Sud şi de Nord. A. melanocarpa (Michx.) Elliot este mai restrânsă
ecologic, doar în locurile neîmpădurite ale arealelor silvice ale Carolinei, unde solul este acoperit
cu specii de muşchi din genul Polytricum [283]. A. arbutifolia (L.) predomină în partea de Vest a

21
Americii de Nord, iar A. melanocarpa (Michx.) Elliot pe coasta de Est, de la Noua Atlantie până
la peninsula Florida, dar ambele pe locuri umede, împotmolite ale zonelor adiacente pădurilor
[112,335]. La sfârşitul secolului XX aceste 2 specii sunt incluse în cercetările de manajment
bioecologic şi bioconservare a biocircuitului natural [338], astfel figurând în proiectele de
biorestaurare vegetală [322, 335].
În flora cultivată din diferite arealuri biogeografice sunt întâlnite ambele specii, dar mai
solicitată, totuşi, este A. melanocarpa (Michx.) Elliot cu următoarele varietăţi: grandifole,
caracterizată prin frunze obovate sau eliptice; elana, cu frunze obovate şi margine fin serată;
subpubescens, cu frunze slab pubescente pe epiderma inferioară. Numele genului Aronia,
probabil, provine de la grecescul „aros” – ajutor, folos, aluzie la utilizarea lor, alţii presupun, că
cuvântul grecesc „arone” este denumirea fructului asemănător cu moşmolul. Cuvântul
„melanocarpa”, ce determină specia, este format de la grecescul „mielas”ori „melanos” – negru
şi „karpos” – fruct şi caracterizează fructele de culoare neagră [338]. Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot în limba latină; aronie – limba română; black chokberry – limba engleză; aronie
mélanocarpe – limba franceză; черноплодная рябина sau черноплодная арония – limba rusă.
1.1.2. Aspecte ecologice şi particularităţi biologice
Plantele de aronie cresc bine pe locuri stâncoase, calcarose, relativ acide, mlăştinoase,
acoperite cu muşchi, pe malul bazinelor de apă şi în locuri relativ însorite, dar preferă atmosferă
umedă, aerată, cu o circulaţie intensă a maselor de aer şi sunt iubitoare de lumină, de aceea
florile sunt distribuite la periferia coroanei. Arbuştii din locurile umbroase şi întunecoase au
număr redus de corimbe şi de flori şi de aceea au indici de roadă scăzuţi. Mugurii vegetativi şi
reproductivi ai plantelor sunt rezistenţi la temperaturi joase. Deoarece în centrul nativ de formare
arbuştii de aronie preferă umiditatea sporită a solului şi a aerului, aceşti parametri trebuie
asiguraţi şi la iniţierea plantaţiilor în regiuni noi. Temperaturile sporite şi lipsa ploilor pe
parcursul verii, în deosebi, când ele se suprapun cu fazele de înflorire, dezvoltare şi maturare ale
fructelor, au un impact negativ asupra calităţii şi cantităţii recoltei.
Calitatea fructelor şi aspectul arbuştilor depinde şi de regimul nutriţional al solului
[320,346,388]. Pentru a evita unele inconveniente şi asigurarea dezvoltării reuşite a aroniei sunt
elaborate şi se aplică cu succes diferite tehnologii şi lucrări agrotehnice [152,162]. Arbuştii de
aronie sunt vulnerabili faţă de diferite mixomicete şi preferând locurile umede există riscul
infectării cu diferiţi patogeni [323]. Astăzi aronia este cu succes cultivată ca plantă decorativă,
fructiferă şi medicinală atât în grădini particulare, cât şi centralizat în plantaţii de proporţii mari,
pentru fructele preţioase în stare proaspătă şi după o prelucrare specială [162,167. Pentru

22
dezvoltarea biologică şi asigurarea viabilităţii plantaţiilor de aronie este necesară reglarea
regimului hidric atât al solului, căt şi a atmosferei.
A. melanocarpa (Michx.) Elliot este un arbust cu numeroase ramuri şi înălţimea de la 2
până la 4 m. La exemplarele tinere, coroana este constrânsă, dar în timpul fructificării ramurile
devin grele şi atârnă în jos, depărtându-se radial de centru, conferindu-i un aspect multiradial şi
semisferic. Lugerii tineri au o culoare brun-roşietică, cei maturi – gri-închis cu multe lenticele
proeminente, de culoare mai deschisă. Aronia dezvoltă sistem radicular rămuros, răspândit în
profunzimea solului. Frunzele sunt simple, ovat-eliptice sau uşor obovate, scurt peţiolate, cu
marginea fin serată, apexul uşor acuminat, lungimea de 6-8 cm şi lăţimea 3-5 cm. Partea
superioară a frunzelor este de culoare verde-întunecată, cu luciu, iar cea inferioară – slab
pubescentă şi culoare verde-gri. Începând cu a II jumătate a lunii septembrie, frunzele se
colorează în nuanţe de la galben la roşu-purpuriu, redând arbuştilor un aspect decorativ, pentru
ce sunt plantaţi în grădini, scuaruri şi parcuri. Florile sunt grupate câte 10-25 în inflorescenţe de
tip corimb şi dezvoltă: caliciul dialisepal; corolă dialipetală, roză în butoni şi albă la deschidere;
androceu din numeroase stamine cu anterele de culoare roză şi gineceu inferior, sincarp.
Arbuştii de A. melanocarpa (Michx.) Elliot fructifică începând cu al IV an, mai rar în al
III an de vegetaţie. Roada medie de la un arbust în primii ani constituie 0,6 kg, maximă – 1,5 kg,
începând cu al VI-lea an – 10 kg. În plantaţiile de aronie, organizate în baza tehnologiilor
moderne, roada poate ajunge până la 20 kg/arbust [129]. Fructele au formă sferică, uşor
aplatizate la apex, cu diametrul de 1,5 cm, culoarea neagră, cu luciu, suprafaţa netedă, cu
depuneri fine de ceară albăstrui-azurie. Fructele se maturează pe parcursul verii şi la începutul
toamnei devin negre, atrăgătoare, suculente, dulci cu nuanţă astringentă pronunţată, care pot
rămâne pe ramuri în corimbe şi pe perioada de iarnă, ce reprezintă un avantaj al acestei plante.
Seminţele sunt mici, cafenii-inchise, câte 1-2 într-o lojă seminală.
Cultivarea aroniei în proporţii mari se practică prin diferite metode de înmulţire: seminţe,
altoire, butăşire şi marcotaj. Puieţi sănătoşi şi viabili se obţin din seminţe. Sunt elaborate
procedee eficiente pentru obţinerea unui material săditor sănătos, adaptat la îngrijirea şi
recoltarea mecanizată a roadei. În scopul ameliorării micropropagării aroniei se încearcă
obţinerea plantulelor prin microtehnici in vitro din diferite organe: rădăcini [287], frunze şi
rădăcini [284], frunze [353], fragmente de lăstari [192], muguri şi meristeme apicale [258].
Arbuştii de aronie au un aspect morfologic atractiv, uşor se supun modelării şi tolerează
ingrijirea prin tehnologii moderne. Se înmulţesc prin butaşi, marcotaj, seminţe, iar pentru
ameliorarea materialului săditor se practică obţinerea vitroplantulelor din fragmente de organe
vegetative.

23
I.2. Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot – trecut, prezent şi perspective
A.melanocarpa (Michx.) Elliot cu centrul nativ de formare în partea de Est a Americii de
Nord, iniţial a fost apreciată ca plantă decorativă [128] prin aspectul semisferic al coroanei cu
ramurile curbat-răsfirate şi coloritul contrast atrăgător şi variat, care se succede pe parcursul
perioadei de vegetaţie: primăvara – corimbe de flori albe abundente prin frunzişul lucitor; vara –
fructe de culoare verde deschis pe fondalul verde-închis al frunzelor, iar toamna – ciorchinele de
fructe negre, lucitoare pe fondalul unui colorit, de la galben până la roşu aprins al frunzelor, care
persistă până toamna târziu. Graţie acestui aspect decorativ, aronia a apărut în cele mai renumite
scuaruri, parcuri, locuri pubilice şi grădini particulare. Ulterior, au fost apreciate calităţile înalt
gustative şi tinctoriale ale fructelor, astfel fiind solicitate în stare proaspătă, uscată, congelată sau
pregătite sub formă de diferite produse alimentare: gemuri, siropuri, compoturi, sucuri, supliment
la îngheţată, frişcă, brânzeturi, cocteiluri, lichioruri [171,309,310,314,338].
Empiric, fructele de aronie au fost antrenate în profilaxia şi tratamentul diferitor maladii.
Cercetările biochimice au pus în evidenţă compoziţia chimică, iar studiile farmacognostice şi
farmacologice au confirmat calităţile tămăduitoare, determinându-le proprietăţile lor înalt
terapeutice, iar fructele drept produs medicinal vegetal [247,315,325,388]. Toate acestea au
servit ca motivaţie pentru extinderea ariilor de cultivare a speciei. În anul 1875 aronia apare pe
teritoriul Irlandei, ulterior, în Finlanda, Danemarka, Anglia, Ungaria, Polonia, Bulgaria,
Germania, România, Moldova etc., iar la sfârşitul secoluli XX, plantaţiile ocupau în Europa
aproximativ 3500 ha. În anii 20 ai secolului XX a fost adusă pe teritoriul Rusiei ca plantă de
perspectivă, producătoare de fructe în regiunile climatice nordice. Conform rezultatelor statistice
centralizate [60], investigaţiile ştiinţifice pe A.melanocarpa (Michx.) Elliot în plan mondial sunt
într-o ascensiune cu maximele în anii 1978, 2002, 2004 (fig.1.1).
y = 0.0598x - 1.0444
2
R = 0.3739
10 100
y = 0.0238x + 4.9477
2
R = 0.0028
Number of papers per year & trendline

Proportional micro index & trendline.

8 80

6 60

4 40

2 20

0 0
1926
1928
1930
1932
1934
1936
1938
1940
1942
1944
1946
1948
1950
1952
1954
1956
1958
1960
1962
1964
1966
1968
1970
1972
1974
1976
1978
1980
1982
1984
1986
1988
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
2006

Fig.1.1 Investigaţiile ştiinţifice axate pe A. melanocarpa (Michx.) Elliot [60].

24
 La începutul secolului XX aronia a fost cultivată în diferite arealuri ale URSS pe o
suprafaţă de 6020 ha [388], inclusiv în 14 regiuni ale Federaţiei Ruse pe o arie de 5400 ha. Tot în
această perioadă aronia este plantată pe teritoriul Ukrainei şi Moldovei [30,32,51]. În prima
jumătate a secolului XX se recolta 1,5-2 kg/arbust, apoi 4-5 kg/arbust, iar astăzi se înregistrează
14-16 kg/arbust în mediu [123,126,310].
Astăzi plantaţii de aronie în R.Moldova sunt înregistrate în ocolul silvic Cantemir, Leova,
Cimişlia, Anenii-noi, Nisporeni, Străşeni, Orhei, Glodeni, Briceni, Donduşeni, Camenca etc. În
scopul majorării resurselor accesorii ale pădurii în limitele fondului forestier [40], pe parcursul
mai multor ani au fost create suprafeţe însemnate de arbuşti fructiferi în R.Moldova, care ocupă
o suprafaţă de 157,8 ha. Conform Agenţiei de Stat pentru silvicultură “Moldsilva” se colectează
anual cca 1900 chintale de aronie [51].
Arbuştii de aronie sunt recunoscuţi ca plante, care preferă locurile umede, mlăştinoase,
dar însorite [335,338], iar creşterea şi maturarea fructelor corelează direct cu regimul hidric
reglat [388]. Plantele de aronie sunt considerate destul de viabile, rezistente la temperaturi joase,
vânturi umede şi reci şi sunt vulnerabile la excesul temperaturilor sporite, calamităţile caniculare
în perioada estivală, determinate de umeditatea redusă a aerului [60].
În baza conţinutului de PA, fructele de aronie [148,343] sunt numite „fitochemicale
bioactive” [66,171] sau „superfructe” [210] recomandate în dieta şi alimentaţia umană, iar graţie
CF benefici, sunt solicitate pentru întreţinerea corpului sănătos şi completarea deficienţei
antioxidante [247,279,309] şi sunt introduse în diferite proiecte de cercetare cum ar fi
„Functional Food Network” [215]. Graţie potenţialului biochimic deosebit al fructelor, în special
al conţinutului sporit antocianic, astăzi aronia este introdusă în diferite proiecte ştiinţifice [272].
Conform informaţiei „Mintel’s Global New Product Database” aronia în calitate de ingredient
figura în 2 proiecte europene în anul 1997 şi în 108 proiecte în anul 2008. Pe teritoriul Americii
de Nord spectrul produselor, care includ extracte din fructele de aronie, s-a extins pe parcursul
ultimului deceniu de la 1 la 30.
În scopul extragerii coloranţilor naturali din fructele de aronie [156] şi a obţinerii
fructelor în calitate de aliment sănătos [171,212] proiectele interstatale prevăd extinderea
plantaţiilor industriale pe teritoriul Europei, iar cele asiatice [60] au ca obiectiv sporirea
viabilităţii şi productivităţii plantaţiilor de aronie în vederea obţinerii ingredienţilor chimici
pentru fortificarea produselor alimentare [343]. În centrele de cercetare ştiinţifică din Finlanda
[124], Polonia [120,192] se studiează procedeele de propagare a speciei A.melanocarpa (Michx.)
Elliot în plantaţiile industriale şi se elaborează tehnologii moderne pentru activităţile agricole
mecanizate în îngrijirea şi protecţia lor. Un proiect elaborat în Suedia [151] prevedea evaluarea

25
germoplasmelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot în scopul optimizării plantaţiilor pentru
producerea fitochemicalelor naturale. Astăzi sunt determinate normativele activităţilor
agrotehnice şi condiţiile biologice pentru recoltarea mecanizată a fructelor în plantaţiile
industriale [60,152]. Cu regret, aceste plantaţii sunt viabile pe parcursul a 20 ani, iar roada
maximă se recoltează doar până la vârsta de 10 ani, după care ramurile roditoare pier, iar
capacitatea de revigorare diminuează [310]. Savanţii sunt în căutare de metode noi de înmulţire
şi organizare a plantaţiilor de aronie mai rezistente şi mai productive [287,353]. Se încearcă
procedee noi de scurtare mecanizată a ramurilor pentru sporirea roadei în plantaţiile industriale
[120]. Viabilitatea şi calitatea plantaţiilor corelează cu modul de propagare şi obţinere a
materialului săditor [310]. Un obiectiv al investigaţiilor ştiinţifice reprezintă obţinerea
materialului săditor sănătos pentru plantaţiile industriale extinse pe suprafeţe mari, adaptate
pentru recoltarea mecanizată. În acest scop se aplică tehnologii moderne de obţinere a
materialului săditor avirotic cu dezvoltare biologică sincronizată prin microtehnicile culturilor in
vitro: din fragmente de lăstari [192]; muguri şi meristeme apicale [258]; frunze [284,353]. Se
practică formarea sistemului radicular pe MN in vitro, apoi transferul ex vitro [287].
Fructele de aronie, fiind relativ mici, reprezintă o mare dificultate la recoltăre. Pentru
sporirea dimensiunilor fructelor de aronie s-au testat diferite procedee agrotehnice [160], iar în
ultimul timp şi prin obţinerea poliploizilor [138,318,256].
Interesul faţă de A.melanocarpa (Michx.) Elliot este într-o ascensiune [176], graţie
compoziţiei chimice a fructelor, care sunt solicitate pe piaţa mondială ca sursă de PA cu
valoroase virtuţi terapeutice, de coloranţi naturali, ingredienţi şi produse dietetice cu efect
antioxidant în industria alimentară [106,117,157,176]. Conform datelor evaluării bibliografice
recente, fructele de aronie sunt de mare perspectivă în asigurarea populaţiei cu aliment sănătos
cu proprietăţi antioxidante. Pentru acoperirea necesităţilor se elaborează proiecte pentru plantaţii
industriale, care necesită material săditor avirotic, obţinut prin microtehnici biotehnologice in
vitro sau obţinerea biomasei calusale in vitro îmbogăţită cu principii biologic active, inclusiv
cele de natură fenolică ca reală alternativă la plantaţiile tradiţionale.
1.3. Compoziţia biochimică şi virtuţile terapeutice ale fructelor de aronie
Începând cu sec.XX, fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot au devenit obiectul de
cercetare în multe laboratoare biochimice şi continuă a fi până în prezent [314, 315] pe teritorilul
Americii, unde şi este centrul de formare a speciei. Datorită extinderii arealului speciei în Europa
şi Asia s-au desfăşurat investigaţii biochime ale fructelor în centrele ştiinţifice europene
[124,148,157,247,272] şi asiatice [163,320,343]. Un aport deosebit în studiul fructelor de aronie
revine centrelor stiinţifice biochimice şi de ameliorare a plantelor din spaţiul ex-sovietic

26
[144,146,204,239,317,346,388]. Compoziţia chimică a solului şi chemicalele administrate
influenţează selectiv asupra calităţii fructelor [301].
Datele privind compoziţia chimică şi distribuirea cantitativă a constituienţilor separaţi în
fructele de aronie sunt disperse. Compoziţia chimică a fructelor, recoltate în România, este
reprezentată prin antociani (492 mg/100g fructe proaspete), acid ascorbic (81,4 mg substanţă
uscată), totalul glucidelor (6,9%), aciditatea totală (1,39%), taninuri (1,29%), pectine (0,59%),
vitamina P (2211-5000 mg%), vitamina E (0,5-0,8 mg%) şi substanţe minerale [33,319].
Fructele, crescute în Japonia, se caracterizează prin următoarea compoziţie: zaharuri – 54,2%,
inclusiv sorbitol – 22,9%, glucoză – 14,5%, fructoză – 16,8%; acizi organici – 18,0%, inclusiv
citric – 2,4%, malic – 14,8%, neidentificaţi – 0,8%; polifenoli – 16,9%, dintre care antociani
(cianidina 3-glucozida, cianidina 3,5-diglucozida) – 13,5%, quercetrina – 1,4%, neidentificaţi –
2,0% şi fibre solubile – 10,8% [163,320].
Calităţile curative ale fructelor de aronie sunt datorate flavonoidelor cu acţiune P-
vitaminică, care prevalează în conţinutul CF. Totalul derivaţilor flavonolilor alcătuiesc 76,43
mg/kg cu următoarea distribuire: quercetrina – 71,13 şi kaempferolul – 5,30 mg/kg [148],
ultimul menţionat şi în alte studii [320]. Probabil, prezenţa kaempferolului în cantităţi mici,
comparativ cu ceilalţi constituienţi, explică absenţa lui în alte lucrări [124]. A fost determinat
conţinutul (mg/kg) total şi individual al unor grupe de fenoli în fructele de A.melanocarpa
(Michx.) Elliot [141]. Studiile din ultimii ani privind conţinutul flavonoidic din fructele de aronie
[302] arată, că maximul revine flavonolilor (71 mg/100 g de produs proaspăt), derivatul major
fiind quercitrina – 80 mg/kg de fructe, ce constituie 30% din totalul heterozidelor fenolice,
reprezentată prin quercetrină-ramnoză-glucoză şi quercetrină-arabinoză [124,148,343].
Quercetrinele şi catehinele din fructe inhibă sinergic producerea peroxidului de hidrogen [259].
Fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot se caracterizează printr-un conţinut antocianic
bogat [246]. Conform unor studii [343,344] totalul antocianilor constituie 1480 mg/100g, iar al
proantocianilor – 664 mg/100g PV proaspăt. Este demonstrat că proantocianii şi (-) epicatehinele
sunt grupele majore de derivaţi fenolici şi alcătuiesc 65% din totalul CF al fructelor [259].
Antocianii, reprezentaţi de un amestec de cianidine, sunt pe locul doi după conţinut şi alcătuiesc
25% din totalul CF. În procesul de maturare a fructelor conţinutul antocianic se modifică şi în
cele coapte au maximul de acumulare [27,29], inducând coloritul atractiv, care determină
aspectul comerical şi calităţile gustative ale fructelor şi sunt cconsideraţi ca PA [172] cu
importante virtuţi terapeutice [156,174,300,311].
Cianidinele manifestă o activitate antioxidantă de 4 ori mai mare decât vitamina E [279],
iar fructele de aronie, fiind unele din cele mai bogate în acest conţinut, se caracterizează printr-

27
un efect antioxidant major [343]. Antocianii contribuie la reducerea nivelului colesterolului cu
impact benefic în prevenirea arterosclerozei, îndeplinesc rol important în reglarea tensiunii
arteriale şi a activităţii cordului [66,68]. Conţinutul antocianic, izolat din fructele de aronie, se
caracterizează prin efect antimutagenic [119,300]. Antocianii izolaţi şi îmbogăţiţi cu bioflavone
împiedică clavajul ADN, manifestă acţiune antiinflamatoare, antioxidantă, diminuează
fragilitatea capilarelor [186]. Fructele de aronie sunt indicate în profilaxia diferitor maladii,
graţie conţinutului sporit în flavonoide, inclusiv în antociani, cu acţiune chimiopreventivă,
chimioprotectoare [315] şi gastroprotectoare [207].
Acizii fenolici din fructele de aronie sunt reprezentaţi prin acidul clorogenic – 301,85
mg/100g PV şi acidul neoclorogenic – 290,81 mg/100g PV [320]. Conţinutul acestora este mai
mare în sucul proaspăt, decât în fructe [130]. O pondere mare din CF revine şi acidului galic –
709,3 mg/100 ml de suc [325]. Aciziii hidroxicinamici, printre care acizii ferulic şi cafeic,
alcătuiesc 50% şi acizii hidroxibenzoici, reprezentaţi prin acidul galic, 10% din CF [124].
Taninurile (0,6-0,86%) conferă fructelor de aronie gust astringent, pentru ce sunt
solicitate în sfera alimentară şi totodată determină efectul terapeutic antiinflamator [130].
Taninurile îndeplinesc rol înhibator în reacţiile chimice de fermentare [364], de aceea sucul
proaspăt de aronie este administrat în calitate de supliment conform reţetelor tehnologice de
pregătire a sucurilor, vinurilor şi altor produse pe bază de fructe ale altor specii [263].
Fructele de aronie se caracterizează prin prezenţa diferitor vitamine: acidul ascorbic –
32,9 mg/%, carotenul – 2,4 mg%, vitamina E – 0,8-2,2 mg %, acidul nicotinic – 0,46-0,64 mg %,
vitamina B2 – 0,13mg %, acidul folic – 1,5 mg % [47,269], care evident sporesc valoarea
nutritivă şi terapeutică [327].
În fructele de aronie este o cantitate impunătoare de glucide solubile în apă. Conţinutul
total de zaharuri din fructele proaspete constituie 8,7%, dintre care: fructoza, 5,4%, glucoza, 2%
şi zaharoza, 1,3% [346]. Cantitatea de glucide creşte de la 6,1% în fructele verzi, până la 24,8%
în cele mature. În fructele coapte este prezent şi sorbitolul (8,2-17,5%), cunoscut în calitate de
substituent perfect al zahărului, de aceea sunt recomandate pentru bolnavii de diabet zaharat
[325, 327]. Fructele de aronie conţin pectine şi protopectine (1,7-2,5%) cu calităţi emoliente, ce
manifestă un efect pozitiv asupra tractului gastro-intestinal, iar datorită proprietăţilor de a lega
(până la 25%) sărurile metalelor grele facilitează evacuarea lor din organism, astfel participând
la detoxifierea organismului [325]. Pectinelor le revine un rol important în formarea masei
gelificate la pregătirea produselor culinare: marmelade, gemuri, dulceţuri [388].
Fructele şi sucul de aronie reprezintă un microdepozit de microelemente: molibden (0,32-
1,88 mg), mangan (3,56-9,64 mg), cupru (0,81-2,97 mg), bor (0,15-0,71mg), iar cobalt – sub

28
formă de urme. Iodul constituie 0,06-0,1 mg, conţinutul căruia depinde de cantitatea
îngrăşămintelor minerale de iodură de caliu, administrate în sol [325]. Microelementele
îndeplinesc rol important biologic în metabolismul celular al fructelor, înfluenţând creşterea şi
acumularea conţinutului de PA [204]. În fructe sunt prezente şi substanţele insolubile în apă –
pentozanii, celuloza, proteinele, ligninele, grăsimile, acizii graşi şi uleiurile volatile [135,176].
Fructele de aronie sunt valoaroase ca remedii antioxidante, graţie nu a constituienţilor separaţi
fenolici [232], dar a complexului total de PA [148,199,246,247,325,344], care au acţiune
sinergică [193]. Totuşi, ponderea determinantă în activitatea antioxidantă revine conţinutului
sporit de CF [149,163,326].
Un aport în elucidarea efectelor terapeutice ale fructelor de aronie revine şcolii medico-
biologice a Departamentului de Farmacologie Clinică şi Preclinică al Universităţii de Medicină
din o.Varna [286,325-328]. Conţinutul CF al fructelor de aronie posedă efecte hipoglicemiante
[327] şi sunt recomandate în prevenirea şi controlul diabetului zaharat, protejează ficatul de
intoxicare, previne apariţia ulcerului stomacal [325]. CF au rol antiinflamator şi previn
inflamaţiile, cauzate de eliberarea mediatorilor alergici (histamina şi serotina) [163,325],
diminuează viabilitatea unor bacterii virulente [328], au acţiune antivirală [286].
CF din fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot survin în reglarea imunităţii în cazul
leucemiei şi cancerului pulmonar, îndeplinesc rol suprimător în diviziunea celulelor cancerului
de colon [260], reduc riscul accidentelor cardiovasculare şi contribuie la înlăturarea
consecinţelor infarctului miocardic [229], reprzintă remedii gastroprotectoare în leziuni gastrice
acute, hemoragice [207].
Astăzi nu există date despre toxicitatea fructelor sau sucului de aronie, doar unele
precauţii individuale, necesare să fie respectate de pacienţii cu maladii cronice [325].
Analiza lucrărilor ştiinţifice, axate pe studiile biochimice şi efectele terapeutice ale
fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, demonstrează interesul vădit faţă de ele pe
parcursul ultimului deceniu. Studiul bibliografic respectiv a pus în evidenţă clasele principale de
compuşi naturali prezente în fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, valoarea benefică
asupra corpului uman şi rolul determinant terapeutic a CF.
1.4. Localizarea şi rolul biologic al compuşilor fenolici în plante
Distribuirea CF la nivelul subcelular în ţesutul fructelor nu este întâmplătoare, dar
corelează cu etapele ontomorfogenetice şi are rol important biologic, sporind rezistenţa la
acţiunea factorilor chimici şi fizici excesivi [27,35,38,98,126,197].

29
1.4.1. Localizarea flavonoidelor, acizilor fenolici, taninurilor
Unii constituenţi fenolici se depozitează în peretele celular sub formă de lignine şi
molecule mai simple (flavonoide şi esteri ai acidului ferulic), alţii, în deosebi, cei solubili, se
acumulează în sucul vacuolar [34,142,220,377,369]. În general, la fructele suculente acumularea
CF are loc, cu precădere, în zonele tisulare externe şi diminuează spre cele tisulare interne
[27,196,197,35]. În bacele de Vitis vinifera, glicozidele flavonolilor, antocianii şi esterii
hidroxicinamici se acumulează în vacuolele celulelor subepidermale [27,35,359]. La majoritatea
fructelor, specializate în biosinteza fenolică, heterozidele flavonolice sunt localizate în regiunea
externă a pericarpului sau numai în epicarp [27,255].
Acumulările maxime fenolice au fost depistate în diferite compartimente celulare, dar cu
precădere în vacuole, în deosebi, în ţesuturile periferice ale fructelor suculente de V. vinifera
[35,261,377], Malus domestica [36,46,369] şi A. melanocarpa (Michx.) Elliot [22,27]. O
distribuire a CF în tot pericarpul este caracteristică fructului de căpşun, zmeur [197]. Catehinele
şi taninurile sunt localizate, la fel, în straturile periferice, conţinutul lor diminuind spre centru. În
pericarpul fructului de măr şi păr concentraţia (+)-catehinelor şi (-)-epicatehinelor este mai mare
în epidermă şi hipodermă, decât în restul pericarpului [255]. În partea externă a fructelor
suculente coapte sunt localizaţi acizii hidrocinamici, în special acidul cafeic şi derivaţii lui
[131,197]. Unii indici biochimici ai CF din fructe sunt confirmaţi prin investigaţiile
ultrastructurale [22, 35,46,82,369].
Localizarea acizilor hidroxibenzoici (acidul vanilic, elagic şi galic) în fructele suculente
este mai puţin cunoscută [197]. Au fost identificaţi în cantităţi echivalente în epicarp, mezocarp
şi endocarp în fructul de tomate, pepene verde [324] şi doar în epicarp la fructele de viţă de vie
[35]. În fructele de piersic şi căpşun este o altă distribuire, 90% din conţinutul acidului elagic
revine straturilor tisulare interne şi doar 6%, celor periferice, iar 4%, seminţelor. Conform altor
lucrări [124,129,324], conţinutul acidului elagic din seminţele de căpşun este superior (9mg/g),
în raport cu pericarpul matur (1,6 mg/g), iar în seminţele de zmeur conţinutul acidului elagic
alcătuieşte 88% şi în pericarp, doar 12%.
Evaluarea studiilor biochimice privind distribuirea CF în funcţie de histogenul fructului
demonstrează localizarea lor preponderent periferică în pericarp, dar fiecare specie necesită
studii individuale. Informaţia privind compartimentalizarea tisular-celulară a CF este necesară
pentru elaborarea tehnicilor de extragere mai reuşită a lor din fructe sau din alte organe [134].

30
1.4.2. Rolul biologic al compuşilor fenolici
CF îndeplinesc diverse roluri de mare importanţă biologică în celulele vegetale, au
menirea de susţinere în calitate de material constructiv al pereţilor celulari, fiind reprezentaţi prin
lignine, care constituie a doua categorie cantitativă de substanţe organice în lumea vegetală, după
celuloze [332]. Flavonoidele, în special antocianii, reprezintă pigmenţii vegetali, care induc
culoarea florilor şi fructelor, determinându-le atractive pentru insecte şi păsări, astfel,
contribuind la realizarea fenomenelor biologice de polenizare şi diseminare [126]. Flavonoidelor
li se atribuie rolul biologic de molecule-signal la interacţiunea dintre plantă şi bacteriile fixatoare
de azot la diferite leguminoase [257]. CF pot contribui la competitivitatea dintre plante, prin
intemediul mecanismului de alelopatie. Unii CF solubili, fiind toxici, pot servi drept constituienţi
alelopatici [203], influenţând pozitiv sau negativ plantele din imediata vecinătate [178].
Un rol important în mecanismul de apărare al plantelor faţă de acţiunea factorilor externi
le revine flavonoidelor şi acizilor fenolici [98,99]. Iradierea excesivă induce sinteza CF.
Acumularea iniţială a CF în celulele epidermale şi subepidermale denotă menirea lor în protecţia
plantei de excesul razelor UV, prin ocrotirea ADN de denaturare şi fragmentare, astfel asigurând
viabilitatea celulelor în condiţii stresante [89,359]. Sinteza CF se intensifică în cazul diferitor
maladii ale plantelor. Procesele biosintezei CF sporesc în ţesutul plantelor, supuse atacului
patogenic, al ierbivorilor sau a acţiunilor mecanice [89,98]. Acumularea flavonolilor, cum ar fi
kaempferolul şi heterozidele lui, a fost menţionată în cazul lizării suprafeţelor organelor [184].
Acumularea excesivă de antociani are loc înainte de declanşarea infecţiilor patogene, inducând
prevenirea infectării [231,257]. Acizii fenolici şi taninurile din ţesuturile periferice ale fructelor,
reprezintă factori eficienţi de prevenire a infecţiei în plantă [70,99,231].
Se discută 2 mecanisme de apărare prin intermediul CF: efectul toxic direct (formarea
radicalilor liberi de unii precursori ai ligninelor) sau formarea activă şi accelerată a ligninelor în
calitate de barieră protectoare [70,89]. Unii CF îndeplinesc rolul de fitoalexine şi pot fi în
cantităţi mici în celule, iar în cazul atacului infecţiei, se acumulează rapid, opunând rezistenţă.
Rolul major al fitoalexinelor le revine acizilor hidroxicumarinici şi hidroxicinamici [257].
Nivelul sintezei CF creşte în cazul stresului nutriţional (limitarea fosfaţilor) şi celui creat
de influenţa temperaturilor joase, având menirea de protecţie, dar mecanismele de acţiune rămân
a fi încă insuficient elucidate [197]. Deficitul de fier provoacă creşterea conţinutului de acizi
fenolici [98], iar deficitul de azot induce sinteza flavonoidelor şi izoflavonoidelor, care servesc
ca indicator chimiopreventiv pentru bacteriile fixatoare de azot [257].
Evaluarea bibliografiei actuale demonstrează, fără echivoc, rolul biologic al CF sintetizaţi
în organele plantelor, deşi mecanismele de acţiune rămân a fi încă insuficient elucidate.

31
I.5. Culturi celulare şi tisulare in vitro la fructe
În literatura din domeniul biotehnologiilor vegetale explantele, antrenate pentru iniţierea
culturilor celulare şi tisulare in vitro, au cea mai diversă origine histologică. Totuşi, lucrări
biotehnologice pe culturi in vitro, provenite din fructe, în special, de la cele suculente, sunt
limitate (tabelul A.1.1), deoarece necesită tehnici individuale [202]. La mijlocul secolului XX au
apărut primele lucrări biotehnologice pe explante, decupate din fructe cu pericarpul suculent. S-a
indus calus frutier de Malus domestica [237,185], apoi de Persica vulgaris [303,349]. Se
studiează rolul kinetinelor şi a valorii pH MN în inducerea calusului din endocarpul suculent de
Citrus limon [173]. În baza tatonării compoziţiei chimice a MN s-a obţinut inducerea şi
acumularea biomasei in vitro din fructele suculente de Persea americana [74].
Acumularea masei calusale se bazează atât pe diviziunea, cât şi pe extinderea celulară, în
deosebi pe MN, suplimentate cu kinetine. Un rol deosebit în iniţierea diviziunii celulare revine
valoarii pH-lui sucului celular al explantului inoculat şi MN. A fost determinată valoarea pH-lui
în iniţierea carpomaselor in vitro din pungile suculente ale endocarpului de C. limon [173]. Tot
în această perioadă se realizează experimente biotehnologice, în care sunt antrenate explante din
fructele suculente de P. americana în culturi in vitro, unde este determinat rolul exo- şi
endogenic al citokininelor în inducerea şi acumularea carpocalusului [74]. Experimente
biotehnologice pe carpoculturi in vitro din fructele suculente apar sporadic, cum ar fi la măr
[96,253] şi păr [180], lămâi [104] şi la specii din g.Vaccinium [227]. Se obţine calus frutier din
mezocarpul suculent al fructelor de Olea europaea [182]. Experimentele axate pe cultura la
fructele din g.Citrus sunt într-o continuitate [122,198]. Sunt tatonaţi diferiţi histogeni din
pericarpul de C.nobilis, iar rezultatele evalute prin metoda “Response Surface Methodology”
[125].
Au fost determinate condiţiile de inducere a diviziunii celalare în explantele decupate din
pericarpul de Ligusticum vulgare [67]. Se reuşeşte inducerea calusului la o etapă timpurie de
dezvoltare la fructele de Prunus cerasus [73]. Se studiează metaboliţii primari şi metabolismul
acizilor organici în calusul din fructele de Malus sylvestris [268]. Ulterior, reapar lucrări
biotehnologice pe explante, prelevate din fructele de P. americana [270], în care se determină
rolul CO2 atmosferic în inducerea biosintezei CF în biomasele calusale. Se determină importanţa
tipului de hormoni şi combinaţiile lor la inducerea calusului static din explantele fructelor de
Solanum xanthocarpum [147]. Se studiează sinteza pigmenţilor carotenoidici în biomasa frutieră,
generată din pulpa fructului de Gardenia jasminoides [230]. Apar lucrări ştiinţifice privind
stimularea biosintezei şi acumulării conţinutului antocianilor, catehinelor în cultura în suspensie
la V.vinifera [91,100,158]. Se studiează rolul tipului de hormoni în inducerea carpocalusului la

32
fructele suculente ale diferitor varietăţi de C.annuum [55] în corelaţie cu conţinutul alcaloizilor
[289], la soiuri de L. esculentum [56,57] şi de Psidium guajava prin evaluarea biomaselor
generate în baza criteriilor histomorfologice [347]. Se încearcă producerea aromelor prin
carpoculturi de Fragaria viridis [137], a antocianilor şi taninurilor prin culturi în suspensie de V.
vinifera în bioreactoare de capacităţi mari [94,97,158]. Prin manipularea diferitor factori fizici şi
chimici se reuşeşte obţinerea carpomaselor, îmbogăţite cu CF [115,335].
Tot în această perioadă în şcoala de anatomie a plantelor a Academiei de Ştiinţe a
Moldovei sub conducerea academicianului B. Matienco se organizează lucrări biotehnologice pe
fructe suculente. Se efectuează tatonarea MN, factorilor fizici şi biologici în scopul optimizării
condiţiilor pentru iniţierea şi obţinerea calusului frutier, numit carpocalus sau carpomasă [206].
Apar lucrări privind evaluarea structurală şi ultrastructurală a carpomaselor, obţinute din fructe,
specializate în biosinteza CF cum ar la A.melanocarpa (Michx.) Elliot [6-9,21, 80,83], V.vinifera
[45,76,206] şi a carotenoidelor la C. annuum, L. esculentum [55-58] şi Cucurbita pepo [206].
Numărul speciilor de plante, donatoare de carpoexplant suculent pentru culturi in vitro
este redus [9]. În prima jumătate a secolului XX s-a încearcat inducerea calusului static din
fructele suculente (tabelul A.1.1). Ulterior, în lucrările biotehnologice pe fructe, au fost înaintate
obiective concrete: determinarea naturii histogenului carpogen pentru inducerea şi acumularea
calusului; determinarea vârstei fructului-donator de explant; elucidarea rolului diferitor MN,
tipului, dozei şi combinaţiilor de hormoni asupra iniţierii şi acumulării biomasei calusale
[12,13,55,56]. În lucrările mai recente se efectuează studii biochimice calitative şi cantitative ale
carpomaselor, obţinute in vitro [23,24,26,81].
Evaluarea experimentelor biotehnologice, privind calusarea carpoexplantelor,
demonstrează că la inducerea calusului, în deosebi din pericarpul suculent, se înregistrează
anumite dificultăţi, determinate de particularităţile histoanatomice şi biochimice ale pericarpului.
În conformitate cu rezultatele obţinute la diferite fructe suculente, este cert, că fiecare specie
necesită investigaţii ştiinţifice complexe, minuţioase, individuale.
I.6. Acţiunea factorilor chimici şi fizici asupra dezvoltării culturilor in vitro
Rezultatele încurajatoare, obţinute prin aplicarea microtehnicilor de culturi celulare şi
tisulare in vitro la plante, au dat, chiar din start un avânt puternic investigaţiilor din domeniul
biotehnologiilor vegetale. S-a declanşat un val de experimente biotehnologice, care continuă să
fie într-o ascensiune, privind determinarea condiţiilor fizice şi chimice optime pentru iniţierea
calusării, acumularea vitromaselor şi obţinerea vitroplantulelor. Efectele acţiunii unui sau altui
factor fizic sau chimic asupra iniţierii calusării, acumulării biomaselor, expresiei embriogenezei
sau non-embriogenezei sunt foarte diverse.

33
 Reuşita experimentelor bitehnologice pe culturi celulare şi tisulare in vitro depinde de
selectarea corectă a tipului MN de bază. Iniţierea calusării, aspectul morfologic al calusului
generat din fructele de Psidium guajava corelează cu tipul MN şi a suplimentului hormonal
[347]. Din 5 tipuri de MN tatonate pentru inducerea calusului din fructele de M. domestica, doar
2 au fost benefice pentru generarea calusului [96]. Incubarea explantelor din stoloni şi muguri de
Eleutheococcus senticosus pe 2 tipuri de MN a demonstrat rezultate diferite: mediul SH
suplimentat cu 1 mg/l de 2,4-D, 1 mg/l de ANA şi 0,5 mg/l BAP a favorizat calusarea la 50% din
stoloni, pe când mediul MS cu modificări hormonale similare, doar la 25%, dar al doilea MN a
fost mai eficace pentru iniţierea calusului din muguri [111]. Pentru culturile in vitro este
important tipul MN utilizat atât pentru iniţierea calusării, cât şi celui, utilizat pentru pasajele
ulterioare. Pasarea calusului primar de A polygama de pe mediile B5, pe MS, reprezintă o tactică
avantajoasă în privinţa creşterii intensive şi acumulării calusului [90]. E evident, că tipul MN
este important pentru iniţierea culturilor, dar prezintă mare interes natura biologică şi starea
fiziologică a explantului utilizat, care în complex determină evoluţia explantului frutier în culturi
in vitro.
Toate categoriile de hormoni cu acţiune reglatoare de creştere (auxinele, citokininele şi
giberelinele) au caracteristici comune în celulele vegetale: acţionează în doze mici; reacţionează
în mod specific la nivelul celulelor ţintă prin intermediul unor receptori; acţionează în echilibru
unii cu ceilalţi [50,53]. Aceste caracteristici servesc reper în întocmirea schemelor
biotehnologice. Rezultatele biotehnologice depind de tipul şi dozele de hormoni auxinici (AIA –
auxină naturală şi 2,4-D sau ANA – sintetice) sau citokininici (zeatina, izopentoniladenina –
compuşi naturali şi BA, K – sintetici), care se stabilesc prin experimentare [17].
Este demonstrat rolul stimulator al acidului 2,4-D, administrat în MN pentru inducerea
calusului [16,18,218,234,373]. Unii autori [253,353] denotă rolul benefic al 2,4-D şi în
acumularea sporită a biomasei, iar subcultivările pe MN cu acest tip de hormoni [80] sporeşte
evident rata de proliferare celulară. Indicii maximi ai biomasei proaspete şi uscate de
Oldenlandia affinis au fost obţinuţi pe mediul MS, suplimentat cu doar 0,4 mg/l de 2,4-D [297].
Experimentele biotehnologice demonstrează că menţinerea calusului pe MN, suplimentate cu
2,4-D frânează embriogeneza, fapt nedorit în micropropagarea speciilor prin intermediul
vitroplantulelor [52]. Frecvent este promovată ideia că una din condiţii pentru obţinerea calusului
nediferenţiat este prezenţa acidului 2,4-D şi a mineralelor în MN [233]. Este demonstrată [289]
prioritatea ANA în calusogeneza şi acumularea biomasei calusale faţă de acidul 2,4-D. ANA în
doze mari (10 mg/l) în MN în combinaţie cu K (0,5 mg/l) cauzează o iniţiere rapidă a calusului
(la a 4 zi) şi o bună proliferare comparativ cu 2,4-D (2-4 mg/l) şi K (0,5 mg/l), care provoacă

34
iniţierea calusării mult mai tardiv şi înscrie o calusare redusă. Efectul ANA poate fi diferit în
funcţie de originea explantului utilizat pentru calusare [62]. S-a studiat rolul AIA în
metabolismul celular al calusului embriogenic şi nonembriogenic [164].
Citokininele au efect stimulator asupra diviziunii celualre în culturi in vitro [50,53,107],
rezultând cantităţi impunătoare de biomasă, în special la culturile celulare în suspensie cu
producere industrială [107,110,137]. Sunt şi rezultatele controverse, citokininele administrate în
MN reţin declanşarea calusării la unele specii [53], iar pentru explantele din fructele de P.
americana manifestă un efect stimulator asupra iniţierii calusului şi acumulării biomasei [74].
Un alt obiectiv înaintat în cercetările biotehnologice este investigarea acţiunii complexe a
auxinelor şi citokininelor în culturi vegetale in vitro. Efecte încurajatoare în cultura tisulară şi
celulară dau combinaţiile fitohormonilor auxinici şi citokininici. Maximul de acumulare a
biomasei, derivată din tulpinile de Salvia officinalis s-a obţinut pe MN, suplimentat cu 2,0 mg/l
de K şi o cantitate minimă (0,05 mg/l) de 2,4-D [292,293]. Concentraţia mică (2,0 mg/l) de ANA
şi mare (8 mg/l) de BAP induce un calus verde la un soi de V. vinifera, iar la alt soi, calus de
culoare roşie, pe când sporirea cantităţii de ANA (10 mg/l) şi reducerii de BAP (0,5 mg/l)
favorizează un calus roşu la soiul, care a generat calusul verde. Cantitatea şi combinaţia
hormonilor acţionează în concordanţă cu genotipul, iar efectul depinde de doză administrată.
Dozele sporite de ANA (10mg/l) stimulează obţinerea calusului de culoare roşie [365]. Aplicarea
hormonilor AIA, ANA şi 2,4-D cu combinaţii a diferitor doze de K au efect benefic asupra
inducerii şi acumulării calusale [147]. Spre expemplu, pentru inducerea şi promovarea calusului
din mezocarpul fructului de Olea europaea un rol esenţial revine AIA şi K [182]. Hormonii au
rol decisiv în inducerea calusului din fructele mature de măr [96].
Un pas progresiv în investigaţiile biotehnologice, pe parcursul ultimului deceniu,
constituie optimizarea şi monitorizarea compiuterizată a administrării balanţei hormonale în MN
şi a aplicării factorilor fizici [77,118,198], reprezentând o cale de succes pentru producerea
culturilor in vitro pe scară largă industrială.
Lumina este un factor necesar în acumularea biomasei in vitro, determinând calitatea
biochimică, dar nu este decisivă în iniţierea calusării. Este demonstrat [198], că obscuritatea este
benefică pentru inducerea calusării. Iluminarea cu intensitatea de 2000 lx determină generarea
calusului colorat în roşu chiar şi la soiurile albe de V. vinifera, iar lipsa luminii, doar a calusului
alb [365]. Inducerea calusării şi producerea biomasei din frunzele de gutui nu este modificată de
calitatea luminii, cu excepţia doar a luminii roşii şi albastre, care diminuează reactivitatea
explantului [218]. Calusul static de Solanum xanthocarpum, dezvoltat în prezenţa luminii atât pe
MN suplimentate cu 2,4-D şi K, cât şi pe cele cu ANA şi K sunt cele mai viabile [147]. Lumina

35
albă în combinaţie cu razele UV frânează creşterea şi modifică caracteristicile morfologice ale
calusului generat [352]. S-a stabilit [373,374] că razele UV în diapazonul 280-320nm, care şi
ajung la suprafaţa pământului, suprimă proliferarea calusului, reduc acumularea biomasei cu
anumite specificări în funcţie de genotit.
Formarea şi acumularea celulelor calusale in vitro este influenţată şi de sursa de elemente
chimice, încorporate în MN. Substituirea P şi N anorganic din MN cu extract din seminţe de soie
(bogat în aceste elemente) conduce la stimularea proliferării şi acumulării biomasei [250].
Azotul, sub formă de amoniu în MN, este metabolizat mai uşor de celulele calusale la Glycine
max, decât cel suplimentat cu nitraţi [372]. Efectul fosfaţilor corelează cu faza calusogenezei,
administrarea în faza staţionară stimulează diviziunea celulară, în schimb, inhibă acumularea
antocianilor în cultura de V. vinifera [158]. Suplimentarea MN cu săruri de N şi de Fe în cultura
de Citrus sinensis a avut efect stimulator în acumularea calusului [233].
Un factor necesar pentru iniţierea şi calusarea reuşită este administrarea diferitor doze şi
combinaţii de vitamine în MN. Mărirea concentraţiei de vitamine de la 3 la 10 ori în MN MS în
combinaţie cu diferiţi hormoni: 2,4-D (2 mg/l) şi K (0,5 mg/l) ori ANA (10 mg/l) şi K (0,5 mg/l)
manifestă un efect negativ în iniţierea calusării la fructele de C. annuum [289].
Studiul realizat denotă că este dificil de evidenţiat rolul decisiv al unui sau altui factor
fizic sau chimic atât în iniţierea calusării, cât şi în evouţia cantitativă şi calitativă a calusurilor în
condiţii in vitro. Este importantă natura factorului aplicat, doza, termenul de expunere,
combinaţiile diferitor factori, care corelează cu histogenul explantului, specializarea structural-
metabolică, vârsta organului-donator de explant şi specie.
I.7. Acţiunea factorilor chimici şi fizici asupra acumulării metaboliţilor secundari în culturi
in vitro
Multitudinea de rezultate ale experimentelor biotehnologice sunt analizate, monotorizate
şi utilizate pentru selectarea liniilor calusale şi celulare înalt productive, cu viitor promiţător în
producerea metaboliţilor secundari utili în domenii aplicative importante cum ar fi: alimentar,
farmaceutic, tinctorial, cosmetic [329].
Iniţierea calusării şi acumularea metaboliţilor secundari posedă caracter taxonomic. Din 3
soiuri de Fragaria viridis, testate pentru calusogeneză şi acumularea antocianilor, doar unul a
dat rezultate promiţătoare [137]. Din multiple soiuri şi varietăţi de C.annuum, antrenate in vitro,
doar var.Punjab s-a selectat pentru propagare, manifestând capacitate sporită de proliferare şi
sinteză a capsaicinei [289]. Calusul generat in vitro păstrează potenţa de biosinteză a CF,
caracteristică organelor-donatoate de explant [77,88,292]. În condiţiile de cultură in vitro se
menţionează diferite expresii calitative şi cantitative ale potenţialului de sinteză fenolică. La

36
speciile g.Vaccinium în cultura in vitro, conţinutul total al acizilor fenolici este echivalent cu cel
din fructele in vivo [188]. Studiile comparate ale biomaselor statice şi ale culturilor celulare in
vitro denotă deosebiri mari cantitative şi calitative. Calusul, generat din fragmente de tulpină de
Salvia officinalis, este mai bogat în CF comparativ cu culturile celulare în suspensie in vitro. În
calus au fost identificaţi 12 CF, pe când în culturile în suspensie, doar 9 [292]. Balanţa
hormonală a MN şi factorii chimici aplicaţi induc schimbari în dezvolatarea şi acumularea
granulelor de amidon în calusul de Ipomea batata [169].
Biomasele de Eleutherococcus senticosus pe MN MS au acumulat cea mai mică
concentraţie de acid clorogenic (0,6mg/g masă uscată), dar cu rată sporită de proliferare, pe când
pe mediu SH, cea mai mare concentraţie (2,0 mg/g masă uscată) şi cea mai mică rată de
acumulare a biomasei [111]. Din 5 MN, testate pentru calusogeneza şi acumularea metaboliţilor
utili la fructele de M. domestica, doar 2 au demonstrat rezultate satisfăcătoare [268].
Razele UV au impact decisiv în dezvolatarea celulei vegetale in vivo şi in vitro. S-a
stabilit rolul pozitiv al razelor UV (280-320 nm) asupra transportului de electroni, implicaţi în
procesul de fotosinteză [352]. Razele UV posedă efect stimulator în biosinteza CF la culturile
calusale de grâu; liniile calusale, rezistente la acţiunea razelor UV, se caracterizează prin
conţinutul fenolic de 5-7 ori mai mare, decât în liniile obişnuite. CF sintetizaţi în celulele
calusale se deosebesc calitativ puţin faţă de cei, caracteristici plantelor, donatoare de explant
[373,374]. Orice iradiere stimulează sinteza poliholozidelor, iar intensitatea sporită a razelor UV
reduce considerabil conţinutul arabinozei şi galactozei din pectinele peretelui celular [123].
Lumina rămâne factorul decisiv în activitatea metabolică a celulei vegetale. Astăzi, rolul
luminii în sinteza polifenolilor şi a acţiunii ei diferenţiate asupra sintezei diferitor CF este
incontestabil [198]. Lumina stimulează biosinteza antocianilor la calusulul din frunzele de
Prunus cerasus [73]. Intensitatea şi calitatea spectrală a luminii are rol pozitiv asupra creşterii
calusului şi biosintezei CF la Cistanche deserticola [248]. Manipulând cu calitatea luminii s-a
obţinut culturi in vitro, bogate cu antociani şi alte flavonoide la Vaccinium pahale [159]. Calusul,
soiurilor albe de V.vinifera, expus la iluminare de 2000 lx, capătă culoare roşie, iar în condiţii de
obscuritate, rămâne alb [365]. Lumina asigură creşterea optimală şi acumularea maximă a CF în
calusul de C. deserticola [248], iar razele UV, dispersate în interiorul bioreactorului au stimulat
producerea biomasei, îmbogăţite cu antociani la Perilla fructescens [354].
Regiumul hormonal a MN îndeplineşte rol crucial în producerea metaboliţilor secundari
prin microtehnicile de culturi in vitro [217]. Prevalarea conţinutului de ANA (10 mg/l) în MN
induce sinteza antocianilor în cultura in vitro atât la soiurile albe, cât şi la cele roşii de V.
vinifera, pe când conţinutul mic de 2,4-D (0,2 mg/l) induce sinteza antocianilor selectiv [365].

37
Administrarea acidului 2,4-D în doze relativ mici (0,1-1,0mg/l) provoacă inhibiţia sintezei
antocianilor în celulele în suspensie la V. vinifera [158].
Sporirea concentraţiei zaharozei în MN are efect pozitiv asupra creşterii celulare şi
producerii CF, în general [318] şi în mod special, asupra biosintezei şi acumulării antocianilor în
culturile celulare de V.vinifera [100]. Glucoza şi zaharoza din MN favorizează creşterea
celulelor, dar prezenţa doar a zaharozei determină acumularea hexozelor în biomase [254].
CF se sintetizează cu diferite intensităţi pe parcursul perioadei de calusogeneză în funcţie
de apartenenţa sistematică a speciei. La speciile cu potenţial de biosinteză fenolică, determinat
genetic, în culturile in vitro se înregistrează o intensificare a producerii CF, chiar la etapa iniţială
a calusogenezei, fenomen demonstrat în experienţele pe specii de Taxus [101], la carpocultura de
V. vinifera [206] şi A.melanocarpa [80,82]. În consecinţă, CF, acumulaţi din abundenţa în
diferite compartimente celulare, frânează celelalte procese metabolice şi cauzează necroza
celulelor calusale generate, în rezultat survine moartea prematură a biomeaslor in vitro [16-18].
Sinteza şi acumularea exagerată a CF conduce la lignificarea pereţilor celulari în celulele mature
sau senescente, fenomen constatat în calusul de Fagopyrum esculentum [285], ce conduce la o
heterogenitate ale celulelor biomasei calusale după gradul de lignificare a pereţilor celulari.
Producerea calusului cu conţinut de alcaloizi din diferite explante a speciei Solanum
eleganifolium demonstrează că, până la a 6-a subcultivare conţinutul alcaloizilor a fost în
ascensiune, iar începând cu cea de a 7-a, se observă o reducere [234]. Majoritatea studiilor arată
că, odată cu sporirea numărului de subcultivări, se intensifică şi biosinteza metaboliţilor fenolici
[100,101]. Totalul concentraţiei antocianilor creşte pe parcursul subcultivărilor, dar selectiv,
favorizând acumularea constituienţilor antocianici, ce se metabolizează mai uşor [94].
Fenilalanina, care se include până la 65% în biosinteza antocianilor, fiind administrată în
MN sporeşte conţinutul final de antociani [288]. Metabolizarea eficientă a fenilalaninei corelează
cu valoarea pH mediului. Valorile pH cuprinse între 8,0 şi 8,7, favorizează activitatea maximă a
acestei enzime-chee în biosinteza CF [197]. Biosinteza CF frecvent este determinată de influenza
diferitor factor patogeni [101] şi acţiunea stresantă a diferitor factori chimici sau fizici [38],
fenomen studiat în condiţii in vitro [10,22,26] şi in vivo [177,307,369].
Administrarea fosfaţilor are rol semnificativ asupra acumulării CF în culturi in vitro de
Hydrangea macrophylla. Concentraţia fosfaţilor poate dirija intensitatea de sinteză a CF [333] şi
este importantă faza calusogenezei, în care au fost suplimentaţi fosfaţii [158]. Concentraţia
nitraţilor din MN, reprezintă un alt factor în dirijarea biosintezei şi acumulării antocianilor şi în
determinarea compoziţiei chimice a biomaselor celulare in vitro la V.vinifera [100].

38
 Valorile pH au efecte substanţiale asupra proceselor biosintetice ale antocianilor din
culturile in vitro. Sporirea valorii pH a MN până la 7,0 cu o balanţă hormonală adecvată
accelerează biosinteza antocianilor în celulele calusale la diferite soiuri de V.vinifera [365].
Frecvent, în culturi vegetale in vitro se sintetizează compuşi chimici noi, nespecifici plantei
producătoare de explant. Administrarea AIA în culturile celulare de D.carota a modificat
metabolismul, rezultând biosinteza unui compus, identificat, ulterior prin minuţioase analize
chimice, ca acidul oxidol-3-acetilasartic, necaracteristic speciei [164]. Un rol important asupra
producerii biomaselor, îmbogăţite cu conţinut antocianic, la Vaccinium pahalae revine factorilor
de lumină şi temperatură [208]. Atmosfera, îmbogăţită cu CO2, induce biosinteza epicatehinelor
în suspensii de celule de Persea americana, iar intensitatea de biosinteză a lor corelează cu
concentraţia CO2 atmosferic [270].
Evaluarea lucrărilor pe culturi de celule şi ţesuturi in vitro în scopul producerii
metaboliţilor secundari de natură fenolică denotă că atât factorii ficzici, căt şi chimici, au o
acţiune selectivă asupra biosintezei constituenţilor fenolici, care corelează cu clasa de CF, natura
factorului aplicat, doza, timpul de acţiune, dar şi cu caracteristici taxonospecifice.
I.8. Studii histoanatomice şi ultrastructurale ale fructelor suculente in vivo
Organizarea histoanatomică şi ultrastructurală a fructelor suculente a fost un obiectiv
major al investigaţiilor botaniştilor atât în plan mondial, cât şi naţional, pentru dezvăluirea
aspectelor structurale şi evolutive ale carpotipurilor. În şcoala de anatomie a plantelor a AŞM
fructul a fost în permanenţă un obiect pentru investigaţii ştiinţifice. Sunt dezvăluite
particularităţile histoanatomice ale fructelor suculente din diferite familii: Cucurbitaceae
[376,378], Rosaceae [9,36,46,380,369], Solanaceae [54,363], Vitaceae [34,35,377]. La sfârşitul
secolului trecut studiile carpologice au fost axate pe organizarea ultrastructurală a fructelor
suculente: în ontomorfogeneză şi evoluţie [378]; pe parcursul perioadei de păstrare [379]; în
corelaţie cu gradientul ecologic al terenului versant-accidentat [369] şi al regiunilor geografice
ale R.Moldova [46], la diferite soiuri autohtone de Malus [36]. Cercetările ultrastructurale ale
celulelor fructelor suculent-cărnoase din s/familia Pomoideae a constituit obiectul investigaţiilor
în multe lucrări ştiinţifice [20,36,46,368,380]. S-au studiat particularităţile anatomice ale
fructelor de căpşuni din zone cu temperaturi şi iradiaţii sporite şi deficit de umiditate [265].
Investigaţiile ultrastructurale ale plastidelor fructelor suculente continuiă să fie obiectul de
cercetare şi în multe lucrări actuale [22,58,337,342,351].
Deşi în ultimul deceniu, investigaţiile structurale apar sporadic atât la nivel naţional, cât
şi internaţional, studiile morfologice, histologice şi ultramicroscopice constituie o parte
complimentară a complexului biologic de investigaţii a legităţilor şi principiilor de dezvoltare a

39
fructelor. Investigaţiile anatomice şi submicroscopice ale fructelor suculente au o nuanţă
specifică, deoarece ele alcătuiesc o grupă carpoecologică aparte. Caracterele histoanatomice,
ultrastructurale ale organizaţiei celuleor fructelor suculente stau la baza funcţionalităţii şi
vitalităţii lor şi determină potenţialul lor aplicativ. Particularităţile specifice ale anatomiei
pericarpului suculent servesc în calitate de reper în asigurarea integrităţii fructului la acţiunea
factorilor stresanţi, în procesele de recoltare, transportare şi păstrare, astfel, determinând calitatea
indicilor gustativi şi a aspectului comercial al fructelor. Caracteristicile citohistologice specifice
ale fructelor suculente sunt necesare în tentativele de inducere a calusării in vitro, deoarece ele
asigură succesul obţinerii carpomaselor şi determină gradul de expresie a totipotenţei în culturile
de celule in vitro [20,55,56,206,289].
Studiul anatomic al pericarpului fructului de aronie a fost realizat de către Gh.Rotaru
[380]. Investigaţiile ultrastructurale ale pericarpului fructului de măr [21,22,36,46,82, 369],
harbuz şi dovleac [376,377,379], vită de vie [34,35], ardei şi tomate [363] denotă un plan de
organizare celulară comun şi confirmă principiul identicităţii zonalităţii histologice [376] cu
anumite specificări structurale calitative şi cantitative, care corelează cu apartenenţa sistematică
a speciei, ecotipul, etapa carpoontomorfogenezei.
Transformările ultrastructurale în celulele fructelor suculente, în perioada maturării şi
senescenţei, afectează toate organitele celulare, dar cu amplitudă, ritm şi grad diferit [369,379].
Acestea constituie diferite etape de: dezorganizare, dezintegrare şi detrucţie, care se succed
treptat şi conduc la peirea celulei [48,369]. Transformările ultrastructurale ale peretelui celular,
exprimate prin dizolvarea lamelei mediane şi dezintegrarea fibrilară, la fructele de măr şi păr,
sunt criterii împortante în stabilirea gradului de evoluare a senescenţei. Apariţia veziculaţiei
intense în regiunea plasmodesmelor, la fel, este un criteriu distinctiv [69]. Unele caracteristici ale
transformărilor ultrastructurale sunt descrise în celulele mezocarpului fructului de piersic [195].
Sunt evidenţiate caracteristicile ultrastructurale pentru celulele pericarpului de Juglans regia la
etapele timpurii de dezvoltare ale fructului (citoplasma bogată în organite, prezenţa
plasmodesmelor şi granulelor de amidon) şi pentru celulele suculente la ultimele etape ale
ontogenezei fructului (degradarea organelelor, subţierea pereţilor celulari, prezenţa acumulărilor
fenolice în nucleu, vezicularea înaintată a citoplasmei) [342].
Studiile histoanatomice şi ultrastructurale la fructele suculente sunt sporadice,
fragmentare, dar foarte necesare în elucidarea diferitor aspecte teoretice şi aplicative ale
carpologiei, fiind parte componentă şi complimentară a complexului de cercetări biologice
vegetale contemporane.

40
I.9. Studii morfologice, anatomice şi ultrastructurale ale biomaselor in vitro
În literatura de specialitate sunt elucidate unele criterii pentru analiza morfologică a
biomaselor: gradul de compactizare (dens-compact sau spongios-lax); aspectul suprafeţelor (mat
sau cu luciu); culoarea (incolor, colorat uniform sau combinaţii de culori) [370]. Aspectul
morfologic al biomaselor este foarte variabil, de aceea specialiştii propun diferite clasificări în
categorii morfologice [371]. Deşi biomasele, formate pe MN semisolide, sunt considerate
acumulări celulare fără un plan strict de organizare [5,53], studiile microscopice demonstrează
că, deja, la etapele timpurii de calusare se deosebesc câteva zone celulare: centrală – cu celule
meristematice nucleate şi citoplasmă bogată şi periferică – din trei tipuri de celule (mari cu
nuclee mari centrale; mici, cu citoplasmă densă şi celule mari, dar cu nuclee mici). La a 10-a
subcultivare se conturează: caulorizogeneza (formarea mugurilor, rădăcinilor); rizogeneza
(formarea rădăcinilor), caulogeneza (formarea lăstarilor); embriogeneza somatică (formarea
embrioizilor); histogeneza (dezvoltarea ţesuturilor) vitromaselor [370].
Frecvent, focarele meristematice au localizare periferică [181,316], dar se întâlnesc şi în
toată biomasa calusală [249]. Celulele meristematice cu poziţie periferică se caracterizează prin:
citoplasmă bogată în ribozomi; vacuole mici; nucleu mare, central, cu 1-2 nucleoli; reticul
endoplasmic dezvoltat; amiloplaste cu o singură granulă de amidon, iar peretele celular străbătut
de multe plasmodesme, care asigură o continuitate simplastică în biomasă [211,330].
Investigaţiile submicroscopice arată, că celulele meristematice din biomasa calusală au o
citoplasmă densă cu multe vacuole mici, bogate în proteine solubile [290]. Studiile comparative,
efectuate prin diferite metode microscopice (optică, electronică cu baleiaj şi prin transmisie), au
demonstrat că calusurile embriogenice sunt compacte, cu noduli „knobs”, elemente conducătoare
şi non-embriogenice – spongioase, friabile, translucide [236]. Majoritatea specialiştilor
determină calusurile compacte ca etapă intermediară între cele nediferenţiate şi cele ce urmează
să se diferenţieze morfogenic şi să genereze vitroplantule [353,370]. Caracterele histoanatomice
(forma celulelor, grosimea pereţilor celulari, prezenţa incluziunilor cu materii de rezervă în
calusul secundar) au caracter conservator pe parcursul subcultivărilor [155, 296].
Ultrastructural, celulele calusului embriogenic se deosebesc de celulele celui
nonembriogenic. Celulele calusului nonembriogenic de Beta vulgaris se caracterizează printr-o
rată sporită de proliferare şi sunt bogate în organite, în special, este dezvoltat RE rugos. Sunt
prezente celulele polinucleate şi este caracteristic peretele celular relativ subţire, uneori
neuniform în grosime sau chiar întrerupt. Celulele calusului embriogenic se caracterizează prin:
prezenţa peretelui celular perfect, grosimea căruia corelează cu topografia celulelor; sunt
vacuolizate şi au un indice sporit al raportului nucleu/citoplasmă [213].

41
 Gradul de lignificare al peretelui la celulele calusale corelează cu caracteristicile
morfogenetice ale soiurilor de hrişcă, antrenate în culturi în calitate de donator de explant [285].
Calusul, generat de specia spontană Lycopersicon ceesmanii typicus se deosebeşte de cel obţinut
de la soiul cultivat de tomate prin densitatea mai sporită şi persistenţa amidomului un timp mai
îndelungat [56]. Caracteristicile morfofuncţionale ale maselor calusale sunt determinate de
influenţa diferitor intensităţi ale radiaţiei UV, cea sporită induce schimbări în structura pereţilor
celulari, creşte grosimea şi densitatea, paralel cu reducerea dimensiunilor celulelor [374].
Aplicarea tehnicii de colorare selectivă la prepararea materialelor pentru studii
ultrastructurale a permis determinarea naturii chimice şi localizarea incluziunilor ergastice în
celulele in vitro la Pinus taeda şi Pseudotsuga menziesii. Materialul fenolic la interacţiunea cu
materialul osmic la examinarea în TEM apare ca incluziuni electrondense negre şi opace [251].
Unii cercetători menţionează lipsa granulelor de amidon în calusul primar [113,296], alţii
[22,55,57,169,351], prezenţa lui. Acumularea amidonului în celulele calusale serveşte ca un
indicator al dezvoltării ulterioare pe cale embriogenică [353], deşi ele au fost depistate şi în
calusurile non-embriogenice [194]. Capacitatea amilogenă sporită a plastidelor în primele 15 zile
de dezvoltare a calusului are loc în baza glucidelor administrate în MN. Odată cu maturarea
biologică a calusului conţinutul de amidon dispare [58]. Atât calusul embriogenic, cât şi cel non-
embriogenic acumulează proteine şi lipide, ultimile în cantităţi mai reduse [169,266].
Studiile ultrastructurale au evidenţiat unele caracteristici specifice ale calusului static de
Mammillaria gracillis: dediferenţierea secundară a cloroplastelor mature, umflarea şi destrucţia
tilacoidelor, acumularea fitoferitinelor, elongarea plastidelor şi mărirea dimensiunilor [266].
Celulele calusale, obţinute din frunzele de Rubia tinctorum, la vârsta de 10-14 zile după
inoculare, se caracterizează prin vacuolizare, dezvoltarea condriomului şi a sistemului de canale
ale RE, sporirea densităţii carioplasmei nucleului şi a hialoplasmei celulei. Local şi sporadic sunt
procese litice ale peretelui celular [245]. Caracteristicile ultrastructurale ale celulelor se schimbă
în corelaţie cu compoziţia chimică a MN pentru cultivare in vitro. Administrarea sărurilor de
amoniu condiţionează biosinteza proteinelor în celulele calusale de soie, exprimată prin sporirea
numărului de ribozomi, tilacoide granale ale cloroplastelor, densitatea optică mai mare a stromei
cloroplastelor, mitocondriilor şi a matrixului citoplasmatic. Transformările ultrastructurale
contribuie la sporirea activităţii fotosintetice şi acumulării biomasei [383].
Evaluarea lucrărilor citoanatomice in vitro denotă prezenţa unor caracteristici
ultrastructurale calitative şi cantitative taxonospecifice şi organospecifice, care corelează cu
direcţia evoluării calusurilor: pe cale embriogenică ori nonembriogenică. Determinarea direcţiei

42
de dezvoltare necesită studii citoanatomice individuale pentru fiecare taxon prin aplicarea
citoreacţiilor specifice de identificare a naturii chimice a structurilor dezvoltate.
1.10. Avantaje, necesităţi şi perspective ale dezvoltării biotehnologiilor culturilor celulare şi
tisulare in vitro
Culturile de celule şi ţesuturi vegetale in vitro oferă o reală oportunitate pentru obţinerea
în flux continuu şi dirijat a metaboliţilor secundari utili [77,115,232], reprezentând o tehnologie
reală de producere modernă, actuală, foarte atractivă şi cu mari perspective pentru viitor.
Culturile vegetale in vitro oferă posibilitatea de îmbogăţire esenţială a biomaselor obţinute cu PA
de valoare, manipulând direcţia metabolică prin intermediul diferitor factori [348]. Rezultatele
investigaţiilor complexe, bazate pe metode moderne de cercetare ale şcolilor biotehnologice din
diferite centre internaţionale servesc în calitate de reper pentru elaborarea liniilor biotehnologice
industriale de producere a compuşilor chimici naturali prin intermediul culturilor vegetale in
vitro [178]. Compuşii chimici produşi se pot utiliza în industria agricolă, alimentară,
farmaceutică, cosmetică etc [110]. Culturile tisulare in vitro pe MN semisolide oferă o stabilitate
genetică mai mare a celulelor decât a culturilor celulare în suspensie [118].
Orice factor fizic sau chimic are o anumită influenţă asupra biosintezei metaboliţilor
primari şi secundari în culturile in vitro şi, în anumite condiţii, în funcţie de specie, poate avea
efect decisiv. Manipulând spectrul luminii s-au obţinut culturi de celule la Vaccinium pahale,
capabile să sintetizeze CF în concentraţii mult mai mari, decât în plantele in vivo şi fără compuşi
de interferenţă, ce simplifică mult procedeele de izolare şi purificare a antocianilor şi a altor CF
[159]. Derivaţii flavonoidelor pot fi mult mai uşor separaţi din culturile, obţinute in vitro, decât
din complexele tisulare ale organelor plantei [188]. Izolarea PA din celulele vegetale suportă
deseori diferite dificultăţi. Pereţii celulari şi alte structuri membranice ale celulei vegetale
reprezintă bariere în evacuarea eficace a constituenţilor chimici valoroşi. Culturile celulare şi
tisulare in vitro oferă oportunităţi reale de izolare a compuşilor chimici valoroşi pentru omenire.
Elaborarea şi stabilirea liniilor de producere biotehnologică industrială a metaboliţilor
secundari utili se bazează pe rezultatele investigaţiilor multianuale complexe. Manipularea
inginerească eficace a direcţiei metabolice în culturile in vitro este posibilă, ţinând cont de
etapele consecutive de sinteză a metaboliţilor secundari: a) prebiosintetică a precursorilor; b)
biosintetică de producere a metaboliţilor structurali de bază şi c) postbiosintetică – în care au loc
bitransformările chimice şi enzimatice, transportarea, depozitarea, evacuarea şi degradarea
compuşilor chimici [355]. Toate etapele sunt importante, air cunoscând modul de derulare şi
caracteristicile ultimei etape, se poate interveni adecvat pentru îmbunătăţirea produsului
biotehnologic în bioindustriile de producere pe scară largă. În culturile in vitro mai uşor pot fi

43
manipulate şi direcţionate procesele postbiosintetice ale metaboliţilor secundari din celule, poate
fi prelungită capacitatea de biosinteză activă a celulelor vegetale, mai efectiv pot fi administrate
diferite procedee chimice şi fizice în scopul stabilizării compuşilor uşor labili [348].
Frecvent, metodele clasice, tradiţionale, practicate de-a lungul anilor, de extragere a
bioflavonilor din fructele specializate în biosinteza lor (specii de Vitis, Vaccinium, Aronia) sunt
însoţite de mari dificultăţi, pierderi şi au mari dezavantaje, în raport cu izolarea lor din celulele
din suspensie in vitro, care oferă anumite facilităţi [159].
Deşi, strategiile producerii biochimicalelor prin intermediul tehnicilor şi procedeelor
biotehnologice de culturi celulare şi tisulare in vitro au debutat în anii 60 a secolului XX,
începutul secolului XXI a fost marcat prin existenţa adevăratelor bioindustrii de producere a
metaboliţilor secundari benefici cu extinderea arealului de utilizare [329]. În rezultatul
monitorizării datelor biotehnologice şi inginiiereşti biomedicale [48,75,121,188,189,329,350],
privind producerea metaboliţilor secundari pentru produsele farmaceutice, alimentare şi dietetice
s-au evidenţiat următoarele avantaje ale culturilor in vitro: producerea în flux continuu;
independent de factorii climatici, caracteristicile solului, rotaţia sezonieră, cataclismele naturale
şi gradul de poluare; posibilitatea monitorizării factorilor chimici şi fizici; manipularea uşoară a
factorilor ce influenţează acumularea biomasei şi biosintezei metaboliţilor secundari; producerea
în cantităţi mari; selectibilitatea şi izolarea mai eficace a compuşilor chimici de interes;
reducerea riscului contaminării cu microbi; ciclurile biosintetice ale cuturilor celulare şi tisulare
în condiţii in vitro sunt mult mai rapide, decât cele ale plantei în condiţii naturale.
O oprtunitate, oferită de microtehnicile biotehnologice in vitro, este asigurarea
biosecurităţii produselor alimentare şi terapeutice, care poate fi realizată doar prin culturi in
vitro, rolul decesiv revenindui factorului uman [118,361]. Produsul biotehnologic final este de
calitate înaltă, ecolgic pur, fiind supus pas cu pas controlului [53]. Astăzi, sunt monitorizate
condiţiile biotehnologice, specifice plantelor medicinale, pentru producerea PA în proporţii mari
pentru satisfacerea necesităţilor pieţii farmaceutice [97,298,361]. M. Lila în lucrarea “Valuable
Secondary Products from In Vitro Culture” evidenţiază criteriile de selectare ale liniilor calusare
şi celulare in vitro la plante medicinale pentru producerea metaboliţilor secundari cu efecte
terapeutice prin intermediul bioindustriilor moderne [189].
Rezultatele investigaţiilor ştiinţifice, în plan mondial, demonstrează, că culturile in vitro
pe scară industrială, se dezvoltă virtiginos în prezent şi vor avea perspective fabuloase în viitorul
apropiat. Permanent apar date noi, privind producerea SBA şi se extinde numărul speciilor de
plante, implicate în biotehnologiile moderne. Se cultivă pe scară largă culturi celulare pentru
obţinerea pro- şi antocianilor, carotenoidelor, heterozidelor cardiotonice, alcaloizilor,

44
antrachinonelor [48,158,188,189,217,348]. Fluxul producerii metaboliţilor, în cazul conţinutului
de antociani, poate fi vectorizat fără a afecta structura moleculară prin administrarea diferitor CF
(mezil-jasmonat şi acidul p-cumaric) în MN [262].
Producerea flavonoidelor cu efecte antioxidante, dietetice, sunt binevenite pentru
ameliorarea sănătăţii corpului celor dependenţi de fumat, diminuând riscul accidentelor
determinate de această dependenţă [165]. Flavonoidele dietetice obţinute vor constitui
ingredientul de bază a raţionului alimentar al persoanelor cu risc de cancer pulmonar [170], celor
supuşi iradierii [172]. Culturile celulare şi tisulare in vitro reprezintă o achiziţie de valoare a
secolului XX, cu cele mai reale perspective în secolul recent pentru producerea metaboliţilor
primari şi secundari în proporţii industriale [110,115], care ar satisface necesităţile mereu
crescânde ale populaţiei pe piaţa mondială. La sfârşitul secolului XX a fost înnaintat obiectivul
de a monitoriza aspectele biologice, chimice şi fizice ale culturilor vegetale celulare şi tisulare in
vitro cu potenţial sporit de producere a metaboliţilor utili în scopul determinării ulterioare a
mecanismelor de reglare metabolică [77,97]. Această informaţie este necesară pentru elaborarea
strategiilor moderne de creare a liniilor biotehnologice de creştere rentabilă a biomaselor în
bioindustria compuşilor naturali utili [5,48,159,188,189].
Interesul sporit faţă de culturile in vitro, multiplele rezultate ştiinţifice în domeniul
biotehnologiilor moderne din ultimul deceniu, determină secolul XXI, drept “Era
biotehnologiilor”, când strategiile moderne favorizează ample schimbări, prin eficienţa şi
productivitatea unei largi palete de produse utile, îmbogăţite cu compuşi naturali valoroşi, care
vor putea satisface necesităţile pieţii din diferite domenii economice [48]. În timpul apropiat,
produsele biotehnologice vor constitui componentul de bază al industriei alimentare, culinare,
cosmetice. Aceasta necesită ameliorarea cunoştinţelor şi educarea biotehnologică a
consumatorilor [28], care trebuie să constituie nu un element pasiv, dar unul activ, promovator,
conştient în era biotehnogică pentru a asigura şi securitatea sănătăţii umane [24,118,187,361].
1.11. Concluzii la capitolul 1
• Interesul pentru obţinerea metaboliţilor secundari utili prin metode neconvenţionale in vitro
este stimulat de reducerea pronunţată a resurselor vegetale, ca urmare a returbării echilibrului
mediului natural, a exploatării nelimitate a acestor resurse, a dificultăţilor tehnice şi
economice în cultivarea plantelor din flora spontană şi a cheltuelilor enorme prin
aclimatizarea noilor specii de plante valoaroase necaracteristice zonei climatice.
• Criteriile citoanatomice şi biochimice ale fructelor in vivo şi a biomaselor in vitro la diferite
specii elucidate în rezultatul evaluării lucrărilor ştiinţifice vor servi în calitate de reper pentru
studiul citoanatomic şi biochimic la fructele şi carpomasele, generate in vitro de aronie.

45
• Strategiile moderne de producere profitabilă a produselor biotehnologice prin culturi celulare
şi tisulare in vitro sunt promiţătoare, dar necesită studii individuale, minuţioase, complexe
(structurale, ultrastructurale, biochimice, biotehnologice) pentru fiecare specie.
Scopul lucrării: Elucidarea criteriilor biologice, chimice, fizice pentru elaborarea strategiilor
biotehnologice de inducere şi acumulare a carpomaselor calusale in vitro din fructele suculente
de A. melanocarpa (Michx.) Elliot şi evaluarea lor anatomică, ultrastructurală şi biochimică
comparativ cu fructele, crescute in vivo.
Obiective:
• Studiul anatomic, cito-, histochimic şi ultrastructural al pericarpului fructului în
ontomorfogeneză şi în funcţie de gradientul ecologo-geografic al R.Moldova;
• optimizarea condiţiilor biologice, chimice, fizice, biotehnologice pentru inducerea şi
acumularea carpomaselor in vitro şi elucidarea factorilor-vectori în stimularea acumulării
celor cu conţinut fenolic;
• studiul comparat al particularităţilor morfoanatomice şi ultrastructurale ale celulelor fructelor
in vivo şi carpomaselor in vitro;
• evaluarea ultrastructurală a incluziunilor polifenolice în vederea elaborării schemei
verosimile de biosinteză, translocare şi acumulare fenolică intra- şi extracelulară;
• efectuarea screening-ului biochimic calitativ al extractelor fructelor şi carpomaselor in vitro
si in vivo de aronie şi analiza calitativă şi cantitativă a principalelor grupe de CF: flavonoide
(antociani); compuşi fenilpropanici; taninuri; totalul polifenolic;
• determinarea activităţii antioxidante şi antimicrobiene a extractelor fructelor in vivo şi
carpomaselor in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.

46
 2. CARACTERISTICA MATERIALULUI FITOBIOLOGIC ŞI METODE DE
CERCETARE
2.1. Materialul fitobiologic de studiu
În calitate de obiecte de cercetare au servit fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
(fam. Rosaceae) din: colecţia Grădinii Botanice (Institut) a AŞM; colecţia Centrului de Cultivare
a Plantelor Medicnale a USMF “Nicolae Testemiţanu” (r. Ialoveni, s. Bardar); plantaţiile
diferitor zone fizico-geografice din R.Moldova: Sud (r. Cimişlia, s. Batâr); Centrală (r. Străşeni,
s. Lozova, Ghelăuza, Grebleşti); Nord (r. Briceni, s. Tabani, Colicăuţi, r. Camenca, s.
Sănătăuca).
S-au utilizat fructe proaspete şi uscate în condiţii naturale (pe lozniţe în şoproane) şi în
condiţii artificiale (T de 50o, 60° şi 80° C), liofilizate cu vapori de azot, congelate în criofrigidere
(T - 50C), conservate în alcool etilic (50 şi 70%) şi în zahăr, păstrate la T de 4-5oC. În calitate de
obiecte de cercetare au servit şi carpomasele generate in vitro din diferiţi histogeni (epicarp,
epicarp cu hipodermă, mezocarp, endocarp) ai fructelor de aronie pe MN cu diferite variante
hormonale în baza diferitor doze şi combinaţii de K, 2,4-D şi ANA.
2.2. Schema experimentelor biotehnologice
Experimentele biotehnologice au fost efectuate la baza experimentală Carpotron a
Laboratorului de Structură şi ultrastructură a plantelor al Institutului de Fiziologie a Plantelor a
Academiei de Ştiinţe a Moldovei şi baza experimentală a Laboratorului Biotehnologic al
Departamentului de Medicină, ULIM.
Pentru experimentele biotehnologice s-au utilizat diferiţi histogeni (epicarp, epicarp cu
hipodermă, mezocarp, endocarp) ai pericarpului fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, la
următoarele etape ontomorfogenetice: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 zile de la înflorire şi la etapa
de maturare deplină. S-au testat diferite MN de bază: B5 şi MS în scopul determinării celui
optim. MN utilizat în schemele biotehnologice, a fost MS, în care se regăsesc diferite categorii
de produşi: săruri minerale (mg/l) NH4NO3-1650, KNO3 -1900, MgSO4 . 7H2O – 370, KH2PO4 –
170, CaCl2 . 2H2O – 440, H3BO3 – 6,2, MnSO4 . 4H20 – 223, CoCl2 . 6H2O – 0,025, CuSO4 .
5H2O – 0,025, ZnSO4-7H20 – 8,6, Na2MoO4 . 2H2O – 0,25, KI – 0,83, FeSO4 . 7H2O – 27,8,
Na2EDTA-37,3 [222]. În calitate de sursă de carbon s-a utilizat zaharoza. MN a fost suplinit cu
vitamine şi agar 0,7%, iar valoarea pH-ului a fost ajustată înainte de autoclavare până la 5,7.
S-au aplicat procedee de stimulare a procesului de proliferare calusală şi acumulare a
metaboliţilor secundari fenolici prin manipularea tipului, dozei şi combinarea hormonilor, prin
acţinunea regimului de lumină şi temperatură. În calitate de hormoni auxinici au fost utilizaţi:
2,4-D; ANA, iar ca citokinine Kşi BAP.

47
 MN, preparate în condiţii aseptice, au fost sterilizate în autoclave, în faze de vapori, la
temeperatura de 120oC, presiunea de 1 atm, timp de 20-30 min. Fructele donatoare de explant au
fost spălate cu apă bidistilată, dezinfectate cu soluţia de 20% a preparatului comercial “ACE”
(agent înălbitor pe bază de clor) pe parcursul a 7 min şi clătite de 3 ori cu apă bidistilată.
Explantele cu dimensiunile 3x4 mm au fost inoculate în condiţii aseptice pe MN
proaspete în cutii Petri şi în flacoane de 30 ml, care au fost plasate în camere speciale de creştere
pe stelaje. Umiditatea relativă a aerului a fost de 70% şi regimul de temperaturi: 20-22oC; 24-
26oC şi 28oC. Au fost experimentate mai multe regimuri de lumină: fotoperiodism natural 16
ore/zi şi 8 ore/noapte; luminozitate continuă cu lămpi luminiscente albe cu intensitatea de 1700
lucşi; obscuritate deplină; lumina cu diferite lungimi de undă roşie şi UV a spectrului. Expunerea
culturilor in vitro la lumină roşie s-a efectuat prin utilzarea filtrului roşu, care permite trecerea
neatenuată a culorii roşii şi reduce până la anulare trecerea razelor complimentare spectrului.
Pasajele s-au realizat la intervale de 2, 3, 4 şi 5 săptămâni pe MN proaspete conform
schemelor experimentale, respectând normele aseptice. În scopul resorbţiei compuşilor fenolici,
expulzaţi în MN, s-a aplicat cărbune activat 300 mg/l [5,52].
Indicele de creştere calusală s-a calculat conform metodicii [111] prin formula 2.1:
m1 – m2
IX = (2.1)
m2
Unde: Ix – indice de calusare; m1 – biomasa calusală finală uscată; m2 – biomasa calusală
iniţială uscată. Biomasa iniţială a fost recoltată după o săptămână de calusare, iar cea finală
după 5 săptămâni, în 3 repetări.
2.3. Metode microscopice de cercetare
Studiul microscopic a fost realizat: în laboratorul de Structură şi ultrastructură a
plantelor a Institutului de Fiziologie a Plantelor a AŞM; în laboratorul de Genetica şi fiziologia
rezistenţei plantelor a Institutului de Genetică şi Fiziologie a Plantelor a AŞM, la catedra de
Farmacognozie şi Botanică farmaceutică a USMF “Nicolae Testemiţanu”.
Microscopie fotonică şi reacţii histochimice. Pentru studiile respective sau utilizat
fructe proaspete, uscate şi conservate în alcool de 70%. Secţiunile tangenţiale, radiale şi
transversale prin pericarpul fructelor de aronie sau obţinut utilizând microtehnicele clasice
[42,387]. Pentru analiza pulberilor din fructe sau efectuat preparate javelizate cu cloralhidrat sau
cu soluţii de 3-5% NaOH conform metodicii [33,44]. Studiul microscopic s-a realizat atât pe
biomasele calusale intacte, cât si pe secţiuni transversale, longitudinale şi tangenţiale. În scopul
evidenţierii structurilor şi determinării naturii chimice a lor au fost aplicate reacţii cito- şi
histochimice calitative, conform procedeelor metodice [42,44,387], pe micropreparatele

48
temporare, efectuate atât din pericarpul fructelor, cât şi din carpomasele calusale. Aspectul
morfologic al suprafeţelor fructelor de aronie şi carpomaselor pigmentate in vitro s-a cercetat cu
microscopul MBC-10. Micropreparatele au fost studiate la microscopul “Biolam 15”, MBC –3
(URSS) şi Micros (Austria), Studart (China).
Microscopie electonică cu baleiaj. Pentru cercetarea microstructurii suprafeţei
pericarpului, fructele de aronie s-au conservat în vapori de OsO4. Deshidratarea materialului s-a
efectuat în soluţii de acetonitrilă cu concentraţie graduală crescândă până la absolută.
Specimenele montate pe măsuţe-suport au fost supuse metalizării cu pulbere de Al, Cu sau C
pentru sporirea densităţii electronice [161] şi investigate în microscopul electronic cu baleiaj
Tesla BS 300 (Cehoslovacia).
Microscopie electronică prin transmisie. Studiul utramicroscopic s-a efectuat prin
metode tradiţionale [386]. Fragmente de ţesut s-au fixat în aldehide glutarice de 3% pe bufer
fosfat, spălate de 3 ori câte 15 min, postfixate în soluţie de 2% de OsO4 – timp de 2 ore,
deshidratate în etanol cu concentraţie crescândă până la absolut, încorporate în amestec de răşini
epoxide „Epon-812”. Secţiunile ultrafine obţinute la ultramicrotomul LKB-480A (Suedia),
ulterior contrastate în soluţie saturată alcoolică de acetat de uranil şi citrat de plumb, montate pe
grile standard au fost examinate la microscopul electronic prin transmisie Tesla BS500
(Cehoslovacia) şi EM 125 K (URSS). Electronomicrofotografiile obţinute la mărimi echivalente
au fost supuse analizei morfometrice cu grilele cu pas întâmplător şi parţial cu panelul grafic
“Heweet Packaral-911” pentru determinarea valorilor volumelor parţiale ale organitelor celulare
şi a componentelor plastidelor [384]. Greşala măsurătorilor a fost calculată pe formule standard
şi prin utilizarea tabelelor R. Strelkov [385]. Punerea în evidenţă a CF şi împiedicarea
redistribuirii lor în celulă s-a realizat prin utilizarea procedeelor specifice de aplicare a
citoreacţiei cu soluţie de cafeină 1% în timpul fixării [221]. Pentru identificarea CF în imaginea
microscopică s-au aplicat citoreacţii cu soluţie de 2% de OsO4, de 10% Fe2(SO4), amestec de
soluţie de 1% de FeCl3 şi K2Fe(CN)6, în cantităţi echivalente [33,35,44,377].
2.4. Metode biochimice de analiză
Studiul biochimic al carpomaselor pigmentate in vitro şi fructelor de aronie a fost realizat
în: Laboratorul ştiinţific al Catedrei de Frmacognozie şi Botanică farmaceutică a USMF
„Nicolae Testemiţanu” (analiza chimică calitativă şi cantitativă a acidului ascorbic, flavonidelor,
antocianilor, compuşilor fenilpropanici, taninurilor); Laboratotul ştiinţific al Departamentului
Tehnologic şi la Catedra de Botanică farmaceutică a Univesităţii de Medicină şi Farmacie „Iuliu
Haţieganu”, o.Cluj-Napoca (analiza calitativă şi cantitativă a flavonidelor, compuşilor

49
fenilpropanici, totalului CF); Centrul de Tehnologii biologice avansate a Institutului de Genetică
şi Fiziologie a Plantelor a AŞM (totalul polifenolic prin metoda Folin-Ciocalteu).
Pentru stabilirea compoziţiei chimice a carpomaselor pigmentate in vitro comparativ cu a
fructelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot s-a apelat la analiza chimică calitativă, bazată pe
separarea principalelor grupe de compuşi chimici naturali prin extracţia succesivă şi selectivă a
PV analizat cu solvenţi de diferite polarităţi conform metodicii [33]. Iniţial s-a obţinut soluţia
extractivă eterică prin aplicarea cloroformului, apoi soluţia etractivă alcoolică (cu metanol) şi în
final, soluţia extractivă apoasă. Pentru identificarea compuşilor chimici în aceste 3 soluţii
extractive, s-au aplicat separat reacţii chimice de identificare, corespunzătoare proprietăţilor
fizico-chimie ale fiecărui grup de substanţe chimice [44,49].
Metode de analiză biochimică a acidului ascorbic. Pentru identificarea acidului
ascorbic s-a utilizat metoda CSS [44]. Determinarea cantitativă s-a realizat prin tehnici [49]
conform cărora: 20 g pulbere din specimenul analizat se amestecă cu 300ml apă distilată, apoi se
macerează -10 min, după ce se centrifughează şi filtrează. În balonul conic de 50-100 ml se
adăugă 1 ml soluţie 2% acid clorhidric, apoi 1 ml de extract analizat şi 13 ml de apă, urmează
titrarea cu soluţie 0,001H de 2,6-diclorfenolindofenolat de Na până la apariţia culorii roze, care
persistă timp de 0,5-1 min. Titrarea se efectuează cel mult 2 min. În cazul culorii intensive a
filtratului ori a conţinutului sporit de acid ascorbic (2,6-diclorfenolindofenolat de Na se cheltuie
peste 2 ml), determinat prin titrarea de probă, s-a diluat înainte de titrare de 2 şi mai multe ori.
Metode de analiză calitativă şi cantitativă a flavonoidelor. Pentru acest studiu s-a
obţinut soluţia extractivă din probele analizate conform recomandărilor metodice [49]. La 1g PV
pulverizat s-a adăugat 100 ml de metanol 50o, care s-a supus extracţiei timp de 30 min pe baia de
apă. Extractul obţinut a fost filtat şi completat până la cota de 100 ml cu acelaşi solvent.
Identificarea flavonoidelor în extractul obţinut s-a realizat prin reacţii chimice specifice de
colorare sau sedimentare (cianidinică, cu acetat de Pb, soluţie de amoniac, acid azotic, soluţie de
vanilină în HCl, soluţie de NaOH în alcool etilic sau în acid sulfuric concentrat, soluţie de AlCl3)
conform metodicelor [33,37,44,49].
Identificarea flavonoidelor prin CSS a fost realizată conform recomadărilor metodice [49].
Extractul obţinut a fost aplicat paralel cu martorii (rutozida, quercitozida, quercetolul) pe
cromatograme, care au fost plasate în sistemele mobile: acetat de etil:acid acetic glacial:acid
formic:apă în raport de 100:11:11:26 şi butanol-n:acid acetic glacial:apă în raport de 4:1:2.
Determinarea cantitativă a conţinutului de flavonoide în extractul analizat a fost efectuată prin
metoda spectrofotometrică [49] la spectrofotometru SP-8002 UV-VIS (1999), bazată pe
compararea Rf-rilor spoturilor extractelor analizate şi celor a substanţelor de referinţă: a)

50
soluţiile martor separat, 3 mg rutozidă (R), quercitozidă (R) şi quercetol (R) se dizolvă în 1 ml de
metanol (R), care se completează cu acelaşi solvent până la 10 ml; b) soluţii martor în complex -
3 mg rutozidă (R), 3 mg quercitozidă (R), 1 mg acid clorogenic (R), 1 mg acid cafeic (R) într-un
ml de metanol (R) şi se completează la 10 ml cu acelaşi solvent.
Metode de analiză calitativă şi cantitativă a antocianilor. Pentru analiza calitativă şi
cantitativă s-a obţinut extractul conform metodicii lui M.Tămaş cu colaboratorii [319]. Un gram
de PV analizat pulverizat a fost supus extracţiei în 100 ml de soluţie de alcool etilic şi HCl de
1,5H în raport de 85:15, timp de 24 ore la T de 4oC. Filtratul adus până la cota de 100 ml s-a
utilizat pentru analize.
Studiul calitativ al antocianilor s-a realizat pe CSS prin separarea selectivă a
constituienţilor antocianici. 10 ml de soluţie extractivă s-au hidrolizat cu 10 ml HCl de 2H, timp
de 40 min, pe baia de apă. Agliconii flavonoidici au fost separaţi cu acetat de etil, iar cei
antocianici cu n-butanol. Soluţia butanolică a fost concentrată prin evaporare la temperatura de
40oC până la obţinerea rezidiului, care a fost dizolvat în 2 ml de metanol acidulat cu HCl de
0,1%. Probele de analizat şi martorii (cianidina şi pelargonidina) au fost aplicate pe
cromatograme, ulterior plasate în sistemul mobil de cromatografiere din acid acetic:acid
clorhidric:apă în raport de 30:3:10. Determinarea conţinutului de antociani în filtratul obţinut s-a
efectuat spectrofotometric [49,319] prin cunoaşterea absorbanţei molare specifice pentru
antocianii la lungimea de undă 535 nm [319] la spectrofotometru SP-8002 UV-VIS (1999).
Metode de analiză calitativă şi cantitativă a compuşilor fenilpropanici de tip C6-C3
Pentru identificarea compuşilor fenilpropanici s-a efectuat reacţia calitativă cu reactivul
Arnow (10 g azotit de sodiu şi 10 g molibdat de sodiu, dizolvate în 100 ml H2O) [31,49].
Determinarea totalului compuşilor fenilpropanici s-a efectuat spectrofotometric [49]. Modul de
lucru: 4,0000 g pulbere de probă se extrag prin refluxare pe baia de apă cu 80 ml alcool etilic
50%. Se cântăreşte flaconul şi se menţine pe baia de apă la reflux, 30 min. După răcire se aduce
flaconul la greutatea iniţială cu alcool etilic 50% şi se filtrează (soluţia A). 5 ml din soluţia A se
diluează cu etanol 50% la 50 ml într-un balon cotat. La 1 ml din această soluţie se adaugă 1 ml
HCl de 0,5H, 1 ml reactiv Arnow, 1 ml NaOH 1H şi se completează la 10 ml cu apă în porţiuni
mici sub agitare continuă, obţinându-se o soluţie de culoare roşie. După 10 min se citeşte
extincţia soluţiei la 500 nm, faţă de amestecul din: 0,5 ml soluţie A, 1ml HCl 0,5H, 1 ml hidroxid
de sodiu 1H şi apă până la 10 ml. Calcularea concentraţiei de compuşi fenilpropanici s-a efectuat
cu ajutorul curbei etalon, ca substanţă de referinţă servind acidul cafeic.
Metode de analiză calitativă şi cantitativă a taninurilor. Reacţii chimice calitative de
identificare (cu gelatină, sare mijlocie a acetatului de Pb, alăuni de Fe şi amoniu, cristale NaNO3

51
şi HCl, FeCl3 şi HCl, apă de Br, cromat de K în bisulfat de Na) au fost aplicate conform
metodicilor [33,37,44,49]. Modul de preparare a soluţiei pentru analiză: la 1g PV mărunţit se
adaugă 100 ml de apă purificată. Extracţia are loc pe baia de apă timp de 20-30 min, după răcire
se filtrează. Determinarea conţinutului de taninuri a fost efectuată prin metoda titrimetrică [44].
Metoda de analiză cantitativă a totalului polifenolic. S-a aplicat metoda Folin-
Ciocalteu de determinare a concentraţiei totale de CF [146,299,336]. Pentru obţinerea extractului
de anlizat s-a utilizat 100g de PV pulverizat în 500 ml apă distilată pe baia cu reflux timp de 3
ore. La 100 ml de extract obţinut s-a adăugat 250 ml de reactiv Folin-Ciocalteu, iar după 1 min –
750 ml de soluţie de Na2CO3 de 20%. Controlul include aceiaşi soluţie obiţinuta din reactivi cu
excepţia soluţiei extractive analizate. După 2 ore de incubare la temperatura de 25oC s-a
determinat absorbanţa la lungimea de undă 760 nm şi comparată cu curba de calibrare a acidului
galic. Pentru construirea curbei de calibrare s-a utilizat substanţa standard de acid galic (Sigma).
Totalul polifenolic a fost determinat în baza echivalentului acidului galic (acid galic mg/extract
g) în 3 repetări. Măsurările s-au efectuat la spectrofotometrul Agilent 8453.
Analiza compusilor polifenolici prin cromatografia de lichide de înalta performanţă
cuplată cu spectrometria de masă. Metoda de analiza utilizata se bazeaza pe metoda CLIP
[124,132] cu unele modificări [331]. Aparatura şi condiţiile de lucrul: coloana analitica: Zorbax
SB-C18,100 mm x 3,0 mm i.d., 3,5 µm, precoloana Zorbax SB-C18; faza mobila: amestec
metanol: soluţie acid acetic 0, 1% (V/V); condiţii a regimului de gradient: eluţie în gradient
(start 5% metanol, până la 35 min 42% metanol, până la 38 min 42% metanol, până la 45 min
5% metanol - reechilibrare); debitul: 1 ml/min, temperatura: 480C; detecţia; UV (330 nm) până la
17 min, 370 nm până la 38 min; volumul de injectare, 5 μl. Condiţiile de lucru SM: sursa de ioni:
ESI (Electrospray); mod ionizare: negativ, nebulizator: azot, presiune 70 psi; gaz vector: azot,
debit 12 l/min, temperatura 3600C; potenţial capilară: +3000 V; mod analiză: monitorizare ioni
specifici (acizi polifenolcarboxilici) sau AUTO MS (flavonoide şi agliconi ai acestora).
Pregătirea probelor pentru analize: extracţia metanolică (70o) din 2 g de pulbere a probei
analizate pe baia de apă la T de 80oC timp de 30 min.
Analiza CF prin detecţie UV. Fiecare clasă de CF a fost detectată la lungimea de undă
corespunzătoare maximului de absorbţie al spectrului UV. Astfel, acizii polifenolcarboxilici au
fost detectaţi la lungimea de undă de 330 nm, iar flavonoidele şi agliconii acestora la 370 nm.
Pentru determinarea cantitativă, a fost realizată curba de calibrare pentru fiecare CF în intervalul
de concentraţie 0.5-5µg/ml. În condiţii cromatografice standard există 2 perechi de substanţe
incomplet separate (acid caftaric–gentisic şi acid cafeic–clorogenic), pentru aceşti CF s-au
realizat doar determinări calitative, bazate pe informaţiile analitice, obţinute din analizatorul SM.

52
 Analiza CF prin detecţie SM. Datorită prezenţei a cel puţin a unei funcţiuni fenolice în
moleculă (dar şi a unei carboxil, în cazul acizilor polifenolici), toţi compuşii pot pierde un proton
acid (transformandu-se în ioni negativi de tipul M-H) şi pot fi, în consecinţă, analizaţi prin
ionizare negativă. Ulterior, spectromertrul izolează ionii de interes (pentru eliminarea
interferenţelor) şi apoi îi fragmentează, înregistrând totodată şi spectrul MS.
În cazul probelor vegatale, compuşii se pot identifica analizând spectrele MS. Initial se
verifica masa moleculara, iar dacă aceasta corespunde, se compară spectrul de masă al
compusului necunoscut cu spectrul de masă al standardelor. În cazul, în care ionii din spectrul de
masă sunt aceiasi, se poate considera identificat compusul respectiv. Au fost înregistrate
spectrele de masă ale celor 18 CF, în calitate de standard. Modul de analiză în SM şi ionii
specifici pentru identificare în cazul probelor extractive sunt în tabelul 2.1.
Tabelul.2.1. Unele caracteristici ale detecţiei compuşilor polifenolici în
spectrometria de masă [331]
Compus polifenolic Mod analiza MS Ioni specifici pentru identificare
Nr.
Ion [M-H] > Ioni din spectru
1 Acid caftaric MRM* 311>148.6, 178.6
2 Acid gentisic MRM 153>108.7
3 Acid cafeic MRM 179.4>134.7
4 Acid clorogenic MRM 353.5>178.7, 190.7
5 Acid p-cumaric MRM 163> 118.7
6 Acid ferulic MRM 193.2> 133.7, 148.7, 177.6
7 Acid sinapic MRM 223.4>148.6, 163.6, 178.7, 207.7
8 Hyperozidă SIM** 463.1
9 Isoquercitrină SIM 463.1
10 Rutozidă SIM 609.1
11 Miricetol SIM 317.1
12 Fisetină SIM 285.1
13 Quercitrină SIM 447.1
14 Quercetol SIM 301.1
15 Patuletină SIM 331.1
16 Luteolină SIM 285.1
17 Kaempferol SIM 285.1
18 Apigenina SIM 269.2
Legendă: * MRM - „multimple reaction monitoring”, monitorizarea ionilor specifici a substanţei, în urma unui
dublu proces MS (izolare + fragmentare), aplicat, când substanţa ionizează mai greu, ionii corespunzători au
intensităţi mai mici, iar spectrometrul l-ar putea considera “zgomot de fond”; SIM** - „single ion monitoring”
presupune un singur stagiu MS, acela de izolare a compusului de interes şi apoi scanare, fără etapa de fragmentare
(se utilizează în cazul, în care analitul se fragmentează incomplet).

53
 Pentru acizii polifenol-carboxilici, analizaţi în modul MS-MRM, au fost extrase
cromatogramele ionilor principali şi spectrele de masă, iar pentru cei, analizaţi în modul automat
al MS, identificarea doar pe baza spectrală.
Au fost analizate în paralel 2 probe din fiecare extract vegetal, una ca atare, iar cealaltă
hidrolizată. S-a recurs la analiza probei hidrolizate deoarece unii agliconi flavonici sau unii acizi
polifenol-carboxilici nu se află în stare liberă, dar legată (heterozide, esteri etc.) şi realizarea
hidrolizei acide conduce la eliberarea acestor compuşi din forma legată, astfel dezvăluind mai
multe informaţii despre compoziţia chimică a polifenolilor în produsul analizat.
2.5. Metoda de analiză a activităţii antioxidante
Studiul activităţii antioxidante a carpomaselor pigmentate in vitro şi fructelor de aronie au
fost efectuate în Centrul Tehnologii biologice avansate al Institutului de Genetică şi Fiziologie a
Plantelor al AŞM (în colaborare cu cercetătorul ştiinţific superior R. Ivanova).
Modul de preparare a extractelor: la 200 mg a probei analizate s-a adăugat 20 ml de soluţie
de 60% alcool etilic, extragerea s-a efectuat la T de 16-180C, timp de 22 ore, extractul a fost
filtrat prin hârtie de filtru şi supus examinării. S-a aplicat metoda potenţiometrică de determinare
in vitro a capacităţii de captare a radicalilor liberi, descrisă de M.Sano cu coautorii [291], cu
unele modificări [146].
Metoda se bazează pe generarea radicalilor peroxi ROO· cu ajutorul 2,2-azobis (2-
amidinopropan) dihidrocloridului. Activitatea antiradicală (%) s-a determinat faţă de proba-
control, care nu conţine bioantioxidanţi. Activitatea antiradicală sau capacitatea extractelor de a
capta radicalii peroxil a fost exprimată în echivalent al acidului galic (GAE) în μM pe un gram
rezidiu uscat al extractului (μMGAE/g). Pentru studiu s-a utilizat: titratorul potenţiometric
TitroLine Easy (Shott, Germania), dozatorul electronic (Electronic Pipettes) Arise model A1000-
1; termostatul (Universal Ultrathermostat) UTU-4.
2.6. Metoda de analiză a activităţii antimicrobiene
Studiul activităţii antimicrobiene a extractelor etanolice din carpomasele pigmentate in
vitro şi fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot au fost efectuate în colaborare cu profesorul
universitar V. Prisăcaru în laboratorul ştiinţific al Catedrei de Epidemiologie şi boli infecţioase
itraspitaliceşti a USMF „Nicolae Testemiţanu”.
Determinarea activităţii antimicrobiene s-a efectuat prin utilizarea culturilor de referinţă
Staphylococcus aureus (tulpina 209-P), Enterococcus faecalis, Escherichia coli (tulpina ATCC
25822), Pseudomonas aeruginosa (tulpina ATCC 27853), Proteus vulgaris (tulpina MX 19222)
şi extractelor etanolice de 20% din fructele şi biomasele frutiere de aronie. În scopul excluderii
efectului acţiunii antimicrobiene a alcoolului s-a cercetat activitatea antimicrobiană a etanolului

54
de 20% faţă de microorganismele standard. A fost utilizată metoda diluărilor în serie în mediul
lichid (bulion peptonat din carne 2%, pH – 7,0) [4]. Microorganismele au fost însămânţate şi
crescute pe geloză tip de18 ore, spălate cu soluţie izotonică de NaCl. Doza de însămânţare
constituie 500 mii de celule microbiene la 1 ml de MN (după standardul optic de turbiditate).
Vasele au fost agitate şi termostatate la T de 37oC, timp de 24 ore. În calitate de test-control au
servit MN, însămânţate cu aceleaşi tulpini de bacterii, fără conţinutul extractelor analizate.
Activitatea bacteriostatică (concentraţia minimă de inhibiţie – CMI) s-a stabilit în cazul
lipsei creşterii microorganismelor în MN lichid, iar cea bactericidă (concentraţia minimă
bactericidă – CMB) s-a determinat în baza lipsei creşterii microorganismelor după însămânţarea
repetată pe geloză peptonată cu termostatarea ulterioară timp de 24 ore [4].
2.7. Metode de analiză statistică
La recoltarea materialului biologic din cămp pentru analizele biometrice, microscopice,
biochimice s-au respectat recomandările metodice [362], tinând cont de: numărul de probe şi
repetări; durata perioadei de recoltare; expoziţia şi regiunea matricală a coroanei arbustului de
aronie. Prelucrarea statistică a valorilor criteriilor evaluate a fost efectuată conform metodicii de
prelucrare matematică [363].

55
 3. PARTICULARITĂŢILE ANATOMICE ALE FRUCTELOR DE ARONIA
MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT
3.1. Organizarea histoanatomică a pericarpului în ontomorfogeneza fructului
Morfogeneza fructelor este un proces complex, rezultat la fertilizarea ovulelor, care
conduce la formarea organului ambiguu. Fructul cu pericarpul suculent şi cărnos are structuri
specifice, care asigură: protejarea şi diseminarea seminţelor; acumularea şi depozitarea
substanţelor nutritive; acumularea pigmenţilor, ce determină aspectul exterior atractiv pentru
păsări, animale şi om. Deşi, carpomorfogeneza a fost discutată în multe lucrări ştiinţifice, puţin
se cunoaşte despre caracteristicile structurale la etapele iniţiale ale carpogenezei şi stabilirea
zonalităţii histoanatomice [205], în deosebi, ale fructelor cu pericarpul suculent [108].
Un tip carpohistologic posedă o anumită organizare histoanatomică a pericarpului
fructului matur, caracterizat cu zonalitate histologică specifică, formată filogenetic, în rezultatul
adaptării evolutive a plantei [376]. Zonalitatea histologică a pericarpului fructului se dezvoltă în
ontomorfogeneză, dar cu particularităţi specifice, stabilite filogenetic [378].
Conform studiului [366] fructului de A.melanocarpa (Michx.) Elliot este caracteristic
tipul carpohistologic pommum. Originea şi natura histoanatomică a pericarpului fructului de tip
pommum au constituit subiectul diferitor investigaţii ştiinţifice la sfârşitul secolului XIX şi în
prima jumătate a secolului XX prin prisma teoriilor receptaculare şi apendiculare. În viziunea
susţinătorilor teoriei receptaculare Kraus (1913), Bayley (1916), Robbins şi Rikett (1934), Hill şi
al. (1936), Turkey (1938), Schaw (1939) la formarea carpotipului pommum participă ţesuturile
ovariene şi ţesuturi receptaculare. Conform teoriei apendiculare, bazată pe cea stelară a lui Van
Tieghem (1968), susţinută, apoi completată de Gray (1887), Fames (1929), şi Daniels (1940)
ţesuturile externe ale pericarpului provin din părţi florale extraovariene fuzionate de natură
apendiculară sau foliară. Unii savanţi, Hillman (1910), Bonne (1928), Jackson (1934), Graeza
(1970), au îmbinat aceste două teorii, susţinând că tipul carpohistologic pommum este de origine
atât receptacualră, cât şi apendiculară.
Majoritatea investigaţiilor din a doua jumătate a secolului XX [36,281,308,376,380,369]
vin în sprijinul teoriei apendiculare, conform căreia fructul de tip pommum provine dintr-un ovar
pentacarpelar, fuzionat cu tubul floral şi zona corticală a receptaculului. Zonalitatea histologică,
bazată pe criterii morfologice şi ontogenetice, caracteristică acestui carpotip pentru multe specii
din cadrul s/familiei Pomoideae a fost stabilită în ciclul de lucrări [376,380]. Cercetările
microscopice ale fructelor pommum a 173 de specii de pomoidee [281] denotă o varietate în
organizarea histoanatomică a pericarpului în corelaţie cu criteriile taxonomice: gradul de
aderenţă şi orientarea caliciului pe fruct; forma şi orientarea celulelor în ţesut; densitatea şi

56
distribuirea sclereidelor în parenchimul suculent; heterogenitatea celulelor parenchimatice;
numărul de carpele; numărul de ovule în carpelă; gradul de conexiune între carpele; gradul de
fuzionare a carpelelor cu alte componente florale. Criteriile menţionate corelează cu gradul de
evoluţie a speciei, determinat de necesitatea adaptării fructului pentru diseminarea mai reuşită.
Conform acestor investigaţii [281] fructele speciilor din g. Aronia Pers. au unele caracteristici
structurale specifice, prin care se deosebesc de alte genuri din cadrul s/familiei Pompodeae. Este
evident faptul că, deşi, pentru reprezentanţii acestei subfamilii este caracteristic acelaş carpotip,
totuşi sunt specificări structurale pentru fiecare specie, argument întemeiat pentru studiul
particularităţilor histoanatomice ale pericarpului fructului de aronie.
Arbustul de A. melanocarpa (Michx.) Elliot se caracterizează prin flori perigine cu
gineceu inferior de tip cenocarp-sincarp, format prin sudarea carpelelor atât prin marginile lor,
cât şi prin laturile vecine, până în centrul ovarului, divizându-l în 5 locule, care corespund
numărului de carpele, numite loje seminale (fig. A.2.1). Deoarece formarea pericarpului la
fructul de aronie are loc prin fuzionarea ovarului, tubului floral şi parţial al receptaculului, ca
rezultat, limita dintre partea ovariană şi extraovariană este evidentă, marcată prin făşii de celule
compact împachetate şi cu pereţii celulari îngroşaţi, lignificaţi (fig. 3.1). Partea suculentă a
receptaculului se intercalează printre cele 5 carpele membranoase, de consistenţă densă din
regiunea centrală a fructului. Fiecare carpelă este delimitată de câte o lojă ovariană cu 1-2
seminţe de formă ovată şi culoare brună (fig. A.2.2). Pericarpul fructului, la exterior, este
constituit din regiunea cărnoasă externă, de provenienţă extraovariană (din peretele
receptaculului şi alte piese florale), şi înternă, centrală, mai densă, de origine ovariană (fig. 3.1).
Rezultatele obţinute pentru fructul de aronie se înscriu în ipoteza şcolii ştiinţifice de
cercetare a fructelor a lui J. Rohrer [281], precum că carpotipul pommum, ancestral se
caracterizează prin 5 carpele, fuzionare redusă între ele, 2 ovule într-o carpelă şi epicarp pielos.
Zonele şi subzonele histologice la fructul de aronie rezultă prin geneza lor şi se conturează chiar
de la etapele iniţiale de dezvoltare, stabilindu-se pe parcursul ontomorfogenezei fructului şi fiind
determinate de componentele florale extraovariene şi ovariene, participante la formarea
pericarpului suculent şi relativ spongios.
Fiecare subzonă se caracterizează prin celule de anumită formă şi dimensiuni, mod de
orientare şi împachetare a celulelor în ţesut, grad de îngroşare şi natura chimică a peretelui
celular, prezenţa sau absenţa incluziunilor ergastice de diferită natură chimică şi distribuirea
spaţială în cadrul zonelor pericarpului, ce vin în conformitate cu criteriile structurale,
determinate în lucrările histoanatomice [281,376].

57
 1

Fig. 3.1. Secţiune transversală prin fructul de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 –

regiunea extraovariană; 2 – regiunea ovariană, x150.

1
2

2
4

5
6

7
3

Fig. 3.2. Secţiune transversală prin pericarpul juvenil (40 zile de la înflorire) de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot: 1 – epicarp; 2 – hipodermă; 3 – subzona externă a celulelor oval-rotungite; 4 –
subzona celulelor oval-alungite radiar; 5 – sclereide; 6 – subzona internă a celulelor oval-
rotungite; 7 – druze de oxalat de calciu; 8 – endocarp, x200.

58
 În pericarpul fructului de aronie, conform genezei, au fost evidenţiate următoarele zone şi
subzone histologice: epicarpul; mezocarpul, diferenţiat în 4 subzone (hipoderma, subzona
externă a celulelor oval-rotungite, subzona celulelor alungite radiar şi subzona internă a celulelor
oval-rotungite); endocarpul (fig. A.2.3;3.2).
Epicarpul fructului reprezintă continuitatea epidermei receptaculului. Iniţial, celulele
constituente se divid în direcţie anticlinală, dar pe măsură ce cresc, diviziunea încetează şi se
accentuează extinderea în direcţie periclinală. Epicarpul constă din celule poligonale, străbătute
de pori, bine împachetate, cu dimensiunile de 30-40 µm pe diamentrul tangenţial şi 12-15 µm pe
cel radial, la maturitate (fig. 3.3;A.2.4;A.2.5). În celule sunt observate plastidele, reprezentate
prin amiloplaste şi cromoplaste şi vacuolele relativ mici, pline cu suc incolor sau colorat (fig.
3.3). Pereţii tangenţiali exteriori ai epicarpului se acoperă treptat de un strat neîntrerupt de
cuticulă (fig.3.4), care la fructele mature, are o grosime de 8-10 µm şi pătrunde la o adâncime de
½, 1/3 printre pereţii radiali ai celulelor epidermale (fig. 3.5).

Fig. 3.3. Celule poligonale ale epidermei fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.
Viziune de-asupra, x250.
La fructele juvenile, inclusiv până la etapa de 50 zile, epicarpul este încă lipsit de
formaţiuni cerifere. Începând 60 zile de la înflorire, se observă formarea stratului de ceară, iniţial
modest, dar cu caracter cumulativ la etapele ulterioare şi maximul în fructele mature.

1
2
3

Fig.3.4. Secţiune transversală prin regiunea Fig.3.5. Răspândirea cuticulei printre

periferică a pericarpului: 1 – cuticula; 2 – celulele epidermale (săgeţi), x180.
epiderma; 3 – hipoderma, x180.

59
 În epicarpul fructelor juvenile se dezvoltă stomatele de tip anomocitic, care asigură
procesele vitale de respiraţie, fotosinteză şi transpiraţie. Celulele stomatice, bogate în
amiloplaste, sunt înconjurate de 5-6 celule anexe, cu dispoziţie radiară (fig. 3.6). În această
perioadă în epicarp se formează perişorii tectori unicelulari, lungi, răsuciţi (fig 3.7;A.2.6).
Deoarece perişorii tectori sunt uşor caduci, odată cu dezvoltarea şi maturarea fructului se obsevă
doar locul de prindere a lor, înconjurat de celulele bazale (fig. 3.8;A.2.7).

A. B.
Fig. 3.6. Un fragment al epicarpului fructului juvenil (30 zile de la înflorire) de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot: A – viziune generală, x200; B – detaliu al stomatei, x320: 1 – complex stomatic;
2 – celule stomatice; 3 – ostiolă; 4 – celulele anexe.

Fig. 3.7. Secţiune transversală prin regiunea periferică a pericarpului fructului juvenil (30 zile de
la înflorire) de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 – perişor tector cu celule bazale, x180.

60
 1

Fig. 3.8. Epicarpul fructului matur de A. melanocarpa (Michx.) Elliot (viziune de-
asupra): 1 – locul de prindere a perişorilor tectori, x 180.

Mezocarpul este reprezentat prin parenchim cortical, alcătuit din celulele ţesutului
fundamental de depozitare a materiilor de rezervă. Mezocarpul constituie partea mediană,
cuprinsă între epicarp şi endocarp, marcată prin două rânduri de fascicole conducătoare
colaterale, care corespund sepalelor şi petalelor. Celulele parenchimului fundamental se divid
preponderent periclinal. Distingem mezocarpul extern şi intern al pericarpului. Mezocarpul
extern este de origine extraovariană, format în rezultatul transformărilor consecutive ale diferitor
componente florale cum ar fi receptaculul şi tubul floral. Mezocarpul intern are origine carpelară
şi reprezintă transformările structurale ale parenchimului carpelelor, în care se deosebesc 2 tipuri
de fascicole libero-lemnoase: dorsale şi ventrale.
În carpogeneză, cele mai intense transformări structurale, bazate pe procesele de dividere
celulară, au loc în primele 30-40 zile de la înflorire. Ele încetează, iniţial, în partea lăuntrică a
pericarpului, iar în cea externă, din imediata apropiere cu epicarpul, dividerea continue încă pe
parcursul a 10 zile, după care urmează extinderea celulelor, îngroşarea pereţilor celulari, selectiv
la unele celule are loc impregnarea cu lignină, ce rezultă în formarea sclereidelor (fig. 3.2). Pe
parcursul etapelor ulterioare (50 şi 60 zile de la înflorire), în partea adiacentă epicarpului,
celulele se extind preponderent periclinal, formând straturi de celule uşor alungite tangenţial,
compact împachetate, care constituie hipoderma. Alungirea tangenţială conduce la stabilirea
formei uşor aplatisată a celulelor şi împachetarea lor mai compactă în ţesut. Urmează îngroşarea
treptată a pereţilor celulari celulozici, micşorarea spaţiilor intercelulare, ce rezultă în
diferenţierea hipodermei (fig. 3.4;3.9). Citoplasma este bogată în organite, granule de amidon,
iar vacuolele sunt relativ mici. Epicarpul şi hipoderma constituie pieliţa fructului, termen,
acceptat în lucrările de profil aplicativ-agronomic [35].

61
 Următoarele straturi de celule ale mezocarpului se extind anticlinal şi periclinal şi
formează subzona externă a celulelor oval-rotungite. Celulele au pereţii celulari pecto-celulozici
subţiri, spaţiile intercelulare relativ mici şi constituie un parenchim relativ spongios cu o
densitate mai redusă, faţă de hipoderma. Se atestă druze de oxalat de calciu, granule de amidon şi
iniţierea formării sclereidelor solitare (fig. 3.9;3.10).
1

Fig. 3.9. Secţiune prin pericarpul fructului de aronie (50 zile de la înflorire): 1 – perişor
unicelular; 2 – cuticulă; 3 – hipodermă; 4 – sclereide solitare; 5 – sclereide în grup, x 200.

Fig. 3.10. Secţiune prin regiunea periferică a pericarpului fructului de aronie (40 zile de la
înflorire): 1 – perişori răsuciţi; 2 – druze de oxalat de calciu; 3 – sclereide solitare, x200.

62
 În partea mediană a mezocarpului prevalează extinderea anticlinală a celulelor, ce
conduce la formarea subzonei cu celule oval-alungite radiar, alcătuită din celule mai compact
împachetate comparativ, cu subzona anterioară, graţie formei şi modului radiar de ancorare în
jurul sclereidelor. Diametrul mare prevalează de 3 ori în raport cu diametrul mic al celulelor. Se
observă îngroşarea prin lignificare a unor celule solitare, iar uneori a unor grupuri mici din 3-4
celule de formă triunghiulară sau poligonală. În partea lăuntrică, adiacentă endocarpului, celulele
se extind echivalent atât pe diagonala anticlinală, cât şi pe periclinală, rezultând subzona internă
a celulelor oval-rotungite, care se deosebeşte prin grad mai compact de împachetare şi spaţiile
intercelulare reduse, graţie formei uşor aplatisate periclinal a celulelor, dimensiunile mult mai
mici şi prezenţa sclereidelor, concentrate în grupuri relativ mari din 6-8 celule sau în formă de
făşii neîntrerupte (fig. 3.11). Pereţii celulari sunt lignificaţi şi străbătuţi de canalele porilor
ramificaţi, care constituie o modalitate de comunicare între celulele vecine (fig. 3.12).

Fig. 3.11. Secţiune prin pericarpul fructului de Fig. 3.12. Detaliu: 1 – sclereide; 2 – pori;
A. melanocarpa (Michx.) Elliot la etapa 3 – perete celular lignificat, x300.
de 60 zile de la înflorire, x150.

Druzele de oxalat de calciu (câte 3-4) în fructele juvenile de aronie (până la 60 de la

înflorire) sunt localizate, preponderent, periferic, (fig. 3.10), iar odată cu maturarea, apar şi în
partea internă a mezocarpului, în subzona internă a celulelor oval-rotungite sub formă de
aglomerări mai numeroase (fig. 3.13).
Graţie proceselor consecutive de dividere şi extindere a celulelor, care se succed pe
parcursul dezvoltării, are loc creşterea în volum a pericarpului, rezultând în fructul matur un
parenchim suculent, realtiv spongios şi voluminos, diferenţiat în zone şi subzone histologice, în
baza indicilor anatomici: modul de dividere şi forma celulelor; modul de extindere şi

63
împachetare a celulelor; gradul de îngroşare a pereţilor celulari; prezenţa şi modul de distribuire
a sclereidelor şi a druzelor de oxalat de calciu.

3 5

Fig. 3.13. Secţiune transversală prin pericarpul fructului matur de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot: 1 – epicarp; 2 – mezocarp; 3 – endocarp; 4 – druze de oxalat de calciu; 5 –
perişori tectori unicelulari, x150.

Endocarpul reprezintă zona histologică internă a pericarpului, cu originea din epiderma

internă a carpelei. Celulele epidermei, iniţial, se divid anticlinal, iar când încetează diviziunea, se
extind, preponderent, periclinal. Endocarpul este alcătuit dintr-un rând de celule parenchimatice,
aranjate compact, uşor alungite tangenţial, cu diametrul mare 12-15 µm şi mic, 7-8 µm.
Endocarpul fructelor până la etapa de 60 zile de la înflorire, dezvoltă perişori tectori subţiri,
lungi, numeroşi (fig. 3.13;A.2.3;2.6). Se conturează grupuri celulare, care constituie policite cu
pereţii lignificaţi, ce formează ulterior peretele sclerificat al lojelor seminale (fig. A.2.8).
Rezultatele studiului efectuat, privind organizarea histoanatomică a pericarpului fructului
de aronie sunt, parţial, în conformitate cu cele din multiplele studii [280,281,308,366,376,380],
efectuate la alte genuri din s/familia Pomoideae, ce demonstrează unele specificări ale zonalităţii
histoanatomice pentru pericarpul fructului de aronie. Mezocarpul fructului de A.melanocarpa
(Michx.) Elliot, similar celor din genurile Sorbus, Malus, Pyrus, Eriobotrya, Micromeles, se
diferenţiază în 4 s/zone histologice: hipoderma; subzona celulelor oval-rotungite externă;
celulelor oval-alungite radiar şi a celulelor oval-rotungite internă. Studiul la fructul de aronie
denotă prezenţa hipodermei în mezocarp, absentă în lucrarea lui Gh.Rotaru şi prezentă doar la A.
arbutifolia [380]. Dezvoltarea hipodermei în pericarpul suculent de aronie constituie o barieră

64
serioasă de apărare împotriva insolaţiei şi radiaţiei sporite, împiedicând pierderea apei, ce şi
reprezintă o reacţie adaptivă adecvată la factorii climatici.
Mezocarpul pericarpului fructului de aronie este diferenţiat în 3 subzone histologice:
externă – cu celule oval-rotungite, mediană – cu celule oval-alungute radiar şi internă – cu celule
oval-rotungite (aproape sclerificate). Condiţiile ecologo-geografice au stimulat expresia
diferenţierii mezocarpului în subzone histologice odată cu evoluţia în geneză a fructului de tip
pommum [280,281,308], o dovadă a adaptabilităţii fructului la acutizarea factorilor mediului
(temperaturi sporite ale aerului şi solului, deficitul de umiditatre, vânturile uscate etc.) prin
mecanismele de xeromorfozare. Prezenţa sclereidelor solitare sau în grupuri, distribuite difuz în
parenchimul suculent şi formarea unor făşii compacte în zona periferică internă, reprezintă o
reacţie adaptivă a pericarpului, bazată pe plasticitatea elementelor structurale constituente. Lor li
se atribuie un rol semnificativ în argumentarea aspectelor evolutive şi reprezintă un element
anatomic calitativ distinctiv în clasificarea fructelor în cadrul s/fam. Pomoideae [366].
3.2. Dinamica transformărilor indicilor structurali în ontomorfogeneza fructului
Numărul de straturi de celule în pericarp se iniţiează încă la începutul dezvoltării sale din
ovarul florii [191]. Ulterior, are loc conturarea zonalităţii histoanatomice a pericarpului de
A.melanocarpa (Michx.) Elliot, care se accentuiează de la etapă la etapă pe parcursul
carpoontomorfogenezei, fiind foarte expresivă în fructele mature. De la etapele iniţiale şi până la
maturitatea deplină, se menţine, în temei, aceiaşi organizare histoanatomică a pericarpului, cu
unele fluctuaţii cantitative şi dezvoltarea unor elemente structurale calitative noi. Variaţia
indicilor structurali din epicarpul şi mezocarpul fructului de aronie sunt reprezentate în tabelul
3.1. Transformările histoanatomice corelează cu etapa ontomorfogenetică a fructului şi survin
consecvent de la una la alta. Dinamica transformărilor indicilor structurali s-a studiat în
ontomorfogeneză fructului de aronie la următoarele etape: 20, 40, 60, 80 zile de la înflorire şi
maturitate deplină.
Astfel, grosimea cuticulei la primele două etape (20 şi 40 zile de la înflorire) creşte
nesemnificativ (fig. A.2.9), în schimb acest indice se amplifică brusc la etapa de 60 zile de la
înflorire, atingând valoarea de 7,7 µm, ce este grosimea dublă în raport cu cea de la etapa
incipientă de 20 zile (3,8 µm). La etapele ulterioare se menţionează creşterea lentă a grosimii
cuticulei, atingând maximul de 8,1 µm la maturitatea deplină a fructelor (tabelul 3.1).
Fructele juvenile la primele 2 etape ale ontomorfogenezei (20 şi 40 zile) sunt
caracterizate prin pubescenţă pe toată suprafaţa epicarpului (fig. 3.14), reprezentată prin perişorii
tectori unicelulari, simpli, lungi, răsuciţi, cu baza rotungită, înconjuraţi de celulele anexe, care
constituie rozeta bazilară hexacelulară (fig. 3.15). Odată cu creşterea accentuată a dimensiunilor

65
 Tabelul 3.1. Valorile indicilor histoanatomici ai pericarpului fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în ontomorfogeneză

Epicarpul Mezocarpul
(zile de la înflorire)
ontomorfogenetică

Dimensiunile

celulelor oval-rotungite
Densitatea sclereidelor
Grosimea celulelor Dimensiunile celulelor parenchimatice (µm)

în subzona internă a
Depuneri cerifere
cuticulei epidermale (µm)

stomatelor
perişorilor
Densitatea

Densitatea
Etapa

(µm)
tangenţial radial S/zona S/zona celulelor oval-
Hipoderma celulelor alungite radiar
oval- diametrul diametrul
rotungite mare mic
66

20 3,8±0,2 10,2±0,1 3,4±0,2 - 14,1±1,2 3,1±0,1 18,2±2,1 17,5±1,3 30,6±2,1 12,4±1,1 -

40 4.5±0,1 12,5±0,3 4.4±0,3 - 10,1±1,4 2,8±0,1 26,4±1,9 29,9±1,9 48,8±2,2 24,5±1,8 8,2±1,3

60 7,7±0,4 22,8±0,4 12.4±0,2 + 5,1±1,3 2,4±0,2 44,6±2,1 48,2±2,7 82,9±2,4 45,7±2,2 14,1±1,3

80 7,8±0,2 38,3±1,2 21.2±0,3 ++ 2,4±1,2 1,5±0,2 57,6±2,3 69,8±2,1 122,4±4,4 58,1±2,6 15,3±1,2

Maturare
deplină 8,9±0,2 40,2±1,4 23.1±0,2 +++ 0,3±1,1 2,1*±0,2 67,1±2,6 110,1±3,8 218,8±3,4 65,8±2,1 15,6±0,9

Legendă: Depuneri cerifere: + - neînsemnate; ++ - moderate; +++ - maxime. Densitatea perişorilor tectori, stomatelor, sclereidelor pe unitate de
suprafaţă ecivalentă cu câmpul de vedere la combinaţia ocular 10x şi obiectiv 20x; * – lenticele suberificate.

66
fructului după aceste 2 etape ontomorfogenetice, la următoarea – 60 zile de la înflorire,
densitatea perişorilor se reduce brusc, fiind de 5,1 pe unitate de suprafaţă (tabelul 3.1), ce
constituie jumătate faţă de etapă anterioară (10,1) şi aproape de 3 ori mai puţin (14,1), decât la
etapa de 20 zile de la înflorire. La etapa 80 zile de la înflorire densitatea perişorilor diminuează
de 2 ori (2,4) în raport cu etapa anterioară (5,1) şi prezintă interes modul de distribuire. În
regiunea mediană a fructului perşorii tectori sunt rari, graţie extinderii excesive a dimensiunilor
celulelor, ei fiind concentraţi, preponderent, la polii pedicelar şi calicial. Densitatea perişorilor
tectori pe suprafaţa fructelor mature este redusă la minim – 0,3. Zona mediană a fructului, supusă
mai mult acţiunilor mecanice, este lipsită de perişorii tectori, fiind prezentă doar rozeta baziliară,
deoarece ei se detaşează uşor de la ea, iar în zonele calicială şi pedicelară, ei se întâlnesc rar.
Paralel cu reducerea densităţii perişorilor în ontomorfogeneza fructului, un alt element
anatomic nou preia funcţia de protecţie, ceara, un produs al metabolismului intens al celulelor
epidermale, formată din formaţiuni cerifere polimorfe specifice, care caracterizează, în special,
epicarpul fructelor mature. Cerificarea începe după etapa de 40 zile de la înflorire şi la cea de 60
zile se pot marca, doar depuneri cerifere modeste, preponderent, în regiunea mediană a fructului,
pe partea expusă mai mult acţiunii razelor solare (tabelul 3.1).

Fig. 3.14. Secţiune transversală prin Fig. 3.15. Detaliu: 1 – perişor tector; 2 – rozeta
regiunea periferică a pericarpului (30 zile de baziliară a perişorului, x300.
la înflorire, x150.

La etapa ulterioara, 80 zile, stratul de ceara se îngroaşă, iar formaţiunile cerifere au o

distribuire omogenă (fig. 3.16). Ceara este persistentă şi reprezintă un indice structural marcant
pentru fructele mature, conferindu-le un aspect uşor azuriu.
Rezultatele studiului formaţiunilor epidermice specifice relevă unele schimbări calitative
şi cantitave, care survin la trecerea de la o etapă a ontomorfogenezei fructului, la alta. Densitatea
stomatelor de 3,1 pe unitate de suprafaţă a epicarpului la etapa de 20 zile de la înflorire se reduce
treptat, deoarece se măresc dimensiunile celulelor epidermale şi la cea de 80 zile de la înflorire

67
se înregistrează valori minime (1,5 pe unitate de suprafaţă), ce reprezintă jumătate din valoarea
fructelor juvenile. Stomatele sunt distribuite neuniform (fig.3.17), uneori formează complexe
structural adaptive de tip stomată-trihomă (fig. A.2.10), ce constituie un indice anatomic cu
caracter adaptiv şi diagnostic specific fructelor de aronie. În epicarpul fructelor mature,
stomatele sunt înlocuite cu lenticele, căptuşite cu plută (fig.A.2.11), care sunt caracteristice doar
regiunii mediane a fructului, în deosebi, pe partea expusă, preponderent, acţiunii directe a razelor
solare. O altă caracteristică a fructelor mature reprezintă formarea fisurilor suberificate ale
epicarpului la fructele de pe ramurile marginale cu expoziţie sudică, expuse mai mult acţiunii
excesive a razelor solare şi depunerea suberului pe fructele lizate de acţiunea mecanică a unor
factori externi cum ar fi: presiunea ramului, ploile cu grindină, intervenţia păsărilor, presiuni în
timpul efectuării activităţilor agrotehnice.

Fig. 3.16. Scanograma epicarpului cu Fig. 3.17. Scanograma epicarpului: 1-

formaţiuni cerifere, x780. perişor tector; 2 – stomate, x660.

Celulele epidermei se măresc în dimensiuni (tabelul 3.1), la etapa de 60 zile sunt dublate
(22,8 şi 7,2 µm) în raport cu cea iniţială (10,2 şi 3,4 µm) şi aproape de 2 ori reduse faţă de cea a
fructelor mature (40,2 şi 14,5 µm). Un salt cantitativ în sporirea dimensiunilor celulelor
epidermale este între etapele 60 (22,8 şi 7,2 µm) şi 80 zile de la înflorire (38,3 şi 13,2 µm), după
care urmează o uşoară tendinţă de creştere la fructele mature (40,2 şi 14,5 µm). Până la etapa de
60 zile în celule predomină granulele de amidon, care dispar treptat la cele ulterioare, paralel se
observă apariţia sucului vacuolar antocianic în hipodermă, îar în celulele subzonei externe oval-
rotungite sunt prezente cloroplastele (fig.3.18). În fructele mature dimensiunile vacuomului şi
intensitatea coloraţiei sucului antocianic sporesc.

68
 1

Fig. 3.18. Secţiune transversală prin pericarpul fructului de A. melanocarpa (Michx.)

Elliot la etapa de 50 zile de la înflorire: 1 – celulele hipodermei cu conţinut antocianic; 2 – celule
oval-rotungite cu cloroplaste, x300.
Modificările histoanatomice cantitative ale parenchimului fundamental au fost evaluate
prin măsurarea dimensiunilor celulelor parenchimatice în funcţie de subzonele mezocarpului.
Numărul rândurilor de celule sporeşte până la faza de 60 zile, după care se menţionează o
stabilitate, urmată de o extindere a dimensiunilor celulelor constituiente. S-a stabilit un gradient
al extensiei celulelor de la exteriorul pericarpului (subzona celulelor oval-rotungite externă) spre
zona mediană a parechimului (subzona celulelor oval-alungire radiar), marcată prin cele mai
mari dimensiuni apoi o descreştere spre partea internă a pericarpului (subzona celulelor oval-
rotungite internă). Volumul pericarpului sporeste din contul extensiei celulelor subzonei oval-
rotungite externă (48,2 µm) şi a subzonei oval-alungire radiar (82,9 µm) ale mezocarpului,
începând cu etapa de 60 zile până la maturarea deplină a fructelor, respectiv, 110,1 şi 218,8 µm.
Pe parcursul carpoontomorfogenezei, dimensiunile celulelor subzonei oval-rotungite
externe se extind de 6 ori, de la 17,5 la 110,1µm, iar a subzonei oval-alungite radiar de 7 ori, de
la 30,6 la 218,8 µm. Aceste celule se măresc în volum prin extensia sistemului vacuolar, care
prevalează asupra restului citoplasmei. Extensia celulelor parenchimatice se reflectă în sporirea
dimensiunilor pericarpului în ontogeneza fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot. Salturi de
îngroşare a pericarpului se înregistrează la etapele de 40 şi 60 zile de la înflorire din contul
diviziunii celulare şi măririi numărului de straturi de celule, iar începând cu 60 zile şi până la
maturare deplină, sporire mai lentă, doar în baza extensiei volumului celulelor. Deşi
dimensiunile pericarpului sunt într-o ascensiune continuă până la maturarea deplină a fructului,

69
coraportul pericarp/lojă seminală reprezintă o stabilitate, începând cu etapa de 60 zile, graţie
stagnării schimbării dimensiunilor lojei seminale (tabelul 3.2).
Tabelul 3.2. Dinamica inor indici biometrici în ontomorfogeneza fructului de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Etapa Grosimea Grosimea lojei Coraport
ontomorfogenetică pericarpului seminale pericarp/lojă
(mm) (mm) seminală
20 zile de la înflorire 1,0±0,02 1,0±0,01 1,0
40 zile de la înflorire 5,0±0,09 1,4±0,02 3,5
60 zile de la înflorire 6,1±0,08 1,5±0,01 4,0
80 zile de la înflorire 6,5±0,07 1,5±0,02 4,3
Maturare deplină 7,5±0,02 1,6±0,02 4,6
Sclereidele, absente în parenchimul fructelor juvenile (20 zile), sunt observate deja la
etapa de 40 zile, care se conturează şi se evidenţiază la etapele ulterioare ale ontomorfogenezei
(tabelul 3.1). La ultimele 2 etape ale ontomorogenezei (80 zile şi maturitate deplină), numărul
sclereidelor (15,3 şi 15,6, respectiv) este aproape constant, cu manieră specifică de distribuire:
solitare ori în grupuri reduse la 2-3 celule, sporadice în tot pericarpul suculent (fig. 3.19); în
grupuri mari (5-7 celule) în subzona celulelor oval-alungite radiar şi aranjate compact, formând
făşii neîntrerupte în subzona internă a celulelor oval-rotungite din imediata apropiere a
endocarpului, care la fel este sclerificat în fructele mature (fig. 3.20).
Retrospectiva dezvoltării ontomorfogenetice a fructelor de A. melanocarpa (Michx.)
Elliot pune în evidenţă apariţia treptată, în dinamică a structurilor anatomice ce pot fi
determinate în calitate de indici anatomici specifici ai etapelor ontomorfogenetice.

Fig. 3.19. Secţiune transversală prin Fig. 3.20. Secţiune transversală prin
pericarpul fructului juvenil: 1 – sclereide pericarpul fructului matur: 1 – hipoderma; 2
sporadice, x180. – sclereide în făşii, x150.

70
 Aceste structuri anatomice au caracter adaptiv faţă de acţiunea factorilor climatici la etapa
ontomorfogenetică concretă a fructului. Unele structuri anatomice se dezvoltă la etapele
ontogenetice iniţiale, apoi diminuează, altele apar şi sunt în ascensiune până la etapele tardive de
dezvoltare ale fructului. Astfel, perişorii unicelulari sunt bine dezvoltaţi la fructele juvenile (20 şi
40 zile de la înflorire), constituind o barieră importantă de protecţie a structurilor fine ale
pericapului juvenil. La etapele ulterioare (60 şi 80 zile), funcţia de protecţie o preiau alte
structuri, cuticula îngroşată cu depunerile cerifere epicuticulare, care sunt mai adecvate şi mai
eficiente pentru a opune rezisenţă la acţiunea temperaturilor excesive şi secetei care ce
intensifică în acesată perioadă.
Deci, în condiţiile de acutizare a condiţiilor pedoclimatice în perioada de vară (sporirea
temperaturilor şi a deficitului de umiditate a atmosferei şi solului) pe parcursul
ontomorfogenezei fructului, dezvoltarea structurilor noi de apărare adecvate este o necesitate
vitală, care asigură rezistenţa la acţiunea factorilor nefavorabili. În schimbul unor structuri ale
epicarpului (perişorii tectori, cuticula subţire) la fructele juvenile, survin alte structuri protectoare
cu caracter adaptiv, în fructele mature: îngroşarea cuticulei, formarea stratului cerifer, apariţia
lenticelelor căptuşite cu formaţiuni cerifere. Transformări structurale în ontomorfogeneză se
marchează şi în mezocarpul diferitor subzone: conturarea hipodermei, formarea druzelor de
oxalat de calciu şi sclereidelor şi modul lor de distribuire.
Astfel, în perioada ontomorfogenezei fructelor de aronie se observă o continuitate
selectivă şi consecvenţă în formarea structurilor cu rol protector-adaptiv. Etapa de 60 zile de la
înflorire se caracterizează printr-un echilibru al dividerii celulelor şi al activităţii proceselor
metabolice, astfel reprezentând una de tranzit a unor indici structurali cantitativi şi calitativi.
Etapa este marcată de modificările structural-metabolice ale fructelor juvenile şi timpurii spre
maturitate deplină, caracterizată prin procese fiziologice şi biochimice intense. Ca rezultat, are
loc acumularea materiilor nutritive de rezervă în fructele mature drept caracteristică de bază a
fructelor suculente, care reprezintă tendinţa naturală majoră, determinată în procesul evoluţiei
[378,282] a compuşilor de natură fenolică ca particularitate structural-metabolică specifică
fructelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot.
Adaptarea pericarpului suculent al fructului de aronie se realizează printr-un mecanism
complex, bazat pe interacţiunea corelativă şi coordonativă a structurilor superficiale şi interne
adaptive, formate la diferite etape ontomorfogenetice. Aceste complexe structural-adaptive se
înscriu în sistemul integru de activitate funcţional-metabolică a plantei. Dezvoltarea şi includerea
selectivă a diferitor structuri cu caracter adaptiv în ontomorfogeneza fructelor se bazează pe

71
principiile geneticii evolutive, care prevăd conlucrarea coadaptivă a genelor, asigurând
dezvoltarea corelativă a structurilor organului [378].
3. 3. Caracteristica histoanatomică a pericarpului fructului matur
Examenul microscopic al secţiunilor transversale ale pericarpului fructelor mature de A.
melanocarpa (Michx.) Elliot a pus în evidenţă următoarea zonalitate tisulară de la exterior spre
interior: epicarpul, mezocarpul (diferenţiat în patru subzone) şi endocarpul.
Epicarpul fructului matur este reprezentat prin epiderma externă unistratificată, acoperită
de o cuticulă relativ groasă până la 8-10 µm, de tip extern-intern. Epiderma constă din celule
parenchimatice, poligonale, alungite tangenţial cu diametrul de 30-40 µm, iar cel radial 14-15
µm, dens împachetate, grupate în policite, uşor vizualizate pe preparate superficiale (fig.3.21) şi
pe secţiuni transversale (fig.3.22). Pe preparatele superficiale leger se evidenţiază grupările de
celule epidermale de configuraţie poliedrică, distinct delimitate cuticular, ce formează policitele
– structuri specifice ale epidermei fructului de aronie (fig. 3.21). La fructele mature perişorii
tectori pot fi văzuţi doar în regiunile calicială şi pedicelară, iar în cea mediană, foarte rar sau
lipsesc, fiind numai celulele rozetei baziliare. Cuticula groasă la joncţiunea bazei perişorilor cu
pereţii tangenţiali externi ai celulelor epidermale adiacente, la fructele juvenile, pătrunde printre
pereţii radiali, ajungând până la pereţii tangenţiali interni ai bazei perişorilor la cele mature.
Aceasta contribuie la desprinderea uşoară a perişorilor la fructele mature prin atingeri mecanice,
rămânând doar rozeta bazală hexacelulară.
Pe scanograma pericarpului periferic (fig. 3.22) observăm forma celulelor epidermale şi
modul de împachetare a lor, grosimea cuticulei şi gradul de răspândire a ei. La menţinerea
fructelor în amestec de eter etilic, alcool etilic şi acetonă în coraport 4:3:2 se înlătură stratul
cerifer epicuticular, punând în evidenţă aspectul reliefului epidermei (fig. A.2.12).

1
1
2

Fig. 3.21. Aspectul suprafeţei epicarpului matur: Fig. 3.22. Scanograma pericarpului periferic:
1 – policite, x150. 1 – cuticula; 2 – epiderma; 3 – hipoderma,
x630.

72
 Celulele sunt aranjate în manieră de parchet, este marcat conturul pereţilor celulari şi
cavitatea celulelor epidermale. În celulele epidermale sunt granule de amidon, identificate prin
colorarea în albastru-violet cu soluţia Lugol. Celulele sunt vacuolizate, iar sucul vacuolar este de
culoare violacee, graţie conţinutului de antociani.
Epicarpului sunt caracteristice stomatele de tip anomocitic cu rol important în schimbul
reglat de gaze şi vapori de apă, care asigură o activitate fiziologică normală a fructului. Celulele
stomatice sunt alungite, lenticulare înconjurate de 6-8 celulare anexe cu aranjare radial-circulară,
iar în fructul matur sunt înlocuite prin lenticele, care prelungesc în fisuri, căptuşite cu acumulări
cerifere (fig.A.2.11;A.2.13). Geneza lor e diferită, pot fi din stomate, care evoluează morfologic
în lenticele, preluând funcţiile de schimb de gaze şi tanspiraţie, indispensabile pentru activitatea
intensivă metabolică şi fiziologică a fructelor mature sau pot apărea prin fisurarea epidermei,
incapabilă de extindere în această perioadă sub presiunea exercitată de extinderea celulelor
mezocarpului, care încă continuă să-şi mărească volumul sau prin fisurarea, motivată de căderea
perişorilor. Indiferent de geneza lenticelelor, ele sunt căptuşite cu suber uşor brunificat, formarea
căruia reprezintă o reacţie adaptivă pentru diminuarea deshidratării fructelor mature în condiţiile
de insolaţie şi radiaţie sporită, secete îndelungate, caracteristice acestei perioade.
Fructele mature de aronie se caracterizează prin depuneri cerifere epicuticulare polimorfe
(fig.3.23). Studiul suprafeţelor intacte ale fructului matur prin SEM a pus în evidenţă
polimorfismul formaţiunilor cerifere, exprimat prin tipurile morfologice ale cristaloizilor: tubular
sau alungit, constituit în mare parte din β-dicetone şi este uşor de înlăturat, de aceea este
considerat unul mai puţin rezistent; lamelar, sau sub formă de plăcuţe cu conţinut bogat în
alcooli primari, ce-i conferă rezistenţă; granular, caracterizat prin compoziţie chimică mixtă
[154]. Primele 2 tipuri predomină în acumulările cerifere, ultimul, granular, este întâlnit sporadic
şi cu o arie de distribuire pe suprafaţa fructului mai redusă.
Conform unor lucrări [36,150], tipul cristaloidului granular de ceară este considerat unul
de tranziţie a celui tubular, care, de regulă, apare iniţial pe suprafeţele fructelor mai juvenile şi se
păstrează sau se transformă în cristaloid lamelar, caracteristic stadiilor tardive de dezvoltare ale
fructelor. Aceasta şi justifică prezenţa cristaloidului granular în cantităţi reduse pe suprafaţa
epicarpului fructului matur. Distribuirea şi gradul de împachetare a formaţiunilor cerifere
corelează cu regiunea fructului: pedicelară şi calicială cu tipul lamelar, iar mediană, cu tipurile
lamelar, granular şi tubular, ce denotă continuitatea transformărilor cerifere pentru a opune
rezistenţă şi a satisface necesităţile de protecţie a acestei regiuni, expuse, în permaneneţă,
acţiunii factorilor excesivi de temperatură, radiaţie şi insolaţie.

73
 A. B.

C. D.
Fig.3.23. Scanograma epcarpului fructelor mature. Formaţiuni cerifere polimorfe: A – tubulare,
x1250; B – granulare, x1250; C – lamelare, cu densitate mare în aranjament regulat, x1250, D –
lamelare, dufuze, x1320.

Mezocarpul este regiunea tisulară mediană cea mai voluminoasă a pericarpului, formată
din 20-24 straturi de celule parenchimatice. În mezocarp, de la exterior spre centru, sunt
conturate 4 subzone, care se succed leger una în alta, fără delimitări puternic pronunţate:
hipoderma; subzona externă a celulelor oval-rotungite; subzona celulelor oval-alungite radiar şi
subzona internă a celulelor oval-rotungite (fig. 3.24).
Hipoderma este reprezentată de 4-5 straturi de celule poligonale cu dimensiunile 50-70
µm, dens împachetate cu spaţii intercelulare reduse, iar pereţii celulari de natură celulozică sunt
uşor îngroşaţi. Celulele sunt puţin vacuolizate, bogate în amiloplaste. Rar sunt sclereidele
solitare, care după dimensiuni, nu diferă de celelalte celule. Sunt prezente idioblastele cu cristale
de oxalat de calciu solitare sau în grupuri câte 3-5.
Subzona externă a celulelor oval-rotungite constă din 8-10 straturi de celule cu
diametrele aproape egale, care variază între 90 şi 125 µm şi spaţii intercelulare mici, vacuolizate,
bogate în suc antocianic. Sclereidele solitare, sau în grupuri mici (2-3 celule) cu pereţii lignificaţi
şi dislocare difuză. Sporadic se întâlnesc idioblastele cu druze de oxalat de calciu.

74
 I
1

4
II

II 3

III

Fig. 3.24. Secţiune transversală prin pericarpul fructului de A. melanocarpa (Michx.): I –

epicarpul; II – mezocarpul; 1 – hipodermă; 2 – subzona externă a celulelor oval-rotungite; 3 –
subzona celulelor oval-alungite radiar; 4 – subzona internă a celulelor oval-rotungite; III –
endocarpul, x300.
Subzona celulelor oval-alungite radiar este constituită din 8-10 straturi de celule cu
diametrul radial 190-210 µm şi cel tangenţial 110-120 µm. Forma alungită asigură o îmachetare
mai compactă în raport cu celulele subzonei oval-rotungite. Celulele sunt vacuolizate, au pereţii
celulari subţiri, fără idioblaste cu druze de oxalat de calciu, iar sclereidele în grupuri sporadice,
care servesc centre de ancorare radială a celulelor parenchimatice oval-alungite.
Subzona internă a celulelor oval-rotungite se limitează cu endocarpul alcătuit din celule
relativ mici, 50-70 µm, compact împachetate, spaţii intercelulare mici. Sclereidele de formă
ovală, poligonală, triunghiulară de dimensiuni diferite (50-70-90 µm) şi grosimea pereţilor
celulari până la 35 µm, sunt din abundenţă, în grupuri mari şi frecvent formează făşii
neîntrerupte, compact împachetate. Se întâlnesc idioblaste cu druze de oxalat de calciu.
Endocarpul este reprezentat de epiderma internă, constituită dintr-un singur strat de
celule de dimenisuni mici (25-30 µm), cu pereţii celulari îngroşaţi, bine împachetate, alungite pe
axa tangenţială şi dispuse în formă de parchet.
Pericarpul fructului matur de A. melanocarpa (Michx.) Elliot se caracterizează prin
zonalitatea histoanatomică (epi-, mezocarp, diferenţiat în 4 subzone şi endocarp), descrisă la

75
multe specii din s/familia Pomoideae în lucrările şcolii de anatomie a plantelor a Academiei de
Ştiinţe a Moldovei [376,378,380], care, cu specificări, se înscrie într-un plan general de structură,
ce confirmă principiul identităţii zonalităţii histoanatomice [376].
3.4. Modificările structurale ale fructului în funcţie de gradientul ecologo-geografic al
Republicii Moldova
Caracteristicile histoanatomice ale organelor vegetale sunt într-o interdependenţă de
condiţiile pedo-geografice de dezvoltare ale plantei. Particularităţile transformărilor structurale
în funcţie de condiţiile ecologice, corelează cu apartenenţa sistematică a plantei şi sunt
organospecifice [369,378]. Această informaţie este importantă la fructe pentru dezvăluirea şi
interpretarea mecanismelor structurale ale fructelor suculente în capoecogeneză la plantele
cultivate [46,363,378,379]. Rezultatele studiilor structurale carpoecologice au o mare pondere
aplicativă, servind criterii atât la dirijarea proceselor de creştere, selectare şi calibrare a fructelor
ecologic polimorfe [369], cât şi la determinarea duratei de păstrare pe perioada de post-maturare
[379] pentru obţinerea fructelor cu calităţi înalt gustative şi aspect calitativ comercial.
Este cunoscut impactul gradientului complexului de factori climatici al reliefului
accidentat-versant al R.Moldova asupra particularităţilor citomorfologice ale plantelor anuale de
cultură şi asupra celor pomicole [378,379]. Aceste studii au pus în evidenţă complexele
structurale în calitate de mecanisme de adaptare la acţiunea gradientului de factori ecologici,
instalat pe terenul versant-accidentat [9] şi în funcţie de gradientul ecologo-geografic [46]. Studii
morfo-anatomice în corelaţie cu factorii ecologo-geografici la fructele de aronie lipsesc.
S-a efectuat studiul transformărilor structurale ale pericarpului de aronie în funcţie de 3
regiuni ecologco-geografice ale R.Moldova: Sud (r. Cimişlia); Centru (r. Străşeni) şi Nord (r.
Briceni). Indicii biometrici: masa, dimensiunile, culoarea fructelor reflectă condiţiile pedo-
climatice de creştere ale plantei [162,301,314], de aceea sunt frecvent antrenate în studiile
morfo-ecologice. Conform studiului lui Kawecki şi colaboratorii [162], valorile masei şi
dimensiunilor fructelor de aronie sunt variabile, în funcţie de acţiunea factorilor fizici şi chimici,
dar regimul hidric are un impact hotărâtor. Variaţia unor indici biometrici (greutatea şi
dimensiunile fructelor, grosimea pericarpului, lojei seminale şi coraportul dintre ele) la fructele
de aronie în funcţie de zona ecologo-geografică a R.Moldova (tabelul 3.3.) demonstrează că
masa minimă a 100 de fructe proaspete variază de la 36,2 g, la Sudul Moldovei, până la 59,2 g,
la Nord, cea maximă, respectiv, de la 47,2 g la 72,1 g. Dimensiunile fructelor variază, în mediu,
la 10 fructe, de la 5,6 mm, în Sud, până la 7,2 mm, la cele din Nordul Moldovei.
Dimensiunile maxime ale fructelor mature sunt determinate de numărul şi dimensiunile
celulelor [88,136,276]. Extinderea celulelor în dimensiuni induce mărirea volumului, dar

76
dividerea celulelor reprezintă un factor esenţial în organogeneza fructului, deoarece determină
numărul de celule în pericarp [86]. Aceste procese sunt dirijate de acţiunea factorilor biotici şi
abiotici şi contribuie la determinarea masei şi dimensiunilor fructelor [86,136,276].
Tabelul 3.3. Variaţia unor indici biometrici la fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în
funcţie de zona fizico-geografică a R.Moldova
Zona Masa a 100 de fructe (g) Diametrul
ecologo-geografică Min Max Medie fructelor(mm)
Sud
36,2 ± 1,1 47,2 ± 1,6 41,7 5,6 ± 0,3
Centrală
44,6 ± 1,8 50,2 ± 1,3 47,4 6,1 ± 0,1
Nord
59,2 ± 1,9 72,1 ± 2,1 65,6 7,5 ± 0,4
Se observă o corelaţie a indicilor biometrici la fructele de aronie cu gradientul ecologo-
geografic al reliefului R.Moldova. Greutatea şi mărimea fructelor este mai mare la cele din zona
de nord, fiind condiţionate de regimul mai leger de temperaturi şi hidratarea mai mare în această
zonă fizico-geografică, care şi cauzează prolongarea perioadei de dezvoltare a fructelor, în raport
cu cele din sud. Valorile masei şi dimensiunilor fructelor de aronie corelează cu cele ale
coraportului dintre grosimea pericarpului şi lojei seminale (fig.A.2.14), înscriind o ascensiune în
funcţie de gradientul ecogeografic, stabilit de la Sudul spre Nordul R.Moldova, graţie sporirii
valorilor pericarpului şi constantei valorilor lojei seminale, ce rezultă în formarea fructelor cu
pericarpul mai suculent în zona nordică, comparativ cu cea sudică. Valorile minime ale indicilor
biometrici sunt caracteristice fructelor din Sudul R. Moldova, unde se instalează un complex acut
de factori pedo-climatici pe perioada estivală. Influenţa regimului de temperaturi sporite şi a
secetei pe perioade îndelungate în Sudul R.Moldova se manifestă asupra duratei etapelor
ontomorfogenetice ale fructelor de aronie, ca rezultat ele se maturează cu 8-10 zile mai devreme,
decât cele din Nordul R.Moldova.
Studiul histoanatomic al fructelor de aronie în funcţie de cele 3 regiuni ecologo-
geografice ale R.Moldova s-a efectuat în baza următorilor indici: grosimea şi tipul cuticulei;
gradul de dezvoltare şi tipul formaţiunilor cerifere; gradul de pubescenţă; dimensiunile celulelor
epidermale şi parenchimatice din subzonele mezocarpului; grosimea pereţilor celulari; gradul de
împachetare a celulelor; densitatea sclereidelor, modul de distribuire, densitatea druzelor de
oxalat de calciu şi modul de distribuire etc. Epiderma cu derivatele ei (cuticila, stratul cerifer) şi
formaţiunile stucturale specifice (perişorii tectori, stomatele, evoluate în lenticele) reprezintă
prima barieră cu rol protector al pericarpului suculent al fructului de aronie. Celulele epidermale
sunt bine împachetate şi acoperite cu cuticulă, vizualizată în SEM, la înlăturarea stratului cerifer,

77
prin dizolvarea formaţiunilor cerifere în solvent eteric (fig. A.2.12). Formaţiunile cerifere sunt
edificate, din abundenţă, pe partea externă a cuticulei (fig. A.2.13).
Indicii histoanatomici variază în funcţie de zona fizico-geografică de dezvoltare a plantei
(tabelul 3.4). O diferenţă mare se observă în grosimea cuticulei, fructele din zona de Sud (fig.
3.25;A. 2.15;A.2.16) dezvoltă o cuticula mai groasă (12,1 µm), decât cele din zona de Nord (7,2
µm). Grosimea cuticulei de 8,1 µm la fructele de aronie din zona Centrală (fig. 3.26) puţin se
deosebeşte de cea a fructelor din zona de Nord (fig. 3.27) cu grosimea medie de 7,2 µm.

2
3

Fig. 3.25. Secţiune prin regiunea periferică a pericarpului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot din
zona de Sud a R. Moldova: 1 – perişor tector; 2 – celule bazale ale perişorului; 3 – cuticulă de tip
extern-internă, x200.

Fig. 3.26. Secţiune prin regiunea periferică a Fig. 3.27. Secţiune prin regiunea periferică a
pericarpului fructului de A. melanocarpa pericarpului fructului de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot din zona Centrală: 1 – (Michx.) Elliot din zona de Nord: 1 –
cuticulă de tip extern, x200. cuticulă de tip extern, x200.

78
 Tabelul 3.4. Variaţia indicilor histoanatomici ai fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie de zona ecologo-geografică a R. Moldova

Densitatea perişorilor
Cuticula Formaţiuni cerifere Dimensiunile Dimensiunile celulelor subzonelor

Densitatea sclereidelor
ecologo-geografică

celulelor mezocarpului
epidermale (µm)

tectori
(µm)
Zona

Tipul cuticulei,

formaţiunilor
de răspândire

formaţiunilor

Distribuirea
Grosimea

Subzona Subzona celulelor oval-

cerifere
cerifere
gradul

Tipul Hipoder externă a alungite radiar

(µm)

ma celulelor
Radiale oval-
Tangenţiale Diametrul Diametrul
rotungite mare mic

Extern-
Sud, intern, Tubular şi Zona
răspândire 12,1±0,4 pedicelară, 4,1±1,3 214,4±3,4
(r. Cimişlia) lamelar 35,6±1,9 12,4±0,7 48,1±2,2 55,1±2,4 19,4±1,6
79

½, 3/4 mediană şi 90,1±3,3

calicială
Tubular,
Centrală Extern, lamelar şi Zona 1,3±1,1 40,2±1,4 14,5±0,2 67,1±2,6 110,2±3,8 218,8±3,4 65,8±2,1 15,6±0,9
răspândire 8,1±0,3 mediană
(r.Străşeni) granular
1/3

Nord Extern, Lipsesc Zona 0,8±0,1 44,1±2,2 16,8±0,6 71,2±2,5 124,2±5,3 220,1±2,4 71,4±3,2 10,2±0,8
răspândire 7,2±0,2 mediană
(r. Briceni) date
mai≤1/3

Legendă: Densitatea perişorilor tectori şi sclereidelor, calculată pe unitate de suprafaţă, ecivalentă cu câmpul de vedere la combinaţia: ocular 10x şi
obiectiv 20x.

79
 Sunt diferenţe graduale de răspândire a cuticulei printre pereţii radiali ai celulelor
epidermei, pentru fructele din zona de Sud, fiind de 3/4, pentru zona Centrală – 2/3, iar pentru
cele din zona de Nord, mai puţin de 1/3. Gradul de răspândire a cuticulei este un parametru
structural informativ, ce denotă o diferenţă categorică în anatomia epicarpului de aronie în
funcţie de condiţiile pedo-climatice, exprimată prin gradaţia xeromorfică a ecotipurilor,
interpretat ca parametru calitativ [20,46,369] cu rol important în adaptarea fructelor suculente la
condiţiile mediului şi sporirea rezistenţei lor faţă de excesul insolaţiei, radiaţiei, temperaturilor
sporite, lipsa umidităţii, care se reflectă asupra longevităţii şi calităţii fructelor pe perioada de
păstrare [379].
Fructele de aronie se caracterizează prin depuneri cerifere epicuticulare [20], iar studiul
suprafeţelor epicarpului în SEM denotă specificul polimorf cerifer. La fructele, crescute în Sudul
R.Moldova deosebim un strat cerifer, în mare parte, alcătuit din formaţiuni a cristaloidului
alungit, uşor de înlăturat, care este însoţit de cele a cristaloidului de tip lamelar, mai aderabil la
cuticulă (fig. A.2.17). Printre depunerile cerifere epicuticulare alungite şi lamelare la fructele din
regiunea Centrală se intâlnesc şi formaţiuni cerifere a cristaloidului granular, care, uneori,
prevalează faţă de celelalte tipuri (fig. A.2.18). Cristaloidul granular, absent la fructele din Sud,
considerat unul de tranziţie [36,150], demonstrează că diferenţierea formaţiunilor cerifere este
mai accelerată la ele, decât la fructele din regiunea Centrală a R.Moldova. Distribuirea
formaţiunilor cerifere corelează cu regiunea fructului. Depunerile cerifere la fructele din zona de
Sud sunt mai impunătoare, cu o distribuire difuză în regiunile calicială şi pedicelară (fig. A.19),
iar în cea mediană au o densitate mai mare, sunt mai omogene cu excepţia acumulărilor, care
căptuşesc fisurile de diferită geneză. (fig.A.20). Fructele din zona Centrală se caracterizează prin
acumulări cerifere mai modeste cu distribuire în regiunea mediană, iar în regiunile pedicelară şi
calicială depunerile cerifere sunt doar în cantităţi reduse, difuze. Acumulările cerifere
epicuticulare cu densitate mare şi mod de distribuire omogen la fructele din sudul R.Moldova
reprezintă o reacţie de adaptare a fructelor la condiţiile pedo-climatice specifice acestei regiuni,
determinate de complexul factorilor externi, caracteristici acestei regiuni geografice: insuficienţa
de umiditate; prezenţa temperaturilor sporite şi a vânturilor caniculare uscate. Depunerile
cerifere în zona mediană constituie un ecran reflector al excesului razelor de lumină şi iradiante,
astfel protejând structurile interne suculente de supraîncălzire şi pierdere de apă.
Stratul cerifer epicuticular reprezintă o barieră structural-fiziologică, care reduce evident
pierderea de apă [150,154] şi exercită o funcţie protectoare majoră a fructului la acţiunea
excesivă a radiaţiei şi a variaţiunilor de temperatură, la acţiunea destructivă a factorilor fizici şi
biologici [36,282]. Datorită însuşirilor hidrofobe, ceara reglează metabolismul apei prin

80
reducerea pierderii şi pătrunderea acesteia din interiorul organului plantei, menţinând o anumită
rată a umidităţii şi transpiraţiei şi împiedicând vestejirea accelerată a fructelor [324]. La fructele
premature de aronie (80 zile), dezvoltate în zona de Sud, perişorii tectori încă persistă şi sunt
numeroşi în regiunile pedicelară (fig. A.2.21) şi calicială (fig. A.2.22), pe când la fructele din
celelalte zone ecologo-geografice, se întâlesc rar sau lipsesc (fig. A.2.23).
Rezultatele analizei celorlalţi parametri, incluşi în cercetare (tabelul 3.4.), variază la fel în
funcţie de zona ecologo-geografică a R.Moldova. Dimensiunile celulelor epidermale şi a celor
parenchimatice din diferite subzone ale mezocarpului sunt mici la fructele din Sud şi se măresc
la fructele din zona Centrală şi cea de Nord. Este bine evidenţiată hipoderma la fructele din zona
de Sud (fig. A.2.22). Pereţii celulelor hipodermei de natură celulozică sunt mai îngroşaţi, iar
celulele, în limitele acestei subzone, sunt mai compact împachetate în ţesut la fructele din zona
de sud, faţă de cea centrală şi nordică. Aceste diferenţe anatomice denotă o creştere mai sporită a
fructelor din regiunea de Nord, exprimată prin mezomorfozarea pericarpului, contrar fructelor
din zona de Sud cu o perioadă de dezvoltare mai redusă cu 8-10 zile, iar pericarpul mai
xeromorfozat.
Diferenţele dimensiunilor celulelor subzonei externe oval-rotungite din primele 4-5
rânduri (90,1 µm – la Sud, 110,2 µm – la Centru şi 124,2 µm – la Nord) sunt evidente, dar pentru
următoarele 10 rânduri, doar în limitele erorii (214,4; 218,8; 220,2 µm, respectiv). Aceasta
denotă, că transformările anatomice cantitative sunt în conexiune cu topografia zubzonei, cele
mai mari deosebiri, fiind în regiunea periferică a pericarpului. Modificările structural-periferice
ale pericarpului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot faţă de gradientul ecologo-geografic al
R.Moldova constituie o dovadă a caracterului lor adaptiv, ce contribuie la sporirea rezistenţei şi
protejarea structurilor suculente ale fructului.
Fructele din zona de Sud dezvoltă un număr mai mare de sclereide, decât fructele din
zona Centrală şi de Nord. În fructele, crescute în zona de Sud, sclereidele au o densitate mare, rar
sunt solitare, frecvent în grupe, dispersate în hipodermă, în subzona externă a celulelor oval-
rotungite, iar în cea internă, constituie o făşie neîntreruptă sclerificată, impunând duritate şi
compactitate (fig. 3.28). Prezenţa din abundenţă şi distribuirea compactă a sclereidelor reprezintă
un element structural a expresiei xeromorfismului [381]. În pericarpul fructelor, crescute în zona
de Nord, densitatea sclereidelor este mai redusă, ele, fiind solitare sau în grupuri mici (fig. 3.29).
Celulele parenchimatice ale celor 4 subzone ale mezocarpului sunt de dimensiuni mai
mici şi mai compact împachetate la fructele de aronie din zona de Sud, în comparaţie cu fructele
din celelalte zone ale R.Moldova (tabelul 3.4).

81
Fig. 3. 28. Secţiune transversală prin pericarpul Fig. 3. 29. Secţiune transversală prin pericarpul
fructului din zona de Sud a R.Moldova, x200. fructului din zona de Nord a R.Moldova, x200.

Incluziunile ergastice sub formă de druze de oxalat de calciu caracterizează pericarpul

fructului de aronie [20], menţionate şi în studiu lui Gh.Rotaru [380]. Frecvenţa şi modul de
distribuire al druzelor în pericarp corelează cu condiţiile ecologo-geografice de dezvoltare ale
plantelor: mai frecvente în fructele din zona de Sud, decât la cele din zona de Nord (fig. 3.30).

A. B.
Fig. 3.30. Secţiune prin pericarpul fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: A – din zona de
Sud; B – din zona de Nord a R.Moldova: 1 – druze de oxalat de calciu, x300.

În fructele din zona de Sud a R.Moldova, druzele de oxalat de calciu sunt distribuite,
preponderent, în regiunea extern-periferică a mezocarpului. Este cunoscut că expresia
morfologică a cristalelor de oxalat de calciu corelează cu procesele de biopolimerizare şi căile
lor de formare [271] şi este reglată genetic de metabolismul acidului oxalic şi a nivelului de
calciu în celulă [116]. În conformitate cu unele lucrări [214], ancorarea cristalelor de oxalat de
calciu se iniţiază pe o matrice proteică, iar sinteza proteinelor se accelerează în condiţiile
nefavorabile şi de stres [225]. Indiferent de modul şi calea de formare a cristalelor în
aglomeratele morfologice, ele au rol biologic, preponderent, de protecţie împotriva animalelor
erbivore şi ca insecticid [116]. Dezvoltarea cristalelor de oxalat de calciu are loc în condiţiile de
stres şi, în deosebi, de salinitate sporită [103,271], corelează cu nutriţia minerală a solului şi
intensitatea luminii [103].

82
 Prin prisma celor relatate, dezvoltarea abundentă a druzelor de oxalat de calciu la
fructele de aronie din regiunea de Sud a R.Moldova şi prezenţa lor maximă în regiunea extern-
periferică a mezocarpului reprezintă o reacţie adaptivă la condiţiile nefavorabile.
Funcţia adaptiv-protectoare la fructele de aronie din Sudul R.Moldova este suplinită atât
de structuri externe: cuticula groasă de tip extern-internă, formaţiunile cerifere omogene cu
densitate sporită, prezenţa perişorilor tectori, cât şi interne: dimensiunile mici ale celulelor
epidermei, hipodermei şi subzonei externe oval-rotungite a mezocarpului; pereţii îngroşaţi;
împachetarea mai compactă a celulelor; densitatea sporită a sclereidelor şi druzelor de oxalat de
calciu. Aceste structuri funcţionează sinergic şi alcătuiesc un complex histoanatomic
compensator protector al pericarpului la acţiunea factorilor externi (deficit de umiditate,
temperaturi sporite ale solului şi aerului pe parcursul perioadei estivale). Micromorfologia
formaţiunilor cerifere epicuticulare la fructele de aronie este polimorfă, exprimată prin diferite
tipuri de cristaloizi, mod de distribuire, grad de densitate şi aderenţă, care corelează cu regiunea
epicarpului (calicială, mediană, pedicelară) şi zona ecologo-geografică de creştere a R.Moldova,
constituind una din „strategiile de adaptare şi rezistenţă” la condiţiile mediului.
3.5. Structuri citoanatomice – suport potenţial în asigurarea calităţii fructelor suculente de
aronie
Fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot sunt solicitate pe piaţă mondială pentru
consumul zilnic şi în calitate de materie primă alimentară, tinctorială şi farmaceutică
[66,79,84,156,160,171,209]. Pentru producerea unui produs comercial şi medicinal calitativ
Aroniae fructus este necesară asigurarea integrităţii fructelor în procesele de recoltare,
transportare, ambalare şi păstrare.
Este dificil de păstrat şi asigurat integritatea fructelor de aronie, ele fiind suculente şi
mici, ce reprezintă un impediment serios în procesele de recoltare atât manuală, cât şi
mecanizată, transportarea şi păstrarea în proporţii mari şi pe perioade de lungă durată. Studiul în
cauză a avut obiectivul de a evidenţia structurile citoanatomice ce constituie reperul esenţial în
asigurarea integrităţii pericarpului suculent de aronie.
Un rol deosibit în fiabilitatea integrităţii fructelor revine structurilor epicarpului, ele fiind
prima barieră la contact direct cu mediul exterior. O mare pondere în acest sens au
particularităţile structurale ale fiecărui element al complexului protector al epicarpului fructului:
dimensiunile celulelor epidermale şi gradul de compactizare, prezenţa structurilor speciale ale
epidermei (perişori, stomate, lenticele); grosimea cuticulei şi gradul de răspândire între celulele
epidermei; microstructura formaţiunilor cerifere, gradul de dezvoltare, densitate şi aderenţă a
stratului cerifer epicuticular (fig. 3.31).

83
 1

a. b.

3
4
c. d.

5
6

e. j.
Fig. 3.31. Structuri anatomice ale pericarpului suculent de aronie: a, b – epcarpul, viziune
de-asupra; c-j – secţiune transversală: 1 – celule tabulare strâns împachetate; 2 – locul de
prindere a perişorului tector; 3 – răspândirea cuticulei printre celulele epidermale; 4 – perişori
tectori; 5 – hipodermă; 6 – sclereide.

Dimenisiunile relativ mici şi alungirea tangenţială a celulelor epidermale permit o

împachetare compactă, ce asigură un anumit grad de rezistenţă la presiuni şi zdruncinări
mecanice în procesele de recoltare şi transportare ale fructelor. Perişorii tectori constituie un
înveliş protector plastic, care acoperă fructul juvenil şi îl protejează de variaţii termice, hidrice,
radiante, acţiuni şi presiuni mecanice. Frecvent lenticele şi perişorii formează complexe trihomo-
lenticulare (fig. A.2.10), care sporesc capacitatea de protecţie a fructului în condiţiile
nefavorabile de creştere [20]. Pe secţiuni transversale ale pericarpului fructelor, provenite din
zona de Sud a Moldovei, se observă răspândirea cuticulei printre celulele epidermale şi grosimea
mai mare, ce sporesc rezistenţa fructului. Aceste caracteristici anatomice ale cuticulei determină
gradul de rezistenţă a fructelor şi asigură integritatea lor la presiuni mecanice în procesele de
transportare şi ambalare.
Un rol important, în asigurarea viabilităţii şi rezistenţei fructelor, revine
micromorfologiei şi compoziţiei chimice a cerii epicuticulare, fiind la contactul direct cu mediul
inconjurător, reprezintă o barieră, care reduce schimbul de apă şi gaze [20,150], protejează

84
organul de acţiunea excesivă a luminii, a variaţiunilor de temperatură [154], reduce acţiunea
destructivă a factorilor fizici şi biologici [36]. Fructele mature de aronie, fiind lipsite de perişori
tectori, sunt protejate, în mare parte de stratul cerifer, care diminuează supraîncălzirea prin
reflectarea razelor solare, astfel frânează veştejirea accelerată a pericapului. Totodată,
acumulările cerifere asigură şi protecţia pericarpului la acţiunea agenţilor patogeni. Stratul
cerifer impune o nuanţă azurie pe fondalul negru, astfel determină aspectul atractiv-apetisant şi
comercial al fructelor de aronie [310]. Ceara epicuticulară a fructelor intervine în procesele
fiziologice şi metabolice ale fructului şi până la urmă constituie un element important plastic al
complexului periferic protector în fiabilitatea integrităţii fructului. Rezistenţa cerii la acţiunea
degradantă a factorilor mecanici este determinată de micromorfologia formaţiunilor, arhitectura
microstructurală, modul de distribuire şi gardul de interdependenţă a cristaloizilor epicuticulari
constituienţi [20,36]. Fructele de aronie cu acumulări cerifere ale cristaloidului alungit (fig.
A.2.19;A.2.24), însoţite în mare parte de cristaloidul lamelar (fig. A.2.17) şi mai puţin de cel
granular (fig. A.2.18;2.25) permit o împachetare mai reuşită, astfel, acoperind mai eficient
suprafaţa epicarpului [20]. Depunerile epicuticulare cerifere din jurul perişorilor persistenţi,
fisurilor şi a lenticelelor contribuie la menţinerea unei continuităţi a stratului cerifer epicuticular,
astfel, sporind rezistenţa fructului. Ceara de tip alungit are o distribuire uniformă în regiunea
mediană a fructului.Tipul lamelar reprezintă cristaloidul mai mult sau mai puţin plat, deşi în
aparenţă neregulat, este, totuşi, supus unor reguli de distribuţie spaţială. Placuţele se formează
din abundenţă la polii fructului (preponderent în depresiunile calicială şi pedicelară), unde se
caracterizează printr-o distribuire mai compactă. Frecvent sunt acumulări cerifere lamelare în
jurul perilor persistenţi. În regiunea mediană a fructului frecvenţa plăcuţelor cerifere este mai
mică cu o aranjare difuz-ocazională. Cu cât plăcuţele cerifere sunt mai plate şi mai bine
împachetate, cu atât mai greu se poate înlătura stratul cerifer epicuticular. Tipul granular al cerii
este reprezentat prin formaţiuni globuloase, constituite dintr-o ceară uşor secretabilă şi nu este
dominant în microstructura epicuticulară, dar însoţeşte formaţiunile tubulare şi lamelare pe toată
suprafaţa fructului matur de aronie cu o distribuţie difuză. Modul de distribuire al acestor tipuri
de ceară pe suprafaţa fructului nu este omogen.
Prezenţa a 3 tipuri morfologice de ceară la fructul de aronie asigură o posibilitate mai
bună a împachetării lor pe suprafeţe, astfel constituind o continuitate a stratului epicuticular, ce
asigură o fiabilitate în îndeplinirea menirii fiziologice – de protecţie a structurilor lăuntrice ale
pericarpului. Micromorfologia cerii epicuticulare se caracterizează printr-un complex de indici:
tipul morfologic; combinaţia tipurilor; gradul de omogenitate; gradul de distribuire şi
compactizare a formaţiunilor cerifere în funcţie de regiunea pericarpului; gradul de aderenţă la

85
cuticulă etc. Fiecare indice structural are aportul, iar împreună constituie complexul epicuticular
cerifer protector, care asigură protejarea, vitalitatea, integritatea şi longevitatea vitală a fructelor.
Mezocarpul, alcătuit din hipodermă şi subzonele externă a celulelor oval-rotungite, a
celulelor oval-alungite radiar, a celulelor oval-rotungite din apropierea epidermei interne, se
caracterizează cu grad diferit de împachetare, îngroşare a pereţilor celulari pecto-celulozici şi
vacuolizare, totuşi reprezintă un ţesut suculent şi relativ spongios. Toate acestea diminuiază
rezistenţa fructelor suculente mature pentru asigurarea integrităţii, în deosebi la acţiunile
mecanice. Analiza histoanatomică a pericarpului arată că, cu cât mai multe elemente mecanice,
sclereide sunt dezvoltate, cu atât este mai înalt gradul de împachetare al celulelor, ce conduce la
micşorarea spaţiilor intercelulare şi asigură o anumită fiabilitate a rezistenţei fructelor suculente.
S-au evidenţiat elementele structurale ale pericarpului de aronie în calitate de criterii
anatomice-suport în determinarea potenţialului de rezistenţă, apreciere a viabilităţii şi longevităţii
fructelor în procesele de recoltare, transportare, ambalare şi post-maturare: ceara (gradul de
dezvoltare, tipul cristaloidului cerifer, densitatea şi arhitectura formaţiunilor cerifere, gradul de
aderenţă a formaţiunilor cerifere la cuticulă, omogenitatea şi modul de distribuire a formaţiunilor
cerifere); cuticula (grosimea şi tipul); celulele epidermei (forma, dimensiunile, maniera de
împachetare); perişorii tectori (densitatea, gradul de dezvoltare şi aderenţă); celulele
mezocarpului (forma, dimensiunile şi modul de împachetare în subzonele histoanatomice; gradul
de vacuolizare şi îngroşare a pereţilor celulari; druzele de oxalat de calciu, sclereidele, gradul de
dezvoltare şi modul de distribuire în subzonele histoanatomice.
E dificil de determinat ponderea fiecărui element structural aparte pentru asigurarea
integrităţii fructelor suculente de aronie, dar este relevant că toate elementele citoanatomice
evidenţiate formează un complex de structuri cu rol hotărâtor în acest sens. Fiecare element
structural determinat atât din regiunea tisulară periferică, cât şi internă îndeplineşte un anumit
rol, iar împreună constituie un complex structural, care asigură vitalitatea, rezistenţa,
longevitatea şi calitatea fructelor de aronie. Studiul anatomic al fructelor de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot readuce în actualitate necesitatea cercetărilor citoanatomice ale fructelor
suculente în vederea evidenţii criteriilor anatomice, care servesc ca reper în asigurarea
integrităţii, longevităţii, vitalităţii şi calităţii fructelor suculente.
3.6. Concluzii la capitolul 3
Studiul histoanatomic al fructelor suculente de tip pommum la A. melanocarpa (Michx.)
Elliot a pus în evidenţă unele caracteristici structurale relevante, care corelează cu etapele
ontomorfogenezei şi condiţiile ecologo-climatice ale reliefului:

86
• Diferenţierea pericarpului în zonele histologice: epicarpul; mezocarpul în 4 subzone
histologice (hipoderma, subzona externă a celulelor oval-rotungite, a celulelor oval-alungite
radiar şi internă a celulelor oval-rotungite), endocarpul este determinată de geneza fructului
şi confirmă principiul identităţii zonalităţii histoanatomice pentru carpotipul pommum.
• În ontomorfogeneza fructului are loc dezvoltarea selectivă şi consecventă a structurilor
histoanatomice cu caracter adaptiv, adecvat condiţiilor concrete ale etapei
ontomorfogenetice, iar etapa de 60 zile de la înflorire, se caracterizează printr-un echilibru al
dividerilor celulare şi al activităţii proceselor metabolice şi reprezintă o etapă de tranziţie a
unor schimbări structurale cantitative şi calitative.
• Adaptarea în ontomorfogeneza fructului la acutizările condiţiilor pedo-climatice este
asigurată de un complex de structuri, care funcţionează printr-un mecanism compensator,
bazat pe acţiunea corelativă şi coordonativă a plasticităţii şi flexibilităţii epi- şi
endostructurilor pericarpului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.
• Rezultatele studiului demonstrează că planul de organizare histoanatomică a pericarpului
rămâne a fi comun pentru fructele de aronie din diferite zone ecologo-geografice ale R.
Moldova, cu diferenţe cantitative şi calitative ale unor indici biometrici şi anatomici studiaţi,
care se reflectă în formarea unei structuri mai xeromorfe la fructele din zona de Sud şi mai
mezomorfe la fructele din zona Centrală şi de Nord.
• Gradientul modificărilor histoanatomice ale fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în
funcţie de fluctuaţiile condiţiilor pedo-climatice de la Sudul spre Nordul R. Moldova au
caracter adaptiv şi corelează cu topografia structurilor în limitele pericarpului; cele mai
accentuate fiind în regiunea periferică externă, reflectată în epidermă cu derivatele şi
formaţiunile specifice şi în hipodermă.
• Integritatea fructelor suculente de aronie este determinată de particularităţile de dezvoltare şi
organizare în ontomorfogeneză şi carpoecogeneză a structurilor protector-adaptive ale celor
două sisteme tisulare (extern şi intern) funcţional interdependente şi sinergiste.

87
 4. STUDII BIOTEHNOLOGICE ŞI PARTICULARITĂŢILE STRUCTURALE ALE
CARPOMASELOR PIGMENTATE DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT
4.1. Optimizarea compoziţiei chimice a mediului nutritiv pentru inducerea şi acumularea
carpocalusului la aronie
Analiza rezultatelor experimentelor biotehnologice din literatura de specialitate
demonstrează importanţa selectării adecvate a MN de bază şi a hormonilor, suplimentaţi, pentru
iniţierea şi dezvoltarea vitromaselor şi vitroplantulelor [52,53]. Viabilitatea şi evoluţia ulterioară
a explantelor vegetale, inoculate în culturi in vitro este determinată de natura MN [111,347],
formula hormonală adiţională [218,353] şi de sursa de carbon [100,111,360].
Reeşind din dificultăţile tehnice, generate de specificul pericarpului fructelor suculente de
Solanum xanthocarpum [147], Malus sylvestris [268], Capsicum annuum şi Lycopersicon
esculentum [55-58], a speciilor din g. Citrus [104,122,233] şi celor din g. Actinidia [90], a
soiurilor de Vitis vinifera [91,100,206] şi ţinând cont de particularităţile organizaţiei
histoanatomice a pericarpului fructului de A.melanocarpa (Michx.) Elliot [20,29,380] şi
specializarea morfofuncţională în biosinteza CF [11,23,26,124,148,163,320,344] ne-am propus
tatonarea MN cu diferite variante hormonale, adiţionate, în scopul optimizării regimului
nutriţional adecvat inducerii calusării, acumulării carpomasei şi stimulării biosintezei
polifenolice.
4.1.1. Acţiunea balanţei hormonale a mediului nutritiv asupra carpocalusogenezei
Pentru realizarea scopului propus, s-a elaborat schema biotehnologică de tatonare a
variantelor hormonale, adiţionate la MN standard – B5 şi MS, bazată pe dozarea şi suplimentarea
individuală sau combinată a hormonilor de tip citokininic (BAP şi K) şi auxinic (2,4-D şi ANA).
Pentru suplimentarea MN de bază s-au întocmit aproximativ 100 de variante hormonale cu
diapazonul dozelor hormonilor de la 0,5 mg/l până la 10 mg/l şi în diferite combinaţii. Explantele
inoculate pe MN B5 cu diferite combinaţii hormonale au generat, sporadic, doar un calus
incipient, neviabil. Explantele, inoculate pe mediul MS cu diferite variante hormonale adiţionate,
au manifestat carpocalusare cu intensitate diferită şi aspect polimorf al carpomaselor generate
(tabelul A.3.1).
Variantele hormonale, în număr de 48, în baza grupelor hormonale B, BD, BN, KD, KN,
au fost antrenate în diferite scheme biotehnologice, prin aplicarea diferitor regimuri de lumină şi
temperatură pentru studierea potenţialului de calusare, acumulare a carpomaselor şi biosintezei
CF din diferite explante ale pericarpului fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot. Din cele
48 de variante hormonale ale MN tatonate, doar 20 varinate hormonale au demonstrat rezultate
impresionante, care şi au fost antrenate în studiile ulterioare (tabelul A.3.2).

88
 Astfel, în rezultatul screenin-gului variantelor hormonale, bazate pe combinaţia diferitor
doze de hormoni auxinici şi citokininici, adiţionate MN de bază MS, s-a reuşit optimizarea
balanţei hormonale în vederea inducerii şi acumulării carpocalusului la A. melanocarpa (Michx.)
Elliot: doze 2,0-2,5 mg/l de 2,4-D şi 0,5 mg/l K a generat carpomasă verde; 2,5-3,5 mg/l ANA şi
0,5 mg/l K – carpomasă violacee; 4,0–5,0 mg/l şi 0,5 mg/l K – carpomasă crem-roză şi 1,0-2,0
mg/l ANA şi 0,5 K – carpomasă crem-albă.
4.1.2. Acţiunea gradientului concentraţiei zaharozei asupra iniţierii şi intensităţii
carpocalusării
Carbonul este elementul chimic absolut necesar creşterii şi menţinerii activităţii vitale a
celulei vegetale. În multiplele experimente biotehnologice, la diferite specii de plante, s-a
menţionat importanţa sursei de carbon şi concentraţia, aplicată, pentru iniţierea şi acumularea
calusală [360]. Concentraţia şi sursa de carbon, utilizată în MN, se reflectă asupra nivelului de
sinteză şi acumulare a metaboliţilor secundari de natură fenolică [228].
Sursa de carbon şi concentraţia zaharozei au impact decisiv în creşterea biomasei şi
acumularea hexozelor la fructele de V. vinifera L. in vitro [254]. Este demonstrată prioritatea
glucidelor atât în diviziunea celulelor şi creşterea masei calusale in vitro, cât şi în sinteza şi
acumularea metaboliţilor secundari [305,318]. Din14 tipuri de glucide, testate pe culturi de
celule in vitro, cele mai asimilabile au fost: zaharoza, glucoza şi fructoza, leger asimilabile
rafinoza şi lactoza [100]. Glucoza şi zaharoza favorizează creşterea celulelor in vitro, dar
acumularea hexozelor [254] şi a CF [305] în celulele calusale este facilitată de prezenţa şi
concentraţia zaharozei. Efectele diferitor doze şi tipul glucidelor aplicate sunt diferite, uneori
contradictorii, dar individuale pentru fiecare specie. Cea mai potrivită sursă de carbon pentru
dividerea celulară, acumularea calusală, biosinteza şi acumularea CF este zaharoza, fapt ce ne-a
determinat să fie experimentată în cazul carpoculturii in vitro la aronie.
S-a studiat reactivitatea morfogenetică a explantelor de diferită natură histogenică
(epicarp, epicarp şi hipodermă, mezocarp şi endocarp),pe MN, cu acelaş fondal hormonal (2,5
mg/l 2,4-D şi 0,5 mg/l K), suplimentate cu diferite concentraţii a gradientului zaharozei: 0,0; 1,0;
2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0%. Observaţiile asupra experimentelor repetate demonstrează că
indiferent de concentraţia zaharozei, administrate în MN, explantele de tip mezocarp şi endocarp
nu calusează, pe când epicarpul şi epicarpul cu hipodermă au realizat un spectru larg al
reactivităţii, în funcţie de gradientul concentraţiei zaharozei (tabelul 4.1).
De menţionat, că intensitatea proliferării corelează cu sporirea gradientului concentraţiei
zaharozei, administrată în MN, dar maximul de calusare şi acumulare a carpomaselor calusale
este în cazul zaharozei cu concentraţia de 6,0%. Intensitatea proliferării explantelor din epicarp şi

89
 Tabelul 4.1. Reactivitatea carpoexplantelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie de
concentraţia zaharozei, adiţionată în mediul nutritiv

Tipul Concentraţia Intensitatea Reactivitatea explantului

explantului zaharozei g/l calusării
Epicarpul 50, 60, 70 + Insuliţe mici, sporadic, apoi necroza.
0 + Proliferare incipientă, apoi necroza.
Epicarpul şi hipodermă

10 + Calus alb, traslucid. Necroză.

20 + Calus verde-gălbui, friabil.
30 ++ Calus verde-crem, acumulare moderată.
40 +++ Calus verde-crem şi acumulare bună.
50 ++++ Proliferare şi acumulare bună.
60 +++++ Calus verde, sănătos, acumulare maximă.
70 ++ Proliferare moderată, calus verde-crem.
Mezocarpul Toate concentraţiile - Colorarea mediului nutritive, necroza.
Endocarpul 0, 10,20, 30, 40 - Nu se induce calusare, necroza.
50, 60, 70 + Insuliţe mici, albe, sporadic, apoi necroza.
epicarp cu hipodermă cedează evident în cazul concentraţiilor mici de zaharoză (1,0 şi 2,0%), iar
absenţa zaharozei induce necroza, fapt menţionat şi în exprienţele axate pe iniţierea calusului din
ovarul florii de Linum usitatissimum [78]. Sporirea concentraţiei zaharozei până la 7%, în MN,
reduce calusarea la aronie până la intensitate moderată. Concentraţia zaharozei în MN are o
acţiune selectivă asupra carpocalusării la aronie. Efecte diferenţiate ale concentraţiei zaharozei
au fost elucidate la cultura in vitro la in [78]: sporirea concentraţiei zaharozei până la 9% -
induce dediferenţierea, până la 12% - reduce dediferenţierea, iar concentraţia de 6-12% este
benefică pentru ginogeneză.
Concentraţia nu influienţează inducerea, dar mărirea concentraţiei zaharozei sporeşte
intensitatea calusării, care corelează cu variantele hormonale ale ambelor grupe hormonale, KD
şi KN (fig. 4.1).
Calusarea % Calusarea %
100
70
90
Zaharoz ă
80 60 6%
70
50
60 Zaharoză
Zaharoz ă
50
6% 40
3%
40 30
30
Zaharoză 20
20
10 3% 10
0
0
1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
Variantele hormonale ale 2,4-D (mg/l )
Variantele hormonale ale ANA (mg/l )

a. b.
Fig. 4.1. Intensitatea carpocalusării în funcţie de concentraţia zaharozei şi variantele grupelor
hormonale ale mediului nutritiv: a. – KD; b. – KN.

90
 În ambele grupe hormonale KD şi KN concentraţia de 6% a zaharozei stimulează
calusogeneza, faţă de cea de 3%. Decalajul este mai accentuat, în cazul grupei hormonale KD, pe
când la grupa hormonală KN, se observă, doar tendinţa de superioritate a acestor indici la
administrarea zaharozei în concentraţie de 6% .
4.2. Criteriile biologice ale expresiei potenţei proliferative a carpoexplantului
Caracteristicile structurale, fiziologice, biochimice ale explantului, destinat inoculării în
culturile in vitro, sunt determinate de vârsta organului şi genomul speciei, care reprezintă
biocondiţii importante pentru asigurarea reuşitei experimentului biotehnologic.
Pe parcursul dezvoltării fructelor in vivo se succed etapele ontomorfogenetice, fiecare cu
anumite caracteristici morfoanatomice, fiziologice şi biochimice specifice genotipului, care se
modifică sub acţiunea factorilor externi. Pericarpul fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
este diferenţiat în zone şi subzone histoanatomice, fiecare cu particularităţile citoanatomice
specifice, care corelează cu etapa ontomorfogenetică [20,27].
Multiplele date ştiinţifice din literatura de domeniu denotă rolul biologic importanat al
vârstei organului-donator de explant, naturii histogenului, dimensiunilor explantului şi poziţiei
lui, în raport cu MN, pentru iniţierea, proliferarea şi acumularea calusului pe medii semisolide in
vitro [12,13,56,57,367,368,206].
4.2.1. Vârsta optimă a fructului donator de explant pentru inoculare
Vârsta optimă a fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot donator de explant, pentru
inocularea in vitro pe MN aseptice, s-a determinat prin experimentare, tatonând histogeni de la
fructe la diferite etape ontomorfogenetice de dezvoltare: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 zile de la
înflorire şi fructe mature (tabelul 4.2).
În rezultatul experimentării repetate s-a observat, că explantele, decupate din fructele
juvenile (10-40 zile), inoculate pe MN, brunifică. Examenul microscopic al explantelor
brunificate prin aplicarea reacţiilor histochimice cu soluţie de 1% Fe2(SO4)3 în HCl de 0,1H, de
1% de clorură fierică şi alăun de fier-amoniu, tetraoxid de osmiu [385], soluţie de acid acetic şi
sare mijlocie de acetat de plumb, soluţie de amoniac, la încălzire [44], demonstrează prezenţa
compuşilor de natură fenolică în diferite compartimente celulare, dar cu precădere, în zona
murală a celulelor cu pereţii celulozici subţiri şi cu localizare în partea periferică a explantului.
Aceasta poate fi interpretată ca reacţie adaptivă şi barieră efectivă de protecţie la acţiunea
condiţiilor stresante in vitro asupra celulelor fine din explantul juvenil de aronie. Sinteza CF din
abundenţă şi prezenţa lor în celulele fructelor juvenile (10-40 zile de la înflorire) suprimă orice
alte activităţi metabolice şi fiziologice de importanţă vitală, inclusiv şi cele de dividere celulară,
explantul necrotizează.

91
 Tabelul 4.2. Reactivitatea carpoexplantelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie
de vârsta organului, histogen şi grupa hormonală, suplimentată mediului nutritiv

Vârsta
fructului- Histogenul - Grupa Capacitatea Intensitatea
donator explant hormonală calusării calusării Observaţii
(zile de la a mediului ( %)
înflorire) nutritiv
10-20 Jumătăţi de BN, BD, KN, 0,0 - Necrotizare.
pericarp KD
30-40 Secţiuni radiare BN, BD, KN, 0,0 - Necrotizare.
ale pericapului KD
50 Epicarp BN 0,0 - Necrotizare.
Epicarp* 8,6 + Insuliţe incolore.
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
Epicarp BD 0,0 - Necrotizare.
Epicarp* 11,0 + Insuliţe mici.
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
Epicarp KD 14,1 ++ Calus incipient,translucid.
Epicarp* 68,8 +++++ Calus verde, viabil.
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
Epicarp KN 11,1 + Calus incipient,translucid.
Epicarp* 49,8 +++ Calus viabil, violaceu.
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
60 Epicarp BN, BD
Epicarp* 0,0 - Necrotizare.
Mezocarp*
Endocarp*
Epicarp KD 13,3 ++ Calus incipient,translucid.
Epicarp* 64,3 ++++ Calus,verde. viabil.
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
Epicarp KN 8,4 + Calus incipient, neviabil.
Epicarp* 38,9 +++ Calus viabil, violaceu
Mezocarp* 0,0 - Necrotizare.
Endocarp* 0,0 - Necrotizare.
70 Epicarp BN, KD, KN
Epicarp* 0,0 - Colorarea mediului în roz,
Mezocarp* necrotizare.
Endocarp*
80 Epicarp BN, KD, KN
Epicarp* 0,0 - Colorarea mediului în roz,
Mezocarp* necrotizare.
Endocarp*
Fructe Epicarp BN, KD, KN
mature Epicarp* 0,0 - Colorarea mediului în roz,
Mezocarp* necrotizare.
Endocarp*

Legendă: epicarp* – epicarp cu hipodermă; mezocarp* – subzona celulelor oval-rotungite

externă; endocarp* – endocarp cu subzona celulelor oval-rotungite internă; intensitatea calusării
– + minimă; ++ – relativă; +++ – moderată; ++++ – bună; +++++ – maximă.

92
 Sinteza fenolilor este o reacţie protectoare a celulei vegetale, manifestată în cazul acţiunii
factorilor excesivi şi pentru speciile, cărora nu le este caracteristică sinteza CF [38,93,374].
Deficienţa nutritivă, acţiunea luminii excesive şi, în deosebi a razelor UV, activează biosinteza
compuşilor fenilpropanici [98], în special al flavonoidelor [126]. Atacul infecţiilor patogene, de
diferită natură declanşează sinteza şi acumularea sporită a fenolilor [89,126,304]. În condiţii de
stres această reacţie de sinteză şi acumulare a CF se accentuează, în deosebi în celulele,
specializate în sinteza lor, cum sunt la fructele de aronie, care servesc în calitate de donator de
explant. Explantul din fructul juvenil (10-40 zile), inoculat pe MN, sintetizează în celule cantităţi
sporite de CF, o reacţie promtă la condiţiile stresante ale culturii in vitro. Studiul ultrastructural
al calusului demonstrează prezenţa incluziunilor fenolice în zonele murală şi paramurală,
constituind o barieră de protecţie. Prin citoreacţii s-a demonstrat [93] că activitatea sporită a
enzimelor, implicate în biosinteza CF se înregistrează în intervalul 4-48 ore după inoculare, ce
denotă reactivitatea imediată a celulelor la in vitro. Rezultatele obţinute la celulele carpogene de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot confirmă datele pe culturi celulare de V. vinifera [158] la, care
enzima-chee, implicată în biosinteza antocianilor se activează la debutul fazei lag a calusogenei.
Necrotizarea explantelor, determinată de sinteza în exces a CF, este un fenomen întâlnit
în practica biotehnologică vegetală [375]. Pentru evitarea necrozei se solicită un procedeu
suplimentar, administrarea pulberii de cărbune activ în MN [52,168] cu capacitate de absorbţie şi
reţinere a unor fenoli simpli şi taninuri, astfel, facilitând evacuarea excesului de CF din celulele
explantului inoculat. La administrarea pulberii de cărbune activ în MN, progrese evidente nu s-a
înregistrat, doar frânarea necrozei cu 2 zile apoi declanşarea bruscă, finalizată în necroză totală.
Explantele, prelevate de la fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot la etapele 50-60
zile, inoculate pe aceleaşi MN, au demonstrat calităţi proliferative, care se deosebesc net de cele
ale etapelor premărgătoare (10-40 zile) şi ale etapelor ulterioare (70-80 zile şi fructe mature).
Explantele au înregistrat valorile maxime ale capacităţii de calusare - 68,8% şi a intensităţii
calusării la etapa de 50 zile de la înflorire şi, respectiv, valorile de 64,3% a capacităţii de calusare
şi intensitatea calusării bună, la cea de 60 zile pe MN cu grupa hormonală KD. Pe MN cu grupa
hormonală KN, adiţionată MN, explantele de la fructele de 50 şi 60 zile au demonstrat valori
maxime ale capacităţii şi intensităţii de calusare, în raport cu cele de la etapele premărgătoare
(10-40 zile) şi ulterioare (70, 80 zile, fructe mature), dar cu un prag mai mic faţă de variantele
analoge ale MN cu grupa hormonală KD. În cazul inoculării explantelor, de la vârsta de 70-80
zile şi fructe mature, a fost marcată o altă consecinţă, cu impact negativ, asupra capacităţii de
proliferare şi a intensităţii calusogenezei. MN a devenit de culoare roză ca rezultat al evacuării
conţinutului antocianic vacuolar în exterior, iar explantele au avut soartă celor juvenile, necroza,

93
dar în acest caz motivată de pierderea integrităţii structurale ale celulelor. La aceste etape
celulele sunt extinse, au dimensiuni mari (80 – 100 µm), cu vacole mari, care prevalează spaţial
asupra citoplasmei, redusă doar la o făşie îngustă [20]. La decuparea histogenului din pericarp, o
mare parte din celule pierd intergritatea, are loc deteriorarea organitelor şi, în primul rând al
vacuolelor mari. Astfel, atât vacuolele celulelor deterioare, cât şi ale celor intacte, la inoculare,
sub acţiunea diferitori factori implicaţi în acest procedeu, expulzează conţinutul, colorând MN,
iar celulele, pierzând integritatea, necrotizează.
Studiul efectuat la carpocultura in vitro de aronie şi rezultatele obţinute la alte specii din:
ovarul gineceului [122], pericarpul juvenil [56,202,206], fructul matur [125] şi senescent, după o
perioadă de păstrare [185], demonstrează că fiecare specie, dar, în deosebi, cele ce dezvoltă
fructe suculente, necesită tatonatări individuale, ţinând cont de specificul zonalităţii
histoanatomice şi specializarea metabolică.
Vârsta organului-donator de explant reprezintă un factor decisiv în reuşita experimentelor
biotehnologice vegetale. Este necesar ca explantul, decupat de la organul-donator, să se
caracterizeze printr-un anumit echilibru al proceselor biosintetice şi al caracteristicilor
ultrastructurale şi morfologice, care corelează cu etapa de dezvoltare a acestuia [27,80,368].
Explantele fructelor juvenile (10-40 zile) manifestă rapid şi pronunţat reacţia de apărare,
exprimată prin biosinteza excesivă a CF, ce duce la necroza rapidă, iar explantele din fructele de
la etapele 70, 80 zile şi maturare deplină, caracterizate prin celule mari, vacuolizate, cu procent
sporit de deteriorare al integrităţii celulare şi tisulare, au capacitate redusă de manifestare a
potenţialului proliferativ.
La etapele 50 şi 60 zile de la înflorire, celulele pericarpului de A. melanocarpa (Michx.)
Elliot se caracterizează printr-un coraport echiblibrat structural-biosintetic, exprimat prin
stabilirea organizării ultramicroscopice ale clulelor [10,22,82,83]. Parametri structurali şi
biochimici sunt într-un echilibru biologic, ce asigură viabilitatea celulelor explantului în condiţii
in vitro şi dezvăluirea potenţei proliferative. Volumul parţial al vacuolelor nu prevalează asupra
celui citoplasmatic şi reprezintă un coraport benefic pentru asigurarea rezistenţei în condiţiile de
stres şi manifestarea potenţialului de dividere celulară în iniţierea calusării şi acumularea
ulterioară a carpomasei [21]. Aici se referă şi rezerva trofică imobilizantă sub formă de granule
amilacee, prezentă în celulele explantului la etapa de 50-60 zile de la înflorire, care este utilizată
în cazul dediferenţierii incipiente, nefolosind substanţele nutritive din MN [22], fapt remarcat şi
la fructele de tomate [56].

94
4.2.2. Originea histogenică, dimensiunile şi poziţia explantului în raport cu mediul nutritiv
Pentru asigurarea succesului experimentului biotehnologic în culturi tisulare vegetale in
vitro este necesară determinarea histogenului-optim, prelevat în calitate de explant, din organul
donator. Aceasta reprezintă o condiţie obligatorie, în deosebi, în cazul antrenării fructelor
succulente, de tip pommum în calitate de organ-donator de explant pentru culturi in vitro, cu
anumite caracteristici structural-metabolice [148,281,320]. Reeşind din specificul structurii
histoanatomice a pericarpului de aronie [23,27], pentru inoculări in vitro s-au testat următorii
histogeni: epicarpul; epicarpul* (epicarpul cu hipoderma); mezocarpul (subzona celulelor oval-
rotungite externă) şi endocarpul* (endocarpul cu subzona internă a celulelor oval-rotungite) în
funcţie de etapa ontomorfogenetică.
Fructele de aronie, la etapele 10 şi 20 zile de la înflorire, sunt de dimensiuni mici şi s-au
utilizat jumătăţi, secţionate prin axa longitudinală, care s-au aplicat cu incizia în contact cu MN.
La următoarele 2 etape (30 şi 40 zile), graţie extensiei celulelor, s-au mărit dimensiunile fructelor
şi s-au decupat porţiuni radiale, care includ toate zonele histologice ale pericarpului. Explantele
la aceste etape ontomorfogenetice de dezvoltare, inoculate pe MN, n-au generat calus.
La etapele timpurii (50, 60, 70, 80 zile) s-au decupat explantele pe histogeni: epicarp,
epicarp*, mezocarp* şi endocarp* de dimensiuni egale (4x5 mm). Reacţia morfogenetică a
acestor explante, inoculate in vitro a fost foarte diferită în funcţie de originea histogenului,
orientarea faţă de MN şi grupa hormonală a MN (tabelul 4.2). Reactivitatea epicarpului şi
epicarpului* în calitate de explant la vârsta fructelor de 50-60 zile se deosebeşte de ceilalaţi
histogeni. Epicarpul manifestă capacitate de calusare la 14,1% (la 50 zile) şi 13,3% (la 60 zile)
din specimene pe MN cu grupa hormonală KD cu o intensitate de calusare relativă, şi 11,1% şi
8,4% din specimene pe cele cu grupa KN, cu o intersitate minimă a calusării, inducând un calus
alb şi translucid cu viabilitate redusă, doar în cazul inoculării explantului cu partea internă în
contact cu MN. La inocularea explantului, cu partea periferică în contact cu MN, s-au observat
iniţieri sporadice a calusării, doar pe inciziile marginal-laterale. Pe MN cu grupele hormonale
adiţionate BN şi BD, epicarpul n-a indus calusare.
Expresia potenţialului de proliferare a explantelor de tip epicarp*, la aceste două etape se
deosebeşte net de ceilalţi histogeni. La etapa de 50 zile de la înflorire, s-a observat inducerea
calusului pe toate grupele hormonale ale MN, dar cu capacitate şi intensitate de calusare diferite:
pe BN, 8,6%, BD, 11,0% de inoculi manifestă capacitate de calusare cu o intensitate minimă; pe
KD, 68,8%, cu intensitate de calusare maximă şi pe KN, 49,8%, cu intensitate moderată.
Epicarpul*, la etapa de 60 zile, induce calusare la 64,3% din inoculi cu o intensitate bună
a calusării pe MN cu grupa KD, şi la 38,9% din inoculi cu o intensitate relativă pe KN, dar la

95
ambele grupe hormonale, cu un prag al intensităţii calusării mai redus, în raport cu etapa de 50
zile, doar în cazul inoculării cu partea internă în contact cu MN. Pe MN cu grupele hormonale
BD şi BN inducerea calusării nu s-a inregistrat. Mezocarpul* şi endocarpul*, indiferent, de
poziţia explantului în raport cu MN n-a manifestat capacitate de inducere a calusului.
Toţi histogenii (epicarp, epicarp*, mezocarp*, endocarp*), utilizaţi în calitate de explant
pentru inoculare la etapele 70, 80 zile de la înflorire şi maturare deplină a fructelor, pe MN cu
diferite grupe hormonale, indiferent de poziţia lor faţă de MN n-au manifestat proliferare,
necrotizând. Explantul, reprezentat de epicarp, are o capacitate de calusare redusă şi o intesitate
de calusare minimă, doar la etapa de 50 zile de la înflorire, iar calusul a generat sub forma unor
insuliţe de celule sporadice, translucide, neviabile. Epicarpul fructelor în calitate de zonă
histogenică, are menirea de apărare [20,27], iar în rezultatul activităţii metabolice a
protoplastului celulele epidermale formează cuticula şi formţiunile cerifere. Reeşind din
particularităţile structural-fiziologice specifice ale acestui histogen, celulele acestuia, în
condiţiile in vitro au o capacitate mai redusă de proliferare.
Specificul zonalităţii histoanatomice a carpotipului pommum la aronie corelează cu etapa
ontomorfogenetică [27], reprezintă un factor decisiv în inducerea culturii in vitro şi serveşte în
calitate de reper în selectarea histogenului optim pentru inoculare. Reacţia morfogenetică a
histogenilor (epicarpul, epicarpul cu hipoderma, mezocarpul şi endocarpul cu subzona celulelor
oval-rotungite internă) a fost diferită în funcţie de orientarea explantului faţă de MN şi grupa
hormonală a MN. Epicarpul manifestă capacitate de calusare, inducând un calus incipient, cu
viabilitate redusă, doar la inocularea cu partea internă în contact cu MN. La amplasarea cu partea
externă s-au observat iniţieri sporadice a calusării pe inciziile marginal-laterale, deoarece
cuticula groasă, pubescenţa, ceara, constituie o barieră mecanică şi nu permite extruzia calusului.
Epicarpul, ca zonă histogenică, are menirea de protecţie, dobândită evolutiv, graţie formării
cuticulei şi cerei ca rezultat al activităţii metabolice a protoplastului şi în condiţiile in vitro
manifestă capacitate proliferativă redusă.
Epicarpul cu hipoderma dezvăluie potenţial proliferativ maxim, iar intensitatea calusării
corelează cu grupa hormonală a MN, KD, mai favorabilă, în raport KN. În ambele cazuri, poziţia
hipodermei în contact cu MN favorizează acumularea carpomasei, graţie caracteristicilor
citoanatomice ale histogenilor constituienţi, fiecare cu rolul lui. Epicarpul asigură viabilitatea
prin îndeplinirea firească a funcţiei de apărare, protejând celulele hipodermei de impactul negativ
a procesului de pregătire pentru inoculare şi acţiunea condiţiilor in vitro. Hipoderma, din celule
mici, compact împachetate, vacuom moderat, nu reprezintă impedimente ale viabilităţii şi
integrităţii celulare în condiţii in vitro, iar rezerva trofică asigură iniţierea proliferării. Se atestă

96
calusare pe inciziile internă şi laterale a hipodermei, dar înaintarea calusării spre interior,
întâmpină rezistenţa mecanică a MN, astfel proliferarea, pe inciziile laterale, prevalează,
favorizând acumularea pe orizontală. Aceste 2 părţi constituiente (epicarpul cu hipoderma), prin
îmbinarea complimentară a funcţiilor şi particularităţilor structurale, determină viabilitatea şi
dezvăluirea maximă a capacităţii proliferative şi intensităţii de calusare. Mezocarpul, din celule
mari, vacuolizate, pierde integritatea la decupare, iar endocarpul cu subzona internă a celulelor
oval-rotungite, fiind din celule sclerificate cu pereţii denşi şi groşi, nu proliferează.
O altă condiţie, importantă pentru expresia potenţei carpocalusogene reprezintă rezerva
de materii nutritive, sub formă de granule de amidon, care serveşte ca sursă de energie pentru
necesităţile metabolice la etapa incipientă, până la implicarea glucidelor din MN, sau a celor
elaborate în procesul fotosintezei, diminuat, în noile condiţii stresante, provocat de tehnicile
inoculării in vitro, fapt similar şi la carpocalusogeneza la tomate [56].
Endocarpul cu subzona celulelor oval-rotungite internă, deşi se caracterizează prin celule
relativ mici şi puţin vacuolizate, nu calusează, probabil, din cauza prezenţei multor celule cu
pereţii sclerificaţi în această subzona, caracterizate cu protoplast redus şi pereţii celulari
îngroşaţi, ce şi determină incapacitatea de proliferare.
În baza experienţelor biotehnologice, efectuate pe fructele de A. melanocarpa (Michx.)
Elliot [12,13,15,16,29] şi din datele bibliografice de domeniu, se observă absenţa unificării
histogenului prelevat din fructe pentru generarea calusului. Antrenarea explantelor de diferită
natură histogenică la fructe, la diferite specii, cum ar fi: mezocarpul şi zona histologică-albedo
cu pungile suculente de C. limon [104,173], mezocarpul [185] şi toţi histogenii de Malus
domestica [253], epicarpul de Persea americana [270 şi de Actinidia deliciosa [74], mezocarpul
de Olea europaea [182], pericarpul integru la g. Ligusticum [67], Solanum xanthocarpum [147]
şi la fructele juvenile de vişin (40 zile după înflorire) [73], mezocarpul de Gardenia jasminoides
[230], pericarpul, placenta şi pedicelul la diferite varietăţi de C. annuum [289], mezocarpul
diferitor taxoni a g. Lycopersicon [56], mezocarpul de C. annuum [55] şi Cucurbita pepo [206]
denotă evident, că originea histogenului şi poziţia lui, în raport cu substratul nutritiv, reprezintă
indici biologici importanţi în expresia potenţialului calusogen şi a acumulării carpomasei şi
necesită tatonări individuale.
Manifestarea potenţialului proliferativ al explantului are un caracter individual
histospecific, organospecific şi taxonospecific, în concordanţă cu etapa ontogenetică de
dezvoltare a organului-donator de explant şi grupa homonală, adiţionată MN. Caracteristicile
citofiziologice ale celulelor explantului: dimensiunile celulelor, gradul de vacuolizare, coraportul
citoplasmă/vacuole, grosimea pereţilor celulari, gradul de cutinizare şi cerificare a epidermei,

97
forma celulelor, gradul de împachetare şi vitalitate al celulelor în histogenul inoculat, rezerva
nutritivă imobilizată şi altele sunt decisive în expresia potenţialului proliferativ.
Histogenul optim al fructului de aronie capabil să genereze calus în condiţii in vitro este
epicarpul cu hipoderma, de dimensiuni 4x5 mm, la vârsta fructului 50-60 zile de la înflorire.
Suprafaţa externă a epicarpului şi a endocarpului posedă structuri dure de protecţie, ce nu permit
extruzia celulelor proliferative, iar suprafeţele inciziilor mezocarpului sunt deteriorate din cauza
dimensiunilor mari ale celulelor vacuolizate.
4.3. Acţiunea regimului de lumină asupra calusogenezei
Lumina reprezintă un factor extern esenţial în dezvoltarea morfo-funcţională normală a
celulelor vegetale in vivo şi cu impact decisiv în metabolismul fenolic [197]. Lumina stimulează
biosinteza flavonoidelor, în special, a antocianilor, flavonelor prin inducerea şi activarea
sensibilităţii enzimei fenilalaninamonialiaza [98,197], implicată în biosinteza fenolilor. CF
sintetizaţi servesc pentru atenuarea acţiunii excesive a luminii asupra celulelor fotosintetizătoare
[223]. Multiple investigaţii demonstrează existenţa unei corelaţii dintre calitatea şi cantitatea
luminii şi conţinutul CF [248], în deosebi, al antocianilor [180,241]. Conţinutul antocianic al
diferitor fructe diferă de la an la an, fiind în corelaţie cu nivelul radiaţiei şi numărul orelor de
lumină pe parcursul perioadei de vegetaţie [373]. Este elucidat rolul luminii, ca factor extern, în
dezvoltarea culturilor in vitro [147,197,198,352,365]. Fotocontrolul este absolut necesar în
dirijarea sintezei şi acumulării antocianilor, atât în organele plantelor in vivo, cât şi în culturile
tisulare şi celulare in vitro [241].
În experimentele pe culturi in vitro la fructele de aronie s-au studiat efectele acţiunii
luminii cu următoarele variante: fotoperiodism natural (zi/noapte 16/8 ore), în calitate de martor;
iluminare continue cu intensitatea de 1700 lucşi; obscuritate în primele 7 zile, urmată de
fotoperiodism natural (zi/noapte 16/8 ore); obscuritate deplină; lumina roşie; lumina UV.
Variantele regimului de lumină au fost aplicate pe carpoculturi in vitro la A. melanocarpa
(Michx.) Elliot, crescute pe MN cu 2 grupe hormonale KD şi KN. Efectele acţiunii diferitor
variante ale luminii s-au analizat pe baza următorilor indici: termenul de inducere a calusării;
intensitatea calusării, apreciată prin câteva praguri (+ - minimă; ++ - relativă; +++ - moderată;
++++ - bună; +++++ - maximă); aspectul morfologic şi viabilitatea carpomasei (tabelul A.3.3).
• Explantele expuse fotoperiodismului natural zi/noapte (16/8 ore) au iniţiat calusarea la a
6-a zi după înoculare pe MN cu grupele hormonale (KD şi KN). Pe MN, suplimentate cu doze
de 2,4-D, intensitatea calusării a fost bună, iar calusul generat de culoare verde, compact.
Explantele inoculate pe MN, suplimentate cu doze de ANA, au manifestat o intensitate a
calusogenezei moderată, calusul marginal, fiind de culoare cremă, iar în zona centrală –

98
violacee, cu insuliţe de culoare verde. Carpomasele, obţinute în acest regim, indiferent de
formula hormonală adiţionată MN, au fost viabile, cu aspect lucios.
• Iluminarea continuă cu intensitatea de 1700 lx a indus calusare cu o zi mai devreme, în
raport cu regimul fotoperiodismului natural (martorul). De menţionat, că pentru ambele grupe
hormonale ale MN, intensitatea calusării se reduce cu un nivel, faţă de varianta regimului
martor. Puţin se schimbă şi cromatica carpomaselor generate, în ambele cazuri nutriţionale
sporesc sectoarele de culoare cremă, aspectul este mat, iar marginile friabile.
• Obscuritate pe termen de 7 zile, urmată de fotoperiodism natural şi obscuritate pe
toată perioada calusogenezei au avut aceiaşi influenţă asupra iniţierii – la a 6-a zi, dar
intensitatea calusării şi aspectul carpomaselor diferă faţă de varianta fotoperiodismului natural.
În cazul expunerii culturilor in vitro, după 7 zile de obscuritate, fotoperiodismului
natural intensitatea calusării şi aspectul morfologic al carpomaselor corelează cu grupa
hormonală, adiţionată MN, calusare minimă şi carpomasă de culoare cremă, cu mici insuliţe
roze, aspect mat, friabil pentru grupa KN şi calusare bună şi carpomasă iniţial crem-gri, care
odată cu expunerea la fotoperiodismul natural, capătă o culoare verde cu luciu şi doar marginile
rămân friabile, mate pe MN cu grupa KD. În varianta cu obscuritate deplină pe toată perioada
calusogenezei, calusarea se induce la a 6-a zi şi frânează la cea de a 10-a zi, indiferent de grupa
hormonală, iar carpomasele, generate sunt alb-translucide, neviabile şi brunifică, cu un efect
mai accelerat şi pronunţat, pe MN cu grupa hormonală KN, decât pe cea KD.
• Lumina roşie manifestă efect inhibator asupra iniţierii calusării în raport cu fotoperiodismul
natural şi regimul de obscuritate şi corelează cu grupa hormonală. adiţionată MN: pentru KD – la
a 7-a zi, iar pentru KN – la a 8-a zi. În variantele regimului de lumină, analizate mai sus, au fost
diferenţe ale valorilor intensităţii calusogenezei, în funcţie de grupa hormonală a MN, dar în
cazul luminii roşii, aceste valori se echivalează. Astfel, intensitatea calusării se reduce cu un
nivel pe MN KD şi rămâne aceeiaş, pe cele KN, în raport cu fotoperiodismul natural.
Carpomasele, generate sub influenţa luminii roşii, se deosebesc după caracteristicile
morfologice, faţă de martor. Pe MN cu grupa hormonală KD aria de extindere a calusului este
mai restrânsă, culoarea verde diminiează, iar crem-gri, predomină. Aspectul morfologic al
carpomasei este spongios şi friabil. Carpomasa, obţinută pe MN a grupei hormonale KN, este
mai voluminoasă, cu extindere pe orizontală şi verticală, iar pigmentaţia violacee mai intensă şi
mai uniformă.
• Razele ultraviolete au avut o altă influenţă, în raport cu martorul şi cu celelalte variante ale
regimului de lumină, antrenate în experiment. S-a observat efectul stimulator al razelor UV

99
asupra iniţierii calusării, cu 3-4 zile mai devreme, în raport cu lumina roşie, cu 2 zile - în raport
cu variantele de obscuritate şi cu o zi - în raport cu iluminarea continuă. Efectul stimulator al
razelor UV asupra intensităţii calusării, pe MN a grupei KD, a condus la acumularea maximă a
carpomasei de culoare verde intens, viabilă, cu luciu. Pentru carpomasa, generată pe MN cu
grupa KN, intensitatea calusării este moderată, cu două nivele mai redusă, decât pe KD, la acelaş
nivel, pe MN analog, dar expuse fotoperiodismului natural şi cu un nivel mai redus, în cazul
obscurităţii. Carpomasa este friabilă, aspect mat, de culoare, preponderent, violacee.
Regimul de lumină influenţează asupra termenului de inducere şi intensităţii calusării.
Razele UV au manifestat o influenţă stimulatoare asupra inducerii carpocalusului la A.
melanocarpa (Michx.) Elliot, rezultate, care confirmă datele ştiinţifice, pe carpoculturi la alte
specii [123,352,354]. Ele au avut un efect benefic şi asupra intensităţii calusogenezei în cazul
grupei hormonale KD a MN. Este demonstrat rolul pozitiv al razelor UV asupra diviziunii şi
metabolizării celulare la calusul de Camelia sinensis [352]. A fost stabilit rolul stimulator al
2,4-D pentru inducerea calusării [218,234,353,374], iar în altele [253,373] rolul benefic al 2,4-
D în acumularea biomasei calusale. Este cunoscut, că orice iradiere stimulează biosinteza
hidraţilor de carbon [123]. În cazul carpomasei de aronie s-au utilizat factori exogeni (razele
UV şi suplimentarea MN cu doze de 2,4-D) cu efect stimulator, care au şi favorizat atât
inducerea, cât şi acumularea carpomasei viabile de culoare verde.
Efectul benefic la inducerea rapidă a carpocalusului sub influenţa razelor UV, a fost
înregistrat şi pe MN a grupei KN, ce demonstrează că, indiferent de tipul hormonilor adiţionaţi,
razele UV stimulează inducerea calusării, iar evoluarea morfologică a carpomaselor pe MN cu
grupa KN a fost alta. Intensitatea calusării diminuează şi conduce la reducerea acumulării
carpomasei, iar culoarea violacee intensă demonstrează că, are loc biosinteza activă a
antocianilor. Datele obţinute susţin rezultatele, relatate pe culturi tisulare in vitro [241,365,374].
Lumina roşie are efect contrar razelor UV asupra intensităţii calusării, frânează
inducerea calusării pe MN la ambele grupe hormonale şi are efect benefic asupra biosintezei CF
pe MN cu grupa KN, date similare întâlnim în alte lucrări [218]. Conform datelor obţinute,
lumina roşie şi hormonul auxinic ANA, administrat în MN, sunt factorii care facilitează
biosinteza antocianilor şi o intensitate moderată a calusării la carpocultura de aronie.
Variantele cu obscuritate denotă, că lumina nu este un factor decisiv în inducerea
calusării. Aceasta este explicabil, deoarece procesele incipiente de diviziune celulară se
realizează, graţie rezervei trofice proprii a celulelor inoculului [21,22,56,82,206] şi a
caracteristicilor histoanatomice ale celulelor histogenilor, care au fost echivalente pentru toate
variantele. Necroza carpomaselor demonstrează, că pentru metabolizarea celulară şi dezvoltarea

100
unui calus sănătos nu sunt suficiente substanţele nutritive din MN, dar este absolut necesară
lumina pentru a fotosintetiza.
Inducerea şi acumularea carpomasei cu o intensitate moderată (MN cu grupa hormonală
KN) şi bună (MN cu grupa KD) în regim de fotoperiodism natural, demonstrează odată în plus,
că, deşi histogenii au fost decupaţi din organul plantei, dezvoltarea celulară se desfăşoară
conform anumitor bioritmuri, stabilite de-a lungul evoluţiei. Este demonstrat, că calusurile
statice, dezvoltate pe MN semisolide în prezenţa luminii naturale, sunt cele mai sănătoase şi
mai viabile [147]. Iluminarea continuă nu stimulează procesele proliferative.
Aplicarea variantei obscurităţii demonstrează, că lumina nu este necesară pentru inducrea
carpocalusului. Indiferent, obscuritate sau diferite regimuri de lumină, explantele iniţiază
calusare, însă lumina este un factor absolut necesar pentru calusogeneza ulterioară, rezultate
similare iniţierii calusului frutier din soiuri de tomate [57]. Transferul carpoculturilor, de la
obscuritate deplină timp de 7 zile, la regim cu fotoperiodism natural, favorizează dezvoltarea
carpomaselor pe MN, suplimentate cu 2,4D şi K, dar cu unele reţineri, faţă de cele crescute pe
MN cu formulă hormonală echivalentă, dar expuse iniţial fotoperiodismului natural şi stagnează
procesele proliferative pe MN ale ambelor grupe hormonale (KD şi KN), în raport cu celelalte
variante ale regimului de lumină. O reţinere a iniţierii calusării este şi în cazul acţiunii luminii
roşii cu grupa hormonală KN, dar, ulterior, stimulează intensitatea calusării, ajungând să fie
echivalentă cu valorile variantei fotoperiodismului natural, pe aceeaşi grupă hormonală a MN.
În toate regimurile de lumină, explantele pe MN a grupei KD iniţiează mai rapid
calusarea, cu o intensitate a calusării mai mare, faţă de grupa KN. S-a demonstrat că prezenţa
luminii nu este obligatorie pentru inducerea calusării, dar calitatea luminii influenţează
intesitatea şi termenul de inducere (lumina roşie frânează, cea UV sporeşte cu 2-3 zile în raport
cu martorul), dar rămâne a fi decisivă în evoluţia ulterioară a carpomaselor. Fotoperiodismul
natural este benefic pentru iniţierea şi acumularea carpomasei verde pe MN cu KD, doar pentru
iniţierea calusării pe KN, dar lumina roşie facilitează intensitatea calusării şi acumularea
carpomasei violacee pe MN cu KN.
4.4. Perioada calusogenezei şi dinamica acumulării carpomasei
În literatura de specialitate perioada de calusogeneză este divizată în faze de durată
diferită [50,371,375]. Valorile duratei perioadei de calusogeneză şi a fazelor componente
corelează cu specificul ţesutului şi apartenenţa sistematică a speciei antrenate în culturi in vitro.
Prin experimentare s-a urmărit scopul de a determina durata perioadei de calusogeneză şi a
fazelor constituiente a carpoculturii tisulare in vitro la fructele de aronie [16-18,80,81].

101
 Perioada de calusogeneză la aronie se extinde pe parcursul a 40 zile, divizată în 4 faze
succesive: lag (latenţă), logaritmică de creştere (exponenţială), staţionară şi senescenţă (fig.
4.2), în care se înscrie o anumită dinamică a acumulării carpomasei (fig. 4.3). Carpomasa are
anumite caracteristici, determinate de procesele cito-biosintetice, care corelează cu faza
calusogenezei [24,80]. În faza lag, cu durata de 4-5 zile, în celulele explantului inoculat au loc
procese de adaptare şi pregătire pentru iniţierea proliferării. În faza logaritmică (a 6-a – a 17-a
zi), iniţiată la sfârşitul fazei lag, derulează intens procesele de dividere celulară, ce rezultă în
mărirea numărului de celule în prima jumătate a fazei. În a doua jumătate a fazei au loc,
concomitent, diminuarea diviziunii celulare şi sporirea extinderii dimensiunilor celulelor. Până la
mijlocul fazei prevalează culoarea verde în toate carpomasele, iar în a doua jumătate apar
diferenţe în pigmentaţie în corelaţie cu grupa hormonală: pe KD, culoarea verde, iar pe KN,
crem-violacee, ce denotă biosinteza metaboliţilor secundari, în special a antocianlor. În faza
staţionară (a 18-a – a 34-a zi) valorile cantitative sporesc uşor, graţie extensiei celulare, care
continuă lent la începutul fazei şi acumulărilor substanţelor de rezervă şi CF [16,17].
g/flacon
120
8
2,4-D
100 7
masa calusala, %

80 6 ANA

5
60
4
40
3

20 2

1
0
0 5 10 15 18 20 25 30 35 40 41 42 43 44 45 0
g
La

zile

Fig. 4.2. Durata perioadei de calusogeneză Fig. 4.3. Acumularea carpomasei în funcţie
la carpocultura tisulară in vitro de A. de fazele perioadei de calusogeneză şi
melanocarpa (Michx.) Elliot. grupele hormonale ale MN.

La sfârşitul acestei faze se administrează acumularea maximă de carpomasă.

Suplimentarea MN cu 2,4-D (2,0-3,0 mg/l) şi K (0,5 mg/l) are un efect benefic asupra proceselor
de diviziune şi creştere celulară, înregistrând maximul de acumulare a biomasei de la 5,783 până
la 6,621 g/flacon. Dozele reduse de 2,4-D (1,0 şi 1,5 mg/l) nu favorizează diviziunea celulară,
biomasa acumulată fiind minimă, respectiv 1,699 şi 2,781 g/flacon. Toate dozele de ANA (2,0,
2,5, 3,0, 3,5 mg/l), adiţionate MN de bază, induc aceiaş influenţă, determinând o acumulare a
carpomasei aproape echivalentă, corespunzător: 3,201, 3,703, 3,801 şi 3,791 g/flacon. Este
evidentă influenţa benefică a 2,4-D cu dozele 2,0-3,0 mg/l, faţă de ANA, cu dozele 2,0-3,5 mg/l,
în acumularea carpomasei. Prezenţa acidului 2,4-D în MN, grăbeşte începerea acestei faze şi
asigură prelungirea ei cu 1-2 zile, faţă de ANA. Maximul de acumulare a carpomaselor revine

102
fazei staţionare pentru ambele grupe hormonale, dar pentru grupa KD valorile sunt superioare,
decât pentru KN (fig.4.3).
Faza senescentă începe cu a 35-a zi, marcată prin schimbarea aspectului carpomaselor,
care e mai intensă pe MN cu grupa KN, în raport cu KD, devin mate şi friabile, de la zonele
periferice spre centrale, iar celulele pierd viabilitatea. Se atestă o pierdere uşoară în masă,
deteminată de deshidratarea celulelor calusale.
Regimul de lumină, balanţa hormonală a MN pot frâna sau stimula transformările
structurale şi biosintetice ale fazelor, modificând doar coraportul duratei, dar succesiunea se
menţine. Ciclul carpocalusogenezei la aronie este caracterizat prin fluctuaţia succesivă a celor 4
faze, fiecare cu specificări structural-biosintetice, ce servesc ca reper la subcultivarea
carpomaselor pe MN proaspete pentru asigurarea continuităţii şi viabilităţii.
4.5. Frecvenţa şi condiţiile subcultivărilor
Multiplicarea celulelor explantului, inoculat pe MN adecvate, în condiţii in vitro,
aseptice, conduce la formarea calusului primar static, în rezultatul dediferenţierii şi proliferării.
Celulele calusale formate au ciclul ontogenetic propriu de dezvoltare, care include şi prevede
succesiunea ulterioară consecventă a proceselor de extindere, maturare, senescenţă şi moarte.
Pentru evitarea proceselor de îmbătrânire şi moarte a celulelor, este necesară subcultivarea
calusului pe MN proaspete, la etapele timpurii de dezvoltare (extindere şi maturare), ca rezultat
generează calusul secundar. În cazul coraportului echilibrat dintre auxinele şi citokininele
administrate în MN, calusul poate fi menţinut pe perioade îndelungate (chiar nelimitate), graţie
păstrării capacităţii celulelor de a se divide, prin pasaje periodice reglate, pe MN proaspete.
Pentru indentificarea formulelor hormonale, suplimentate MN, care să determine o
proliferare mai activă a celulelor şi o acumulare mai bună a carpomasei la subcultivarea
calusului primar pe MN proaspete, s-au utilizat două procedee: 1) transferarea calusului primar
pe MN identice, privind formula hormonală, celor, pe care s-a iniţiat calusul primar; 2)
transferarea calusului primar pe MN noi, privind formula hormonală (tabelul A.3.4.).
Calusul primar, format pe MN, suplimentate cu doze de 2,4-D, transferat pe MN identice,
începând cu al doilea pasaj, se caracterizează prin creşterea intensităţii calusării, în corelaţie cu
doza administrată: de la minimă (+) - la relativă (++), la 1mg/l; de la relativă (++) - la moderată
(+++), cu 1,5 mg/l; de la moderată (+++) - la bună (++++), cu 2,0 mg/l; de la bună (++++) - la
maximă (+++++), cu 2,5 mg/l; de la moderată (+++) - la bună, cu 3,0 mg/l. În toate variantele
hormonale intensitatea calusării creşte cu un nivel odată cu subcultivarea. În cazul administrării
hormonului 2,4-D în doze de 2,0 mg/l, 2,5 mg/l şi 3,0 mg/l, intensitatea calusării după al doilea
sau al treilea pasaj, se menţine pe parcursul a mai mult de 10 subcultivări. Calusurile multiplicate

103
sunt viabile, viguroase, cu luciu, în care prevalează culoarea verde. Dozele mici (1,0-1,5 mg/l) şi
mari (3,5-4,0 mg/l) de 2,4-D, după al 3-lea ori al 4-lea pasaj, diminuează intensitatea calusării
treptat până la minim. Carpocalusurile de pe aceste MN, se caracterizează prin aspect friabil,
sectoarele de culoare verde-deschis alternează cu sectoarele crem-albe. Odată cu creşterea
numărului de pasaje, sectoarele crem-albe predomină, faţă de verde. Transferul repetat al
calusului pe MN identice conduce la menţinerea aspectului morfologic şi culorii respective, iar
intensitatea proliferării poate fi în ascensiune sau în descreştere, în funcţie de doza administrată.
Majoritatea calusurilor primare, obţinute pe MN, suplimentate cu doze de ANA,
transferate pe MN identice au avut, la fel, o sporire a intensităţii calusării, dar mai mică, decât pe
MN cu doze de 2,4-D. Excepţie, carpocalusurile primare, obţinute şi subcultivate pe MN cu doze
minime de ANA(1,0 mg/l), unde intensitatea proliferării, odată cu creşterea numărului de pasaje,
a rămas constantă şi calusurile primare, crescute şi subcultivate pe MN cu doze maxime (3,5 –
4,5 mg/l) de ANA, unde intensitatea calusării a fost într-o descreştere lentă până la minim (+).
Situaţia a fost alta, în cazul transferului calusului primar pe MN cu alte formule
hormonale. Calusurile de pe pe MN cu doze mici (1,0-1,5 mg/l) de 2,4-D, pasate pe MN cu doze
mai mari (2,0 – 2,5 mg/l) au avut o sporire a intesităţii calusării, de la minimă şi relativă, până la
bună şi maximă (tabelul A.3.4). Transferul calusurilor de pe MN cu doze de 2,0 şi 2,5 mg/l de
2,4-D, pe cele cu doze mici (1,0 şi 1,5 mg/l) a provocat descreşterea calusării şi intensităţii după
a 5-a subcultivare, iar calusurile au pierduit din vigurozitate şi intensitatea culorii.
Calusurile de culoare verde de pe MN, suplimentate cu 2,0 şi 2,5 mg/l de 2,4-D,
transferate la a 3-a subcultivare, pe MN cu ANA (3,0 mg/l), au o rată de multiplicare mai sporită,
decât în cazul iniţierii şi creşterii, doar pe MN cu ANA (3,0 mg/l). La a 4-a subcultivare calusrile
erau viabile, iar culoarea verde substituită cu crem-roză şi violacee; ultima, la a 5-a subcultivare,
prevalează. Dozele de 2,0 şi 2,5 mg/l de 2,4-D, încorporate în MN, sunt benefice asupra iniţierii,
apoi asupra evoluării calusurilor, la transferul atât pe MN similare sau diferite privind doza de
2,4-D, cât şi la transferul pe MN cu diferite doze de ANA. Calusurile iniţiate pe MN, cu doze
(2,5 şi 3,0 mg/l) de ANA cu o intensitate relativă a calusării şi culoare violacee, transferate pe
MN cu doze (2,5 şi 3,0 mg/l) de 2,4-D, au păstrat rata de calusare la 3-4 pasaje, apoi a diminuat
până la minim, devenind verde-crem. Indiferent de numărul de pasaje pe MN identice, sau pe
MN cu formule hormonale noi, s-a reuşit, doar, inducerea calusului. Transferul repetat, pe MN
cu 2,0-3,0 mg/l de 2,4-D, induce multiplicarea celulelor activă şi acumularea carpomasei
viguroase, viabile, verde. Iniţierea calusului primar pe MN, modificate cu 2,0-3,0 mg/l de 2,4-D

104
 KD ++ KD +++ KD ++++ KD +++++ KD+++++
Calus Crem-verde Verde, viabil Verde, viabil Verde, viabil
translucid
KN ++ KN ++++
KN +++
Crem-verde Violacee, viabil
Crem-roz
Subcultivările
I. II. III. IV. V.

KN ++ KN +++ KN +++
105

KN + KN ++
Violaceu, mat,
Calus Crem-roz Violaceu, viabil Violaceu, viabil friabil
translucid

KD ++ KD +++ KD ++++
Verde, viabil
Crem-roz Roz-verde

Fig. 4.4. Acţiunea frecvenţei subcultivărilor şi a regimului nutriţional asupra intensităţii carpocalusării la A. melanocarpa (Michx.)Elliot.
Legendă: intensitatea calusării: + – minimă; ++ – relativă; +++ – moderată; ++++ – bună; +++++ – maximă; .
– menţinerea regimului hormonal; – schimbarea regimului hormonal al mediului nutritiv.

105
şi transferul la 2 subcultivări pe MN identice, iar, începând cu a 3-a, pe MN, suplimentat cu 3,0
mg/l ANA, favorizează o proliferare bună şi o acumulare sporită a carpomasei violacee viabile.
Rezultatele obţinute au permis elaborarea schemei eficienţei subcultivărilor (fig. 4.4),
conform căreia, odată cu subcultivarea calusului primar şi menţinerea regimului nutriţional al
MN, creşte intensitatea calusării. Pe MN, suplimentate cu 2,4-D şi K, intensitatea calusării este
cu 2 praguri mai superioară, decât pe MN, suplimentate cu doze de ANA în combinaţie cu K.
Transferul reglat al carpocalusului, în faza logaritmică de creştere, pe MN proaspete
favorizează intensitatea calusării şi acumularii carpomasei viabile, iar balanţa hormonală
acţionează selectiv. Dozele de 2,4-D au rol stimulator asupra acumulării carpomaselor
pigmentate, iar cele de ANA asupra acumulării metaboliţilor fenolici în carpomase [23].
4.6. Reacţia morfogenetică a carpoexplantelor în funcţie de regimul nutriţional al mediului
Reacţia de bază a explantului (epicarpul cu hipodermă), inoculat pe MN cu grupele
hormonale KD şi KN (tabelul A.3.5) a fost calusogeneza, dar cu diferite intensităţi de calusare şi
caracteristici morfologice, în funcţie de varianta hormonală utilizată. Celulele diferenţiate ale
explantului, decupat din pericarpul fructului, în condiţii in vitro preiau capacitatea de diviziune
celulară, pierdută în procesul diferenţierii. Trecerea celulei in vitro, din starea de diferenţiere, la
cea de dediferenţiere, este condiţionată de schimbările activităţii genelor (variabilitatea
epigenetică) [50]. Multiplele experimentări, prin microtehnica cultivării tisulare in vitro pe MN
semisolide la fructele de aronie, au demonstrat, că, deşi masele calusale, obţinute sunt polimorfe,
ele, totuşi, au caracteristici comune. La baza polimorfismului carpomaselor calusale stau reacţiile
morfogenetice diverse ale explantelor fructelor de aronie în funcţie de regimul nutriţional
hormonal, concentraţia zaharozei, suplimentată în calitate de sursă principală de carbon, regimul
de lumină ca factor vector în acumularea calitativă şi cantitativă a carpomasei etc.
Reacţiile morfogenetice au fost specifice, în funcţie de aportul unui sau altui hormon de
tip auxinic: 2,4-D ori ANA în combinaţie cu doze constante (0,5 mg/l) de K. Explantele,
inoculate pe MN, suplimentate cu 2,4-D, au avut reacţii similare, au generat carpocalus cu
extindere pe orizontală, verde, dar cu diferite intensităţi de calusare, în funcţie de doza
hormonală (tabelul A.3.5). Calus spongios, uşor dezagregabil, crem, cu zone de culoare verde şi
o intensitate de proliferare redusă (+) pe MN în care s-a încorporat 2,4-D în cantităţi mici (0,5;
1,0 mg/l). Sporirea nesubstanţială a cantităţii (1,5 mg/l) de 2,4-D în MN a indus schimbări ale
reacţiei morfogenetice, astfel a sporit capacitatea de calusare a explantelor (48,8–65,3%) şi
intensitatea proliferării (+++). Pe MN cu 2,4-D, în cantitate de 2,0 mg/l şi 6% de zaharoză,
calusează aproape acelaş procent de explante (68,8%), ca şi în cazul anterior (65,3%), iar

106
capacitatea de proliferare sporeşte, fiind una bună (++++). La administrarea zaharozei de 6% în
MN, capacitatea de proliferare este relativă, iar carpomasă verde (fig. 4.5).
Doza de 2,5 mg/l de 2,4-D în ambele cazuri de concentraţie a zaharozei de 3 şi 6%,
provoacă o calusare maximă, respectiv 85,9 şi 88,6%. De menţionat că concentraţia de 6% a
zaharozei determină capacitate maximă de proliferare (+++++). Explantele au generat calus
compact, bine structurizat cu rată sporită de multiplicare a celulelor de culoare verde (fig.
A.3.1). În carpomasa de culoare verde, sporadic, se observă centre de celule violacee, numite şi
celule antocianifere (fig. A.3.2). Carpomasa, obţinută pe aceste MN, este viguroasă şi viabilă.
Dozele sporite de 2,4-D (3,0; 3,5; 4,0 mg/l), administrate în MN, reduc reactivitatea
explantelor până la 45,6 % şi respectiv diminuează şi capacitatea de proliferare până la relativă
(++), limitându-se la formarea doar a calusului incipient, marginal, crem-albicios cu rare insuliţe
verzi, friabile. Calusurile de pe aceste MN sunt heterogene după culoare şi aspectul morfologic,
cele de pe MN, suplimentate cu 3,0-3,5 mg/l de 2,4-D, se carcterizează prin alternanţa diferitor
zone: verzi şi compacte identice cu cele de pe MN cu 2,0 mg/l de 2,4-D; cremă şi verde deschis,
spongioase, identice cu cele de pe MN cu 0,5 şi 1,0 mg/l de 2,4-D; crem-verzui şi albicioase,
friabile, mate, identice cu cele de pe MN, suplimentate cu 1,5 mg/l de 2,4-D. MN, suplimentate
cu cantităţi medii (2,0 şi 2,5 mg/l) de 2,4-D, favorizează proliferarea cu intesitate sporită a
calusării, calusul fiind viabil, viguros, bogat, de culoare verde. Dozele mai mici sau mai mari de
2,4-D, înglobate în MN, au un efect inhibator asupra calusării şi capacităţii de proliferare.
Pe MN, cu doze de ANA, reacţia de bază a fost, la fel, calusarea. Procentul de calusare a
explantelor este mai redus în comparaţie cu MN, suplimentat cu 2,4-D (tabelul A.3.5).
În cazul dozei de 1,0 mg/l de ANA, explantele nu calusează. Pe MN cu doze mici de 1,5
mg/l de ANA procentul de calusare este sub 40 %, dar capacitatea de proliferare este minimă (+),
rezultând un calus incipient, care, ulterior, necrotizează. Pe MN cu ANA (2,0 mg/l), calusare
manifestă 38,8 – 39,9% din explante, cu capacitate a calusării relativă (++) pe MN cu 3%
zaharoză şi proliferare moderată (+++) pe MN cu 6% zaharoză. Calusul generat este de culoare
crem-albă, moale şi uşor friabil (fig. 4.6).
MN suplimentate cu doze de 2,5; 3,0; 3,5mg/l de ANA şi concentraţia zaharozei de 3 şi 6
%, au favorizat dezvoltarea calusului violaceu, cu celule antocianifere (fig. 4.7). Carpomasele
sunt compacte, cu luciu, viabile, doar la periferie friabil şi mate. Procentul de calusare al
explantelor este de 63,3 şi 65,2% şi intensitatea calusării este bună, în cazul concentraţiei de 3
mg/l a ANA şi reprezintă maximul pentru grupa hormonală KN, dar cedează în raport cu grupa
hormonală KD. Înglobarea a 4,0 mg/l de ANA în MN, reduce procentul de calusare al
explantelor până la 29,7 %, iar cele, care calusează se caracterizează printr-o intensitate relativă a

107
calusării, la concentraţia zaharozei de 3% şi moderată, la 6%. Carpomasa, generată este de
culoare crem-roză, uşor dezagregabilă, mată.

Fig. 4.5. Carpomasă verde, obţinută pe MN, suplimentat cu 2,0 mg/l de 2,4-D şi 6% zaharoză.

Fig. 4.6. Carpomasă crem-albă, obţinută pe MN, suplimentat cu 2,0 mg/l de ANA şi 6% de
zaharoză.

108
Fig. 4.7. Carpomasă violacee, generată pe MN, suplimentat cu 3,0 mg/l de ANA şi 6% zaharoză.

Fig. 4.8. Carpomasă crem-roză, pe MN, suplimentat cu 4,0 mg/l de ANA şi 6% zaharoză.

Deseori, sectoarele roze, alternează cu cele translucide cu luciu sau cu cele de culoare
crem-albicioasă, dar mate (fig.4.8;A.3.3). Odată cu sporirea aportului de ANA – 3,5 mg/l,
procentul de calusare scade până la 32,5 şi 34,6% şi explantele manifestă o intensitate a calusării
relativă şi moderată. Sectoarele de culoare roză sunt bogate în celule cu vacuole antocianifere.
Sporirea aportului de ANA (4,5 şi 5,0 mg/l) în MN, frânează procesele proliferative până la
minim (+), iar procentul de calusare se reduce de la 25,6 până la 9,9 %. Explantele formează

109
doar un carpocalus incipient spongios de culoare albă, translucidă, apoi necrotizează. Pe toate
MN, suplimentate cu ANA, explantele au generat carpocalus, dar cu diferite caracteristici în
funcţie de dozele administrate: până la 2,0 mg/l, calusul e moale, spongios, de culoare crem-albă;
2,5 şi 3,5 mg/l, calus mai consistent şi compact, de culoare violacee; 4,0-5,0 mg/l, carpocalus
crem-roz, spongios şi friabil, ce permite fragmentarea şi dezagregarea uşoară, fără a deteriora
integritatea celulară.
Acidul 2,4-D şi ANA sunt hormoni auxinici, dar acţiunea lor este diferită asupra calusării
carpoexplantelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot. În toate variantele hormonale ale MN cu
grupa hormonală KD, carpoexplantele au manifestat o calusare, cu precădere, mai mare, decât
ale grupei hormonale KN (fig. 4.9).

90
80 KD
70
Intensita tea calusă rii %

60 KN
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6 7
Varian te le h orm on al e (m g/l): 1 - 1 de 2,4-D şi ANA; 2 - 1,5 de 2,4-D şi ANA; 3 - 2,0 de 2,4-D şi
ANA; 4 - 2,5 de 2,4-D şi ANA; 5 - 3,0 de 2,4-D şi ANA; 6 - 3,5 de 2,4-D şi ANA; 7 - 4,0 de 2,4-D şi ANA.

Fig. 4.9. Calusarea carpoexplantelor de aronie în funcţie de grupa şi varinata hormonală a MN

Un parametru ilustrativ în acest sens este indicele de calusare al carpomaselor pigmentate
(fig. 4.10), utilizat în diferite lucrări biotehnologice şi calculat conform metodicii stabilite [111].

64
%
100 66

90 72

80

70

60

50
Biomasa verde
40

30
Biomasa crem-
20 albă

10 Biomasa crem-
roz
0
1 Biomasa
violacee

Fig. 4.10. Variaţia indicelui de calusare în funcţie de pigmentaţia carpomasei de aronie.

Carpomasa pigmentată verde se caracterizează prin cel mai înalt indice de calusare –
99%, apoi în descendenţă urmează carpomasa violacee – 72%, apoi crem-roză – 66% şi crem-

110
albă, cu 64%. Evaluarea morfologică a carpocalusurilor, generate din explantul fructelor de
aronie a demonstrat o heterogenitate în corelaţie cu grupa şi varinata hormonală, adiţionată MN
şi gradientul concentraţiei zaharozei. Se menţionează un spectru larg al polimorfismului
calusurilor vis-a-vis de originea histogenului şi apartenenţa sistematică a speciei, antrenată în
culturi in vitro [111,289]. În multe lucrări, sunt evaluate calusurile cu origine histogenică
comună, dar obţinute pe MN nutritive cu balanţă hormonală diferită [43,56,57].
Pentru descrierea şi evaluarea diversităţii morfologice a carpomaselor calusale, generate
de explantul de aronie, s-a elaborat un sistem de criterii: vectorul de creştere a calusului (verical,
orizontal), gradul de împachetare a celulelor (compact, moale, spongios), aspectul suprafeţelor
(mat, cu luciu), gradul de friabilitate (dezagregabil sau nedezagregabil), culoarea
(monocromatică, policromatică, alternaţa şi îmbinările de culori) etc. Unele criterii, gradul de
compactizare (spongios, compact, moale), aspectul exterior (mat, cu luciu), culoarea (mono- sau
policromatică), au fost utilizate în analiza morfogenetică a diversităţii calusurilor la: Stachys
sieboldii [43], la Triticum aestivum [370], soiuri de V. vinifera [100,206] şi de L.esculentum
[56,57]. În baza indicilor morfologici şi în funcţie de gradul de diferenţiere a biomaselor in vitro
C.Zhang [353] descrie 4 tipuri morfologice de calusuri: non-embriogenic – spongios, lax,
albicios; pre-embriogenic – globulos, transparent, lipicios; embriogenic de două tipuri – compact
şi transparent sau compact, opac şi albicios. Conform altei lucrări [371], caracteristicile
calusului: spongios, lax, hidratant, uşor dezagregabil, gradul de compactizare, dislocarea
centrelor proliferative, corelează cu originea histogenică a inoculului, apartenenţa sistematică a
speciei donatoare de explant şi condiţiile de creştere in vitro. Prin examinarea în SEM calusul la
Oryza sativa se descrie ca o masă spongioasă, friabilă, translucidă, galben-albă [236], iar în alte
lucrări [102,206], calusul este redat ca o masă de celule oval-alungite, dezorganizate.
Heterogenitatea carpomaselor de aronie demonstrează labilitatea sporită morfogenetică a
explantului în funcţie de tipul şi doza hormonilor din MN. Caracteristicile citoanatomice ale
explanţilor, utilizaţi în calitate de inoculi, pot constitui reperul de bază în explicarea spectrului
larg al reactivităţii celulelor biomaselor [95], iar variabilitatea morfologică a biomaselor,
generate de la acelaş explant, reprezintă o expresie a potenţialului genetic, în funcţie de acţiunea
factorilor chimici şi fizici.
4.7. Studiul citomorfologic al carpomaselor pigmentate
S-a efectuat evaluarea citomorfologică comparată a carpomaselor pigmentate, generate
din fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot, în funcţie de formula hormonală a MN: violacee
– ANA (3,0-4,0 mg/l) şi K (0,5 mg/l); crem-roză – ANA (4,5-6,0 mg/l) şi K (0,5 mg/l); crem-
albă – ANA (0,5-2,5 mg/l) şi K (0,5 mg/l); verde – 2,4-D (1,5-2, 5 mg/l) şi K (0,5 mg/l).

111
 Studiul citomorfologic comparativ s-a realizat pe secţiuni transversale, longitudinale şi pe
preparate presate ale carpomaselor pigmentate. Rezultatele studiului demonstrează că
carpomasele pigmentate prezintă o biomasă heterogenă de celule, cu unele specificări în funcţie
de balanţa hormonală, adiţionată MN de creştere [16,17,80].
4.7.1. Carpomasa violacee
Carpomasa violacee se caracterizează prin aspect globulos şi spongios cu un grad redus
de coeziune, care favorizează dezagregarea uşoară a celulelor. Aceasta prezintă o dificultate în
microtehnica de preparare a secţiunilor, de aceea pentru studiu microscopic s-au analizat atât
secţiuni prin carpomasă, cât şi micropreparate, obţinute prin presare.
Suprafaşa carpomasei are luciu, doar unele sectoare sunt mate. Sectoarele cu luciu
constau din celule vii, în dezvoltare cu unele centre juvenile, proliferative cu localizare
periferică, pe suprafaţa superioară, pe părţile laterale şi inferioară la zona de contact cu MN, cele
mate sunt alcătuite din celule mai mature (fig. 4.11,4.12; A.3.4,A.3.5). Centrele proliferative
constau din celule cu citoplasmă densă şi vacuole mici, lipsite de conţinut antocianic. Centrele
proliferative periferice determină creşterea şi acumularea carpomasei violacee pe verticală şi pe
orizontală.
Analiza micropreparatelor demonstrează că carpomasa violacee reprezintă o biomasă din
celule parenchimatice de formă oval-rotungită (fig. 4.11,4.12; A.3.4,A.3.5). Celulele au pereţii
celulari subţiri şi sunt vacuolizate. În carpomasă predomină populaţii de celule parenchimatice
de culoare violacee, determinată de conţinutul sporit al antocianilor în vacuole (fig. 4.13). În
carpomasa violacee, fără o strictă localizare, se observă micile populaţii de celule de culoare
crem-albă, în care sunt prezente amiloplastele, care alternează cu cele alcătuite din celule, bogate
în cloroplaste (fig. A.3.4,A.3.6). În partea bazală a carpomasei violacee sunt celulele de formă
alungită, iar cele apicale sunt răsfirate, care stabilesc şi sporesc contactul cu MN (fig. 4.12).
Pentru identificarea prezenţei diferitor compuşi chimici s-au aplicat diverse citoreacţii [44,385],
efectele cărora (tabelul A.3.6) demonstrează că carpomasa violacee se caracterizează prin
conţinut pronunţat de taninuri.
Din cele patru citoreacţii pentru identificarea taninurilor cele mai eficiente au fost: cu
soluţie 1% de clorură fierică şi alăun de fier-amoniu, rezultând o masă granulată verde-
negricioasă (fig.4.14) şi cu soluţie de 1% Fe2(SO4)3 în HCl de 0,1H, formând, similar, o masă
uşor granulată, însă de culoare verde-brună.
Flavonoidele au fost evidenţate sub formă de precipitat galben-oranj, la aplicarea soluţiei
alcoolice de acetat de plumb şi galben, care, la temperatură, a trecut în culoare roşie, cu soluţie
de amoniac (fig. 4.15).

112
 1

2
Fig. 4.11. Secţinune prin carpomasa violacee. Stratificarea carpomasei: 1 – partea superioară; 2 –
partea inferioară bazală, x150.

Fig. 4.12. Secţiunie transversală prin partea bazală a carpomasei violacee: 1 – celule alungite,
răsfirate în MN, x200.

113
 Fig. 4.13. Preparat presat din carpomasa violacee. Celule cu conţinut antocianic, x350.

Fig. 4.14. Preparat presat din carpomasa Fig. 4.15. Secţiune prin carpomasa violacee.
violacee. Reacţie cu soluţie 1% de clorură Reacţie cu soluţie de amoniac, coloraţie oranj-
fierică şi alăun de fier-amoniu, x250. roşie (săgeţi), x300.

Reacţiile aplicate pentru identificarea pectinelor au demonstrat o prezenţă bună şi

moderată în celulele carpomaseor violacee. Reacţia cu soluţie Lugol, aplicată pentru identificarea
granulelor de amidon, a demonstrat un efect moderat. Sporadic, cu un efect slab al reacţiei, s-au
înregistrat celule cu pereţii celualari lignificaţi şi cu incluziuni lipidice (tabelul A.3.6).
4.7.2. Carpomasa crem-roză
Carpomasa crem-roză reprezintă o masă amorfă cu aspect spongios, de culoare crem-roză,
mai dezagregabilă, decât carpomasa violacee (fig. A.3.7;A.3.8). Carpomasa constă din celule
parenchimatice, de formă sferică, cu pereţii celulari celulozici şi subţiri. În carpomasă prevalează
zonele de culoare roză, dar se întâlnesc şi zone de culoare cremă. Zonele calusale de culoare roză

114
sunt alcătuite din celule vacuolizate cu conţinut antocianic. Vacuolele, de regulă, ocupă regiunea
centrală. Zonele de culoare cremă constau din celule bogate în amiloplaste.
Stratificarea este mai puţin evidentă, comparativ cu carpomasa violacee. Citoreacţiile
administrate pe secţiuni şi preparate presate au demonstrat prezenţa moderată a taninurilor,
moderată şi bună a flavonoidelor, cu un efect mai mult moderat – pectinele, cu o reacţie slabă –
ligninele şi incluzunile lipidice (tabelul A.3.6). O reacţie bună a fost înregistrată la aplicarea
soluţiei Lugol, ce demonstrează prezenţa amidonului în zona mediană şi periferică bazală (fig.
4.16; 4.17). Regiunea periferică superioară a carpomasei crem-roză se caracterizează printr-un
conţinut mai redus în amiloplaste, comparativ cu regiunile mediană şi bazală.

Fig. 4.16. Carpomasa crem-roză. Zona Fig. 4.17. Carpomasa crem-roză. Zona
mediană. Reacţie cu soluţie Lugol. Granule bazală. Reacţie cu soluţie Lugol. Granule de
de amidon (săgeţi), x300. amidon (săgeţi), x300.

4.7.3. Carpomasa crem-albă

Carpomasa crem-albă se caracterizează prin acumulare pe verticală şi orizontală [16], cu
aspect, pepondernt, mat (fig. 4.18;A.3.9). În faza logaritmică de creştere a calusogenezei,
carpomasa este alcătuită din celule parenchimatice, de formă sferică cu număr de cloroplaste
redus, parietale, ce în secţiune redau o culoare verzuie (fig. A.3.10), cu pereţii celulari celulozici
şi subţiri. Marginal se observă centrele proliferative, care contribuie la creşterea biomasei.
Carpomasa în faza staţionară de calusogeneză are un aspect spongios (fig. 4.18). La începutul
acestei faze pereţii celulari sunt celulozici, subţiri, care uşor se îngroaşă până la sfârşitul fazei.
La aplicarea soluţiei de clor-zinc-iod pe secţiunile carpomasei crem-albă, la sfârşitul fazei
staţionare şi începutul celei senescente, s-au înregistrat reacţii moderate, ce atestă o uşoară
îngroşare (lignificare) a pereţilor (tabelul A.3.6; fig.A.3.11). Celulele au formă oval-rotungită,
bogate în amiloplaste, evidenţiate prin aplicarea soluţiei Lugol (fig. 4.19), ce înregistrează o
reacţie foarte bună (tabelul A.3.6). Celulele stratului periferic superior se caracterizează prin
forma sferică şi heterogenitate după conţinutul în granule de amidon, unele bogate, iar altele –

115
sărace (fig. A.3.12; A.3.13). Un alt aspect are partea periferică a carpomasei crem-albă (fig.
4.20), la contact cu MN, celulele sunt de dimensiuni mai mari, alungite şi bogate în amidon.

Fig. 4.18. Carpomasa crem-albă cu aspect Fig. 4.19. Secţiune transversală prin carpomasa
spongios, x120. crem-albă. Reacţie cu soluţie Lugol, x150.

Fig. 4.20. Celulele alungite ale părţii bazale la contact cu MN a carpomasei crem-albă. Reacţie
cu soluţie Lugol. Granule de amidon (săgeţi), x300.

Au fost înregistrate efecte moderate ale citoreacţiilor pentru identificarea taninurilor şi

flavonoidelor şi efecte slabe pentru pectine şi incluziuni lipidice (tabelul A.3.6). Carpomasa
crem-albă senescentă este constituită din celule parenchimatice bine împachetate, fără focare
proliferative şi se aseamănă cu un parenchim de depozitare (fig. A.3.13).
4.7.4. Carpomasa verde
Carpomasa verde reprezintă o biomasă de celule cu extindere mai mult pe vectorul
orizontal al suprafeţei MN [80]. Carpomasa se caracterizează prin aspect viabil, cu luciu, culoare
verde (fig. 4.21;4.22), sporadic cu populaţii de celule de culoare violacee, dispuse difuz (fig.

116
4.23), sau sub formă de făşie (fig. A.3.14). Se întâlnesc şi făşii de culoare crem-albă (fig.
A.3.15), în deosebi, în partea internă. Partea mediană a carpomasei constă din celule mai
uniformizate după formă, preponderent, oval-rotungite, relativ suculente în care cloroplastele au
o aranjare parietală (fig. 4.22). Carpomasa verde se caracterizează cu un conţinut mai redus de
granule (fig. A.3.16), comparativ cu carpomasele crem-albă şi crem-roză. Spre periferiile
carpomasei, în funcţie de poziţie (superioară, bazală, laterală), se observă o diversificare a
formelor celulelor: de la sferice până la prismatice, alungite şi măciucate (fig. A.3.17-A.3.20).
Este diferită şi maniera de împachetare, gradul de compactizare şi orientare a celulelor în
carpomasa verde. Pe tot perimetrul periferic sunt dispersate centre mici proliferative (fig.
A.3.18). Celulele în carpomasă au împachetare relativ compactă (fig. 4.21,4.12;A.3.16 – A.3.18),
iar citoreacţia cu soluţie Lugol demonstrează acumulări moderate de amidon în partea periferică
superioară (fig. A.3.19), mediană (fig.A.3.16) şi în cea inferioară bazală (fig. 4.17; A.3.20).

Fig. 4.21. Secţiune prin carpomasa verde, Fig. 4.22. Detaliu a zonei mediane a
x150. carpomasei verde, x300.

Fig. 4.23. Carpomasă verde cu populaţii Fig. 4.24. Partea bazală a carpomasei verde.
difuze de celule violacee (săgeţi), x120. Reacţie cu soluţie Lugol. Granule de amidon
(săgeţi), x 200.

117
 Celulele suprafeţei bazale, care vin în contact cu MN, sunt alunghite, răsfirate, care
permit ancorarea mai bună în MN şi sporesc suprafaţa de contact cu MN, ceea ce facilitează
nutriţia. Rezultatele citoreacţiilor specifice aplicate (tabelul A.3.6) denotă prezenţa taninurilor,
flavonoidelor şi a pectinelor, dar cu efecte mai reduse, decât în carpomasele violacee, crem-roză
şi crem-albă. Lipsesc incluziunile lipidice, iar pereţii celulari sunt subţiri şi celulozici.
Analiza numeroaselor micropreparate ale carpomaselor pigmentate: violacee, crem-roză,
crem-albă şi verde în faza staţionară a calusogenezei demonstrează, că în secţiunea transversală a
calusului se conturează trei straturi evidente de celule [16,17,80], condiţional denumite: cortical
superior, median şi cortical inferior (fig. 4.25).

Fig. 4.25. Secţiune transversală prin carpomasa de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 – strat
cortical superior; 2 – strat median; 3 – strat cortical inferior; 4 – celule alungite; 5 – rânduri
celulare uniserate; 6 – zonă proliferativă.
Stratul cortical superior constă din 4-5 rânduri de celule parenchimatice, uşor alungite,
compact împachetate, cu pereţii celulari puţin mai îngroşaţi, decât restul carpomasei. Celulele
rândului marginal sunt puţin vacuolizate, au o uşoară îngroşare a pereţilor celulari spre partea
exterioară, sunt cu spaţii intercelulare reduse şi-s orientate perpendicular pe axa orizontală de
extindere a carpomasei. Următoarele rânduri sunt alcătuite din celule mature, cu un număr sporit
de cloroplaste cu aranjare parietală. Ele amintesc un parenchim asimilator de tip palisadic.
Stratul median sau zona internă a carpomasei este alcătuită din celule parenchimatice
poligonale sau oval-rotungite, aranjate neregulat, cu unele mici spaţii intercelulare, ce induc un
aspect uşor spongios. Celulele au vacuole centrale, relativ mari, numărul cloroplastelor e mai
redus, decât în stratul exterior. Colorarea în albastru-violet la aplicarea soluţiei Lugol
demonstrează prezenţa acumulărilor de amidon în toate biomasele pigmentate. Stratul median de
celule în carpomase de diferită pigmentaţie reprezintă un parenchim de depozitare.
Stratul cortical inferior, care vine în contact direct cu MN, constă din celule alungite,
aranjate perpendicular pe axa orizontală de extindere a carpomasei calusale. Spre periferie,

118
frecvent, celulele sunt aranjate în rânduri relativ lungi, uniserate, iar celulele terminale sunt
măciucate, înglobate în MN, îndeplinind rol de ancorare şi absorbţie. Rândurile de celule
uniserate sunt răsfirate în substrat, astfel mărind suprafaţa de contact cu MN, favorizând nutriţia
mai eficientă a celulelor. Celulele se caracterizează prin pereţii celulari subţiri şi lipsa
cloroplastelor. Acest strat aminteşte un parenchim de absorbţie. În zonele periferice laterale ale
carpomaselor calusale se menţionează grupări de celule juvenile, de formă strict sferică, cu
pereţii celulari subţiri, citoplasmă densă şi vacuole mai multe, dar mici. Ele reprezintă centrele
celulare cu creştere proliferativă, ceea ce şi determină extinderea carpocalusurilor pigmentate.
De menţionat că, stratificarea carpomaselor are diferite grade de expresie în funcţie de
pigmentaţia lor. Expresia stratificării în descendenţă poate fi reprezentată în felul următor:
carpomasa violacee> crem-roză>, verde >crem-albă.
Studiile citomorfologice, privind biomasele calusale sunt limitate [154,285,290]. Totuşi,
în ultimul deceniu au apărut lucrări [16,17,56,75,109,206,211,236,249,290,316], în care
biomasele calusale sunt evaluate citomorfologic, dar rezultatele sunt disperse. Biomasele sunt
descrise ca acumulări amorfe celulare, dar heterogene [57,206,370]; uneori cu tendinţe de
stratificare în 3 straturi, ca la rizocalusul de Curcuma zedoaria [211], în 2 zone, la filocalusul de
Elaeis guineensis [296] şi în 4 zone, la rizocalusul de Triticum aestivum [370].
Topografia centrelor proliferative determină vectorul de creştere a biomaselor şi are
caracter organospecific, care corelează cu apartenenţa sistematică a plantei şi nu se încadrează în
anumite tipologii. La aronie centrele proliferative au localizare periferică şi determină vectorul
de creştere a carpomaselor, care corelează cu formula hormonală, adiţionată MN: carpomasele
violacee, crem-roză şi crem-albă, dezvoltate pe MN cu ANA şi K, au creştere pe orizontală şi
verticală, iar cea verde, pe MN, cu 2,4-D – are creştere preponderentă, pe vectorul orizontal [80].
Unii autori [370] menţionează localizarea centrală, alţii [316], difuză şi sporadică a focarelor
proliferative, ce vin în contradicţie cu datele obţinute la aronie [16,17,80] şi la alte specii [56,58,
181,211,290,296,330].
4.8. Concluzii la capitolul 4
• În rezultatul screening-ului compoziţiei chimice a MN pentru inducerea calusării la fructele de
A.melanocarpa (Michx) Elliot s-au selectat 20 variante hormonale, în baza diferitor combinaţii
şi doze a 2 grupe hormonale KD, KN, care au fost aplicate în investigaţiile biotehnologice
ulterioare. Reactivitatea explantelor e maximă pe MN cu grupa hormonală KD (de la 34,6 până
la 88,6 %), urmată de KN (de la 18,9 până la 65,2%).
• Variantele hormonale, în baza combinaţiilor dozelor de hormoni auxinici şi citochininici au
condiţionat dezvoltarea carpomaselor pigmentate, cu diferite valori ale indicelui de calusare:

119
 doze 2,0-2,5 mg/l de 2,4-D şi 0,5 mg/l K, carpomasă verde cu 99%; 2,5-3,5 mg/l ANA şi 0,5
mg/l K, carpomasă violacee cu 72%; 4,0–5,0 mg/l şi 0,5 mg/l K, carpomasă crem-roză cu
66% şi 1,0-2,0 mg/l ANA şi 0,5 K, carpomasă crem-albă cu 64%.
• Dezvăluirea potenţialului proliferativ al explantului are caracter individual histospecific,
organospecific şi taxonospecific în concordanţă cu etapa ontomorfogenetică de dezvoltare a
organului-donator de explant, poziţia explantului în raport cu MN şi grupa hormonală.
• Vârsta optimă a fructelor de aronie, donatoare de explant, pentru inducerea calusării şi
acumularea carpomasei este cea de 50-60 zile de la înflorire, caracterizată printr-un echilibru
biologic al parametrilor structurali şi biochimici şi prezenţa rezervei trofice, ce asigură
viabilitatea celulelor explantului în condiţii in vitro.
• Histogenul optim al fructului de aronie, alcătuit din epicarp cu hipodermă, se caracterizează
prin capacitate şi intensitate maximă de calusogeneză, determinate de îmbinarea
complimentară a particularităţilor structural-funcţionale ale celor 2 părţi constituiente:
epicarpul, cu rol în asigurarea viabilităţii explantului prin îndeplinirea funcţiei de apărare a
celulelor hipodermei de acţiunea factorilor în condiţii in vitro, şi hipoderma, prin prezenţa
rezervei trofice, ca sursă energetică, pentru declanşarea proceselor proliferative.
• Lumina şi calitatea ei nu este factorul decisiv în inducerea calusării, dar este absolut necesar
pentru evoluţia şi acumularea ulterioară a carpomaselor pe parcursul calusogenezei.
• Ciclul carpocalusogenezei la aronie durează 40 zile şi este divizat în 4 faze consecutive,
caracterizate prin particularităţi structural-biosintetice specifice: lag, logaritmică de creştere,
staţionară şi senescentă. Regimul de lumină, balanţa hormonală, adiţionată MN, pot frâna sau
stimula transformările structural-biosintetice, caracteristice fazelor calusogenezei, astfel
modificând coraportul duratelor, dar succesiunea consecutivă se menţine.
• Studiul citomorfologic demonstrează tendinţa spre stratificare a carpomaselor de aronie ca o
adaptare a specializării morfofuncţionale: stratul celular extern cu pereţii îngroşaţi şi
împachetare compactă are funcţie de protecţie; stratul intern median cu funcâie de asimilare
sau depozitare a materiilor de rezervă; stratul marginal – de creştere proliferativă; stratul bazal
la contactul cu MN are funcţie de înglobare în MN şi absorbţie a substanşelor nutritive.
• Polimorfismul celular al carpomaselor de aronie reprezintă o specializare morfofuncţională,
care corelează cu formula hormonală a MN: carpomasa verde – clorofiliană are funcţia de
asimilare fotosintetică; carpomasa violacee – antocianiferă cu funcţia de sinteza şi acumulare a
CF; carpomasele crem-roză şi crem-albă au funcţia de depozitare a amidonului şi a CF.

120
 5. STUDII BIOCHIMICE COMPARATE ALE FRUCTELOR ŞI CARPOMASELOR
PIGMENTATE IN VITRO DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT
5.1. Screening-ul biochimic al fructelor şi carpomaselor in vitro
În scopul identificării compoziţiei chimice a carpomaselor pigmentate, obţinute in vitro,
s-a recurs la examenul chimic calitativ global [33,37]. Deoarece studiul biochimic al
carpomaselor, obţinute in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, s-a realizat pentru prima dată,
inţial s-a efectuat screeningul biochimic calitativ al lor, comparativ cu al fructelor, care permite
obţinerea datelor relevante şi de aceea are o pondere importantă în metodologia de cercetare
biochimică. Studiul biochimic calitativ s-a bazat pe separarea principalelor grupe de compuşi
chimici din PV, analizate prin extracţia succesivă şi selectivă cu solvenţi de diferite polarităţi:
chloroform, soluţie alcoolică, apă [33,49] în aparatul de extracţie continuă de tip Soxhlet. S-au
obţinut 3 extracte: a) soluţia extractivă cloroformică; b) soluţia extractivă alcoolică şi c) soluţia
extractivă apoasă. În extractul cloroformic se găsesc compuşi chimici lipofili, iar în celelalte 2
extracte – compuşi hidrofili. Pentru identificarea compuşilor chimici, aceste 3 soluţii extractive
s-au analizat separat, aplicând procedeele metodice,determinate pe proprietăţile fizico-chimice
[33,44,49]. Extractele din fructele de aronie şi carpomasele pigmentate, obţinute in vitro
(violacee, crem-roză, crem-albă şi verde) au fost supuse acestor analize [tabelul A.4.1].
Analiza soluţiei extractive cloroformice. Soluţiile extractive au fost supuse testărilor cu
reacţii chimice specifice, recomandate de tehnicile metodice [33,44,49] pentru identificarea
compuşilor liposolubili. Pentru identificarea uleiurilor volatile, extractul cloroformic s-a distilat
la sec. Organoleptic, nu s-a sesizat prezenţa aromelor, dar colorarea neaccentuată în roşu, la
aplicarea reactivului Sudan III, denotă prezenţa uleiurilor volatile în cantităţi reduse în fructe şi
în carpomasele pigmentate. Prezenţa uleiurilor volatile în fructele de aronie a fost relatată
anterior şi în alte lucrări [135].
Identificarea substanţelor grase s-a efectuat în rezidiul obţinut prin tratare cu 10 ml
soluţie alcoolică 0,5H de KOH la fierbere în reflux pe baia de apă, timp de 1,5 ore până nu s-au
mai observat picături de ulei. Efectul reacţiei a fost mai pronunţat în soluţia extractivă din fructe,
faţă de carpomasele pigmentate, care se datorează conţinutului lipidic al seminţelor [357]. După
procedeele chimice consecutive: distilarea alcoolului, dizolvarea în apă şi separarea fazelor în
pâlnia de separare cu eter, s-au obţinut 2 faze extractive: eterică deshidratată şi apoasă alcalină.
La aplicarea H2SO4 concentrat şi colorarea stratului superior în verde-violet (reacţia Libermann-
Borchard), în extractul eteric s-au identificat triterpenele prin apariţia inelului roşu-violet la linia
de separare a lichidelor. La dizolvarea rezidiului în cloroform şi anhidridă acetică, apare culoarea
verde, care denotă prezenţa clorofilelor, iar la aplicarea H2SO4 concentrat, apare culoarea

121
albăstruie, ce demonstrează prezenţa carotenoidelor. În soluţia apoasă alcalină s-au identificat
acizii graşi (urme) prin apariţia opalescenţei cu HCl concentrat. Prin dizolvarea rezidiului în
metanol şi tratarea cu pulbere de Zn şi HCl concentrat (reacţia Shibata) şi apariţia unei coloraţii
oranj roşiatice, s-au pus în evidenţă agliconii flavonici.
Analiza soluţiei extractive alcoolice. Fructele de aronie şi carpomasele pigmentate au
fost supuse extracţiei alcoolice cu metanol. În extractul degrasat s-au aplicat reacţii specifice de
identificare (de colorare şi sedimentare) a principalelor grupe de compuşi naturali: taninuri,
flavonoide, antracenozide, iar rezultatele efectelor reacţiilor sunt reprezentate în tabelul A.4.1.
Analiza soluţiei extractive apoase. În soluţia extractivă apoasă, obţinută după extracţia
consecutivă cloroformică şi alcoolică, prin aplicarea reacţiilor specifice, s-a identificat prezenţa
hidraţilor de carbon (oze şi polioze); taninurilor; flavonoidelor etc, [33,44].
Screening-ul biochimic calitativ, bazat pe rezultatele reacţiilor specifice, exprimate printr-
un gradient al intensităţii: absenţă, slabă, moderată, pronunţată şi foarte pronunţată (tabelul
A.4.1) a pus în evidenţă principalele grupe de compuşi chimici naturali prezente în carpomasele
in vitro şi fructele de aronie (tabelul 5.1).
Tabelul 5.1 Rezultatele screening-ului biochimic al fructelor şi carpomaselor de aronie
Compuşii chimici Intensitatea reacţiilor specifice în specimenele analizate
identificaţi Fructe Carpomasă Carpomasă Carpomasă Carpomasă
violacee crem-roză crem-albă verde
Uleiuri volatile + + + + -
Uleiuri grase ++ + + + -
Carotenoide ++ ++ ++ + ++
Clorofile + + + + +++
Taninuri ++ +++ +++ ++ ++
Flavonoide ++++ ++++ +++ ++ +
Proantocianidoli +++ +++ +++ +++ +++
Antociani ++++ ++++ +++ + +
Hidraţi de carbon:
oze, ++ ++ +++ ++++ ++
pectine, ++ +++ +++ +++ ++
amidon ++ ++ +++ ++++ ++
Legendă: Intensitatea expresiei reacţiilor specifice: – absenţă; + – slabă; ++ – moderată; +++ –
pronunţată; ++++ – foarte pronunţată.
Expresia intensităţii reacţiilor specifice pentru uleiurile volatile şi grase este aceiaşi
pentru toate specimenele analizate, doar că menţionam un prag mai superior (moderată) pentru
fructele de aronie, faţă de carpomasele in vitro, care, conform opiniei altor autori [320], se
datorează prezenţei seminţelor. Pentru carotenoide, excepţie constituie carpomasa crem-albă, cu

122
un nivel mai redus (slabă), iar pentru clorofile – carpomasa verde cu 2 nivele mai sporite ale
intensităţii reacţiilor (pronunţată), faţă de celelalte probe analizate. Interes prezintă rezultatele
reacţiilor specifice pentru compuşii fenolici: taninuri, flavonoide, proantocianidoli şi antociani.
Se observă fluctuaţii în expresia intensităţii reacţiilor pentru indentificarea taninurilor, valorile
maxime fiind pentru carpomasa violacee şi crem-roză. Se observă un gradient al expresiei
intensităţii reacţiilor specifice pentru flavonoide şi antociani: de la foarte pronunţată (++++),
pentru fructe şi carpomasa violacee, la pronunţată (+++), în carpomasa crem-roză, moderată
(++), în carpomasa crem-albă şi slabă (+) – în cea verde. Rezultatele expresiei reacţiilor pentru
proantocianidoli sunt similare pentru toate probele analizate. Intensitatea maximă de expresie a
reacţiilor pentru hidraţii de carbon este caracteristică pentru carpomasa crem-albă, cu 2 nivele
mai superioară, decât pentru carpomasa verde şi fructe şi cu un nivel, faţă de cea crem-roză.
Astfel, rezultatele screening-ului biochimic calitativ al probelor investigate arată că, în
fructele de aronie, sunt prezente grupele de compuşi naturali, menţionate şi în lucrările ştiinţifice
ale altor autori [148,163,259,277,320,325,343]. Este important de remarcat, că, pentru prima
dată, au fost evaluate, biochimic, calitativ extractele cloroformice, alcoolice şi apoase din
carpomasele in vitro, comparativ cu fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot. Studiul a
demonstrat că, în carpomasele in vitro sunt prezente aceleaşi clase de compuşi naturali ca şi în
fructele de aronie, cu unele mici excepţii; dar expresia intensităţii reacţiilor specifice este diferită
(tabelul 5.1) şi corelează cu pigmentaţia carpomasei calusale. Analiza rezultatelor screening-ului
biochimic calitativ denotă prezenţa diferitor grupe de CF în fructele de aronie şi în carpomasele
pigmentate in vitro, ce justifică continuarea studiului lor biochimic calitativ şi cantitativ prin
antrenarea altor metode de analiză: CSS, CLIP-SM, spectofotometrice, titrimetrice.
5.2. Studiul calitativ şi cantitativ al acidului ascorbic
Generalităţi. Acidul ascorbic (vitamina C) este lactona acidului 2,3 difenol-L-gulonic,
care posedă un caracter puternic reducător şi pierzând uşor atomii de hidrogen trece în acidul
dehidroascorbic şi ambele forme reprezintă izomeri de tip L.
Acidul ascorbic se sintetizează doar în celulele vegetale, este prezent şi în fructele de A
.melanocarpa (Michx.) Elliot [47,112], care, farmacologic, acţionează sinergic cu vitamina P
(biflavonoide), contribuind la menţinerea permiabilităţii peretelui vascular în limitele
homeostatice şi asigurarea integrităţii lui, ce reprezintă o condiţie obligatorie în vitalitatea şi
funcţionalitatea normală a corpului uman [141,269].
În celulele organismului uman, acidul ascorbic acţionează şi ca antioxidant şi
imunostimulator, favorizând activitatea unor celule implicate în răspunsul imun, precum şi
elaborarea unor mediatori cu rol important în apărarea imună [47,326]. Astăzi, studiile ştiinţifice,

123
care contribuie la valorificarea noilor surse vegetale cu conţinut de acid ascorbic, sunt foarte
binevenite. Aceasta constituie un argument pentru identificarea în carpomasele in vitro a acidului
ascorbic şi evaluarea comparată a conţinutului lui în carpomasele in vitro şi fructele de aronie.
Identificarea acidului ascorbic pe CSS. Extractul apos din fructele de aronie şi din
carpomasele lor s-a pregătit conform recomandaţiilor metodice [44], care s-au aplicat cu
martorul, acidul ascorbic etalon, pe placa cromatografică „Silufol”, plasată apoi în camera
cromatografică cu sistemul de solvenţi: acetat de etil şi acid acetic glacial (80:20). După
parcurgerea solventului ~ 13 cm, cromatograma uscată a fost tratată cu soluţie 0,04% de 2,6-
diclorfenolindofenolat de sodiu. Acidul ascorbic s-a identificat în calitate de spot alb pe fondalul
de culoare roză în toate mostrele analizate cu expresia intensităţii spotului în descendenţă:
carpomasa violacee, crem-roză, fructe, carpomasa crem-albă şi verde.
Determinarea conţinutului de acid ascorbic. Dozarea acidului ascorbic s-a efectuat
prin metoda titrimetrică, bazată pe proprietatea acidului ascorbic de a reduce 2,6-
diclorfenolindofenolul [44]. Este importantă schimbarea culorii 2,6-diclorfenolindofenolului în
funcţie de valoarea pH a mediului: în alcalin – culoare albastră, în acid – roşie.
Reeşind din faptul, că 1 ml de soluţie 0,001H de 2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu,
utilizat pentru titrare, corespunde la 0,000088 g de acid ascorbic, conţinutul acidului ascorbic (X)
în raport cu PV uscat s-a calculat după formula 5.1:
VF 0 , 000088 V 1 100 * 100
X = , unde: (5.1)
mV 2 ( 100 − w )

V este volumul soluţiei de 0,001 n de 2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu, care s-a cheltuit la

titrare, ml; F – coeficientul de rectificare a titrului soluţiei de 0,01H de 2,6-
diclorfenolindofenolat de sodiu; V1 – volumul extractului probei de PV, ml; m – masa probei de
PV, g; V2 – volumul extractului luat pentru titrare, ml; w – pierderea din masa PV la uscare.
Conţinutul acidului ascorbic variază în funcţie de zonele geografice ale R. Moldova
(tabelul 5.2), biosinteza şi acumularea minimă revine fructelor recoltate în zona de Sud (9,1
mg/100g PV) şi maximă (18,5 mg/100g PV) – celor din zona de Nord. Datele bibliografice [386]
arată, că conţinutul de acid ascorbic în fructele de aronie are un diapazon larg, de la 8,0 până la
72 mg/100g de PV, iar în altele [47] nu depăşeşte nivelul de 2,0 mg/100g.
Rezultatele noastre denotă, că conţinutul de acid ascorbic în fructele de aronie variază de
la 9,1 la 18,5 mg/100g de PV, în funcţie de zonele geografice ale R. Moldova, caracterizate prin
complexe de factori pedo-climatici diferiţi, fapt remarcat şi în alte lucrări [112].

124
 Tabelul 5.2. Conţinutul acidului ascorbic (mg/100g de PV) în fructele de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot din diferite zone geografice ale R. Moldova
Nr. Zona Conţinutul acidului ascorbic
d/o geografică Localitatea mg/100g de PV
1. Sud Ocolul silvic, r. Cimişlia, s. Batâr 9,1±0,11
2. Grădina Botanică a AŞ a RM. 12,8±0,09
Centru

3. Ocolul silvic, r. Străşeni, s. Lozova 14,5±0,08

4. Grădina particulară, r. Orhei 16,4±0,10
5. Nord Ocolul silvic, r. Briceni, s. Colicăuţ 18,5±0,08

Rezultatele studiului conţinutului de acid ascorbic în carpomasele pigmentate in vitro

(fig. 5.1) arată, că carpomasa pigmentată violacee se caracterizează prin valoare maximă de acid
ascorbic (24,53 mg/100g), de 2 ori mai mare, decât în fructele de aronie in vivo (12,8 mg/100g),
cedează carpomasa pigmentată crem-roză (21,0 mg/100g), apoi cea crem-albă (18,1 mg/100g),
iar carpomasa verde are valoare minimă (13,5 mg/100g), comparativ cu alte carpomase
pigmentate, dar superioară fructelor (12,8 mg/100g), recoltate din Gradina Botanică (Institut) a
AŞM, care au servit în calitate de martor.

mg/100g
24,5

25 0,210

0,180
20

13,5
12,8
15

10

Fructe de aronie Carpomasă violacee Carpomasă crem-roz Carpomasă crem-alb Carpomasă verde

Fig. 5.1. Variaţia conţinutului de acid ascorbic în fructele de A. melanocarpa (Michx.)

Elliot şi carpomasele pigmentate in vitro.
În condiţii in vitro, dozele de 2,0-4,5 mg/l de ANA cu 0,5 mg/l de K în MN stimulează
biosinteza acidului ascorbic, cea optimă fiind de 2,5-3,5 mg/l, care a favorizat sinteza maximă de
24,53 mg/100g. Explantele, decupate din fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, inoculate
pe MN cu ANA, au generat carpomase pigmentate cu conţinut de acid ascorbic 18,1-24,5
mg/100 g de PV, iar pe MN, suplimentate cu 2,5-3,5 mg/l de 2,4 D, carpomase cu conţinut
minim – 13,5 mg/100g.

125
 Fructele de aronie sintetizează şi acumulează acid ascorbic, iar conţinutul lui variază în
funcţie de zona geografică a R. Moldova: minim – în zona de Sud (9,1 mg/100 g de fructe) şi
maxim (18,5 mg/100g de fructe) - în zona de Nord. Toate carpomasele pigmentate, generate in
vitro de la fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot păstrează capacitatea de biosinteză a
acidului ascorbic, iar conţinutul acumulat prevalează faţă de cel din fructe. Valoarea conţinutului
de acid ascorbic corelează cu tipul hormonilor adiţionaţi în MN: minimă – în carpomasa verde,
crescută pe MN cu doze de 2,4-D şi maximă (în ascensiune) – în carpomasele crem-albă, crem-
roză şi violacee, crescute pe MN cu doze de ANA.
5.3. Studiul biochimic al compuşilor fenolici în fructele in vivo şi carpomasele in vitro
5.3.1. Studiu calitativ şi cantitativ al flavonoidelor
Generalităţi. Flavonoidele reprezintă un grup de substanţe chimice de origine vegetală
înrudite, derivaţi ai 2-fenilbenzopiranului (flavonului) sau 3-fenilbenzopiranului (izoflavonului),
având la bază scheletul C6-C3-C6 [364]. Ei constituie o mare parte din pigmenţii naturali, care
dau culoare organelor vegetale. Majoritatea derivaţilor au nucleul A, la C5 şi C7 grupări hidroxil
alcoolice provenite din funcţia carbonilică a malonil-Co-A şi grupării OH fenolice în 4' sau 3' -
4', 3' - 4' - 5', provenite din compuşi fenilpropanici. Aceste grupări hidroxile pot fi metoxilate,
glicozidate sau prenilate. După gradul de oxilare şi hidroxilare a scheletului C6-C3-C6
flavonoidele se împart în mai multe grupe, care includ derivaţii: flavonei, flavanonei,
izoflavonei, flavonului, flavanonolului, flavanului, calconei [37] (fig. A.4.1).
Flavonoidele sunt incluse în CF vegetali pentru proprietăţile fizico-chimice, iar graţie
particularităţilor specifice farmacologice reprezintă PA valoroase. Flavonoidele menţin
integritatea capilarelor, contribuie la potenţarea acidului ascorbic, reduc acţiunea histaminei prin
inactivare şi protejează organismul împotriva acţiunii nocive a radiaţiilor UV, posedă acţiune
antibacteriană, antivirotică şi antioxidantă [148,163,247,269,325].
Flavonoidele sunt foarte diverse şi pot fi prezente ca agliconi sau sub formă heterozidică,
partea glucidică fiind reprezentată prin glucoză, ramnoză, arabinoză, galactoză, xiloză, acid
glucuronic etc. În fructele de aronie flavonoidele se întâlnesc şi ca dimeri [320], reprezentând
biflavonoide cu însuşiri farmacologice, cea mai importantă fiind acţiunea P-vitaminică [33].
Flavonoidele, din punct de vedere chimic, sunt foarte labile, iar carcteristicile lor fizico-
chimice stau la baza studiului biochimic calitativ. Flavonoidele reprezintă substanţe solide,
cristalizate, colorate în culori vii de diferite intensităţi, lipsite de gust şi miros [364]. Culoarea
derivaţilor flavonici este datorată grupărilor cromofore – C=C-C<. Gruparea hidroxolică din
poziţia 3 cauzează coloraţia galbenă, iar cele din poziţiile 3' şi 4' – coloraţia galbenă intens. Când
în toate poziţiile amintite sunt grupări hidroxilice, culoarea se accentuiază şi se deplasează spre

126
oranj. În cazul antocianilor, colorarea se produce prin alt mecanism, formarea de legături cu acizi
şi baze, în plus, se mai formează un sistem continuu de legături duble conjugate, alături de
legătura chinonică [49]. În lumina UV, flavonoidele prezintă fluorescenţă caracteristică:
agliconii flavonoidelor sau cele, care posedă un OH liber în poziţia 3 – galbenă-aurie până la
galbenă-verzuie; când OH din poziţia 3 lipseşte sau este blocat prin glicozidare, fluorescenţa de
culoare brună. În cazul când OH este metilat, odată cu creşterea gradului de metilare, nuanţa
fluorescenţei trece în albastru luminos. În soluţii acide au fluorescenţă de culoare galbenă-
verzuie, cu acid clorhidric şi albastră, cu acid sulfuric concentrat, ca urmare a formării sărurilor
de flaviu în lumina vizibilă. Flavonoidele prezintă spectre de absorbţie caracteristice în UV şi
infraroşu [49,178, 364].
Reacţii specifice de identificare. S-au aplicat reacţii specifice de colorare şi sedimentare
[44,49] în extractele alcoolice analizate, iar efectele reacţiilor au fost foarte diverse şi
reprezentate în tabelul A.4.2.
Reacţia cianidinică (reacţia Shibata) prin aplicarea HCl concentrat şi a Zn metalic
formează antocianii în soluţiile analizate, identificate prin apariţia coloraţiei roşii în mediul acid.
Reacţia are loc prin reducerea hidrogenului eliberat în reacţia dintre Zn şi HCl. Apariţia
coloraţiei roşii sau portocalii, indică şi prezenţa agliconilor flavonoidelor; culoarea roşie este
caracteristică flavonolilor, iar cea oranj, flavonelor.
Reacţia cu acetat de Pb. La aplicarea acetatului de Pb în probele analizate, doar în
carpomasele crem-roză, crem-albă şi verde, prin colorarea în galben, s-au identificat flavonele,
care au grupe ortohidroxile libere în inelul B, iar prin precipitatele colorate în roşu din extractele
fructelor şi a carpomasei violacee –antocianii.
Reacţia cu soluţie de amoniac. Colorarea extractelor din carpomasele crem-albă şi verde
în galben, care la încălzire trece în oranj, demonstrează prezenţa flavonelor, flavononelor,
flavonolilor şi flavononolilor. Coloraţia în albastru a extractelor din fructe, carpomasele violacee
şi crem-roză, la tratarea cu soluţie de amoniac, denotă prezenţa antocianilor.
Reacţia cu acidul azotic concentrat. Flavonele formează săruri de flaviu, colorate în
galben intens, care dau fluorescenţă verde sau albastră-violet, bazată pe transformarea structurii
nucleului piranic în aromatic, iar oxigenul carbonilic se găseşte sub formă de oxidril. Colorarea
în galben, iar la temperatură, trecerea în culoare roşie, denotă prezenţa flavonoidelor în fructe,
carpomasele violacee şi crem-roză.
Reacţia cu soluţie de 1% de vanilină în acid clorhidric concentrat. Colorarea în roşu-
zmeuriu arată prezenţa catehinelor în toate probele analizate.

127
 Reacţia cu baza de natriu de 10% în alcool etilic. Flavonele, flavonolii, flavanonele în
prezenţa unei substanţe alacaline dau coloraţie galbenă, iar la încălzire – până la roşu.
Schimbarea culorii se datorează izomerizării flavanonei în chalconă. La dizolvarea în acid
sulfuric, flavanonele formează săruri ale chalconelor de culoare portocalie până la roşu. Efecte
ale reacţiilor în extractele analizate au fost înregistrate de la galben tulbure cu trecere în roşu în
carpomasa violacee şi de la galben tulbure cu trecere în oraj – în crem-roză şi crem-albă.
Reacţia cu clorura de aluminiu de 1%. Grupele principale flavonoidice (flavonolii,
flavanonele, flavonele) se colorează în galben. Prezenţa grupărilor oxidril-alcoolice în
vecinătatea grupării ceto permite formarea de chelaţi cu metalele trivalente [Al(III)] şi colorare
în galben mai intens decât flavona iniţială. Flavonele cu grupări OH libere la C3 sau C5 (5.2)
formează împreună cu gruparea ceto de la C4 chelaţi, în poziţia orto (I) sau peri (II).

HO O HO O

O OR
OH O Al O O
(5.2)
Al
I II
Aceşti compuşi se pot obţine şi atunci, când pe nucleul B există 2 grupări OH vecine, iar
mediul de reacţie este alcalin, în aceste condiţii gruparea din 4OH΄ se transformă în grupare
cetonică prin tautomerie, poziţia para. Chelaţii obţinuţi sunt de culoare galbenă intensă şi au o
fluorescenţă galbenă-verzuie în UV. Efectele reacţiilor în extractele fructelor şi carpomaselor
pigmentate sunt diferite după intensitatea culorii şi sedimentului (tabelul A.4.2), datorită
prezenţei unui complex de grupe flavonoidice.
Diapazonul efectelor reacţiilor specifice în probele analizate este mai larg în carpomasele
pigmentate, decât în fructe, ce demonstrează prezenţa unui spectru flavonoidic diferit. Condiţiile
in vitro cauzează sinteza unei componenţe chimice flavonoidice diferite, care corelează cu tipul
hormonilor adiţionaţi MN. Screening-ul rezultatelor reacţiilor calitative pentru identificarea
flavonoidelor a demonstrat prezenţa favonolilor, flavononelor, flavonelor, antocianilor şi
catehinelor în fructe şi în carpomasele pigmentate cu unele specificări (tabelul 5.3).
Identificarea flavonoidelor pe CSS. Studiul calitativ al flavonoidelor în fructele şi
carpomasele pigmentate in vitro de aronie s-a realizat pe CSS conform metodicii [49], care
include mai multe etape (fig. A.4.2). Analiza cromatogramelor se bazează pe compararea Rf-
rilor spoturilor extractelor analizate cu Rf-rile substanţelor etalon (rutozida, quercitozida şi
quercetolul.

128
Tabelul 5.3. Grupele de flavonoide identificate în extractele fructelor şi carpomaselor pigmentate
de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Reacţia Fructe Carpomasă Carpomasă Carpomasă Carpomasă
aplicată violacee crem-roză crem-albă verde
Flavonoli, Flavonoli, Flavonoli,
Cianidinică flavonone, flavonone, flavonone, flavone flavone
flavone flavone flavone
Acetat de Flavone, Flavone, flavone flavone flavone
Pb antociani antociani
Flavone, Flavone,
Soluţie de Antociani Antociani Antociani flavonone, flavonone,
amoniac flavonoli, flavonoli,
antociani antociani
Soluţie de
vanilină în Catehine Catehine Catehine Catehine Catehine
HCl

După volatilizare cromatogramele obţinute (fig. 5.2;5.3;A.4.2;A.4.3) s-au examinat la

lumina zilei şi în razele UV, la 365 nm. Analizele comaparate ale cromatogramelor, obţinute în
diferite sisteme mobile, denotă că, în sistemul - acetat de etil:acid acetic glacial: acid formic
anhidru:apă (fig. 5.2,5.3), cu 4 substanţe de referinţă, s-au idenificat rutozida Rf=0,50 şi acidul
clorogenic Rf=0,55 în toate probele analizate. De menţionat prezenţa spoturilor neidentificate cu
Rf=0,4 în fructe, carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă bine evidenţiate, iar în carpomasa
verde – sub formă de urme.
Analiza CSS din sistemul mobil butanol:acid acetic glacial:apă (fig. A.4.3),
demonstrează că atât în extractul din fructe, cât şi din carpomasele pigmentate sunt prezente 3
fracţiuni flavonoidice identificate prin spoturi cu fluorescenţa: galbenă-brunificată în UV (365
nm) corespunzătoare rutozidei (Rf=0,60); galbenă – quercitozidei (Rf=0,80), galbenă-albăstruie -
quercetolului (Rf=0,88). Spoturile cu clorofilă dau o fluorescenţă roşie. Spoturi neidentificate cu
diferită fluorescenţă şi diferite valori ale Rf-lui şi au şi o prezenţă diferită în probele analizate:
0,70, în toate probele analizate; 0,43, în toate carpomasele pigmentate; 0,46 şi 0,84, în
carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă (MN, suplimentate cu doze de ANA) şi 0,72 –
doar în carpomasa verde, de pe MN cu doze de 2,4-D (tabelul A.4.3).
Rezultatele analizei studiului flavonoidic pe CSS au pus în evidenţa prezenţa
quercetolului, quercitozidei, rutozidei şi a acidului clorogenic în fructe şi carpomasele
pigmentate. Au fost marcate flavonoide neidentificate: în fructe (1 spot); în toate carpomasele
pigmentate (3 spoturi); în carpomasele de pe MN, suplimentate cu doze de ANA – (1 spot); în
carpomasele de pe MN, cu doze de 2,4-D (1 spot).

129
 1 2 3 4 5 6,7 8 9
Fig. 5.2. Cromatograma identificării flavonoidelor la lumina zilei: Probele extractelor de
analizat: 1 – fructe; 2 – carpomasă violacee; 3 – carpomasă crem-roză; 4 – carpomasă crem-albă;
5 – carpomasă verde. Substanţele de referinţă: 6 – rutozidă; 7 – quercitozidă; 8 – acid cafeic; 9
– acid clorogenic.

1 2 3 4 5 6,7 8 9
Fig. 5.3. Cromatograma identificării flavonoidelor în raze UV – 365 nm. Probele extractelor de
analizat: 1 – fructe; 2 – carpomasă violacee; 3 – carpomasă crem-roză; 4 – carpomasă crem-albă;
5 – carpomasă verde. Substanţele de referinţă: 6 – rutozidă; 7 – quercitozidă; 8 – acid cafeic; 9
– acid clorogenic.

130
 Determinarea conţinutului de flavonoide. Studiul flavonoidelor în extractele
carpomaselor pigmentate in vitro şi fructelor de aronie s-a realizat prin metoda
spectrofotometrică [44,49]. Concentraţia flavonoidelor s-a determinat cu curba etalon pentru
rutozidă (fig.A.4.4). Calculele privind determinarea concentraţiei rutozidei în probele analizate s-
au realizat prin formula 5.3:
C = x · 100 : a · 10 . 5 , unde (5.3)
25 25

x – valoarea corespunzătoare absorbantei la lungimea de undă de 430 nm, a – masa PV, luat
pentru analiză.

0,478 0,483
%
0,5 0,43

0,401
Fructe 0,45

Carpomase: 0,4

violacee
0,35

Crem-roză 0,3 0,2 30

0,25
Crem-albă
0,2

v
Verde 0,15

0,1

0,05

0
1

Fig. 5.5. Conţinutul flavonoidelor în carpomasele pigmentate şi fructele de aronie.

Analizele rezultatelor experimentale (fig.5.5) denotă o echivalenţă a conţinutului de

flavonoide (exprimată în rutozidă) în fructe şi carpomasa violacee (respectiv, 0,478 şi 0,483 %),
cu o tendinţă de prevalare în ultima. În carpomasele crem-roză şi crem-albă conţinutul
flavonoidelor scade puţin (0,430% şi 0,401%), pe când în carpomasa verde, este înjumătăţit
(0,230%), faţă de cel al carpomasei violacee şi al fructelor de aronie. Studii fitochimice similare,
dar la fructele de afin in vivo şi in vitro [187], denotă, la fel, aproape o echivalenţă a conţinutului
flavonoidic, dar cu unele deosebiri cantitative privind unii constituienţi separaţi (conţinutul
quercitozidei de 2 ori mai mare în carpomase, decât în fructe).
Rezultatele studiului flavonoidelor denotă prezenţa quercetolului, quercitozidei şi
rutozidei în carpomasele şi fructele de aronie. Conform unor lucrări ştiinţifice [148,196] în
fructele de aronie a fost identificată quercitozida şi kaempferolul, iar în altele [124], doar

131
prezenţa quercitozidei şi sub formă de urme, miricetina şi kaempferolul. În lucrări recente [343]
a fost determinată quercitozida şi derivaţi neidentificaţi, similar studiului [23]. Studiul
flavonoidic comparativ arată că potenţialul biosintetic flavonoidic se manifestă mai accentuat în
carpomasele in vitro, decât în fructele de aronie. Carpomasele pigmentate, obţinute pe MN cu
doze de ANA, sintetizează flavonoide în cantităţi mai mari în carpomasa violacee şi aproape
echivalente în carpomasele crem-roză, crem-albă şi fructele de aronie. Cea mai mică concentraţie
de flavonoide se înregistrează în carpomasa verde, generată pe MN, suplimentat cu 2,4-D,
valoare de 2 ori mai mică decât în carpomasele violacee şi fructele de aronie.
Studiul flavonoidic relevă, că analiza calitativă prin CSS este o metodă rapidă şi facilă de
diferenţiere a CF prezenţi în fructele de aronie in vivo şi în carpomasele in vitro, unde fiecare CF
reprezintă o amprentă cromatografică specifică. Rezultatele obţinute arată că rutozida,
quercitozida şi quercetolul se sintetizează atât în fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot, cât
şi în toate carpomasele pigmentate obţinute in vitro, iar cantitativ prevalează în carpomasa
violacee faţă de celelalte specimene analizate. Conţinutul minim de flavonozide este specific
carpomasei de culoare verde, generată pe MN, suplimentat cu doze de 2,4-D.
5.3.2. Studiul calitativ şi cantitativ al antocianilor
Generalităţi. Antocianii sunt reprezentaţi prin derivaţii flavanului, pigmenţi vegetali,
responsabili de culoarea roşie, violetă, albastră a fructelor, florilor şi altor organe. La baza
structurii antocianilor stă cationul de piriliu sau flaviliu, un ion de oxoniu, unde atomul de oxigen
este trivalent, cu sarcină pozitivă, care dă stabilitate [364]. Se cunosc 3 grupe principale de
antocianidine (capi de serie), clasificate după numărul hidroxililor substituiţi la fenilul legat de
C-2 (inelul B): pelargonidolul, cianidolul şi delfinidolul [33]. Conform lucrării lui M. Tămaş
[319], pelargonidolul şi cianidolul şi glicozidele lor sunt prezente în fructele de aronie.
În antociani (glicozidele), glucidele (mono-, diglucidele) se leagă de antocianidine
(aglicon), de obicei la hidroxilul de la C-3 de pe heterociclu. În lumea vegetală cu prevalenţă se
sintetizează antocianii monoglicozidici, mai rar se întâlnesc antocianii diglicozidici. Antocianii,
sub formă de cianidină 3,5-diglucozidă, cu un conţinut de 13,5%, din totalul antocianic, sunt
menţionaţi şi în fructele de aronie [163]. Conţinutul antocianilor în fructele de aronie este
variabil: 405,6 mg/100g fructe [148], 640 mg/100g fructe [141], mai mult de 800 mg/100g fructe
[23,81,319 şi 1480 mg/100g fructe [320]. Proprietăţile fizico-chimice ale antocianilor stau la
baza reacţiilor de identificare. Varietatea culorilor este determinată de valoarea pH vacuolar, în
mediul acid – roşie, iar în alcalin – albastră. Cu acizii minerali formează săruri stabile de culoare
roşie. Antocianidinele cu grupări hidroxilice învecinate formează cu metalele (Al, Fe) compuşi
complecşi de culoare albastră [33,37].

132
 Identificarea antocianilor pe CSS. Identificarea antocianilor a fost realizată prin
metoda CSS conform recomadaţiilor metodice [37,319]. Probele analizate s-au aplicat pe placa
cromatografică alături de martori (cianidina şi pelaronidina) în 2 sisteme mobile: acid
acetic:clorhidric:apă (30:3:10) [319] şi butanol:acid acetic:apă (19:2:19) [37].
În primul sistem (cu distanţa de parcurgere 10,5 cm) au fost depistate 2 spoturi în
probele analizate: cu Rf=0,40, care corespunde cianidinei şi cu Rf=0,56, revine pelargonidinei
(fig. A.4.5). Au fost spoturi antocianice neidentificate: cu Rf= 0,35 şi 0,43 în toate carpomasele,
cu excepţia fructelor; cu Rf=0,45 şi 0,50 în fructe şi carpomasele violacee şi crem-roză; cu
Rf=0,72 şi 0,78 doar în carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă, iar cu Rf=0,62 – în
carpomasa verde (tabelulA.4.4). În al doilea sistem – cianidina, cu Rf=0,68 şi pelargonidina cu
Rf=0,8. În UV, cianidina dă fluorescenţă brun-roşietică, iar pelargonidina, brună (fig. A.4.5).
Rezultatele denotă că carpomasele pigmentate, dezvoltate pe MN cu diferite doze de
ANA în combinaţie cu 0,5 K, sintetizează o paletă mai largă de compuşi, decât carpomasele
obţinute pe MN cu doze de 2,4-D şi în ambele cazuri – mai diverse, decât în fructele de aronie.
Suplimentarea MN cu 2,4-D induce sinteza unui constituent antocianic cu Rf=0,62, care nu se
sintetizează în fructele de aronie şi nici în culturile in vitro de pe MN, cu doze de ANA.
Determinarea conţinutului de antociani. S-a efectuat prin metoda spectrofotometrică
[49,319], extincţia s-a măsurat la lungimea de undă 535 nm a extractului alcoolic cu HCl (85:15)
a mostrelor luate pentru analiză, ţinute la rece timp de 24 ore. Conţinutul antocianilor (mg/ml) a
fost calculat conform formulei 5.4:

A·D
Antociani (mg/ml) 98,2 · m unde, (5.4)

A – extincţia absorbanţei probei de analizat; D – factorul de diluţie (ml); 98,2 = E 1%: 1 cm la

535 nm; m – masa PV.
Rezultatele (fig. 5.6) relevă că conţinutul maxim antocianic revine fructelor de aronie,
818 mg/100 PV, puţin cedează carpomasa violacee, 780 mg/100 PV. Comparativ, în
carpomasele violacee şi crem-roză, conţinutul antocianic este mai mare, decât în fructele de
aronie, analizate în alte lucrări [148]. În carpomasele crem-albă şi verde valoarea conţinutului
antocianic este înjumătăţită, faţă de fructele de aronie şi carpomasa violacee.
În toate specimenele analizate au fost identificaţi antocianii: cianidina şi pelargonidina
[81], ce confirmă rezultatele unor lucrări la fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot [319], pe
când în alte lucrări [148,224] a fost depistată doar cianidina, care conform unor lucrări[148,343]
reprezintă un amestec de 4 glicozide.

133
 mg/100g PV

818
680
900

800 540
700
436
600 401

500

400

300

200

100

ronie
e de a
fruct

Fig. 5.6. Conţinutul antocianic în carpomasele pigmentate şi fructele de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot.
Balanţa hormonală, adiţionată MN, îndeplineşte rol reglator în inducerea biosintezei
selective a constituenţilor antocianici în carpomasele pigmentate, necaracteristici fructelor de
aronie cu spoturi neidentificate: 2 cu Rf=0,35 şi 0,43 în toate carpomasele; 2 cu Rf=0,72 şi 0,78
– în carpomasa violacee, crem-roză şi crem-albă, de pe MN, cu doze de ANA; 1 cu Rf=0.62 în
carpomasa verde, obţinută pe MN, cu doze de 2,4-D.
5.3.3. Studiul calitativ şi cantitativ al compuşilor fenilpropanici
Generalităţi. În categoria de compuşi aromatici de tip C6-C3 intră constituienţii fenolici:
acidul cafeic, derivaţii monocafeilchinici (acidul clorogenic şi izomerii lui) şi dicafeilchinici
(cinarina şi izomerii) [49]. Aici se încadrează şi acidul cichoric, acidul p-cumaric, alcoolul
sinapic şi acidul cinamic (fig.A.4.6). Un grup de derivaţi fenilpropanici este reprezentat de esterii
fenilpropanici, rezultaţi prin esterificarea unei di- sau triozide cu o moleculă de
dihidroxifeniletanol, rar ca heterozide [33]. Cel mai răspândit acid fenilpropanic este cel cafeic,
care uneori este substituit cu acidul p-cumaric sau ferulic [37]. Compuşii fenilpropanici posedă
calităţi antioxidante, anihilând acţiunea radicalilor oxid şi peroxid, care intervin în procesele de
îmbătrânire [47,141].
Studiul calitativ şi cantitativ al compuşilor fenilpropanici a fost realizat în extractele
fructelor de aronie şi carpomasele pigmentate (violacee, crem-roză, crem-albă şi verde) in vitro.
Studiul calitativ al compuşilor fenilpropanici. Conform tehnicilor metodice [31,49]
extractele metanolice de 5% ale probelor analizate au fost supuse analizei calitative prin tratarea
cu reactivul Arnow (10 g azotit de sodiu şi 10 g molibdat de sodiu, dizolvate în 100 ml apă –
soluţie proaspătă), care în prezenţa HCl şi a NaOH s-au colorat în roşu cu diferite intensităţi în
descreştere: carpomasa violacee, crem-roză, fructe, crem-albă, verde. Acidul cafeic şi derivaţii

134
săi la interacţiunea cu reactivul respectiv se colorează în roşu, ceea ce arată prezenţa lor în
probele analizate, iar diferenţele intensităţii culorii denotă conţinutul lor cantitativ diferit.
Identificarea compuşilor fenilpropanici prin CSS. În calitate de martori au servit acizii
cafeic şi clorogenic. Faza mobilă utilizată: acetat de etil:apă:acid formic:acid acetic în coraport
72:14:7:7, distanţa de migrare – 8,0 cm. Cromatogramele (fig.A.4.7) au fost analizate în lumina
vizibilă şi UV, la 365 nm (tabelul A.4.5). La lumina vizibilă, în toate probele analizate, s-au
marcat 2 spoturi brune, care, în UV, corespund acidului clorogenic (Rf=0,55) cu fluorescenţă
brun-cărămizie şi acidului cafeic (Rf=0,91) cu fluorescenţă albastră. Spoturi neidentificate,
brune, în lumina vizibilă, cu fluorescenţă galbenă (Rf=0,32) au fost văzute în carpomasele
violacee, crem-roză şi crem-albă; galbenă-verzuie (Rf=0,42) şi brună (Rf=0,52), doar în
carpomasa verde; galbenă-violet (Rf=0,62) – în toate probele analizate; galbenă şi marginal
albăstruie (Rf=0,73) – în toate carpomasele; galbenă-roşiatică (Rf=0,94) în carpomasele
violacee, crem-roză şi crem-albă.
Rezultatele demonstrază, că 3 spoturi au fost prezente în toate probele analizate, ceea ce
denotă, că potenţialul de sinteză al compuşilor fenilpropanici, caracteristici pentru fructele de
aronie, s-a manifestat şi în carpomasele in vitro, indiferent de formula hormonală adiţionată MN
[23]. Condiţiile de cultură in vitro au indus biosinteza unor CF în carpomase, nespecifici
fructelor. Prezenţa a 2 spoturi neidentificate (Rf=0,32 şi 0,94) în carpomasele de pe MN,
suplimentat cu ANA şi a altor 2 (Rf=0,42 şi 0,52), în carpomasele de pe MN, cu 2,4-D,
demonstrează influenţa selectivă şi individuală a hormonilor asupra biosintezei CF de tip C6-C3.
Determinarea conţinutului de compuşi fenilpropanici. S-a efectuat prin metoda
spectrofotometrică [49], bazată pe proprietatea compuşilor fenilpropanici de a forma
nitrozoderivaţi cu acidul azotos, ce se izomerizează în oxime şi datorită caracterului lor slab acid,
se dizolvă în soluţii alcaline, rezultând coloraţie roşie. Extincţia probelor analizate s-a citit la
lungimea de undă 500 nm, în raport cu soluţia de referinţă. Determinarea cantitativă s-a efectuat
cu curba etalon a substanţei de referinţă (acidul cafeic), construită în baza valorilor absorbanţelor
şi a concentraţiilor corespunzătoare, conform formulei 5.5:
y = 0,0790 + 1,4752 x (5.5)
Unde: y – absorbanţa probei (500nm); x – concentraţia corespunzătoare absorbanţei citite.

Conţinutul cantitativ (%) de compuşi fenilpropanici s-a calculat prin formula 5.6:
a·5 1
C = x · 80 : . (5.6)
50 25

unde: C – concentraţia (%); a – cantitatea de PV (g); x – concentraţia absorbanţei citite.

135
 Totalul acizilor fenilpropanici a variat astfel: 0,178% – în fructe; cantitatea dublă faţă de
fructe, în carpomasa violacee (0,372%) şi crem-roză (0,341%); 0,295% – în crem-albă şi 0,201%
în cea verde (fig.5.7). Conţinutul CF în fructele de aronie este variabil 0,240-0,300% [112] şi
0,305% [325]. Carpomasele pigmentate sintetizează acizi fenilpropanici în cantităţi superioare
fructelor de aronie [23].

%%
0,4

0,35

0,3

0,25 fructe de
aronie

0,2 carpomasa
violacee

0,15
carpomasa
crem-roză
0,1
carpomasa
crem-albă
0,05

carpomasa
verde
0
fructe de aronie carpomasa carpomasa crem- carpomasa crem- carpomasa verde
violacee roză albă

Fig. 5.7. Conţinutul compuşilor fenilpropanici în carpomasele pigmentate şi fructele de aronie.

5.3.4. Studiul calitativ şi cantitativ al taninurilor
Generalităţi. Taninurile sunt substanţe organice polifenolice cu diferită masă
moleculară, compuşii de tip C6-C3-C6, din care fac parte catecholii, derivaţii 3-hidroxiflavanului,
care prin condensare formează taninuri catechice. Proprietăţi similare au compuşii C6-C1, acidul
galic şi derivaţii săi, care sub formă de esteri, constituie taninurile galice. Se întâlnesc şi
taninurile mixte, esteri ai acidului galic cu catecholul, epicatecholul şi galocatecholul [33].
Taninurile sunt răspândite în lumea vegetală, iar structura corelează cu starea fiziologică
a plantei. Taninurile pot fi dizolvate în sucul vacuolar al celulelor organelor vii şi pot cristaliza
pe pereţii celulelor celor uscate [33,124]. Ele sunt substanţe solide, amorfe, lipsite de miros, cu
gust astringent, cu proprietăţi de tăbăcire a pielii şi precipită proteinele şi alcaloizii din soluţii
diluate, se dizolvă în apă caldă, mai greu la rece, formând soluţii coloidale (solubilitatea
corelează cu gradul de condensare), în alcool, acetonă, acetat de etil; sunt insolubile în eter,
cloroform, benzen, eter de petrol şi în alţi solvenţi organici apolari. Fiind fenoli, au proprietăţi
reducătoare. Caracterul acid al taninurilor se datorează grupurilor –COOH şi –OH fenolice
libere. Acizii şi sărurile minerale precipită taninurile din soluţiile coloidale [49].

136
 Taninurile galice (hidrolizabile) şi taninurile catechice (condensate) pot fi identificate în
mediul acid, la cald: taninurile galice hidrolizează, eliberând acid galic, acid elagic sau derivaţi;
taninurile catechice, în aceleaşi condiţii, formează polimeri brun-roşiatici (flobafene) prin
condensare la C4-C8 şi C4-C6. În mediul alcalin, prin topire, taninurile se descompun, formând
acid galic (taninurile galice) sau acid protocatechic şi floroglucinol (taninurile catechice). Toate
taninurile în soluţie precipită cu gelatina, alcaloizi, metale grele şi cu soluţii saturate ale unor
săruri de clorura şi sulfat de sodiu şi de amoniu, fosfat de amoniu. Proprietăţile fizico-chimice
ale taninurilor stau la baza reacţiilor calitative generale şi specifice de identificare.
Reacţii calitative de identificare a taninurilor au fost aplicate conform tehnicilor
metodice [33,49], iar rezultatele prezentate în tabelul A.4.6.
Reacţia cu gelatină de 1% şi 10% de clorură de sodiu. Taninurile în prezenţa gelatinei au
dat opalescenţă în toate probele analizate, dar cu diferite intensităţi: pronunţată în carpomasele
violacee şi crem-roză, apoi în descendenţă în fructe, carpomasa crem-albă şi verde.
Reacţia cu sare mijlocie a acetatului de plumb de 10%. Taninurile hidrolizabile formează
precipitat negru-albastru, iar cele condensate, precipitat negru-verde. În toate probele analizate a
rezultat precipitat cu coloraţie şi intensitate diferită: foarte pronunţat în carpomasa violacee şi
slab pronunţată în carpomasele crem-albă şi verde.
Reacţia cu alăuni de fier şi amoniu cu taninurile hidrolizabile formează precipitatul
negru-albastru, iar cu cele condensate, negru-verde. În fructe, carpomasa violacee – precipitat cu
nuaţă brună, în crem-roză, crem-albă şi verde, opalescenţă, apoi o coloraţie în nuanţă verde.
Reacţia cu cristale de NaNO3 şi HCl de 0,1H. În prezenţa taninurilor hidrolizabile apare
culoarea cafenie. În probele analizate a rezultat o coloraţie zmeurie în extractele fructelor şi
carpomasei violacee şi în roză în celelalte probe analizate.
Reacţia cu clorură de fier 1% şi HCl. În toate probele analizate apare precipitatul, doar
că pentru fiecare este caracteristică o anumită coloraţie.
Reacţia cu apă de brom. Taninurile catechice (condensate) dau precipitate de culoare
galbenă şi în probele analizate s-a înregistrat nuanţe de la galben-brun, la galben-negricios.
Cromat de potasiu în bisulfat de sodiu cu taninurile galice dau o coloraţie roşie. A fost o
coloraţie în roşu brunificat în extractele fructelor şi carpomasele crem-albă şi verde şi roşie
negricioasă în carpomasele violacee şi crem-roză.
Rezultatele obţinute (tabelul A.4.6) arată un diapazon larg al efectelor reacţiilor în
probele analizate, deseori cu devieri ale intensităţii precipitatului sau a coloraţiei faţă de cel
aşteptat, induse de prezenţa taninurilor asociate cu diverşi CF (antociani, flavonoli, proantociani,
acizi fenilpropanici) şi compuşi de altă natură chimică, prezenţi în mostre [23,82]. Intensitatea

137
precipitatului şi nuanţele coloraţiei corelează cu tipul carpomasei pigmentate. Efecte pronunţate
similare sunt menţionate în extractele fructelor de aronie şi carpomasele violacee, care se
atenuează cu unele specificări în cele crem-roză, crem-albă şi verde. Rezultatele reacţiilor denotă
prezenţa taninurilor hidrolizable şi a celor condensate în toate mostrele analizate.
Determinarea conţinutului de taninuri s-a efectuat prin metoda titrimetrică [33], bazată
pe proprietatea taninurilor de a se oxida repede cu permanganatul de K. Probele analizate au fost
supuse extragerii în apă pe baie, timp de 30 min până la reacţia negativă cu soluţia de alăuni de
fier şi amoniu. Soluţiile extractive în prezenţa acidului indigosulfonic se titrează cu 0,1H
permanganat de K până la apariţia culorii galbenă-aurie. Conform rezultatelor obţinute (fig.
5.12), maximul conţinutului de taninuri revine carpomasei violacee – 11,3%, puţin cedează
carpomasa crem-roză (9,2%), urmată de fructe (7,7%). Aproape de 3 ori mai puţin este
conţinutul taninurilor în carpomasa crem-roză (4,7%) şi de 4 ori mai puţin în carpomasa verde
(2,6%), în raport cu carpomasa violacee (11,3%).

11,3
%
12

9,2
10

7,7

6 4,7

4 2,6

0
fructe aronie carpomasa violacee carpomasa crem-roz carpomasa crem-alb carpomasa verde

Fig. 5.8. Conţinutul taninurilor în carpomase şi fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.

5.3.5. Determinarea cantitativă a totalului polifenolic
Totalul polifenolic în extractele carpomaselor in vitro şi a fructelor de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot a fost determinat prin metoda Folin-Ciocalteu [146,299], exprimat prin mg a
echivalentului acidului galic (AGE) la kilogram de PV (tabelul 5.4). Conţinutul polifenolic în
carpomasele pigmentate variază de la 36 780 mg/kg – în carpomasa verde până la 65 579 mg/kg
în cea violacee. De menţionat, că în carpomasele pigmentate violacee, crem-roză, crem-albă,
crescute pe MN, suplimentate cu diferite doze de ANA şi 0,5 mg/l de K, conţinutul polifenolic
este mult superior, faţă de cel din carpomasa verde, dezvoltată pe MN, suplimentat cu doze de
2,4-D şi 0,5 mg/l de K.

138
 Tabelul 5.4. Conţinutul totalului polifenolic în carpomasele şi fructele de aronie
Conţinutul totalului polifenolic
Extractele analizate (mg/kg)
Violacee
Carpomase 65 570±800
pigmentate
Crem-roză 52 910±720
Crem-albă 51 170±400
Verde 36 780±880
Proaspete 63 123±1153
de aronie
Fructele

0
Uscate la temperatura de 60 C 58 370±1490
Uscate la temperatura camerei 34 210±610
Congelate la temperatura de 40C 60 896±1610

Maximul conţinutului polifenolic se înregistrează în carpomasa violacee (65 579 mg/kg).

Carpomasele crem-roză şi crem-albă se caracterizează printr-un conţinut aproape echivalent
(52 910 şi 51 170 mg/kg, respectiv), care puţin cedează, în raport cu cel din carpomasa violacee
(65 570 mg/kg). Grupa şi variantele hormonale, adiţionate în MN au un rol decisiv în biosinteza
şi acumularea conţinutului polifenolic, determinate de activitatea enzimei-chee,
fenilalaninamonialiaza [85] şi a altor enzime cu rol important în asigurarea calităţii fructelor
[142,219,324]. Activitatea fenilalaninamonialiazei este dirijată de condiţiile de creştere şi
dezvoltare a plantei. O sporire a activităţii acestei enzime şi respectiv a conţinutului polifenolic a
fost remarcată în plantele, crescute pe soluri cu deficit mineral [98]. Temperaturile scăzute
sporesc activitatea enzimei, conducând la acumularea considerabilă a CF în frunze [313]. La
congelarea fructelor de aronie are loc acumularea mai sporită a polifenolilor (60 896 mg/kg), în
raport cu cele uscate la temperatura camerei (34 210 mg/kg), rezultate ce vin în conformitate cu
datele altor lucrări [98]. Congelarea reprezintă un factor de stres [219,345,358], iar celulele,
afectate de factorii de stres de orice natură, tind spre acumularea CF ca protecţie. Conţinutul
sporit a CF din carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă, obţinute pe MN cu diferite doze
de ANA (tabelul 5.4) presupune şi o avansare în activitatea fenilalaninamonialiazei, nemijlocit,
implicată în biosinteza CF, comparativ cu carpomasa verde, de pe MN cu 2,4-D [219].
Rezultatele obţinute demonstrează că modul de pregătire a fructelor pentru analize
influenţează conţinutul totalului polifenolic. Fructele de aronie proaspete au conţinut sporit
polifenolic 63 123 mg/kg, faţă de cele congelate (60 896 mg/kg) şi aproape dublu faţă de
fructele uscate îndelung la temperatura camerei (34 210 mg/kg), valoare mai mică, decât în
carpomasa pigmentată verde (36 780 mg/kg). Astfel, congelarea asigură păstrarea conţinutului
polifenolic în fructele de aronie, pe când uscarea la temperatura camerei şi la cea de 600C
contribuie la pierderea în conţinutul polifenolic, comparativ cu fructele proaspete. Rezultate
similare, privind variaţiile conţinutului polifenolic în fructele suculente ale diferitor specii,

139
întâlnim în alte lucrări [124]. Se menţionează variaţia conţinutului de mircetină şi kaemferol, faţă
de alţi constituienţi fenolici, pe parcursul perioadelor îndelungate de păstrare la temperatura
camerei [124,157], bazată pe sensibilitatea diferită a constituienţilor, care şi determină acţiunea
selectivă a regimului de păstrare asupra CF. Rezultatele obţinute în studiul recent, privind
conţinutul totalului polifenolic în fructele de aronie, comparate cu datele din literatură (tabelul
A.4.7) demonstrează fluctuaţii mari, determinate de condiţiile de creştere şi dezvoltare ale plantei
[24,25,148,320,343], deşi unii autori [301] menţionează că elementele minerale din sol nu
manifestă un impact decisiv asupra conţinutului polifenolic din fructele de aronie.
Condiţiile pedo-climatice ale R.Moldova, cu deficit de umiditate pe perioada estivală,
persistenţa vânturilor uscate, temperaturilor sporite ale solului şi aerului, vin în contradicţie cu
necesităţile vitale ale plantei din patrie (solurile, atmosfera şi vânturile umede, regimul moderat
de temperaturi pe tot parcursul anului) [283] şi conduc la biosinteza şi acumularea sporită a
conţinutului polifenolic, faţă de fructele, crescute în alte regiuni [71,148,320].
5.4. Studiul compuşilor fenolici în fructe şi carpomasele pigmentate prin metoda CLIP-SM
Studiul comparativ al potenţialului fenolic din fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
şi carpomasele in vitro, prin metoda CSS şi spectrofotometrică denotă prezenţa: quercetozidei şi
rutozidei, în calitate de flavonoli; cianidinei şi pelargonidinei – antociani; acizii cafeic şi
clorogenic – compuşi fenilpropanici de tip C6-C3 [23,27,81,82].
Scopul, investigaţiilor prezente, este evaluarea extractelor alcoolice din fructele de aronie
şi din carpomasele pigmentate, generate în condiţii in vitro în vederea identificării şi determinării
conţinutului de CF prin metoda CLIP-MS. Pentru studiul CF s-a aplicat metoda CLIP-SM,
bazată pe metoda CLIP [132], cu unele modificări de optimizare [331], care se referă la faza
mobilă: fosfatul de potasiu a fost suplinit cu acidul acetic, astfel, încât de la o fază mobilă cu
componente nevolatile s-a ajuns la una volatilă. Principalul beneficiu al acestei modificări este
faptul că eluentul din coloana cromatografica poate fi introdus în SM (care necesită doar
componenţi volatili în faza mobilă). Astfel, se pot obţine informaţii suplimentare referitoare la
CF, prezenţi în proba analizată, deoarece spectrometrul înregistrează masele moleculare şi
spectrele de masă ale compuşilor detectaţi. Cromatograma amestecului de standarde a 18 CF, cu
detecţie în UV la 330 si 370 nm este prezentată în fig. 5.9. Valorile timpilor de retenţie şi
parametrii dreptei de calibrare pentru CF analizaţi sunt reprezentaţi în tabelul A.4.8, iar
formulele celor mai importanţi CF sunt în fig. A.4.8. Cromatogramele CLIP-MS ale extractelor
din fructele de aronie şi carpomasele pigmentate in vitro sunt în fig. A.4.9–A.4.13, iar compuşii
polifenolici identificaţi şi dozaţi în extractele analizate în baza cromatogramelor sunt prezentaţi
în tabelele 5.5 – 5.9.

140
 Fig. 5.9. Cromatograma amestecului din 18 polifenoli (substanţe standard), detecţie UV la
330 si 370 nm (numărul picului, reprezintă nr. crt. din tabelul A.4.8).

Tabelul 5.5. Compuşii polifenolici identificaţi şi dozaţi în fructele de aronie

Nr. pe Compus Nr. în Identificat Confirmat Concentraţie în
cromatogramă polifenolic metodă UV SM extract (µg/ml)
Acid gentisic 2 NU DA calitativ
Acid cafeic 3 NU DA calitativ
1 Acid clorogenic 4 DA DA 18,319
2 Hyperozidă 8 DA DA 2,016
3 Isoquercitrină 9 DA DA 1,947
4 Rutozidă 10 DA DA 0,948
Quercitrină 13 DA DA 2,102
5 Quercetol 14 DA DA 0,142

Tabelul 5.6. Compuşii polifenolici identificaţi şi dozaţi în carpomasa violacee

Nr. pe Compus Nr. în Concentraţie în
Identificat UV Confirmat SM
cromatogramă polifenolic metodă extract (µg/ml)
Acid gentisic 2 NU DA calitativ
Acid cafeic 3 NU DA calitativ
1 Acid clorogenic 4 DA DA 21,037
2 Acid p-cumaric 5 DA DA 1,334
3 Hiperozidă 8 DA DA 3,638
4 Isoquercitrină 9 DA DA 5,795
5 Rutozidă 10 DA DA 0,948
Quercitrină 13 DA DA 3,212
6 Quercetol 14 DA DA 0,252

Tabelul 5.7. Compuşii polifenolici identificaţi şi dozaţi în carpomasa crem-roză

Nr. pe Compus Nr. în Identificat Confirmat Concentraţie în
cromatogramă polifenolic metodă UV MS extract (µg/ml)
Acid gentisic 2 NU DA calitativ
Acid cafeic 3 NU DA calitativ
1 Acid clorogenic 4 DA DA 19,682
2 Acid p-cumaric 5 DA DA 1,755
3 Hiperozidă 8 DA DA 3,571
4 Isoquercitrină 9 DA DA 5,030
5 Rutozidă 10 DA DA 1,393
6 Quercetol 14 DA DA 0,445
7 Quercitrină 13 DA DA 2,148

141
 Tabelul 5.8. Compuşii polifenolici identificaţi şi dozaţi în carpomasa crem-albă
Nr. pe Compus Nr. în Identificat Confirmat Concentraţie în
cromatogramă polifenolic metodă UV MS extract (µg/ml)
Acid gentisic 2 NU DA calitativ
Acid cafeic 3 NU DA calitativ
1 Acid clorogenic 4 DA DA 12,901
Acid p-cumaric 5 DA DA 0,221
2 Hiperozidă 8 DA DA 0,927
3 Isoquercitrină 9 DA DA 3,411
4 Rutozidă 10 DA DA 0,429
5 Quercetol 14 DA DA 0,307
6 Quercitrină 13 DA DA 2,104

Tabelul 5.9. Compuşii polifenolici identificaţi şi dozaţi în carpomasa verde

Nr. pe Compus Nr. în Identificat Confirmat Concentraţie
cromatogramă polifenolic metodă UV MS în extract (µg/ml)
Acid gentisic 2 NU DA calitativ
Acid cafeic 3 NU DA calitativ
1 Acid clorogenic 4 DA DA 10,636
Acid p-cumaric 5 NU DA calitativ
2 Hiperozidă 8 DA DA 0,409
3 Isoquercitrină 9 DA DA 1,254
4 Rutozidă 10 DA DA 0,206
5 Quercitrină 13 DA DA 1,990

Prin spectrofotometria UV în carpomase au fost identificaţi cei mai importanţi CF (acidul

clorogenic, hiperozida, isoquecitrina, rutozida şi quercetolul), iar SM a pus în evidenţă 3 CF
suplimentari (acizii gentisic, cafeic şi quiercitrina). Analizele comparative ale cromatogramei
substanţelor de referinţă (fig.5.9) şi a probelor analizate (fig.A.4.9–A.4.13) denotă prezenţa unor
CF neidentificaţi cu timpii de retenţie, 6,2 min şi 14,9 min. Au fost determinate valorile
conţinutului cantitativ (µg/ml) a unor CF în fructele de aronie: acidul clorogenic – 18,319;
hiperozida – 2,016; isoquercitrina – 1,947; quercitrina – 2,102; rutozida – 0,948 şi quercetolul –
0,142 (tabelul 5.5).
Aceşti CF au fost depistaţi şi în carpomasele pigmentate, generate in vitro din fructele de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot. Analizele cromatogramelor (fig. A.4.10-A.4.13) şi datelor din
tabelele 5.6-5.9 arată că acizii gentisic şi cafeic au fost depistaţi doar calitativ prin SM ca şi în
fructele de aronie. Acidul clorogenic a fost identificat şi determinat cantitativ în toate
carpomasele pigmentate: valoarea maximă este caracteristică pentru carpomasa violacee –
21,037 mg/ml, apoi în descendenţă, în carpomasa crem-roză – 19,682 mg/ml, în crem-albă –
12,901 mg/ml şi minimă în cea verde – 10,636 mg/ml. Prezintă interes acidul p-cumaric, care
lipseşte în fructele de aronie şi a fost depistat calitativ doar în carpomasa verde, crescută pe MN

142
cu doze de 2,4-D, îar în carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă, de pe MN cu ANA, s-a
determinat şi cantitativ, cu valoare maximă în carpomasa crem-roză şi minimă în cea crem-albă.
În toate carpomasele pigmentate, indiferent de tipul hormonilor adiţionaţi MN, au fost
identificate şi determinate valorile cantitative ale unor constituienţi flavonoidici, similar fructelor
de aronie: hiperozida, izoquercitrina, quercitrina, rutozida, excepţie constituie quercetolul, care
lipseşte în carpomasa verde, dezvoltată pe MN cu adaus de 2,4-D. Analizele datelor arată că
valorile cantitative maxime pentru constituienţii flavonoidici sunt pentru carpomasele violacee,
crem-roză şi crem-albă, crescute pe MN cu doze de ANA, iar minime în carpomasa verde, de pe
MN cu 2,4-D (tabelele 5.6-5.9). Conţinutul cantitativ al constituienţilor flavonoidici în fructele
de aronie cedează faţă de carpomasa violacee şi crem-roză. Doar în carpomasele pigmentate au
fost marcaţi CF neidentificaţi cu timpii de retenţie 6,2 min, 14,9 min, 20,5 şi 24,1 min.
Estimarea cantitativă şi determinarea coraportului procential al constituienţilor fenolici
din totalul lor (tabelul 5.10) relevă date noi. Acidul clorogenic prevalează cantitativ (mg/ml) şi îi
revine cota parte (%) maximă comparativ cu alţi acizi fenilpropanici din totalul polifenolic
determinat în toate probele analizate. Deşi valorile maxime ale conţinutului cantitativ al acidului
clorogenic sunt în carpomasa violacee (21,037 mg/ml), crem-roză (19,682 mg/ml) şi fructele de
aronie (18,319 mg/ml), iar minime în cea verde (10,636 mg/ml), distribuirea procentuală din
totalul CF este altfel: cota parte maximă şi aproape echivalentă în carpomasa verde (73,37%) şi
fructele de aronie (71,91%), iar minimă şi aproape echivalentă în carpomasa violace (58,08%) şi
crem-roză (57,84%).
Tabelul 5.10. Estimarea cantitativă a compuşilor fenolici în extractele carpomaselor pigmentate
in vitro şi fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Carpomasele pigmentate
Fructe
Compusii violacee crem-roză crem-albă verde
fenolici Cota Cota Cota Cota Cota
parte parte% parte% parte% parte%
(µg/ml) % din (µg/ml) din (µg/ml) din (µg/ml) din (µg/ml) din
totalul totalul totalul totalul totalul
fenolic fenolic fenolic fenolic fenolic
Acid clorogenic 18,319 71,91 21,037 58,08 19,682 57,84 12,901 63,55 10,636 73,37
Acid p-cumaric - - 1,334 3,69 1,755 5,16 0,221 1,08 calitativ calitativ
Hiperozidă 2,016 7,93 3,638 10,06 3,571 10,49 0,927 4,56 0.409 2,83
Quercitrina 2,102 8,25 3,212 8,86 2,148 6,31 2,104 10,36 1,990 13,72
Isoquercitrină 1,947 7,64 5,795 16,02 5,030 14,78 3,411 16,80 1,254 8,65
Rutozidă 0,948 3,72 0,948 2,62 1,393 4,09 0,429 2,11 0,206 1,43
Quercetol 0,142 0,55 0,252 0,69 0,445 1,33 0,307 1,51 - -

Total 25,474 100 36,216 100 34,024 100 20,300 100 14,495 100

143
 Distribuirea procentuală a constituienţilor flavonoidici din totalul CF corelează cu proba
analizată. În fructele de aronie cota parte maximă din totalul CF revine quercitrinei (8,25%),
urmată de hiperozidă (7,93%), isoquercitrină (7,64%) şi rutozidă (3,72%). Cota minimă revine
quercetolului – 0,55%. În carpomasele pigmentate se observă o altă distribuire (%) a
constituienţilor flavonoidici din totalul polifenolic, care corelează cu pigmentaţia carpomasei. În
carpomasele violacee, crem-roză, crem-albă, generate pe MN cu doze de ANA maximul
procentual constituie isoquercitrina, iar în cea verde de pe MN, suplimentate cu 2,4-D, maximul
procentual revine quercitrinei, similar fructelor de aronie.
Consecvenţa descendenţei procentuale este diferită: în carpomasa violacee –
isoquercitrina (16,02%), hiperozida (10,06%), quercitrina (8,86%), rutozida (2,62%) şi
quercetolul (0,69%); în carpomasa crem-roză – isoquercitrina (14,78%), hiperozida (10,49%),
quercitrina (6,31%), rutozida (4,09%) şi quercetolul (1,33%); în carpomasa crem-albă –
isoquercitrina (16,80%), quercitrina (10,36%), hiperozida (4,56%), rutozida (2,11%) şi
quercetolul (1,51%) şi în carpomasa verde – quercitrina (13,72%), isoquercitrina (8,65%),
hiperozida (2,83%), rutozida (1,432%), iar quercetolul lipseşte.
Carpomasele violacee şi crem-roză se caracterizează prin conţinut maxim de CF, care
prevalează, faţă de cel din fructele de aronie. Carpomasa verde cedează mult, în conţinutul CF
(14,495 mg/ml), faţă de fructele de aronie (25,474 mg/ml) şi mai mult de 2 ori, faţă de
carpomasele violacee (36,216 mg/ml) şi crem-roză (34,024 mg/ml).
Rezultatele studiului flavonoidelor din fructe prin metoda CLIP-MS, puţin diferă faţă de
cele din literatura de specialitate. În investigaţiile proprii n-a fost identificat kaempferolul,
similar lucrării lui S. Hakkinen [124]. Studiul efectuat arată că flavonolii principali din fructele
de aronie sunt quercitrina (8,25%), hiperozida (7,93%), isoquercitrina (7,64%) şi rutozida
(3,72%), pe când în unele studii [148,196], flavonolul principal este quercitrina (93,07%), însă
este determinat cantitativ un alt constituient – kaempferolul în concentraţie redusă (6,9%). În altă
lucrare ştiinţifică [124] este semnalată şi prezenţa mirecitrinei, deşi în cantităţi minime.
Rezultatele obţinute privind studiul biochimic comparativ al CF în carpomasele
pigmentate in vitro şi în fructele de aronie prin metoda CLIP-MS confirmă datele obţinute prin
metode CSS, spectrofotometrice, titrimetrice [23,81,82] şi dezvăluie noi aspecte.
Analiza datelor (tabelele 5.5–5.9) în baza cromatogramelor (fig. A.4.9 – A.4.13),
realizate prin metoda CLIP-SM permite nu numai identificarea CF, dar şi dozarea acestora, iar
rezultatele obţinute denotă unele caracteristici relevante:

144
a) Acizii gentisic şi cafeic au fost depistaţi calitativ pe baza informaţiei SM în toate probele
analizate; cantitativ nu a fost posibil, deoarece există 2 perechi de substanţe incomplet
separabile: acid caftaric – acid gentisic şi acid clorogenic - acid cafeic.
b) Acidul clorogenic a fost decelat în toate extractele analizate, căruia îi revine cea mai mare
cotă parte din totalul polifenolic: 73,37% – carpomasa verde; 71,91% – fructele de aronie;
63,55% – carpomasa crem-albă; 58,08% – carpomasa violacee şi 57,84% – cea crem-roză;
c) Acidul p-cumaric a fost identificat calitativ în toate carpomasele pigmentate şi decelat
cantitativ, doar în carpomasele violacee (1,334 mg/ml), crem-roză (1,755 mg/ml) şi crem-
albă (0,221 mg/ml);
d) Hiperozida, quercitrina, isoquercitrina, rutozida au fost identificate în toate probele analizate,
iar conţinutul cantitativ şi cota parte a fiecărui component din totalul CF variază în fructe,
comparativ cu carpomasele pigmentate;
e) Quercetolul a fost identificat calitativ şi dozat în toate probele analizate, în cantităţile cele
mai reduse, comparativ cu alţi CF: fructe – 0,142 mg/ml; carpomasa violacee – 0,252 mg/ml;
crem-roză – 0,445 mg/ml şi crem-albă – 0,307 mg/ml, cu excepţia carpomasei pigmentate
verde, în care lipseşte.
Prin metoda CLIP-MS au putut fi identificaţi şi cuantizaţi mai mulţi CF, comparativ cu
tehnica CSS. Conţinutul calitativ şi cantitativ al CF în carpomasele pigmentate corelează cu
balanţa hormonală, adiţionată MN. Carpomasele violacee şi crem-roză au conţinut mai bogat de
CF, faţă de carpomasa crem-albă, toate generate pe MN cu doze de ANA şi faţă de fructele de
aronie şi mult superior, faţă de carpomasa verde, obţinută pe MN, cu doze de 2,4-D.
5.5. Concluzii la capitolul 5
• Screening-ul biochimic calitativ relevă prezenţa uleiurilor volatile şi grase, a CF (flavonoide,
antociani, proantociani, taninuri) şi hidraţilor de carbon (pectine, amidon) în fructele de aronie
şi în carpomasele pigmentate in vitro, iar intensitatea expresiei reacţiilor specifice corelează cu
specimenul analizat. S-a elucidat gradientul expresiei intensităţii reacţiilor specifice pentru
identificarea flavonoidelor (antocianilor), taninurilor în descendenţă: fructe=carpomasa
violacee>carpomasa crem-roză>carpomasa crem-alba>carpomasa verde.
• Prin CSS în fructe şi în capomasele pigmentate s-au identificat flavonoidele (quercitrina,
quercetolul, rutozida) şi s-au evidenţiat spoturi neidentificate cu diferite valori ale Rf doar în
carpomasele pigmentate.
• Condiţiile de cultură in vitro facilitează dezvăluirea potenţialului de biosinteză constituienţilor
antocianici (pelargonidina şi cianidina), caracteristici fructelor in vivo şi în carpomasele
pigmentate şi îndeplinesc rol reglator în inducerea sintezei selective a unor constituenţi

145
 antocianici în carpomase, necaracteristici fructelor şi deşi carpomasele cedează cantitativ, faţă
de fructe, ele pot servi materie primă de alternativă în obţinerea antocianilor.
• Studiul calitativ a pus în evidenţă prezenţa acizilor cafeic şi clorogenic în carpomasele
pigmentate şi fructele de aronie, iar condiţiile de cultură in vitro stimulează, selectiv, biosinteza
lor, astfel conţinutul maxim este în carpomasa violacee (0,375%) şi crem-roză (0,341%);
valoare dublă, în raport cu fructele de aronie (0,178%), apoi urmează carpomasa crem-albă
(0,295%) şi verde (0,235%).
• În fructele de aronie şi în carpomasele pigmentate in vitro s-au identificat taninurile catehice şi
galice, cu conţinutul cantitativ maxim în carpomasa violacee şi crem-roză, iar carpomasele
crem-albă şi verde cedează în raport cu fructele.
• Conţinutul totalului polifenolic în carpomasele in vitro corelează cu tipul de hormoni,
suplimentat în MN: dozele de ANA stimulează biosinteza polifenolilor, în carpomasa violacee
şi crem-roză; valorile cedează, faţă de fructele de aronie şi se dublează, în raport cu carpomasa
verde, obţinută pe MN cu doze de 2,4-D.
• Pentru prima a fost efectuat studiul CF în fructele de aronie comparativ cu carpomasele
pigmentate in vitro, prin metoda CLIP-SM şi au fost identificaţi 8 CF atât în fructe, cât şi în
carpomasele pigmentate: acizii clorogenic, gentisic, cafeic; hiperozida, isoquercitrina, rutozida,
quercitrina şi quercetolul. În carpomase sunt CF, care lipsesc în fructe: acidul p-cumaric, cu
timpul de retenţie 8,7 min şi unii CF neidentificaţi, cu timpii de retenţie 20,5 şi 24,1 min.

146
 6. ULTRASTRUCTURA FRUCTULUI IN VIVO ŞI CARPOMASELOR IN VITRO DE
ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT ŞI PRINCIPIILE EVOLUTIVE
6.1. Ultrastructura pericarpului în ontomorfogeneza fructului
Lucrări ştiinţifice ultrastructurale apar sporadic, în ultimul timp, dar investigaţiile în acest
domeniul sunt necesare, binevenite, constituind o parte esenţială şi complimentară a complexului
ştiinţific de elucidare a mecanismelor de evoluare a celulelor în culturi in vitro, comparativ cu
cele in vivo. Studiul ultrastructural al celulelor pericarpului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot s-
a efectuat la fructele imature (60 zile de la înflorire) şi la fructele mature.
6.1.1. Ultrastructura celulelor pericarpului fructului imatur
Pericarpul fructelor imature este alcătuit din celule parenchimatice cu un singur nucleu,
care ocupă poziţie centrală, iar în celulele mai vacuolizate – parietală. Nucleul este, frecvent,
sferic cu un nucleol bine individualizat (fig. 6.1;A.5.1) şi cromatina condensată, uniform
dispersată în secţiunea nucleului, cu concentraţii evidente la contactul cu anvelopa nucleară.
Citoplasma este densă, bogată în diferite organite (fig. 6.1;6.2;A.5.1). Ribozomii sunt numeroşi,
dispersaţi în hialoplasmă (fig. 6.1-6.4;A.5.1–A.5.6), sau formează polisomi localizaţi în
apropierea plastidelor, mitocondriilor ori nucleului (fig. A.5.5). Prezenţa ribozomilor
protosintetic activi denotă prevalarea proceselor anabolice asupra celor catabolice în perioada
creşterii şi dezvoltării fructului de aronie.
Condriomul este reprezentat de mitocondii, preponderent, de formă sferică (fig. 6.1;6.3),
dar se întâlnesc şi elongate (fig. 6.2; A.5.1), rar, de formă atipică. Mitocondriile sunt condensate
şi se caracterizează prin formarea cristelor din abundenţă (fig. 6.2;6.3), paralele, orientate
perpendicular pe membrană, stroma este densă, ce demonstrează o activitate metabolică intensă a
celulelor. Unele mitocondrii se caracterizează prin stromă neuniformă, în zona lor centrală cu
arii de o densitate redusă sau translucidă, unde se atestă şi prezenţa filamentelor de ADN, care
corespund zonelor genofore şi activităţii ribozomilor mitocondriali, care determină creşterea
dimensiunilor mitocondriilor.
Uneori se observă contacte ale mitocondriilor cu membrana nucleară (fig. 6.1) şi a
plastidelor (fig. 6.1-6.3;A.5.1), sau, mitocondriile contactează între ele (fig. 6.1;6.3), formând
lanţuri organelare energetice, fapt ce denotă derularea proceselor celulare biosintetice intense,
specifice acestei perioade de dezvoltare a fructului. Complexul Golgi (fig. A.5.1) este alcătuit din
5-7 saculi aplatisaţi, alungiţi, bine împachetaţi şi vezicule sferice golgiene mici, cu dispoziţie
distală, care se detaşează de la cisterne, dovadă a prezenţei unei activităţi metabolice intense.

147
Fig.6.1. Un fragment al celulei pericarpului Fig.6.2 Un fragment al celulei pericarpului
fructului de A. melanocarpa (Michx.), fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot,
x18 000. x16 000.

Fig.6.3. Un fragment al celulei pericarpului Fig. 6.4. Detaliu al plastidei cu incluziuni de

fructului de A. melanocarpa (Michx.) diferită natură chimică, x14 200.
Elliot, x14 000.
Predomină canalele RE rugos, care traversează citoplasma cu o orientare paralelă
peretelui celular. Ataşarea ribozomilor pe canalele RE şi prezenţa poliribozomilor asigură
biosinteza proteinelor de structură, necesare celulelor în creştere, care survin şi se intercalează în
formarea biomembranelor, contribuind la extinderea lor şi creşterea componentelor celulare;
paralel are loc şi biosinteza proteinelor funcţionale [41], reprezentate prin enzimele cu rol activ,
sau menţinute în stare inactivă prin formarea legăturilor de H cu taninurile prezente şi celor de
depozitare. Canalele RE neted realizează nemijlocit transportarea precursorilor de la locul de
biosinteză la cel de utilizare, concomitent, participând la transformări biochimice, ce rezultă în
producerea oligo- şi poliglucidelor, implicate în extinderea peretelui pecto-celulozic şi a lipidelor
structurale, care, ulterior, se intercalează în extensia biomembranelor.
Plastidele sunt de formă lenticulară (fig. 6.2;6.3), ovală (fig. 6.4) sau uşor elongate (fig.
A.5.4), reprezentate prin cloroplaste cu incluziuni de diferită natură chimică (amilacee, lipidică,
fenolică), în număr redus (tabelul 6.1). Membranele fotosintetice sunt organizate în sistemul
tilacoidal-granar, dispus în lungul axei mari a cloroplastului (fig. 6.2-6.4;A.5.4). Predomină
granele din 2-3 tilacoide, bine împachetate, cu spaţii intratilacoidale reduse (fig. 6.2–6.4;A.5.3),
deşi se întâlnesc şi grane mari din 6-7 tilacoide (fig. 6.2;6.3). Granele sunt anastomozate prin

148
intermediul tilacoidelor stromatice, ce rezultă într-o continuitate a sistemului membranar
fotosintetic. În secţiunea cloroplastului se observă 2-3 granule amilacee, relativ mari, globuloase,
dar, frecvent, sunt şi de formă ovală (fig. 6.1-6.4;A.5.1); plastoglobulele, la fel, în număr redus,
2-3 în secţiune (fig. 6.1;6.4;A.5.1;A.5.3;A.5.4). Depunerile electrondense de natură fenolică sunt
caracteristice lumenului spaţiilor intratilacoidale interne (fig. 6.2,6.3;A.5.4,A.5.5) şi marginale
ale unor grane (fig. 6.2; 6.3), mai rar, ca incluziuni ovale în stroma plastidelor (fig. 6.2;6.4).

Tabelul 6.1. Organizarea structurală a plastidelor pericarpului fructului de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot
Numărul

Incluziuni

Incluziuni

Incluziuni

Incluziuni
Tilacoide/

amilacee/

proteice/
Plastide/

fenolice/
Specimenul
plastidă

plastidă

plastidă

lipidice/
plastidă

plastidă
Grane/
celulă

grană
analizat

Fructul imatur 14,4±0,6 15,8±0,8 4,5±0,5 2,3±0,2 3,8±0,3 2,8±2,4 0,0

Fructul matur 11,4±0,3 6,5±1,2 2,3±0,4 4,1±0,6 2,2±0,4 6,8±1,2 0,0
Rezultatele analizei unor indici numerici a organizării ultrastructurale a plastidelor
(tabelul 6.1) demonstrează, că la o celulă revin 14,4 plastide, iar unei plastide – 15,8 grane şi
unei grane – 4,5 tilacoide. Frecvenţa incluziunilor de diferită natură chimică pe secţiunea
cloroplastului au următoarea distribuire, în descendenţă: fenolice – 3,8; lipidice – 2,8; amilacee –
2,3, iar cele proteice – lipsesc, pe când volumele parţiale ale acestora denotă altă consecvenţă:
amilacee – 14,5%; fenolice – 13,5% şi lipidice – 5,0 % (tabelul 6.2). Numărul granulelor
amilacee este cel mai mic, dar volumele parţiale sunt maxime, graţie dimensiunilor mari.

Tabelul 6.2.Volumul parţial al constituenţilor plastidiali în pericapul fructelor de

A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Volumul parţial (%)
Specimenul al incluziunilor
analizat granelor stromei totale amilacee fenolice lipidice

Fructul imatur 39,9±2,4 29,6±0,9 30,5±1,2 14,5±1,8 13,5±0,9 5,0±0,8

Fructul matur 20,2±1,8 26,8±1,1 53,0±2,2 28,1±2,4 8,4±0,6 16,5±1,4
Maximul volumului parţial în plastidele (tabelul 6.2) fructelor imature revine granelor
(39,9%), ce denotă activitatea fotosintetică înaltă a plastidelor. Volumul stromei (29,6%) este
redus faţă de grane şi este aproape echivalent cu volumul total al incluziunilor (30,5%). Este
dificil de încadrat plastidomul într-o tipologie strictă, fiind reprezentat de forme structural-
funcţionale de tranziţie: cloroamiloplaste, taninoamiloplaste, taninocloroamiloplaste, ce
ilustrează începutul unei specializări funcţionale a plastidelor în fructele imature, care derulează
intens, la etapele ulterioare de dezvoltare.

149
 Se întâlnesc celule cu câteva vacuole, relativ mari (fig. 6.1;6.3), iar în restul citoplasmei
vacuole mici, dispersate, rar, celulele au o singură vacuolă, centrală (fig. A.5.3;A.5.4;A.5.6), cu
metaboliţi fenolici, vizualizaţi ca făşii fine electrondense pe tonopast, sau în lumenul vacuolei şi
pe tonoplast, sub formă de incluziuni mari, sferice (fig. A.5.6). Se observă material fenolic pe
membranele externe ale mitocondriilor, pe plasmalemă şi pe peretele celular (fig. 6.2).
Studiul morfometric al incluziunilor fenolice în diferite compartimente celulare (tabelul
6.3) demonstrează, că volumele parţiale ale acestora sunt aproape echivalente în plastide (41,1%)
şi vacuom (40,1%), maximul, faţă de alte compartimente. Volumul parţial în RE (13,2%), urmat
de al plasmalemei (3,1%), formaţiunilor membranice (1,6%) şi peretelui celular (0,9%). În
plastide incluziunile fenolice prevalează în spaţiile intratilacoidale (23,9%), faţă de cele de formă
ovală din stromă (16,2%). Peretele celular este de natură pecto-celulozică, relativ, subţire şi
strabătut de pori cu multe plasmodesme (fig. 6.2;A.5.5;A.5.6). Plasmalema e conturată, cu multe
sectoare cutate, însă fără mari deplieri de la peretele celular.

Tabelul 6.3. Volumului parţial al incluziunilor fenolice în compartimentele celulare ale

fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Volumul parţial al incluziunilor fenolice (%) în compartimentele celulare
Plastide Vacuom
Specimenul

Perete celular
endoplasmatic

membranice
Plasmalemă

Formaţiuni
analizat

Intratilacoidal

Tonoplast
Reticul

Lumenul
vacuolar
Stromal

Total
Total
41,1±2,1

40,1±2,8
13,2±1,2

3,1±0,5

0,9±0,1

1,6±0,1
Fructul 23,9±2,1 16,2±1,8 23,1±2,1 17,0±1,2
imatur
68,1±1,9

12,1±0,2
5,8±0,9

4,0±0,7

5,1±0,3

1,9±0,2 3,9±0,1 28,1±1,9 40,0±2,4

4,9±0,7

Fructul
matur

Suprafaţa cutată a plasmalemei este indicele structural, care reflectă intensitatea

proceselor fiziologice active celulare. Extensia celulelor, caracteristică perioadei de creştere,
prevede implicarea componentelor constructive în plasmalemă şi peretele celular, prin inserarea
precursorilor, sintetizaţi de ribozomii numeroşi şi RE bine dezvoltat şi prin particulele bogate în
enzime, implicate în procesele de formare şi definitivare a microfibrilelor celulozice din peretele
celular [41].
6.1.2. Ultrastructura celulelor pericarpului fructului matur
În carpogeneză, celulele pericarpului suferă schimbări structurale, marcate de procesele
fiziologice şi metabolice ale maturării. Peretele celular se îngroaşă, iar porii se evidenţiază,

150
nucleul îşi schimbă forma, în celulele mature capătă o formă lobată, localizându-se parietal, iar
cantitatea de cromatină condensată e redusă. Este caracteristică vacuolizarea celulelor cu vacuola
centrală de formă iregulată. Citoplasma, în făşii înguste pe perimetrul peretelui celular, (fig.
6.5,6.6) are sectoare rarefiate, iar hialoplasma cedează în densitate (fig.A.5.7), în raport cu
celulele imature. Ribozomii sunt numeroşi (fig.A.5.7–A.5.10) şi conform [295] sunt implicaţi nu
în biosinteza şi formarea proteinelor structurale, deoarece procesele de creştere sunt încheiate,
dar în cele enzimatice şi de rezervă. În această perioadă enzimele active sunt: lipaza şi
lipozidaza, catalaza şi peroxidaza, citocromoxidaza şi polifenoloxidaza, diferite hidrolaze
(amilaza, celulaza, invertaza), transaminazele, piruvatdecarboxilaza, ribonucleaza, care atestă
derularea proceselor intense, specifice carpomaturării [64,324].
Un indicator prezintă vezicularea citoplasmei celulelor pericarpului matur: canalele
dilatate ale RE, părţile distale ale dictiozomilor, vaculole sau alte organite, localizate,
preponderent, în zona murală. Fragmentarea şi vezicularea canalelor RE, deseori, cu conţinut
electrondens, demonstrează implicarea RE în metabolismul fenolic, astfel, contribuind la
edificarea fondului antioxidant, caracteristic fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
[23,26,320,326]. La carpomaturarea celulelor se atestă vezicule translucide, de origine
endoplasmatică, purtătoare de enzime litice, care migrează, paricipând la procesele de
biodegradare, iniţiate la această etapă şi se dezvoltă virtiginos ulterior [22]. Caracteristicile
ultrastructurale ale RE pe parcursul maturării carpocelulelor denotă schimbarea funcţiei RE: în
fructele premature prevalează funcţia biosintetizătoare şi de transport a materialului
biostructural, iar în cele mature – fragmentele canaliculare şi veziculare cu funcţie de transport a
enzimelor litice, a formării vacuolelor litice şi depozitării lipidelor şi fenolilor. Astfel,
ultrastructura RE este un indicator al activităţilor biositetice, de transport cu menire formativ-
constructivă şi biodegradare. RE, pe parcursul maturării fructului, suferă schimbări graduale
structurale, care exprimă activitatea fiziologică şi metabolică, ce confirmă datele obţinute la
fructele de măr [46,369,379].
În celulele mature creşte numărul mitocondriilor în grupuri, instalând contacte
interorganelare. Forma mitocondriilor de la oval-alungită, la ramificată, asigură o suprafaţă mai
mare de contact cu alte organite. Matrixul dens, criste cu conţinut translucid şi orientare diferită,
faţă de anvelopa mitocondrială, denotă activitatea respiratorie intensă, legată de generarea
energiei, necesară pentru biosinteza proteinelor enzimatice, care intervin în procesele fiziologice
de maturare [64]. Creşterea activităţii enzimatice litice, corelează cu apariţia zonelor de liză
citoplasmatică (fig. A.5.7). Ariile translucide, corespunzătoare zonelor genofore din matrixul

151
mitocondrial, se reduc, semnalând diminuarea biosintezei proteinelor constructive, determinată
de stoparea creşterii mitocondriilor [59,64,139].
Transformările organizaţiei ultrastructurale a plastidelor, pe parcursul maturării fructelor,
au fost în centrul cercetării, deoarece au o organizare structurală complexă şi plastică. Deşi,
sistemul tilacoidal-granar este foarte bine dezvoltat în unele cloroplaste (fig. A.5.8;A.5.9), totuşi

Fig. 6.5. Făşie fenolică Fig. 6.6. Amiloplast. Fig.6.7. Vacuolă cu

electrondensă cu expansiuni Acumulări fenolice în formaţiuni electrondense
sferice, x12 500. zona murală, x12 500. fenolice, aforme, x10 200.

numărul mediu de grane în secţiune (6,5) şi a celor de tilacoide în grane (2,3) se reduce
substanţial, faţă de fructele imature, 15,8 şi 4,5, respectiv (tabelul 6.1), iar volumul parţial al
granelor se micţorează de 2 ori (tabelul 6.2), ce demonstrează diminuarea activităţii fotosintetice
a cloroplastelor. Se atestă mărirea numărului de granule de amidon (2,3, în fructe imature şi 4,1,
în fructe mature), dar mai mult a dimensiunilor lor în plastide, ce conduc la dublarea valorilor
volumelor parţiale (14,5% în celulele imature şi 28,1% – în mature). În plastide predomină
granulele globuloase, mari, amilacee, în număr de 2-3 (fig. 6.6;A.5.7), care ocupă tot spaţiul
plastidei, sau sunt 4-7 granule mai mici, care ocupă jumătate din aria plastidelor (fig. A.5.10).
Indicii numerici şi morfometrici (tabelul 6.1;6.2) denotă prevalarea funcţiei de depozitare a
meteriilor de rezervă asupra celei de fotosinteză, rezultând în forme intermediare de plastide:
amilocloroplastele (fig. A.5.10), amilocromoplaste sau în categorie definitivată, amiloplastele
(fig. 6.6). Plastidele sunt variate după configuraţie, apar şi în formă de cupă (fig. A.5.11).
Evoluţia plastidelor în perioada de maturare a fructelor presupune transformări la 3 nivele
ultrastructurale: lamelar, stromal şi al incluziunilor de diferită natură chimică, determinate de
polifuncţionalitatea plastidelor, ce confirmă principiul evolutiv al diversificării funcţiilor (Plate).

152
Este afectat sistemul granar, care se reduce de la 39,9% în fructele imature, la 20,2%, în cele
mature şi demonstrează diminuarea fotosintezei în schimbul progresiei funcţiei de depozitare,
exprimată prin dublarea volumelor parţiale amilacee (de la 14,5 la 28,1%), triplarea celor lipidice
(de la 5,0 la 16,5%). Datele morfometrice arată, că are loc substituirea calitativă a funcţiei de
fotosinteză prin cea de depozitare în plastide, ce ilustrează acţiunea principului substituţiei
funcţiei (Dorn). Volumul sporit al incluziunilor fenolice în fructele imature faţă de cele mature şi
prevalarea în spaţiile intratilacoidale (23,9%), în raport cu cele din stromă (16,2 (tabelul 6.3.),
denotă implicarea membranelor tilacoidale ale plastidei juvenile în biosinteza CF.
În celulele pericarpului fructelor mature se menţionează transformări structurale de
dezorganizare, dezintegrare şi chiar destrucţie. Deşi plastidele se caracterizează printr-o
stabilitate ultrastructurală a sistemului fotosintetic, reprezentat prin membrane tilacoidale bine
structurate în grane (fig. A.5.7;A.5.9;A.5.10), totuşi, sunt menţionate şi plastide cu transformări
structurale profunde, exprimate prin dilatarea spaţiilor tilacoidale, dezorganizarea sistemului
tilacoidal fotosintetic şi destrucţia lui, apariţia plastoglobulelor şi vezicularea stromei (fig.
A.5.12), resturi membranare şi depuneri fenolice (fig. A.5.13).
În fructele mature incluziunile fenolice sunt rar în spaţiile intratilacoidale (fig. A.5.9;
A.5.10), frecvent, ca incluziuni ovale sunt în stroma plastidei, predomină în vacuole, pe
tonoplast, ca o bandă relativ groasă, neîntreruptă (fig. 6.5;A.5.9), care, uneori, formează
expansiuni sferice (fig. 7.5), pe plasmalemă şi pe peretele celular (fig. 6.5,6.6;A.5.14).
Acumulările fenolice aforme sunt vizualizate în spaţiul vacuolar (fig. 6.7), pe membranele
veziculelor citoplasmatice (fig. A.5.15). Acumulările fenolice sunt observate în aceleaşi
compartimente celulare în fructele imature şi mature, dar valorile volumelor parţiale sunt diferite
(tabelul 6.3). O diminuare a volumelor parţiale se observă în plastide: de la 41,1% - în fructele
imaturem la 5,8% - în cele mature. Incluziunile fenolice prevalează în stroma plastidei (3,9%),
faţă de spaţiile intratilacoidale (1,9%) în fructele mature, contrar celor imature 16,2% în stromă
şi 23,9%, în spaţiile intratilacoidale (fig. 6.8). O reducere a volumelor parţiale a incluziunilor
fenolice, în perioada maturării fructelor, este caracteristică RE (de la 13,2%, în fructe imature, la
4,9%, fructe mature). Pentru celelalte compartimente celulare se înregistrează o sporire a
volumelor parţiale, pe perioada de maturare a fructelor: în vacuom 68,1%, la fructele mature şi
40,1%, la fructele imature; pe plasmalemă 4,0% şi 3,1%; pe peretele celular 5,1% şi 3,1%, pe
formaţiunile membranice 12,1% şi 1,6%, respectiv. În fructele mature, acumulările din lumenul
vacuolar prevalează mult, faţă de cele de pe tonoplast (fig. 6.9).
Pe parcursul maturării fructelor se atestă sporirea cantitativă şi creşterea gradului de
compactitate al incluziunilor fenolice. La etapele premature ale fructelor, forma primară de

153
depozitare a substanţelor fenolice este reprezentată prin proantociani, monomeri sau dimeri [59],
care, la maturare, se transformă în antociani, conferind culoarea violetă fructelor sau în
polifenoli, prezenţi, în fructele mature de A. melanocarpa (Michx.) Elliot [24,27,148,343].

25

Pericarpul imatur
(60 zile de la
20 înflorire)
Pericarpul matur

15

10

0
I. II.

Fig. 6.8. Variaţia volumului parţial al incluziunilor fenolice în plastide:

I – incluziuni intratilacoidale; II – incluziuni stromatice.

40

Pericarpul imatur
35
(60 zile de la
înflorire)
30 Pericarpul matur

25

20

15

10

0
I. II.

Fig. 6.9.Variaţia volumului parţial al incluziunilor fenolice în vacuom:

I – pe tonoplast; II – lumenul vacuolar.
Variaţia valorilor volumelor parţiale ale incluziunilor fenolice în fructele imature/mature
(fig. 6.10) arată, că ponderea cea mai mare în fructele imature revine plastidelor, în cele mature –
vacuomului. În fructele mature, valorile volumelor incluziunilor fenolice prevalează şi pe
formaţiuni membranice, plasmalemă şi perete celular.

154
 80
Pericarpul
70 imatur (60 zile
Valorile volumelor parțiale (%)

de la înflorire)
60
50
Pericarpul
40 matur
30

20

10

0
Plastide Reticul Perete 
Vacuom Formațiuni Plasmalemă Anvelopă
endoplasmatic membranice celular 
celulară

Fig. 6.10.Variaţia volumului parţial al incluziunilor fenolice în diferite compartimente celulare

în fructele imature şi mature de A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Este evidentă prezenţa numeroşilor ribozomi pe parcursul perioadei de maturare a

fructului, însă activităţile lor biosintetice diferă: în prima etapă, preponderent, biosinteza
proteinelor structurale, necesare ca material constructiv plastic în expansiunea celulară, în a doua
etapă, biosinteza proteinelor enzimatice şi hormonale indispensabile procesului de maturare. La
fructele imature de aronie se observă o stare de echilibru metabolic între procesele anabolice,
dominante în etapele premărgătoare şi cele catabolice, care vor predomina în etapele ulterioare.
Aceasta este exprimată prin corelaţiile dintre diferite componente celulare, cum ar fi cel
ribozomal şi mitocondrial. Sinteza activă a proteinelor, atât structurale, cât şi enzimatice, la
etapele timpurii de dezvoltare a fructului, asigură un substrat respirator pentru activitatea
mitocondrială la etapele ulterioare de dezvoltare.
Enzimele litice asigură formarea substratului respirator pentru producerea energiei de
către mitocondrii [59], astfel, concomitent, se observă o uşoară reducere a ponderii ribozomilor
şi o ascensiune a mitocondriilor. Ribozomii şi mitocondriile, pe parcursul maturării fructului, îşi
desfăşoară activitatea asincron, fapt descris şi pentru soiuri de măr [36].
Investigaţiile ultrastructurale întreprinse demonstrează, că maturarea pericarpului
fructului se asociază cu evoluţia transformărilor ultrastructurale profunde. Cele mai multe
transformări sunt concentrate în citoplasmă: vezicularea citoplasmei, formarea agregatelor
multiveziculare, diminuarea densităţii hialoplasmei, forma atipică a organitelor, apariţia corpilor
mielinici, alterarea structurii plastidelor la 3 nivele (lamelar, stromal şi al incluziunilor),
acumulările fenolice. Modificări ultrastructurale similare au fost observate în fructele de măr, la
acţiunea factorilor pedo-climaterici ai terenurilor versante [369] şi în perioada de post-maturare

155
[46], în celulele scoarţei de salcâm [267], în lăstarii de dud [235], în celulele scoarţei, atacate de
patogeni [105] în perioada de aclimatizare sezonieră, în frunzele de Brassica napus, supuse
temperaturilor joase [307]. Acestea demonstrează, că maturarea celulelor carpogene şi reacţia de
răspuns la acţiunea factorilor externi are lor prin aceleaşi mecanisme ultrastructurale.
Rezultatele obţinute constituie o contribuţie semnificativă pentru dezvăluirea
modificarilor ultrastructurale, care însoţesc maturarea fructelor suculente de aronie cu
specializare metabolică fenolică. Evoluţia maturării celuleor fructului implică modificări
ultrastructural-funcţionale graduale exprimate prin: instalarea polimorfismului organelar;
sporirea contactelor interorganelare omogene şi heterogene; sporirea ariilor cromatinei
condensate şi menţinera activă a componentului nucleolar; modificările plastidomului la 3 nivele
ultrastructurale, care rezultă în schimbarea calitativă a diferitor tipuri de plastide; evoluţia
ribozomilor proteosintetic activi de la biosinteza proteinelor structurale la biosinteza proteinelor
enzimatice; transformările mitocondriilor de la tip ortodoxal la condensat, însoţite de
intensificarea activităţii oxidative pentru producerea necesarului de energie; evoluţia RE rugos în
RE neted cu elemente de fragmentare şi veziculare, ce semnifică evoluţia funcţiei de biosinteză
la depozitare şi transport; formarea deponentei imobilizate reprezentată prin sporirea volumelor
amilacee şi lipidice, îngroşarea peretelui celular; formarea şi extinderea fondului fenolic cu rol
antioxidant prin implicarea selectivă, succesivă, individuală a organitelor; vacuolizarea şi
vezicularea sporită de diferită geneză, formarea agregatelor multiveziculare; formarea corpilor
mielinici; rarefierea citoplsmei şi apariţia zonelor de liză citoplasmatică.
6.2. Ultrastructura celulelor carpomaselor pigmentate in vitro
Pentru prima dată s-a efectuat studiul ultrastructural, îmbinat cu analiza morfometrică a
celulelor carpomaselor pigmentate: violacee, crem-roză, crem-albă şi verde.
6.2.1. Carpomasa violacee
Celulele parenchimatice în carpomasa violacee sunt, relativ, compact împachetate.
Nucleul de regulă, e cu un singur nucleol, bine evidenţiat şi structurizat (fig. 6.11;A.5.16), cu
poziţie centrală sau parietală, în funcţie de gradul de vacuolizare a celulei. Nucleul de formă
sferică ocupă poziţia centrală a celulei, mai puţin vacuolizată (fig. A.5.16), nucleul de formă
alungită (fig.6.11) are o poziţie parietală în celula vacuolizată. Unele celule se caracterizează
prin citoplasmă granulată, bogată în ribozomi (fig. A.5.16 – A.5.19), grupări de mitocondrii,
variate ca formă şi densitate electronomicroscopică a matrixului (fig. A.5.17), străbătută de
profilele lungi ale RE (fig. 6.34), frecvent, reprezentate de canale dilatate şi fragmentate.
Plastidomul este reprezentat de 11,9 plastide/celulă, polimorfe. În celulele tinere se
deosebesc plastidele lenticulare, iar în cele mature, vacuolizate, plastidele sunt oval-alungite (fig.

156
A.5.19), până la elongate (fig. 6.12;), în formă de cupă (fig. 6.12;A.5.20). Heterogenitatea
ultrastructurii plastidelor este exprimată prin gradul diferit de dezvoltare a sistemului lamelar;
natura chimică şi prezenţa incluziunilor în stromă (tabelul 6.4).
Tabelul 6.4. Organizarea ultrastructurală a plastidelor celulelor carpomaselor pigmentate in vitro
Numărul
Carpomase
pigmentate

Plastoglobule/
Incluziuni

Incluziuni

Incluziuni
Tilacoide/

amilacee/

proteice/
Plastide/

fenolice/
plastidă

plastidă

plastidă

plastidă

plastidă
Grane/
celulă

grană
Violacee 11,9±0,4 6,8±0,3 2,8±0,1 3,4±0,06 4,4±0,06 6,6±0,04 0,8±0,01
Crem- 11,4±0,3 6,9±0.4 2,4±0,2 4,2±0,09 3,0±0,02 7,8±0,02 0,5±0,04
roză
Crem- 8,1±0,4 4,4±0,7 2,2±0,1 6,8±0,10 1,8±0,01 10,1±0,9 0,6±0,03
albă
Verde 13,6±0,6 16,4±1,8 5,0±0,2 2,2±0,09 4,3±0,04 2,9±0,04 -
În celulele carpomasei violacee deosebim cloroplaste (fig. A.6.19), în care sistemul
membranelor fotosintetice este organizat în grane alcătuite din 2-4 tilacoide, iar în calitate de
incluziuni sunt doar cele de natură fenolică atât în spaţiile intratilacoidale, cât şi sub formă de
granule, în stromă. Se întâlnesc şi cloroamiloplaste cu 2-4 granule de amidon, iar membranele
împachetate mai compact şi numărul de tilacoide în grane este mai mare (fig. 6.12;A.5.21).
Pentru cloroplaste, funcţia dominantă rămâne fotosinteza, reflectată prin sistemul
tilacoidal-granar dezvoltat, iar în cloroamiloplaste, fotosinteza este suprimată de funcţia de
depozitare a materiilor de rezervă, care prevalează. Mai deosebim plastide cu sistem granar şi cu
granule amilacee, lipidice şi fenolice (fig. A.5.16), ce denotă că funcţiile de fotosinteză,
biosinteză şi acumulare a incluziunilor de diferită natură chimică se găsesc într-un echilibru. Se
întâlneşte un tip de plastide specific acestei carpomase, cromoproteoplastele (fig. 6.13), cu
incluziuni mari, globuloase, proteice, ce ocupă o 1/2 din aria plastidei, cealaltă, e cu incluziuni
lipidice, iar granele lipsesc, ce denotă specializarea în depozitarea materiilor de rezervă, o
tendinţă firească în evoluţia ontogenetică a plastidelor.
Studiul morfometric al plastidomului (tabelul 6.5) arată că volumul parţial maxim
aparţine incluziunilor – 58,1%, care, conform naturii chimice, se distribuie: amilacee – 17,2%,
urmate de valorile echivalente, a câte ~ 16% pentru lipidice şi proteice, apoi 12,6% – incluziunile
fenolice. Granele ocupă un volum minim (19,4%), ce denotă prevalenţa funcţiei de depozitare
asupra celei de fotosinteză şi permite determinarea carpomasei violacee, ca una de depozitare. În
celulele carpomasei sunt prezenţi peroxizomii, organite cu membrană unitară, ce dispun de un
echipament enzimatic complex, care intervin în procesele metabolice, participă la oxidarea

157
acizilor graşi, aminoacizilor, a-hidroxiacizilor, care se formează la acţiunea factorilor endo- si
exogeni. În rezultat se formează peroxidul de hidrogen, care este descompus în H2O şi O2 de
către catalază. Atunci, când acizii graşi se formează în exces, capacitatea catalazei de a
descompune H2O2, format prin metabolizarea acestora, este depăşită şi, ca urmare, nivelul lui în
peroxizomi sporeşte şi conduce la stresul oxidativ [47,243]. Peroxizomii reprezintă o reacţie
adaptivă a celulelor calusale in vitro pentru oxidarea lipidelor, ca rezultat a dezorganizării şi
destrucţiei membranelor intracelulare.
Tabelul 6.5. Volumul parţial (%) al constituenţilor plastidieni în carpomasele pigmentate
Volumul parţial (%) al
Carpomase incluziunilor
granelor

stromei

pigmentate
totale amilacee fenolice lipidice proteice
Violacee 19,4±0,3 22,5±1,6 58,1±3,1 17,2±0,4 12,6±0,5 16,2±1,5 16,1±1.8
Crem-roză 13,4±0,4 9,0±0,7 76,6±4,2 38,2±1,2 4,1±0,4 20,2±1,2 14,1±0,4
Crem-albă 11,2±0,7 6,0±0,9 82,8±2,8 40,1±0,9 1,2±0,1 26,1±1,6 15,4±0,2
Verde 40,4±0,8 32,5±2,1 27,1±3,4 12,4±0,8 6,9±0,8 7,8±0,9 -
O caracteristică dominantă a celulelor carpomasei violacee este prezenţa incluziunilor
fenolice heteromorfe. Se atestă sub aspectul unei făşii neregulate pe tonoplast (fig. 6.12), în
formă de semisferă (fig. A.5.22) sau făşie neîntreruptă, relativ groasă pe plasmalemă (fig.
A.5.23). Incluziuni fenolice sferice, dispersate, sau sub formă de aglomerări se văd în tot
lumenul vacuolar (fig. A.5.24). Se mai deosebesc şi aglomerări iregulate, aforme, în spaţiul
vacuolelor (fig. A.5.25). Sunt celule, transformate în depozite fenolice, la care vacuola
electrondensă, ocupă tot spaţiul. Depuneri fenolice se observă între microfibrilele peretelui
celular, în regiunea lamelei mediane (fig. 6.14). Menţonăm următoarea distribuire (tabelul 6.6),
în descendenţă: 61,1% - în vacuom; 12,1% - pe formaţiuni membranice; 10,8% - în plastide (în
stroma plastidială); 7,9% - în canalele RE; 5,1% – pe peretele celular şi 4,0% - pe plasmalemă.
Tabelul 6.6. Volumului parţial al incluziunilor fenolice în compartimentele celulare ale
carpomaselor pigmentate
Volumul parţial (%) al incluziunilor fenolice în
Carpomase Plastide RE Vacuom Plasmalemă Perete Formaţiuni
pigmentate celular membranice
Violacee 10,8±1,2 7,9±1,2 61,1±0,6 4,0±0,7 5,1±0,7 12,1±0,4
Crem-roză 5,9±0,7 4,1±0,6 64,1±0,4 5,2±0,7 5,8±0,3 14,9±0,4
Crem-albă 3,1±0,7 3,3±0,5 61,6±0,2 7,1±0,2 7,1±0,4 18,1±0,2
Verde 3,3±1,2 13,0±1,1 40,1±1,2 2,1±0,2 0,9±0,1 0,6±0,1
În unele celule senescente ale carpomasei sunt înregistrate rarefieri ale hialoplasmei,
vezicularea citoplasmei, multiple vezicule în părţile distale ale complexului Golgi, intensificarea
proceselor litice, lărgirea profilelor RE, acumularea materialului electrondens în hialoplasmă

158
(fig. A.5.26;A.5.27;A.5.28). Se observă deplierea plasmalemei de la peretele celular, formarea
formaţiunilor concentrice, acumularea plastoglobulelor în plastide.
Acumulări fenolice se observă pe formaţiunile membranice şi pe perimetrul multiplelor
vacuole (fig. A.5.28;A.5.29). În unele celule se atestă procesele de dezintegrare şi destrucţie,
când organitele pierd integritatea, iar acumulările fenolice sunt pe toate formaţiunile şi resturile
membranice (fig. A.5.30;A.5.31). Deşi, sunt prezente şi celulele cu caracteristici ultrastructurale
senescente, carpomasa violacee, preponderent, este alcătuită din celule fiziologic active.

Fig. 6.11. Nucleu angular parietal, x12 800. Fig. 6.12. Plastidă cu incluziuni amilacee,
fenolice. Făşie fenolică pe tonoplast, x14 200.

Fig. 6.13. Proteocromoplast. Resturi Fig. 6.14. Depuneri fenolice în peretele celular,
membranice în vacuolă, x10 200. celule umplute cu conţinut fenolic, x 9200.

6.2.2. Carpomasa crem-roză

Carpomasa crem-roză este alcătuită din celule heterogene, după organizarea
submicroscopică, preavalează cele cu caractere de senescenţă. Celulele carpomasei crem-roză
sunt vacuolizate, un sistem de vacuole (fig. 6.15;A.5.32) ori o singură vacuolă, mare cu poziţie
centrală (fig. 6.16;A.5.33;A.5.34). Citoplasma este redusă la o făşie pe peretele celular, bogată în
organite, cu multe vacuole mici şi veziculări (fig. A.5.32-A.5.34).
Nucleul are o formă atipică, des, alungit-angulară, cu carioplasma omogenă, lipsită de
zone de cromatină concentrată, poziţie parietală, caracteristică celulelor vacuolizate (fig. 6.16).
În celulele cu elemente de dezorganizare şi destrcuţie, carioplasma are unele concentraţii în zona
anvelopei nucleare (fig. A.5.35). Numărul ribozomilor în celulele calusale variază de la moderat

159
la redus, sunt dispersaţi în citoplasmă, poliribozomii lipsesc, rar sunt ataşaţi pe canalele RE, care,
în conformitate cu unele date [177,342], ilustrează diminuarea biosintezei proteinelor
constructive, în schimbul progresiei sintezei celor enzimatice cu rol de catalizare, ce reflectă
predominanţa proceselor catabolice asupra celor anabolice. Mitocondriile, frecvent sunt de formă
ovală, cu număr mic de criste, uneori veziculate, matrix de densitate redusă, lipsit de arii
translucide, corespunzătoare zonelor genofore şi mitoribozomilor, care denotă diminuarea
necesităţii de energie [36,235]. Nu se observă contacte intermitocondriale şi nici cu alte organite
citoplasmatice. Uneori, mitocondriile au caracteristici ale condiţiilor de stres [267,307,369], fiind
aforme, elongate şi cu strangulaţii (fig. A.5.36). RE este reprezentat prin fragmente de canale,
lipsite de ribozomi, dilatate şi umplute cu material electrondens fenolic (fig. A.5.35).
Plastidomul este heterogen, similar carpomasei violacee, dar cu unele specificări:
plastidele au sistem de membrane fotosintetizătoare redus, iar incluziunile, de diferită natură
chimică, predomină şi reprezintă diferite forme intermediare: cloroamiloplaste (fig. 6.15;A.5.32)
– cu granule amilacee, relativ mari; cloroamilotaninocromoplaste (fig. 6.17;A.5.33) – cu granule
amilacee, fenolice şi plastoglobule. Valorile numerice ale granelor, tilacoidelor în grane,
incluziunilor, de diferită natură chimică ( tabelul 6.4) sunt aproape echivalente pentru carpomasa
violacee şi crem-roz. Analiza morfometrică a ultrastructurii plastidelor (tabelul 6.5.) denotă, că
volumul granelor este redus (13,4%), faţă de carpomasa viloacee (19,4%), iar cel al stromei
diminuează substanţial, fiind ocupat de incluziunile de diferită natură chimică cu un volum total
de 76,6%, care este superior faţă de carpomasa violacee (58,1%). Incluziunile amilacee ocupă
volumul maxim de 38,2% (dublu, faţă de carpomasa violacee), apoi urmează incluziunile
lipidice, 20,2% (puţin sporit faţă de carpomasa violacee), proteice, 14,1% (redus, faţă de
carpomasa violacee), iar volumul minim revine incluziunilor de natură fenolică – 4,1%, fiind de
3 ori mai mic, decât în cea violacee, ce reflectă diminuarea activităţii fotosintetice a plastidelor,
concomitent, cu sporirea celei de depozitare a materiilor de rezervă, de diferită natură chimică.
Prezenţa incluziunilor CF, caracterizate printr-un grad sporit de polimerizare, un
diapazon larg de distribuire şi cantităţi sporite, sunt indici specifici carpomasei crem-roză
(tabelul 6.6). În stroma plastidei şi, rar, în spaţiile intratilacoidale incluziuniunile sunt ovale (fig.
6.17;A.5.32;A.5.33), pe perimetrul tonoplastului au formă de făşii groase (fig.6.15); în lumenul
vacuolar se văd incluziunile sferiforme (fig. A.5.37), în canalele RE (fig. A.5.35) şi pe
formaţiunile membranice citoplasmatice (fig. A.5.38-A.5.40) acumulări aforme, ce denotă
implicarea diferitor organite celulare în metabolismul CF. Valorile maxime ale volumului parţial
al incluziunilor CF, ca şi în carpomasa violacee, revin vacuomului (64,1%), iar volumul fenolic

160
din plastide şi RE se reduce, pe când, cel din zona murală, este în ascensiune (fig. 6.18), ce
ilustrează tendinţa vectorului mural de implicare a organitelor în translocarea fenolică.
Se înregistrează procese structural-destructive exprimate prin: dezorganizarea organitelor
şi reorganizarea lor în corpi mielinici (fig. A.5.33); fragmentarea RE (fig. A.5.35); formarea
agregatelor multiveziculare (fig. A.5.38;A.5.39); progresia proceselor şi extinderea ariilor litice,
care conduc la dispariţia organitelor, rarefierea citoplasmei, reducerea citoplasmei, concomitent
cu creşterea excesivă a volumului vacuolelor (fig. A.5.38-A.5.40), ce denotă prevalarea
proceselor catabolice în celulele carpomasei crem-roză, care conduc la senescenţă.

Fig. 6.15. Vacuolizarea Fig. 6.16. Nucleu parietal Fig. 6.17. Plastidă cu incluziuni
celulei, acumulări fenolice, angular, x12 200. fenolice intratilacoidale şi
x14 500. stromatice, x15 200.

70

60 Carpomasă
violacee
50 Carpomasă
crem-roz
40
Carpomasă
crem-albă
Carpomasă
30
verde

20

10

0
Plastide Reticul Vacuom
Perete 
Formațiuni Plasmalemă Anvelopă
celular 
endoplasmatic membranice celulară

Fig. 6.18. Variaţia valorilor volumului parţial al incluziunilor fenolice în diferite compartimente
celulare ale carpomaselor pigmentate.

161
6.2.3. Carpomasa crem-albă
Caracteristicile ultrastructurale ale celulelor, în plan general, sunt similare carpomasei
violacee, însă cu unele aspecte specifice doar acestui tip de carpomasă. Nucleul este ovat (fig.
A.5.41) sau aform (fig. 6.19) cu cromatina decondensată şi, numai pe alocuri, heterocromatina
lângă membrana nucleară în formă de insuliţe mici sau în strat subţire. Ribizomii liberi sunt în
număr mic, iar polizomii lipsesc, ce denotă o activitate biosintetică proteică redusă.
Mitocondriile sunt diverse, din punct de vedere morfologic: sferice, ovate, alungite (fig. 6.19;
A.5.41;A.5.42), caracterizate prin stromă rarefiată şi un număr de criste redus.
În celulele carpomasei crem-albă plastidele au indici numerici deosebiţi (tabelul 6.4), în
raport cu carpomasa crem-roz şi violacee, sunt lipsite de cloroplaste, predomină
cloroamiloplastele (fig. A.5.41-A.5.44) şi amiloplastele (fig. A.5.45), confirmate şi de datele
morfometrice (tabelul 6.5). O caracteristică a carpomasei crem-albă este forma specifică a
granulelor de amidon şi modul de localizare a centrelor amilogene în plastide. Sunt granule
amilacee de formă ovată, distribuite câte 2-3 printre membranele fotosintetizătoare (fig. A.5.4.1),
ocupând 1/3 din suprafaţa secţiunii plastidei. Prezintă interes granulele amilacee aforme cu
contur sinuat, grupate câte 5-6, constituind centre cu localizare marginală sau distală (fig. 6.19;
A.5.41-A.5.44). Se observă aranjarea compactă mozaicată a granulelor amilacee (fig. 6.19;
A.5.42-A.5.44). Forma granulelor de amidon poate reprezenta starea fiziologică a celulei şi
serveşte ca un criteriu diagnostic, în plan aplicativ [87]. De regulă, granulul de amidon se iniţiază
pe un centru amilogen [242] şi prin depuneri succesive a straturilor se măreşte în dimensiuni.
Aranjarea compactă mozaicată a granulelor de amidon rezultă de la fragmentarea granulelor
mari, fenomen fiziologic, descris în celulele cotiledoanelor din perioada germinării seminţelor,
care precedează etapele de degradare a amidonului prin implicarea fosforilazei şi amilazei [278].
Aceasta demonstrează că plastidele, caracterizate prin sistem granar redus, nu produc substanţele
necesare celulelor şi ele îşi satisfac necesităţile prin utilizarea amidonului depozitat. În
carpomasa crem-albă sunt prezente şi amiloplastele (fig. 6.20) cu 1-2 granule amilacee mari,
care ocupă tot spaţiul intraplastidial.
O altă caracteristică a carpomasei crem-albă este prezenţa plastidelor în formă de cupă,
cu invaginări, care, în secţiunea longitudinală, au configuraţia unui laţ (fig. A.5.45–A.5.46), cu
structuri specifice senescenţei (acumulări de plastoglobule, aranjate în lanţuri de 3-7). Se mai
întâlnesc plastide, lipsite de grane, cu o incluziune proteică mare, globuloasă, distală, care ocupă
½ din aria secţiunii longitudinale, cealaltă ½ e câptuşită cu incluziuni, mari, lipidice (fig.
A.5.47), ce le determină ca proteocromoplaste, specializate în depozitarea materiilor de rezervă,
ce ilustrează principiul diversificării funcţiilor (Plate) la nivelul celular de organizare. Analiza

162
parametrilor cantitativi (tabelul 6.4) a organizării structurale a plastidelor, arată deosebiri în
carpomasele pigmentate, confirmate prin analiza morfometrică (tabelul 6.5).
Studiul morfometric al incluziunilor fenolice reflectă tendinţele similare de acumulare,
preponderentă, în vacuom şi în zona murală, ca şi în celelalte carpomase (tabelul 6.6). Valorile
volumului parţial al incluziunilor fenolice din plastide şi RE sunt în descreştere, dar sporesc cele
de pe plasmalemă, peretele celular şi de pe diferite formaţiuni membranice (fig. 6.18).
În carpomasa crem-albă se întâlnesc elemente înaintate de dezintegrare şi destrucţie ale
celulelor (fig. 6.21;6.22;A.5.45-A.5.51), rarefierea citoplasmei şi reducerea numărului de
ribozomi (fig. A.5.45;A.5.46;A.5.49), fragmentarea şi dilatarea canalelor RE, apariţia
lizozomilor cu rol litic, care cauzează distrugerea porţiunilor de citoplasmă, ce rezultă în
pierderea integrităţii organitelor (fig. A.5.49;A.5.50). În unele vacuole sunt resturi de membrane,
în altele sunt formaţiuni aforme fenolice în lumenul vacuolar (fig. 6.21), sau pe perimetrul
tonoplastului (fig. 6.22). Sunt celule, lipsite de citoplasmă sau redusă la o făşie îngustă, doar cu
unele formaţiuni membranice şi reziduri ale organitelor distruse, cu pereţi sinuaţi (fig. 6.22).

Fig. 6.19. Nucleu angular. Mitocondrii Fig. 6.20. Detaliu a unui amiloplast,
elongate, x9 800. x15 200.

Fig. 6.21. Vacuolă cu acumulări fenolice Fig. 6.22. Peretele celular pliat. Acumulări
în formă de fulgi, x12 200. fenolice pe plasmalemă şi în peretele
celular, x9 800.
6.2.4. Carpomasa verde
Organizarea ultrastructurală a celulelor carpomasei verde se deosebeşte de cea a
celorlalte carpomase pigmentate, fiind alcătuită din celule parenchimatice oval-rotungite, cu
pereţii pectocelulozici subţiri, grad moderat de vacuolizare, o singură vacuolă centrală sau 2-3

163
mai mici, care ocupă nu mai mult de 1/3 din volumul celulei. Nucleul sferic, central (fig.
A.5.52), cu un singur nucleol, cromatina condensată, uniform dispersată în carioplasmă,
anvelopa nucleară fără dilataţii. Uneori, nucleu atipic, angular cu doi nucleoli (fig. 6.23) sau cu
invaginări, care înscrie o configuraţie neregulată (fig. A.5.53), dar îşi păstrează poziţia centrală.
Celulele cu hialoplasma densă, citoplasmă bogată în organite: ribozomi şi poliribozomi
(fig. 6.23;A.5.52;A.5.53); RE dezvoltat, cu profile paralele (fig. A.5.54); dictiozomii, din 5-7
saculi aplatisaţi (fig. A.5.55). Mitocondriile sferice (fig. A.5.56;A.5.57), dispersate sau câte 3-4,
cu criste dezvoltate, conturate în secţiune şi matrix structurat. Deosebim şi populaţii de
mitocondrii alungite, cu sistem de criste dezvoltat şi stroma densă. Se atestă contactele
interorganelare plastidă-nucleu (fig. 6.23;A.5.52), mitocondrii-mitocondrii (fig.A.5.57;A.5.58),
canalele RE-ribozomi (fig. A.5.54), dictiozomi-mitocondrii (fig. A.5.55).
Plastidomul este reprezentat prin plastide mai uniformizate, privind forma şi organizarea
intraplastidială. Parametrii numerici ai plastidomului carpomasei verde (tabelul 6.4) reprezintă
un decalaj, în raport cu carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă. Numărul de
plastide/celulă este sporit: numărul de grane, de 2 ori mai mare, decât în carpomasa violacee şi
crem-roz şi de 4 ori mai mare, faţă de crem-albă. Numărul tilacoide/grană se dublează, iar al
incluziunilor amilacee se micşorează de 2 ori, faţă de carpomasa crem-roză şi de 3 ori, faţă de
cea crem-albă Numărul plastoglobulelor se reduc de 2 ori, faţă de celelalte carpomase
pigmentate. De menţionat, prezenţa incluziunilor fenolice, în număr echivalent, în plastidele
carpomasei verde şi violacee. O caracteristică specifică este lipsa incluziunilor proteice în
carpomasa verde. Plastidomul în carpomasa verde, este reprezentat prin cloroplaste (fig. 6.23-
6.25; A.5.56;A.5.59-A.5.63), cu membranele împachetate în tilacoide granare, unite prin
tilacoide stromatice, constituind un complex membranar unic, orientat de-a lungul axei mari a
cloroplastului. Incluziunile amilacee şi lipidice sunt reduse. De menţionat, prezenţa reticulului
periferic în cloroplastele carpomasei verde (fig. 6.24; A.5.60), care, conform [9,369], reflectă un
trafic metabolic intens al asimilatelor din cloroplaste în zonele de necesitate, ce nu permite
acumulări intraplastidiene. Rar sunt cloroplastele în formă de cupă (fig. A.5.59;A.5.60), care
reprezintă un indicator al adaptării la condiţiile nefavorabile [9]. Dezvoltarea plastidelor în formă
de cupă şi cu invaginări în formă de laţ în celulele carpomasei verde, este o reacţie adaptivă la
condiţiile de cultură in vitro, ce accelerează procesele de senescenţă.
Studiul morfometric (tabelul 6.5) confirmă prevalarea plastidelor de tipul cloroplastelor
în carpomasa verde. Cel mai mare volum parţial (40,4%) revine granelor, ce este mult superior,
faţă de alte carpomase pigmentate. Stroma cloroplastelor este densă, bogată în plastoribozomi şi

164
Fig. 6.23. Nucleu angular, Fig. 6.24. Cloroplast cu Fig. 6.25. Acumulări fenolice
x14 200. reticul periferic, x10 200. pe tonoplast, x 9200.
ocupă un volum de 32,5%, ce este de 5 ori mai mare, decât cel din carpomasa crem-albă, unde
stroma este inlocuită de incluziunile materiilor de depozitare. În cazul carpomasei verde,
volumul parţial minim revine incluziunilor de diferită natură – 27,1 %, cu următoarea distribuire
în descendenţă: 12,4% - amilacee, 7,8% - lipidice, 6,9% - fenolice. Deşi, volumul incluziunilor
fenolice este cel mai mic (6,9%) şi sunt prezente, atât în spaţiile intratilacoidale (fig. A.5.57;
A.5.61; A.5.62), cât şi sub formă de granule, în stroma plastidelor (fig. A.5.62), el constituie a
patra parte din volumul total al incluziunilor (27,1%), similar carpomasei violacee. Pentru
celelalte carpomase acest coraport este altul: a 18 parte în carpomasa crem-roză şi a 64 parte în
cea crem-albă din volumul total al incluziunilor. Aceasta denotă implicarea activă a plastidelor
din carpomasa violacee şi verde în biosinteza şi metabolismul fenolic.
Incluziunile electrondense de natură fenolică mai sunt atestate, în cantităţi reduse, pe
perimetrul tonoplastului, sub formă de făşie îngustă (fig. 6.25;A.5.63), sferă sau semisferă,
înşirate pe perimetrul tonoplastului (fig. A.5.63). Datele morfometrice, privind distribuirea
volumului parţial al incluziunilor fenolice (tabelul 6.6) în carpomasa verde, demonstrează
valoarea maximă a volumului parţial fenolic (43,3%) revine plastidelor, fiind mult superioară, ca
şi cea din RE (13,0%), faţă de carpomasele violacee, crem-roză şi crem-albă, iar cele minime
revin formaţiunilor membranare şi zonei murale (plasmalemă şi peretele celular).
Indicii ultrastructurali, remarcaţi în studiul carpomaselor in vitro confirmă existenţa unei
sensibilităţi a organitelor celulare, în condiţiile de dezvoltare in vitro, iar studiul morfometric
denotă transformarea graduală a ultrastructurilor, în concordanţă cu balanţa hormonală a MN şi
a factorilor fizici aplicaţi, fapt remarcat şi în alte studii [206,266,285]. Polimorfismul organitelor
este o reacţie generală de restructurare a organitelor în procesul de adaptare la condiţiile in vitro
[22,82,206,266,351] şi a celulelor in vivo, la acţiunea factorilor nefavorabili ai mediului ambiant
[8,46,177,267,307].

165
 Pe perioada dezvoltării carpomaselor la aronie, plastidele au fost cele mai sensibile
organite, care reacţionează şi se adaptează la condiiţiile in vitro graţie flexibilităţii sistemului
lamelar-granar printr-o gamă de transformări, fapt menţionat şi în alte studii in vitro
[206,251,266,351]. Deşi, prezenţa incluziunilor amilacee, lipidice, proteice, fenolice este o
caracteristică a celulelor calusului embriogenic [166,194,296] ele au fost descrise şi în celulele
celui nonembriogenic [6,21,22,57,58,83,113,290]. Unii autori [169,296] menţionează lipsa
amidonului în calusul primar şi prezenţa lui în cel secundar. În celulele carpomaselor de aronie
amidonul este prezent în calusul primar şi secundar, similar altor lucrări [57]. Calusului secundar
îi este specific numărul variabil şi polimorf de granule amilacee: de la una ovală, în celulele
imature, până la 7-9, de forme variate, în celulele mature, la aronie [21,22], similar altei lucrări
[330]. În carpocultură, la tomate, raportul este invers; acumulări amilacee maxime, în calusul
juvenil şi diminuarea în cel matur [58]. Sporirea conţinutului de amidon în celule calusale, în
faza staţionară, are loc, fie din glucidele MN, fie în rezultatul activităţii fotosintetice, determinată
de volumul granelor plastidelor şi se înscire în tendinţa naturală, caracteristică celulelor vegetale
mature, de a forma rezerve nutriţionale, obţinută pe parcursul evoluţiei lumii vegetale [206,382].
Incluziuni proteice au fost descrise în celulele calusale nonembriogenice, deşi în cantităţi
mai mici, decât în cele embriogenice [131,266]. Atestarea incluziunilor proteice, doar în
carpomasele violacee, crem-roză, crem-albă, crescute pe MN cu doze de ANA, exprimă o
reacţie specifică de adaptare la condiţiile nutriţionale concrete in vitro, deoarece ele lipsesc în
carpomasa verde de pe MN cu 2,4-D şi nu sunt caracteristice fructelor in vivo.
Prin îmbinarea metodelor de analiză ultrastructurală şi morfometrică a plastidomului
polimorf s-a determinat direcţia transformărilor calitative graduale ale plastidelor în corelaţie cu
pigmentaţia carpomasei: verde, reprezentată prin cloroplaste cu sistem membranar dezvoltat şi
structurizat în grane; violacee, crem-roză cu forme heterogene de tranziţie, amilocloroplaste;
cromocloroplaste; cromproteooplaste, taninocloroplaste; crem-albă, prin amiloplaste,
cromoplaste, proteoplaste. Asamblarea ribozomilor, sporirea densităţii electronmicroscopice din
mitocondrii, profilele lungi şi paralele ale RE rugos, plastidele cu un nivel înalt de dezvoltare şi
structurizare a sistemului granar, grupările de mitocondrii şi contactele sporite interorganelare
denotă o activitate metabolică energetică sporită. Multiplele vezicule golgiene şi îngroşarea
peretelui celular confirmă prezenţa unui trafic sporit şi contribuţia lor la formarea peretelui
celular, fapt demonstrat şi în alte lucrări [330].
Sporadic se atestă elementele de dezorganizare, dezintegrare şi destrucţie la nivelul
plastidelor în funcţie de pigmentaţia carpomasei: în verde, doar dezorganizarea, asociată cu
abilitatea de umflare a stromei şi paralel menţinerea sistemului tilacoidal integru; în violacee,

166
dezorganizarea şi dezintegrarea, exprimată prin dilatarea tilacoidelor şi pierderea integrităţii ca
rezultat al inducerii modificărilor în capacitatea osmotică a membranelor, asociată cu sporirea
absorbţiei apei de constituienţii hidrofili ai stromei [307]; iar în crem-roză, şi mai frecvent, în
crem-albă – destrucţia, remarcată prin pierderea integrităţii plastidei. Se atestă procese
destructive ale diferitor organite (RE, dictiozomi, mitocondrii), reorganizarea lor în corpi
mielinici, formarea agregatelor multiveziculare, determinate de progresia proceselor şi extinderii
ariilor litice [36,206], care conduc la dispariţia organitelor, rarefierea citoplasmei, reducerea
citoplasmei, concomitent cu creşterea excesivă a vacuolelor, ce ilustrează prevalarea proceselor
catabolice în celulele carpomaselor crem-albă, crem-roză. Starea fiziologică a celulelor este
reflectată prin succesiunea graduală a etapelor deteriorării, ele fiind mult mai accelerate în
carpomasele crem-albă şi crem-roză, faţă de violacee şi verde, provocând senescenţa.
Vezicularea citoplasmei de diferită geneză în vecinătatea organitelor denotă existenţa
unui transport accelerat, care asigură procesele metabolice celulare intense în carpomasele
violacee, crem-roz, crem-albă. Migrarea veziculelor este direcţionată de elementele
citoscheletului pe 2 vectorizări: 1) în interiorul celulei, unde se pot intercala în continuitatea
membranelor organitelor, dar ultima verigă reprezintă vacuomul, centru atractiv şi colector al
diferitor metaboliţi şi 2) spre experior, cu menirea de expulzare a unor compuşi din protoplast,
iar precursorii celulozici şi ligninici se intercalează în pereţii celulari [131,236], sporind
îngroşarea şi densitatea lor, ce reprezintă o caracteristică a celulelor carpomaselor violacee,
crem-roză şi crem-albă.
O caracteristică a carpocalsurilor este formarea corpilor mielinici şi agregatele
multivacuolare, care reprezintă derivate ale plasmalemei [200] sau ale altor organite [65,377], iar
lipsa lor în unele celule poate fi explicată prin posibilitatea reutilizării [307]. Indiferent de
geneză, lor li se atribuie rol important în transportul intracelular al precursorilor, enzimelor,
substanţelor elaborate de protoplast intra- şi extracelular.
Celulele carpomaselor in vitro: violacee, crem-roză şi crem-albă (MN cu doze de ANA)
şi verde (MN, cu doze de 2,4-D) au organizarea ultrastructurală comună, dar cu unele
particularităţi specifice, ce atestă diferenţe relevante, care corelează cu pigmentaţia carpomasei:
dezvoltarea organitelor; plasticitatea organizaţiei intraplastidiale şi reactivitatea ei printr-o gamă
de modificări ultrastructurale, ce implică sistemul tilacoidal-granar, stroma şi incluziunile de
diferită natură chimică; prezenţa sistemului multivacuolar în baza agregatelor multiveziculare,
vezicularea sporită de diferită geneză; prezenţa corpilor concentrici mielinici; polimorfismul,
topografia diversă a incluziunilor fenolice, amilacee, lipidice, proteice; fragmentarea, dilatarea şi
vezicularea profilelor RE; întreruperea tonoplastului şi a plasmalemei; prezenţa precipitatelor şi

167
complexelor membranare în vacuole; asincronismul în evoluarea proceselor de dezorganizare,
dezintegrare şi destrucţie a organitelor celulare.
Celulele carpogene in vivo şi in vitro au plan comun de organizare ultrastructurală, iar
evoluarea maturării celulelor are loc prin mecansime ultrastructurale similare, dar în cele in vitro
în termeni comprimaţi, detereminate de viteza, amplituda şi gradul de asociere a transformărilor
în corelaţie cu pigmentaţia carpomaselor. Modificări ultrastructurale asemănătoare au fost
descrise în fructe la acţiunea complexului ecologic al terenurilor versante şi al reliefului
geografic [9,46], în perioada de post-maturare [379], ce denotă că, celulele reacţionează la
acţiunea factorilor externi şi celor de carpomaturare şi post-maturare analog, prin mecanisme
ultrastructurale similare, dar specificări relevante.
6.3. Ultrastructura celulelor fructului şi carpomaselor pigmentate in vitro şi principiile
evolutive
Culturile tisulate inoculate pe MN aseptice, reprezintă modele de sisteme biologice noi,
adaptate la anumite condiţii de cultură in vitro, prin intermediul diferitor modificări structural-
funcţionale şi stuctural-biochimice. Analiza comparativă structural-biochimică a celulelor
pericarpului fructului in vivo şi a carpomaselor in vitro, prin prisma principiilor evolutive,
permite elucidarea rolului modificărilor structural-funcţionale în asigurarea progresului biologic
[378,382]. S-a determinat că transformările structural-funcţionale comparative ale celulelor
carpomaselor in vitro şi fructelor in vivo de aronie reflectă fluctuaţia modificărilor elementare de
organizare, care corespund anumitor principii evolutive la nivel de organizare ultramicroscopică.
Principiul intensificării funcţiilor (Severţov) însoţit de modificările profunde, care
prevede mărirea numărului de unităţi discrete, dependente de surplusul activităţii anabolice.
Acest principiul se manifestă în celulele carpomaselor in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
prin sporirea contactelor dintre organitele de acelaş tip sau diferite tipuri ale celulelor;
dezvoltarea organitelor de formă atipică, cu invaginări şi protuberanţe, ce determină
polimorfismul organelar; heterogenitatea structurală a plastidomului; dezvoltarea potenţialului
nutritiv celular de rezervă. Astfel, celule carpomasele in vitro ajung la maturare într-o perioadă
de timp mai comprimată, decât celulele pericarpului de aronie in vivo.
Principiul substituţiei funcţiei (Dorn) exprimat prin diminuarea funcţiei principale cu
structura corespunzătoare şi sporirea altei funcţii secundare, prin dezvoltarea structurilor
respective, ce conduce la substituirea calitativă a funcţiilor. Aspectele ultrastructurale cum ar fi
transformarea cloroplastelor, prin diminuarea funcţiei de fotosinteză şi sporirea celei de
depozitare, în amiloplaste, proteoplaste, taninoplaste; transformarea vacuolelor cu funcţia de
turgor în vacuole cu funcţie de depozitare a incluziunilor polifenolice; RE cu rol de transport şi

168
contact în RE cu îndeplinirea funcţiei de depozitare în celulele carpomaselor in vitro pe parcursul
perioadei de calusogeneză şi pe perioada de maturare a fructelor in vivo ilustrează acest
principiu.
Principiul diversificării (extinderii) funcţiilor (Plate), care prevede sporirea numărului
de funcţii secundare, concomitent, păstrând funcţia principală, ilustrat prin prezenţa
amilocloroplastelor, taninocloroplastelor, proteocloroplastelor, cromocloroplastelor, în care
funcţiile secundare de sinteză şi acumulare a CF, proteinelor, amidonului, lipidelor, au loc
paralel cu funcţia principală de fotosinteză. Prin dezvoltarea acestor funcţii secundare apar
structuri specifice, ce conduc la formarea unor plastide cu ultrastructură intermediară, ce nu
permite încadrarea într-o tipologie strictă şi reprezintă o diversificare morfo-funcţională a
plastidomului, ce constituie un mecanism universal de adaptare celulară la acţiunea diferitor
factori ecologici, iar, în cazul dat, la condiţiile de cultură in vitro.
Principiul compartimentalizării organelor sau a funcţiilor (Severţov). Un organ sau
organit, caracterizat prin integritate în procesul filogenezei, se compartimentalizează, formând
organe sau structuri independente, care contribuie la sporirea intensităţii activităţilor structural-
metabolice. Fragmentarea vacuolei centrale în mai multe compartimente şi formarea sistemelor
multivacuolare în celulele carpomaselor demonstrează o activitate intensă metabolică a celulelor,
care şi conduce la formarea unei deponente de metaboliţi secundari.
Principiul compensaţiei funcţiilor şi ritmul diferit al modificărior organelor (Voronţov)
se manifestă prin restructurarea rapidă a unor structuri, care compensează întârzierea
restructurării altor structuri a aceluiaşi sistem. În celulele mature ale carpomaselor in vitro şi
fructelor in vivo este bine dezvoltat plastidomul cu un diapazon larg de restructurări
intraplastidiale cum ar fi: reducerea şi reorganizarea sistemului tilacoidal-granal, apariţia
incluziunilor de diferită natură chimică, vezicularea stromei, pe când transformările organizaţiei
structurale ale mitocondriilor sunt mult mai rezervate. Astfel, plastidele şi mitocondriile,
formând aceiaşi grupă funcţională, prin activitatea lor, în anumite condiţii, se pot compensa.
Principiul integrităţii fragmentare în organizarea celulară (Matienco). În cazul
pierderii integrităţii totale a unor organite celulare, are loc restructurarea lor în formaţiuni noi,
care asigură funcţionalitatea celulei. Odată cu pierderea integrităţii plastidelor şi a altor organite,
în perioada de maturare-senescenţă atât în celulele in vivo, cât şi în cele in vitro are loc formarea
structurilor concentrice, graţie însuşirilor membranelor de reorganizare structurală, descrise şi în
alte lucrări ştiinţifice [46,177,306,377].

169
 Principul autonomizării în dezvoltarea organelor (Scripcinskii). Fructele sunt
considerate organe cu nivel relativ înalt de autoreglare, determinate ca sisteme semiautonome, cu
o biontitate specifică, ce permite vitalitatea lor metabolică, independent de planta-mamă. În baza
multiplelor investigaţii ale fructelor diferitor specii [363,378], au fost elucidate caracteristicile
organospecifice anatomice, submicroscopice, biochimice, în calitate de criterii fundamentale,
care asigură autonomia relativă în dezvoltarea şi evoluţia fructelor suculente. Unele au fost
descrise în celulele fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot [21,22], care se deosebeşte prin
particularităţi specifice carpotipului pommum şi în celulele carpomaselor in vitro, în calitate de
biosisteme cu autoreglare şi autonomie. Un criteriu reprezintă acumularea materiilor de rezervă
în calitate de rezervă imobilizată în celule, exprimată prin biosinteza şi depozitarea hidraţilor de
carbon, proteinelor, lipidelor, polifenolilor, care se acumulează în diferite compartimente
celulare in vivo şi in vitro. Evoluţia plastidomului, din cloroplaste, în celulele juvenile, în amilo-,
tanino-, proteoplaste, în celulele mature şi senescente, transformarea vacuomului în depozite
polifenolice constituie un suport structural în acest sens.
Un alt criteriu reprezintă biosinteza pigmenţilor carotenoidici şi fenolici, în celulele
carpogene, independent de planta-mamă, deoarece activitatea metabolică continuă şi include
procese anabolice şi catabolice. Biosinteza pigmenţilor carotenoidici şi de natură fenolică
(flavonii, antocianii) în fructele înlăturate de la plantă şi în celulele carpocalusale in vitro
ilustrează continuitatea activităţilor biochimice, bazate pe specificul autoreglării şi
autonomizării. Pigmenţii se sintetizează, utilizând rezervele proprii şi asigură o autonomie şi o
independenţă de factorii mediului. Procesul de fotosinteză este o condiţie obligatorie a
autonomizării fructelor şi carpomaselor, asigurată de plastidom, cu sistem fotositetic bine
dezvoltat în grane.
Analiza organizaţiei ultrastructurale ale celulelor carpogene in vitro, comparativ cu in
vivo, prin prisma principiilor evolutive, permite elucidarea şi înţelegerea mai profundă a
mecanismelor de adaptare, precum şi determinarea nivelului de modificări tipice şi transformări
elementare, care conduc, în final, la adaptări idiogene. Aceasta prezintă interes pentru
determinarea gradientului transformărilor structurilor adaptive ale organelor plantelor în condiţii
noi pedo-climatice şi prognozarea modificărilor ultrastructurale în celulele, dezvoltate in vitro.
6.4. Concluzii la capitolul 6
• Celulele fructelor in vivo şi a carpomaselor in vitro au plan comun de organizare
ultrastructurală şi maturarea lor are loc prin mecansime ultrastructurale similare, dar în in
vitro – în termeni comprimaţi, detereminaţi de ritmul, amplituda şi gradul de asociere a

170
 transformărilor în corelaţie cu pigmentaţia carpomaselor, ele fiind mai accelerate în
carpomasele crem-albă, crem-roză şi violacee, în raport cu cea verde.
• Balanţa nutriţională, suplimentată MN, a favorizat specializarea morfo-funcţională a
carpomaselor, în corelaţie cu pigmentaţia: carpomasa verde, generată pe MN, suplimentate
cu doze de 2,4-D, este asimilatoare; carpomasa violacee, pe MN cu doze de ANA, este una
de depozitare a fondului antioxidant, graţie acumulărilor fenolice; carpomasele crem-roză şi
crem-albă, pe MN cu doze de ANA, sunt de depozitare a substanţelor de rezervă cu rol
nutritiv.
• Investigaţiile ultrastucturale comparate, în procesul dezvoltării fructelor in vivo şi carpomasei
in vitro, la aronie, au pus în evidenţă un complex de modificări ultrastructurale, care
demonstrează prezenţa mecanismelor similare, dar cu specificări relevante pentru celulele in
vitro, ce exprimă un indicator al adaptabilităţii în asigurarea vitalităţii, capacităţii de
diviziune celulară şi dezvăluirii potenţei specifice.
• Transformările structural-funcţionale atât în celulele carpomaselor in vitro, cât şi în fructele
in vivo, la A. melanocarpa (Michx.) Elliot, corespund anumitor principii evolutive la nivel de
organizare submicroscopică şi demonstrează existenţa paralelismului în modificările
structurale elementare de organizare.

171
 7. ASPECTE CITO-, HISTOCHIMICE, ULTRASTRUCTURALE, BIOCHIMICE ŞI
ACTIVITATEA BIOLOGICĂ A COMPUŞILOR FENOLICI ÎN CARPOMASELE ŞI
FRUCTELE DE ARONIA MELANOCARPA (MICHX.) ELLIOT
7.1. Studiul histochimic şi biochimic al compuşilor fenolici în ontomorfogeneza fructului
CF sunt metaboliţi secundari cu o largă distribuire în organele plantelor cormofite [359],
îndeplinând roluri importante în activitatea celulelor, ţesuturilor, organelor şi organismului
integru [359], de aceea se află în vizorul multor cercetări stiinţifice [6,7,10,38,83,98,99,142,145,
177,294,307,340,341]. Au fost dezvăluite diferite aspecte structurale, biochimice ale CF, dar
localizarea şi distribuirea CF, la nivel histoanatomic, prin prisma ontomorfogenetică de
dezvoltare a organului, în deosebi, la fructele suculente, încă nu sunt suficient elucidate.
7.1.1. Studiul hictochimic al compuşilor fenolici în ontomorfogeneza fructului
Scopul acestui studiu a fost determinarea, în baza reacţiilor histochimice, a dinamicii
localizării şi distribuirii incluziunilor polifenolice, în limitele pericarpului suculent de A.
melanocarpa (Michx.) Elliot, în funcţie de etapele ontomorfogenetice (10, 20, 30, 40, 50, 60, 80
zile de la înflorire şi fructe mature). Rezultatele analizelor historeacţiilor, aplicate pe secţiunile
pericarpului (tabelul 7.1), demonstrează prezenţa unui caracter dinamic în localizarea calitativă
şi cumulativă a CF, în limitele pericarpului şi pe perioada ontomorfogenezei fructului.
La fructele juvenile (etapele 10 şi 20 zile), efectele historeacţiilor, aplicate pentru
identificarea taninurilor şi flavonoidelor au fost moderate şi reduse, iar pentru compuşii
fenilpropanici au avut un efect bun. La etapele iniţiale, CF analizaţi sunt distribuiţi aproape
uniform în limitele pericarpului, alcătuit din celule cu pereţii celulari foarte subţiri. De
menţionat, lipsa antocianilor în celulele pericarpului fructului juvenil (fig. 7.1).
În pericarpul fructelor, la etapele următoare (30 şi 40 zile), efectele historeacţiilor sunt
moderate şi bune, iar modul de distribiure este specific. Se observă o concentrare evidentă a CF
în epicarp şi hipodermă. Este caracteristic efectul bun al historeacţiilor pentru flavonoide şi cel
redus, până la moderat, pentru taninuri. Efectul reacţiei pentru identificarea compuşilor
fenilpropanici este bun, la etapa de 30 zile şi foarte bun, la 40 zile de la înflorire, iar distribuirea
lor rămâne a fi în toate zonele pericarpului. Vizual, antocianii nu sunt înregistraţi (fig. 7.1).
La etapele 50 şi 60 zile de la înflorire arealul CF, în pericarpul fructului de aronie, se
măreşte. Reperul de bază al localizării CF rămâne a fi regiunea periferică a pericarpului –
epicarpul şi hipoderma, dar distribuirea lor se extinde şi în subzona externă a celulelor oval-
rotungite a mezocarpului. Efecte foarte bune ale reacţiilor histochimice pentru flavonoide şi bune
pentru taninuri sunt în epicarp şi în primele 4-5 rânduri ale parenchimului mezocarpului, care, la

172
aceste etape, se conturează ca subzonă histologică – hipoderma. Spre interiorul pericarpului
efectele reacţiilor histochimice diminuează până la moderat şi redus.
Tabelul 7.1. Efectele reacţiilor histochimice aplicate pe secţiunile pericarpului de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie de etapele ontomorfogenezei
Efectele reacţiilor histochimice pe etapele

identificaţi
Compuşii
ontomorfogenetice
Reacţia Expresia

mature
Fructe
20 zile

30 zile

40 zile

50 zile

60 zile

80 zile
aplicată morfologică,
culoarea

Soluţie de 1% Masa + ++ ++ +++ +++ +++ ++++

Taninuri
Fe2(SO4)3 în granulată în ● ○ ○ ○* ○* ○* ●
HCl 0,1H vacuole,
verde-brună.
Soluţie 1% de Masa uşor ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++
Taninuri

clorură fierică granulată, ○ ○ ○* ○* ○* +

şi alăun de negru-verde. ● ●
fier-amoniu
Soluţie de 5- Sediment + ++ ++ +++ +++ +++ +++
Taninuri

10% K2Cr2O7 granulat ○ ○ ○* ○* ○* ●

negru-verzui, ●
brun.
Acid Sediment ++ ++ ++ +++ + +++ ++++
Taninuri

tetraosmic negru. ● ○ ○ ○* ○* ○* ●

Soluţie de Galbenă, la + ++ ++ ++++ ++++ ++++ ++++

Flavonoide

amoniac temperatură ● ○ ○ ○* ○* ○* ●
în roşie.

Soluţie Sediment ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++

Flavonoide

alcoolică de galben-oranj. ● ○ ○ ○* ○* ○* ●
acetat de
plumb
Reactivul Roşie ++ +++ ++++ ++++ +++ ++ ++
fenilpropanici

Arnow, HCl ● ● ● ● ● ● ●
Compuşi

0,5H, NaOH
1H
Legendă: Efectele historeacţiilor: + - redus; ++ - moderat; +++ - bun; ++++ - foarte bun; ● –
distribuire în toate zonele histologice ale pericarpului; ○ – distribuire în regiunea extern-
periferică (epicarp şi hipodermă); ○* – distribuire în regiunea extern-periferică (epicarp,
hipodermă şi subzona celulelor oval-rotungite externă).
Compuşii fenilpropanici sunt distribuiţi în tot pericarpul, cu un efect bun al historeacţiei.
Este semnificativă apariţia antocianilor cu localizare în vacuole. Ei sunt identificaţi vizual, uşor
prin prezenţa culorii violacee a sucului vacuolar. Distribuirea lor este mai restrânsă, decât a
celorlalţi CF, fiind localizaţi doar în epidermă şi hipodermă (fig. 7.1).

173
 2

10 zile 20 zile 40 zile

60 zile 80 zile fructe mature

Fig. 7.1. Distribuirea compuşilor fenolici în secţiunea transversală a pericarpului în funcţie de
etapa ontomorfogenetică a fructelor de aronie: 1 – antociani; 2 – flavonoide şi taninuri.

La etapa de 80 zile de la înflorire, efectele historeacţiilor pentru toţi CF identificaţi sunt

similare cu cele de la etapa anterioară, doar că arealul de localizare se extinde spre zona internă a
mezocarpului. Culoarea violet-purpurie a antocianilor este mai intensă, comparativ cu cea de la
etapa de 60 zile de la înflorire, cu localizare, în deosebi, în epicarp şi hiodermă. Intensitatea
culorii diminuează de la exterior spre regiunea mediană a pericarpului. În fructele mature CF
sunt localizaţi în toate zonele histologice ale pericarpului. Reacţiile histochimice au demonstrat
efecte foarte bune, în regiunea periferică şi bune, în restul pericarpului. Excepţie prezintă
compuşii fenilpropanici, marcaţi doar prin efecte moderate şi sporadic reduse, dar cu o
distribuire în toate zonele histologice ale pericarpului fructului de aronie.
Antocianii, la fel, sunt distribuiţi în tot pericarpul fructului (fig. 7.1), iar intensitatea
culorii violet-purpurie a lor este foarte pronunţată la periferie, în epicarp şi hipodermă. Se
remarcă diminuarea lentă a intensităţii culorii spre regiunea mediană a pericarpului, ca rezultat a
vacuolizării excesive, dezvoltării pereţilor subţiri şi sporirii dimensiunilor celulelor subzonei
oval-alungite radiar, faţă de celulele oval-rotungite ale subzonelor externă şi internă şi a celulelor
hipodermei.
Studiul histochimic al CF în ontomorfogeneză a pus în evidenţă localizarea şi distribuirea
calitativă şi cantitativă a CF în limitele pericarpului. Pericarpul juvenil, fiind constituit din celule
fine cu pereţii celulari subţiri, necesită mecanisme suplimentare de protecţie împotriva acţiunii

174
factorilor externi nefavorabili: excesul radiaţiei, temperaturilor sporite, caracteristice lunii iunie,
care coincide cu perioada de dezvoltare. Structurile anatomice superficiale, cu rol protector,
reprezentate prin cuticula subţire de tip extern şi perişorii tectori unicelulari, nu satisfac
necesităţile de apărare împotriva acestor factori, de aceea, pe lângă mecanismele de protecţie ale
epistructurilor, se includ şi cele ale endostructurilor, exprimate prin biosinteza intensă a CF, care
au menirea de suplinire a funcţiei de protecţie a celulelor mezocarpului suculent. Această
explicaţie vine în conformitate cu rezultatele multor altor lucrări [98,126,177,304,358,359].
Localizarea periferică a CF, la etapele ulterioare (30 şi 40 zile de la înflorire), reprezintă o
reacţie continuă cu caracter adaptiv la temperaturile sporite şi lipsa umidităţii aerului şi solului,
care se instalează brusc, chiar la începul verii. Capacitatea de protecţie a complexului de
epistructuri protectoare scade, deoarece densitatea perilor se reduce, iar formaţiunile cerifere încă
nu sunt formate. CF rămân a fi localizaţi la periferia fructului, astfel, complimentând aportul
protector al structurilor externe cu rol de apărare şi constituind o barieră serioasă de protecţie a
structurilor interne, la acţiunea factorilor mediului extern, fapte, care confirmă datele obţinute la
alte specii de plante [201,359]. Localizarea flavonoidelor în zona periferică şi exudarea lor în
exterior permite o interpretare individuală a rolului lor, comparativ cu cei din interiorul
organului. CF, localizaţi periferic, constituie un cordon de barieră cu rol protector şi contribuie în
calitate de inductor la stabilirea contactului organului cu mediul înconjurător [261,304,358,359],
fapt demonstrat, în cazul poluării excesive a atmosferei şi a infecţiei patogene în atmosferă.
Etapele de 60-80 zile de la înflorire a fructelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot coincid
cu perioada estivală, când condiţiile pedo-climatice, în Moldova, se acutizează, devenind
stresante pentru dezvoltarea plantelor, în genere, şi a fructelor de aronie, în mod special,
deoarece ele necesită atmosferă umedă, ca factor ecologic decesiv, determinat de condiţiile din
patria aroniei [280,281,283,322]. Este cunoscut că acţiunea factorilor de stres: poluarea [359],
razele UV [248,373], infecţiile [304,322], presiunile mecanice [38,184,252] stimulează
biosinteza CF, rezultând o concentraţie sporită a lor în zonele histologice periferice ale
organelor. Este menţionată [313] acumularea primară a CF în celulele epidermei frunzelor şi
tulpinii, expuse acţiunii UV, atribuindu-le un rol primordial în protecţia constituenţilor celulari.
CF din ţesuturile de apărare constituie prima bariră celulară, cu menire de apărare, între organul
plantei şi mediul înconjurător [201,241,261,358].
Începând cu etapa de 60 zile de la înflorire, antocianii apar în regiunea periferică, care,
odată cu dezvolatea şi maturarea fructelor, se acumulează rapid şi se distribuie în tot pericarpul.
Potenţialul fenolic periferic a pericarpului se completează cu o grupă nouă de CF, antocianii

175
[27], cunoscuţi, ca metaboliţi secundari, cu efecte antimutagene [119], antiradiante [315],
antioxidante [247], ce contribuie la fortificarea capacităţii de protecţie a fructului suculent [321].
Fructele de aronie se maturează în a 2 jumătate a lunii august, caracterizată în
R.Moldova, în ultimii ani, prin canicule estivale drastice şi de durată. Pericarpul, constituit din
celule mari, vacuolizate, cu pereţi celulari subţiri, necesită mecanisme complexe de protecţie
pentru a rezista la acţiunea temperaturilor şi iradiiaţiilor excesive, vânturilor uscate şi deficitului
de umiditate. Pentru a opune rezistenţă şi a supraveţui sunt mobilizate mecanismele de adaptare a
epistructurilor, exprimate prin edificarea epicuticulară a formaţiunilor cerifere, îngroşarea
cuticulei şi stabilirea tipului extern-intern [20] şi a endostructurilor (dezvoltarea hipodermei şi
sclereidelor), precum şi acumularea şi lărgirea arealului CF. Distribuirea CF în tot pericarpul, dar
cu concentrare periferică, reprezintă o reacţie adaptivă, care demonstrează funcţionarea sinergică
a acumulării fenolice cu complexul de structuri protectoare periferice şi structurilor interne.
7.1.2. Dinamica acumulării compuşilor fenolici în ontomorfogeneza fructului
CF se pot sintetiza şi acumula în diferiţi histogeni şi la diferite etape de dezvoltare ale
organismului vegetal: în celulele meristematice ale apexului caulinar [358], în celulele
embrionului seminal [177] şi în celulele tisulare ale primelor etape ale ontomorfogenezei
[20,153]. Conţinutul CF variază în ontomorfogeneza plantelor. Maximul CF, la specii din
g.Hypericum revine butonizării [61], la M. domestica, fructelor mature şi brunificate [223], la V.
vinifera, la unele soiuri, în bacele mature [35,64], la altele la etapele iniţiale de dezvoltare [114].
Studiile microscopice ale incluziunilor CF, prin aplicarea reacţiilor histochimice, au
demonstrat o corelaţie între topografie, distribuire, grupa CF şi etapele ontomorfogenetice la
fructele de aronie [27]. Prezintă interes conţinutul CF în funcţie de etapa ontomorfogenetică a
fructelor de aronie. S-a realizat studiul biochimic, în vederea determinării dinamicii conţinutului
unor CF (flavonoide, antociani, derivaţi fenilpropanici, taninuri) în ontomorfogeneza (de la 20
zile de la înflorire şi până la maturarea deplină) fructelor de aronie (tabelul 7.2).
Tabelul 7.2. Dinamica acumulării compuşilor fenolici ontomorfogeneza fructelor de aronie
Grupa de Etapa ontomorfogenetică
compuşi 20 zile 40 zile 60 zile 80 zile Fructe mature
fenolici de la de la înflorire de la înflorire de la înflorire
înflorire
Compuşi
fenilpropanici 0,201±0,01 0,353±0,02 0,291±0,12 0,278±0,23 0,178±0,45
(%)
Flavonoide % 0,286±0,03 0,321±0,06 0,445±0,01 0,464±0,02 0,478±0,04
Antociani
(mg/100g 121,1±3,81 243,2±4,70 488,3±9,90 723,7±9,14 818,9±8,91
fructe)

Taninuri (%) 0,891±0,12 2,145±0,21 3,482±0,34 7,015±0,23 7,769±0,12

176
 Dinamica acumulării grupelor de CF are caracater specific în funcţie de etapa
ontomorfogenezei, iar conţinutul fenolic maxim este caracteristic fructelor mature (fig. 7.2).

% Dinamica acumulării acizilor fenilpropanici % Dinamica acumulării flavonoidelor

0,4 0,6
0,35
0,5
0,3
0,25 0,4
0,2 0,3
0,15
0,2
0,1
0,05 0,1
0 0
20 zile 40 zile 60 zile 80 zile fructe 20 zile 40 zile 60 zile 80 zile fructe
mature mature
mg/100 g
%
900 Dinamica acumulării antocianilor Dinamica acumulării taninurilor
800 9
700 8
600 7
6
500
5
400
4
300 3
200 2
100 1
0 0
20 zile 40 zile 60 zile 80 zile fructe 20 zile 40 zile 60 zile 80 zile fructe
mature mature

Fig. 7.2. Dinamica acumulării CF în etapele ontomorfogenetice ale fructelor de aronie.

• Compuşii fenilpropanici înscriu o dinamică specifică, se acumulează chiar de la etapa

juvenilă de 20 zile (0,201 %) şi ating maximul la etapa de 40 zile (0,353%), după care urmează o
diminuare lentă a conţinutului lor la următoarele etape de 60 şi 80 zile de la înflorire. Fructele
mature sunt caracterizate printr-un conţinut minim (0,178%), care reprezintă jumătate din
conţinutul de compuşi fenilpropanici a fructelor la etapa de 40 zile de la înflorire.
• Conţinutul flavonoidelor este într-o creştere continuă, cu o rată de acumulare de 1,2, de la
0,286% - la etapa de 20 zile de la înflorire, până la 0,478%, la etapa de maturitate deplină a
fructului. Se observă o acumulare accentuată a flavonoidelor de la o etapă la alta, până la cea de
60 zile de la înflorire (0,445%), apoi urmează o acumulare lentă, 0,464% - la 80 zile de la
înflorire şi cu conţinutul maxim de 0,478%, în fructele mature.
• Conţinutul antocianilor are o dinamică specifică de acumulare în ontomorfogeneza
fructului. Rata de sinteză şi acumulare este relativ sporită şi echivalează cu 6,6, cedând doar faţă
de cea a taninurilor – 8,7. Conţinutul antocianilor se dubleaza în fructe, la etapa de 40 zile de la
înflorire. Se observă un salt cantitativ la 60 zile (488 g la 100g fructe), de 2 ori mai mare, faţă de
etapa precedentă şi de 4 ori mai mare, faţă de 20 zile de la înflorire. Acumularea antocianilor
este în ascensiune şi maximul conţinutului (818 mg/100g) este înregistrat în fructele mature.

177
• Taninurile se caracterizează printr-o acumulare lentă, de la 0,891%, în fructele juvenile,
până la 3,482%, la frructele de 60 zile. Se observă un salt cantitativ la etapa ulterioară – 80 zile
(7,015%), apoi urmează o acumulare lentă a taninurilor cu maximul (7,76%) în fructele mature,
care este de 8,7 ori mai mare, decât în fructele juvenile.
Dinamica acumulării diferitor grupe de CF (compuşi fenilpropanici, flavonoide,
antociani, taninuri), în ontomorfogeneza fructelor, poartă un caracter specific individual, cu
maximul de acumulare în fructele mature pentru toate grupele fenolice, cu excepţia compuşilor
fenilpropanici (fig. 7.2).
Rezultatele obţinute confirmă datele din literatura de domneniu [153,226,320]. CF
reprezintă metaboliţii secundari, cu rol important în asigurarea viabilităţii, vitalităţii, durabilităţii,
adaptabilităţii, funcţionaltăţii organismelor vegetale şi, în final, supraveţuirea lor. Totalul
polifenolic şi diferitor grupe separate li se atribuie un rol mare în reacţiile sistemice de adaptare a
plantelor la acţiunea factorilor stresanţi şi agenţilor patogeni [38,190,257,304]. Ei sunt un
element fundamental în asigurarea unui mecanism complex şi sistemic de protecţie a
organismelor vegetale, care derulează în ontomorfogeneză. Compuşii fenilpropanici se
sintetizează, mai intens, la primele etape ontomorfogenetice, fiind şi o reacţie de protecţie
adecvată a fructelor juvenile la acţiunea temperaturilor sporite, care, în ultimii ani, se observă,
începând cu luna iunie [27].
În general, fenilpropanoizii se consideră CF, care se sintetizează iniţial, apoi formează
diferiţi derivaţi, prin participarea la biosinteza unei game diverse de metaboliţi fenolici, cum ar
fi flavonoidele, taninurile [38,89,197,219]. Direcţia de biotransformare ulterioară a
fenilpropanoizilor, pe parcursul ontomorfogenezei fructului, corelează cu apartenenţa sistematică
a speciei [142] şi explică faptul diminuării conţinutului de derivaţi fenilpropanici la maturarea
fructelor de aronie, proces, care se produce în paralel cu sporirea conţinutului de flavonoide,
antociani şi taninuri. Flavonoidele se acumulează, mai intens, la etapele tardive ale
ontomorfogenezei, contribuind la acumularea pigmenţilor, care induc pigmentarea pericarpului
în ascensiune, începând cu etapa de 60 zile, până la maturarea deplină a fructelor. Flavonoidele,
inclusiv antocianii, acumulaţi în fructe, asigură protecţia ţesuturilor interne ale mezocarpului
suculent de excesul razelor ultraviolete ale soarelui, temperaturilor sporite şi deficitului de
umiditate, caracteristice lunii august, care coincide cu etapa de maturare a fructelor de aronie.
Caracterul cumulativ al CF în ontomorfogeneza fructelor de aronie, cu maximul de
acumululare în cele mature prezintă avantaje pentru rezistenţa şi supraveţuirea în condiţii de
secetă, temperaturi sporite, atac patogenic al dăunătorilor şi pentru asigurarea calităţăţlori înalt
gustative şi a aspectului comercial atractiv prin coloritul viu al pericarpului. Conţinutul sporit al

178
antocianilor, flavonoidelor şi taninurilor în fructele mature este şi o condiţie biologică esenţială
pentru diseminarea şi asigurarea perpetuării speciei [89,152,153,339,340].
7.2. Aspecte citochimice şi ultrastructurale ale biosintezei, localizării, translocării şi
acumulării compuşilor fenolici
CF sunt metaboliţi secundari, larg răspândiţi în lumea vegetală şi constituie categoria de
compuşi chimici naturali cu rol deosebit biologic, în activitatea metabolică şi vitală a propriei
celule şi cu proprietăţi importante în celulele organismului uman. De aceea, ei reprezintă
obiectele de cercetare, sub diferite aspecte, în cele mai avansate centre ştiinţifice. Deşi,
cercetările ultramicroscopice ale CF au fost iniţiate în I jumătate a secolului XX, iar pe parcursul
anilor s-au perfectat procedeele şi metodele de investigaţii, care au permis dezvăluirea aspectelor
lor ultrastructurale [21,22,35,83,84,177,206,221,307,330,342], totuşi, astăzi încă nu sunt
suficient elucidate şi rămân a fi discutabile mecanismele şi organitele, implicate în biosinteza,
translocarea şi depozitarea CF.
Noi am întreprins studiul citochimic şi ultrastructural al incluziunilor CF în următoarea
consecutivitate (fig.7.3): fructul imatur de aronie, donator de explant (60 zile de la înflorire);
fructul matur; explantul după 5 zile de inoculare; calus imatur (15 zile) şi calus matur (30 zile)
pentru a evidenţia particularităţile ultrastrucurale ale localizării, distribuirii, transformărilor lor în
dinamică, în funcţie de condiţiile de dezvoltare in vivo şi in vitro. Acumulările fenolice, în
imaginea submicroscopică, apar ca incluziuni electrondense, în rezultatul reacţiei cu OsO4,
aplicat în timpul fixării materialului [92].

Fructe imature
(fruct-donator de explant la Fructe mature
etapa de 60 zile de la
înflorire) in vivo

Carpoexplantul Carpocalus Carpocalus

(5 zile după imatur matur
inoculare) (15 zile) (30 zile)

in vitro
Fig. 7.3. Schema studiului citochimic şi ultrastructural al acumulărilor CF în carpocelulele
in vivo şi in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.
Deoarece lipidele posedă afinitate, faţă de acest reactiv, pentru evitarea dubiilor, în
privinţa naturii chimice a incluziunilor electrondense, s-au aplicat reacţii citochimice cu soluţii
de alăuni de fier şi soluţie neutră de acetat de plumb, prin excluderea tetraoxidului de osmiu în
timpul fixării materialului pentru TEM [377]. Acest procedeu tehnic a citoreacţiilor a fost aplicat

179
şi în studiul recent [7,8,83], iar analizele electronomicrografiilor au demonstrat că incluziunile
fenolice au acelaş contur morfologic. Deoarece constituienţii fenolici sunt hidrofili, există
pericolul deteriorării imaginii reale în perioada pregătirii specimenelor pentru studiul
ultramicroscopic.
Pentru identificarea mai sigură şi vizualizarea mai reuşită a incluziunilor fenolice în TEM
şi impiedicarea redistribuirii lor în alte compartimente celulare, în timpul fixării, s-a aplicat
reacţia cu soluţie de cafeină [221] în studiul incluziunilor fenolice la fructele de aronie in vivo şi
in vitro [21,22,80-82]. Citoreacţia cu soluţi de cafenia, frecvent, a fost utilizată în practica
investigaţiilor ultrastructurale ale incluziunilor polifenolice [177,307]. În imaginea
electronomicroscopică, CF, precipitaţi cu soluţie de cafeină şi tetraoxid de osmiu, sunt vizualizaţi
sub formă de acumulări electrondense, opace [7,8,22,80]. În specimenele investigate
submicroscopic, acumulările fenolice apar în diferite compartimente celulare cu un spectru larg
al expresiei morfologice [21].
În fructele imature, materialul fenolic se observă ca depuneri electrondense, în plastide,
cu următoarea localizare: în spaţiile intratilacoidale mai lărgite ale sistemului granal, complet
umplute cu acumulări uniforme; în stroma plastidei ca incluziuni de formă ovată sau sferică.
Materialul electrondens fenolic este menţionat şi în canalele RE. Acumulările fenolice sunt
atestate în vacuole sub forma unor făşii înguste, sau incluziuni semisferice, sferice pe tonoplastul
vacuolelor şi incluziuni sferice în lumenul vacuolar. Depuneri fenolice se observa, sporadic, în
cantităţi reduse, pe plasmalemă. Pe peretele celular incluziunile fenolice lipsesc [22].
Rezultatele studiului morfometric al incluziunilor fenolice (tabelul 7.3.) confirmă analiza
electronomicrografică şi denotă, că volumul parţial maxim al CF revine plastidelor (41,1%), apoi
urmează vacuomul (40,1%). Volumul parţial al CF, în plastide, prevalează în spaţiile
intratilacoidale (23,9%), faţă de cel din stromă (16,2%). În vacuom prevalează incluziunile
fenolice pe tonoplast (23,1%), faţă de volumul incluziunilor fenolice din lumenul vacuolar
(17,0%). Urmează acumulările fenolice din RE, cu un volum parţial de 13,2%. Volume parţiale
minime ale incluziunilor fenolice sunt înregistrate pe plasmalemă (3,1%), pe formaţiunile
membranice din citoplasmă (1,6%) şi, sub formă de urme, pe pereţii celulari (0,9%).
Deşi celulele pericarpului matur de aronie e se caraterizează prin organite bine
dezvoltate, totuşi, se observă transformări submicroscopice de dezorganizare, dezintegrare şi
destrucţie, care atestă senescenţa [21]. Un interes deosebit prezintă distribuirea şi localizarea
incluziunilor electrondense de natură fenolică. Depunerile fenolice se întâlnesc în plastide,
îndeosebi, în stromă sub forma incluziunilor ovale, sau oval-alungite. Este evidentă distribuirea
şi acumularea polimorfă, preponderentă, în sistemul vacuolar: pe tonoplast – sub formă de o

180
bandă îngustă neîntreruptă sau ca o făşie continue groasă; formaţiuni sferice sau aforme – în
largul vacuolelor; material electrondens fenolic repartizat în tot lumenul vacuolar, sau pe
resturile membranice din vacuole.
Acumulările fenolice sunt caracteristice şi în veziculele citoplasmatice, pe formaţiunile
membranice, pe plasmalemă şi pe peretele celular. Pe membranele agregatelor multiveziculare şi
formaţiunilor concentrice depunerile fenolice aforme constituie mari aglomerări.
Conform analizei morfometrice ale electronomicrografiilor, volumul parţial maxim
fenolilic revine vacuolelor – 68,1%, cu distribuire, preponderentă, în tot largul lor. În celulele
fructelor mature sporeşte volumul fenolic pe formaţiunile membranice citoplasmatice (12,1%),
faţă de celulele celor imature (1,6%). Volumul parţial fenolic de 5,1% pe peretele celulelor
mature, în raport cu 0,9%, în celulele juvenile ale pericarpului de A. melanocarpa (Michx.)
Elliot, atestă tendinţa de expulzare a materialului fenolic în afara protoplastului şi localizarea lui
apoplastică.
Organizarea submicroscopică a celulelor explantelor, decupate din fructele imature şi
inoculate pe MN in vitro, este diferită, faţă de celulele pericarpului donator de explant, dar prin
mulţi parametri ultrastructurali este similară cu cea a fructelor mature. Acumulările fenolice sunt
localizate în aceleaşi compartimente celulare, dar cu o altă expresie morfologică şi distribuire a
volumului parţial (tabelul 7.3)
Maximumul CF este înregistrat în vacuomul celulei – 51,3%, ce reprezintă mai mult de
jumătate din tot volumul fenolic al celulei, cu o distribuire aproape echivalentă pe tonoplast
(24,9%) şi în lumenul vacuolar (26,4%), unde formaţiunile fenolice sunt aforme. Se observă o
reducere substanţială a volumelor parţiale ale acumulărilor fenolice în plastide – 4,8%, cu o
localizare, preponderent, în stromă şi în RE – 3,1%. Rar se observă acumulări fenolice în
lumenul canalelor, frecvent în veziculele detaşate de RE şi dictiozomi.
De menţionat, o sporire evidentă a volumelor parţiale fenolice din zona murală ale
celulelor explantelor (pe plasmalemă – 17,4% sub formă de făşii, iar pe peretele celular –
18,3%), în raport cu fructele imature (pe plasmalemă – 3,1%, iar pe peretele celular – 0,9%). Se
atestă vezicularea citoplasmei şi formarea corpilor din membrane concentrice cu acumulări
fenolice. Analiza morfometrică denotă că, în fructele imature, valorile maxime ale volumului
parţial al incluziunilor fenolice revine organitelor din centrul citoplasmei, iar, în fructele mature,
valorile maxime ale volumului incluziunilor fenolice sunt în zona murală (fig. 7.4).

181
 Tabelul 7.3. Volumul parţial al incluziunilor fenolice în compartimentele celulare ale
carpomaselor şi fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Volumul parţial (%) al compuşilor fenolici în compartimentele celulare
Plastide Vacuom
Specimenul

endoplasmatic
analizat

Perete celular
Intratilacoidal

Incluziuni în

membranice
Plasmalemă

Formaţiuni
Tonoplast
Total

vacuolar
Total

Lumenul
Reticul
stromă
41,1±1,9

40,1±2,3
Fructul
imatur

23,9±1,1 16,2±1,1 13,2±1,9 23,1±1,6 17,0±0,9 3,1±0,4 0,9±0,1 1,6±0,1

68,1±2,5
Fructul

5,8±0,3
matur

1,9±0,2 3,9±0,1 4,9±0,2 28,1±2,1 40,0±1,3 4,0±0,1 5,1±0,3 12,1±2,1

51,3±3,3
Explant

4,8±0,4
(5 zile)

1,8±0,2 3,0±0,1 3,1±0,1 24,9±1,3 26,4±0,9 21,4±2,2 18,3±1,4 3,1±0,2

40,1±1,7

37,4±2,1
(15 zile)

24,2±1,5 15,9±1,4 14,9±2,1 20,4±1,1 17,0±0,2 4,1±0,6 2,3±0,1 2,1±0,1

Calus

51,5±3,3
(30 zile)
6,1±0,4

1,8±0,2 4,3±0,2 6,2±1,1 19,5±0,9 32,0±2,1 15,3±1,1 13,9±2,2 9,1±2,1

Calus

%
70
Pericarpul imatur
60
(60 zile de la
50 înflorire)
40 Pericarpul matur
30
20

10
0
ic

r
at
e

la
tid

uo
m

lu
as

as

ac

ce
Pl

pl

te
do

re
en

Pe
ul
ic
et
R

Centroplasmă Zona murală

Fig. 7.4. Volumele parţiale ale incluziunilor fenolice în diferite compartimente celulare ale
fructelor imature şi mature de A. melanocarpa (Michx.) Elliot.

182
 Odată cu maturarea celulelor, diminuează ponderea plastidelor, RE, dictiozomilor, şi,
concomitent, sporeşte cea a structurilor din regiunea periferică în biosinteza şi translocarea
fenolică, ce ilustrează vectorul mural al traficului fenolic. În celulele calusale imature (15 zile) se
înregistrează schimbări ale prezenţei, localizării şi morfologiei acumulărilor fenolice, comparativ
cu explantul după 5 zile de inoculare, şi se observă asemănări, în distribuirea lor, cu pericarpul
imatur de aronie. Datele morfometrice (tabelul 7.3.) demonstrează, că maximul volumului parţial
la incluziunilor fenolice revine plastidelor – 40,1%, cu o distribuire internă, similară plastidelor
din pericarpul imatur. Urmează vacuomul, cu un volum de 37,4%, care este puţin mai redus,
decât în pericarpul imatur. Se observă o echivalenţă a volumelor parţiale fenolice pe plasmalemă
şi peretele celular, ce nu diferă mult de valorile respective din pericarpul juvenil şi sunt, cu
precădere, mai mici, decât în explantele inoculate in vitro. Rezultatele analizei
electronomicrogarfiilor şi a studiului morfometric al incluziunilor fenolice din celulele
carpomasei mature sunt diferite de cele descrise în celulele carpomasei imature (15 zile).
Vacuomul se caracterizează printr-o acumulare maximă de CF, cu un volum parţial de 51,5%.
Sunt vacuole cu lumenul total ocupat de acumulări electrondense, fiind transformate în depozite
de CF.
Acumulările substanţelor fenolice din plastide alcătuiesc un volum parţial de 6,1%, ce
reprezintă aproape a 7 parte din volumul caracteristic plastidelor din parenchimul imatur de
aronie şi calusul juvenil. Volumul parţial fenolic (6,2%) din RE revine veziculelor detaşate de la
canale şi este mai redus, decât în fructele imature şi carpocalusul juvenil. Este evidentă sporirea
volumelor parţiale ale CF în celulele calusului matur pe plasmalemă, de la 2,3 la 11,1%, pe
peretele celular de la 2,3 la 13,9%, pe formaţiunile membranice de la 2,1 la 9,1%, faţă de calusul
juvenil. Studiul ultrastructural, în baza citoreacţiilor CF, denotă, că în biosinteza, localizarea,
acumularea şi distribuirea stocurilor fenolice sunt implicate organitele cu anumite conexiuni
între ele.
Localizarea şi volumul maxim al CF, în spaţiile intratilacoidale ale plastidelor din
celulele pericarpului imatur de aronie şi ale carpomasei in vitro (15 zile), denotă că, iniţial, în
biosinteza primară se implică membranele sistemului tilacoidal-granar al plastidelor. Preferinţă,
în biosinteza CF, se dădea plastidelor [35,127,294,377]. În studiul ovarelor şi bacelor imature de
V.vinifera incluziunile fenolice erau descrise în plastide [34,114], numite ulterior taninoplaste
[337], iar mai târziu în fructul [35] şi carpocalusul pigmentat din fructul de viţă de vie [206]
descrise în cianoplaste, graţie conţinutului de antociani.Incluziunile electrondense fenolice din
veziculele golgiene şi mitocondrii presupun participarea lor în biosinteza şi traficul intracelular

183
fenolic. Discuţii ştiinţifice, privind implicarea mitocondriilor şi altor organite celulare în
metabolismul fenolic au fost caracteristice multor lucrări ştiinţifice [82,206,307,369,379].
Conform rezultatelor relatate, în celulele tinere atât calusale, cât şi ale pericarpului de
aronie un aport în biosinteza fenolilor revine şi canalelor RE, iar veziculele detaşate, cu conţinut
fenolic, au rol, preponderent, în transportul lor [139,140]. Aceste date confirmă rolul deosebit al
RE în biosinteza fenolică, demonstrat în baza localizării citochimice ultramicroscopice a
translocării CF pe parcursul embriogenezei, în perioada de maturare şi latenţă a seminţelor, apoi
imbibiţie şi germinare [177]. În primele 3 ore ale perioadei de imbibiţie şi germinare, sinteza CF
corealează cu reapariţia membranelor RE, iar, în următoarele 3 ore, acumulările fenolice sunt
marcate în numeroasele vezicule ale RE, dar nu în canalele lui, ce confirmă contribuţia majoră a
lor în translocarea fenolică. Aplicarea diferitor procedee citobiochimice au făcut posibil
depistarea enzimelor, implicate în biosinteza CF de pe membranele RE, ce înlătură orice dubii în
această privinţă [139,240]. Abea după 48 ore de germinare a seminţelor, CF apar în vacuole
[177]. În studiul carpomaselor şi fructelor de aronie, CF, pe tonoplast şi în largul vacuolelor apar,
la fel, cu o mică reţinere, faţă de plastide şi RE, ceea ce demonstrează includerea treptată, în
timp, a organitelor celulare în metabolismul fenolic.
Majoritatea cercetătorilor califică vacuolele ca locul de bază în depozitarea incluziunilor
polifenolice [34] atât în celulele in vivo [99,114,220,264,339], cât şi in vitro
[10,21,22,82,83,206]. Indiferent de geneza vacuolelor, fie cu originea din RE [139,341] sau alte
organite [177,206,379] se presupune implicarea nemijlocită a tonoplastului în biosinteza
fenolică, iar, însăşi vacuolele îndeplinesc rol de colector şi depozitare a incluziunilor fenolice,
reprezentând un centru de atragere fenolică, ce determină vectorizarea vacuolară. Acumulările
incluziunilor fenolice în vacuole este o caracteristică a celulei vegetale şi nu reprezintă, doar
simple reziduri [275,358], ele pot influenţa activitatea enzimelor din sucul vacuolar
[197,252,313], au rol protector, graţie caracteristicilor antioxidante [321], inhibă procesul de
dividere mitotică şi reprima expresia genelor [257] sau pot fi reutilate [177].
În multe lucrări ştiinţifice este menţionată acumularea CF în peretele celular
[195,201,332]. Prevalarea CF pe plasmalemă, peretele celular şi în spaţiile intercelulare, în
celulele mature in vivo şi in vitro de aronie, în raport cu cele juvenile, demonstrează o altă
tendinţă de vectorizare a translocărilor fenolice, mural-apoplastică în evoluţia maturării celulelor
[8,21,22], care duce la evacuarea extracelulară a CF. Aceiaşi vectorizare fenolică este
înregistrată în celulele explantului, decupat din fructele imature de aronie (60 zile de la înflorire)
după 5 zile de inoculare în condiţii in vitro, ce contribuie la formarea unei bariere cu rol
protector în condiţiile de creştere in vitro. Condiţiile stresante in vitro, accelerează evacuarea CF.

184
 Vectorul mural de translocare fenolică a fost confirmat în investigaţiile carpoculturii
tisulare la V. vinifera [206]. Localizarea în peretele celular [201,332] şi apoplastică a depozitelor
fenolice în celulele seminţelor de B.napus în perioada de latenţă [341], la fel, confirmă direcţia
murală a transportului fenolic, care rezultă şi constituie ultima etapă în depozitarea fenolilor,
contribuind la formarea unei bariere cu rol protector [359]. Formarea acestei bariere fenolice
murale şi apoplastice în celulele explantului, inoculat în condiţii in vitro, reprezintă o reacţie de
protecţie adecvată la condiţiile noi, neobişnuite, iar în celulele mature a fructelor de aronie
ilustrează dezvoltarea rezistenţei celulelor suculente ale pericarpului la acţiunea complexului de
factori nefavorabili în perioada estivală, care corespunde maturării fructelor.
În literatura de specialitate, metabolismul fenolic este reglat de enzimele frecvent asociate
cu membranele biologice [98,200,220]. Depozitele fenolice pe membranele plastidelor,
canalelor, veziculelor RE şi golgiene, membranele agregatelor multiveziculare şi formaţiunilor
membranare, la frontiera de interferenţă citoplasmă/tonoplast, plasmalemă şi zona apoplastică
sunt în concordanţă cu locul subcelular de biosinteză a compuşilor fenilpropanici [98,288], grupă
de CF, prezentă în diferite cantităţi în toate carpomasele pigmentate şi în pericarpul fructului de
aronie [23]. Reeşind din proprietăţile antoxidante ale CF, localizarea lor, cu preponderenţă, pe
membranare celulare constituie un avantaj, ce asigură protecţia fosfolipidelor împotriva
peroxidării sub acţiunea radicalilor liberi [321]. În rezultat, membranele păstrează integritatea, ce
reprezintă o condiţie vitală pentru funcţionarea şi activitatea metabolică normală a celulei.
Rezultatele anailzei datelor citochimice şi ultrastructurale, privind localizarea şi
distribuirea incluziunilor polifenolice în ontogeneza celulelor in vivo şi in vitro de aronie, văzute
prin prisma celor mai actuale interpretări ştiinţifice din domeniu, ne-a permis să concludem, că
organitele celulare implicate în metabolismul CF se includ individual, selectiv şi treptat, ce a
permis elaborarea schemei verosimile de biosinteză, translocare şi acumulare a lor (fig. 7.5).
În interpretările ştiinţifice [7,8,206,342], privind mecansimele de translocare fenolică
intracelulară şi extracelulară, sunt impicate diferite structuri citoplasmatice. Un rol deosebit, în
translocarea substanţelor fenolice, revine complexelor de vezicule citoplasmatice dinamice şi a
formaţiunilor membranice citoplasmatice [200], care sunt în celulele in vitro şi in vivo. Este
demonstrată contribuţia majoră a acestor formaţiuni structurale în transportul CF, din celulele
pericarpului suculent, în cele ale seminţei, la fructul de Juglans regia [342]. Deşi mult timp
vezicularea citoplasmei, corpurile paramurale şi mielinice au fost descrise ca artefacte, studiile
miniţuoase au demonstrat, că ele reprezintă formaţiuni structurale cu rol important biologic
[177,200].

185
 Plastide
(tilacoidele granale, stroma)

Vectorul mural-apoplastic
Reticul endoplasmatic
(canalele şi veziculele
I.{ detaşate)
Mitocondrii
(criste, stroma)
Complexul Golgi
(veziculele golgiene)

Vacuole
(tonoplast, lumenul vacuolar )

Plasmalemă
II.{

Peretele celular pectocelulozic

III.{
Spaţiul intercelular

Fig. 7.5. Schema verosimilă a organitelor celulare implicate în biosinteza şi translocarea

compuşilor fenolici: I. Zona central-citoplasmatică; II. Zona murală; III. Zona apoplastică.
vectorul vacuolar; vectorul mural-apoplastic.
Indiferent de geneză veziculelor, lor li se atribuie rol mare în transportul precursorilor,
enzimelor şi substanţelor elaborate de protoplast, în afara lui [131], formarea cărora se intensifică
la acţiunea factorilor nefavorabili ai terenurilor versante [369] şi pe perioada de post-maturare a
fructelor [379]. Structurile multimembranare, contactul organelar şi vezicularea celulelor in vivo
şi in vitro la aronie, demonstrează existenţa unui transport accelerat, ce asigură desfăşurarea
proceselor metabolice intense în celulele mature şi în cele în condiţii nefavorabile.
Este important vectorul de mişcare a veziculelor. În celulele carpocalusale la A.
melanocarpa (Michx.) Elliot deosebim două vectorizări: spre vacuole şi spre exteriorul celulei,

186
ultimul fiind determinat în unele lucrări anterioare [8,83,206] ca vector mural. Fluxul spre
sistemul vacuolar al celulei se poate realiza prin formaţiunile multiveziculare [307]. Veziculele
citoplasmatice, indiferent de geneză, reprezintă verigile principale de conexiune interorganelară
în lanţul de translocare celulară a diferitor grupe de CF. Mişcarea veziculelor formate şi a
formaţiunilor multiveziculare se realizează prin proteinele-motore, angrenate în microtubuli şi
microfilamente [72,133].
Fluxul vezicular spre sistemul vacuolar contrubuie la extensia lui şi explică fenomenul de
vacuolizare şi acumulare a incluziunilor fenolice în celulele mature iar spre alte organite –
denotă prezenţa unei translocări metabolice intense. Fluxul mural se realizează prin intermediul
veziculelor golgiene şi cele detaşate de la canalele RE, ajungând la plasmalemă, se intercalează
în continuitatea ei, expulzând conţinutul cu precursori celulozici în afara protoplastului,
contribuind la formarea peretelui pecto-celulozic [332], iar, în cazul conţinutului bogat în materii
noncelulozice, cum ar fi cele de natură fenolică, favorizează evacuarea lor din protoplast şi
formarea unui cordon apoplastic de protecţie.
Tendinţa vectorizării murale şi extracelulare a CF reprezintă un interes cu aspect aplicativ
în biotehnologie. Este cunoscut că, evacuarea în exterior a substanţelor sintetizate de protoplast
întâlneşte diferite bariere, care trebuiesc depăşite, ceia ce crează mari dificultăţi în izolarea lor.
Vezicularea abundentă şi direcţionarea murală a fluxului vezicular, în celulele calusale,
reprezintă un moment-chee important, ce facilitează evacuarea, mai uşoară şi mai eficace, a
substanţelor sintetizate, inclusiv, a celor de natură fenolică. Aceasta poate fi un reper structural-
metabolic de bază, utilizat la elaborarea mecanismelor de izolare reuşită a metaboliţilor
secundari utili din celule cu puţine pierderi şi eforturi.
7.3. Conţinutul polifenolic şi activitatea biologică a extractelor fructelor in vivo şi
carpomaselor in vitro de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot
7.3.1. Activitatea antioxidantă a extractelor din fructele şi carpomasele in vitro de aronie
Fructele sunt produse naturale delicioase, bogate în vitamine, fibre şi diverşi compuşi
polifenolici [66]. În ultimile decenii fructele sunt intens studiate, graţie conţinutului de compuşi
naturali cu potenţial benefic în fortificarea corpului uman [66,175]. Astăzi, numărul persoanelor
cu risc de sănătate este mereu în ascensiune şi este regretabil faptul, că se răsfrânge la vârsta
fragedă sau activă. Un motiv întemeiat al riscului de sănătate ar fi stresul oxidativ, bazat pe
formarea şi acumularea radicalilor liberi în organism, care declanşează diferite maladii
[47,210,243,356].
Radicalii liberi de oxigen (RLO) sunt specii reactive ale oxigenului (SRO) şi frecvent
aceşti doi termeni sunt consideraţi echivalenţi. SRO iau naştere în toate organismele aerobe prin

187
reducerea parţială a oxigenului molecular. Grupul SRO este constituit din specii radicale (RLO
propriu-zişi); radicalul anion superoxid (O2.-); radicalul hidroxil (HO.); radicalul peroxil (RO2.),
care activează alături de o serie de molecule puternic reactive: oxigenul singlet (1O2); peroxidul
de hidrogen (H2O2); monoxidul de azot (NO); dioxidul de azot (NO2) [47]. SRO sunt produse în
mod continuu în celulele organismului viu. Sistemele antioxidante endogene, precum şi aportul
corespunzător de antioxidanţi prin alimentaţie cu produse naturale, pot menţine nivelul SRO în
limitele normale, fiziologice. În cazul efectelor reduse ale sistemelor antioxidante sau a lipsei
aportului de produse, cu rol antioxidant, are loc acumularea considerabilă a SRO, care induce
stresul oxidativ, care induce deteriorări oxidative ale proteinelor, lipidelor, ADN-ului. Stresul
oxidativ produs este implicat în numeroase stări patologice,care duc la declanşarea diferitor
maladii, numite „Free Radical Diseases” (arteroscleroza, bolile reumatice, cataracta, cancerul),
dar, totuşi, afirmaţia, potrivit căreia SRO constituie principala cauză în apariţia diferitor maladii
incurabile, este insuficient argumentată. În schimb, este cert faptul, că prezenţa SRO poate
agrava o serie de stări patologice ale organismului, care pot fi evitate prin asigurarea zilnică cu
fructe, bogate în compuşi naturali cu efecte antioxidante [84,167,171,176,210,326,356].
Astăzi, numărul pacienţilor cu riscul cardiovascular este în ascensiune. Un rol important
în morbiditatea şi mortalitatea cardiovasculară joacă stresul oxidativ şi nivelul sporit de SRO şi
RLO în vasele sanguine şi cordul organismului uman [176,325]. Sunt numeroase studii, în care
s-a elucidat potenţialul benefic al extractelor fructelor de A.melanocarpa (Michx.) Elliot [66],
determinat pe efectul anticancerigen, bazat atât pe supresarea genelor tumorale, cât şi reducerea
stresului oxidativ, astfel, inducând schimbări importante în ADN, care reduc considerabil
proliferarea celulelor cancerigene [174].
Polifenolii sunt consideraţi compuşii naturali cu cea mai sporită capacitate antioxidantă
[279]. Potrivit unor studii, anume polifenolii, în special, constituenţii antocianici şi flavonolici,
reprezintă cei mai valoroşi compusi chimici din fructele de aronie [124,148,163], care posedă
calităţi antioxidante [175,246,326], astfel, revenindu-le un rol important în prevenirea bolilor
cardiovasculare, diminiarea riscului declanşării maladiilor cancerigene şi sporirii imunităţii
organismului. Ulterior, s-a demonstrat interacţiunea directă între extractul vegetal, îmbogăţit cu
compuşi polifenolici şi receptorii ori enzimele implicate în semnalele de transducţie [219].
Cianidinele, în calitate de constituenţi antocianici majori [81,163], sunt determinate ca
remedii tinctoriale în industriile alimentară, cosmetică şi farmaceutică cu pronunţate efecte
antioxidante [311]. Rămâne a fi discutabilă, dacă valoarea benefică asupra sănătăţii corpului
uman este bazată pe totalul polifenolic al fructelor de aronie ori doar de unii constituienţi fenolici
(antocianii sau acizii fenolici), care posedă calităţi antioxidante superioare totalului polifenolic.
În ultimul timp, este discutată şi promovată ideia interacţiunii sinergistice a diferitori grupe de

188
CF, astfel, complexul polifenolic facilitează dezvăluirea diferitor însuşiri valoroase, inclusiv
antioxidante [247,326]. În baza multiplelor investigaţii [148,224,356] este demonstrat, fără
echivoc, rolul decisiv al CF în captarea radicalilor liberi, iar consumul zilnic al fructelor este
asociat cu prevenirea diferitor maladii degenerative, specifice stilului modern de viaţă [171,193].
Activitatea antioxidantă a flavonolilor (quercetina, kaempherolul), flavonelor (luteolina),
flavanolilor (- (+)-catehina), antocianilor (cianidina, pelargonidina, malvidina şi glicozidele lor),
este superioară, faţă de cea, manifestată de vitamina E, acidul ascorbic şi beta-carotenul [106],
majoritatea CF caracteristici fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot [26,148,319].
Fructele de aronie sunt comestibile, caracterizate prin colorit viu (diferite nuanţe ale
culorilor violet, albastru, roşu, negru), prezintă adevărate depozite de compuşi polifenolici cu
proprietăţi antioxidante şi, fiind consumate, pot inhiba cancerigeneza prin acţiunea lor la nivel
molecular, la diferite etape de iniţiere, promovare şi progresie [196,224].
Astăzi este determinat cert că polifenolii sunt captatori de radicali liberi şi exprimă
potenţialul antioxidant al fructelor [71,84]. Prin diferite metode performante este evaluată
capacitatea antioxidantă a fructelor de aronie, în raport cu conţinutul polifenolic
[146,148,157,356]. Valorile conţinutului totalului polifenolic la fructele de aronie sunt diferite în
diferite lucrări [146,148,163,320,356], ce se explică prin diferenţe ale condiţiilor pedoclimatice
de dezvoltare a fructelor. Aceasta a servit ca argument pentru determinarea totalului polifenolic
al fructelor de aronie, crescute şi recoltate în condiţiile R.Moldova.
Pe perioada ultimului deceniu, cererea de fructe, inclusiv de aronie cu proprietăţi
antioxidante, este în continuă creştere [167,171,210,232,325] şi aceasta se exprimă prin
ameliorarea cunoştinţelor consumatorului privitor la efectul vădit benefic şi necesitatea
introducerii fructelor, bogate în conţinut polifenolic, în raţia zilnică [106]. Solicitarea mereu
crescândă a fitooxidanţilor pentru industria alimentară, farmaceutică şi cosmetică nu poate fi
acoperită, doar din resursele naturale. O sursă de alternativă reprezintă culturile celulare şi
tisulare in vitro, generate de la speciile de plante specializate în biosinteză fenolică [97,189,329].
Este actuală necesitatea sporirii spectrului de plante, implicate, în calitate de producenţi, în
biotehnologii in vitro şi evaluării biomaselor celulare şi tisulare, generate in vitro, în vederea
determinării conţinutului polifenolic, comparativ cu cel din plantele in vivo.
Astăzi, investigaţii comparate, privind conţinutul polifenolic în biomasele in vitro şi a
fructelor in vivo, sunt puţine [73,118,355] şi continuă să reprezinte o necesitate. În acest scop, s-a
efectuat studiul comparativ al conţinutului polifenolic la fructele de aronie in vivo şi carpomasele
pigmentate in vitro, generate pe MN cu supliment nutriţional hormonal diferit [12,13,18,19,24] şi
respectiv s-a evaluat potenţialul lor antioxidant [25,29]. Totalul conţinutului polifenolic al

189
extractelor analizate a fost determinat prin metoda Folin-Ciocalteu [299,336] şi calculat,
utilizând curba de calibrare, construită în baza coraportului dintre unităţile de absorbţie şi
gradientul concentraţiei crescânde a acidului galic (fig. 7.6).

Unităţi de absorbanţă

mg/l acid galic

Fig. 7.6. Curba de calibrare a acidului galic.

Activitatea antioxidantă a polifenolilor din carpomasele pigmentate şi fructele de aronie a
fost evaluată în baza capacităţii de captare a radicalilor liberi [146,291], exprimată prin
echivalentul acidului galic (CAE), în μM, în raport cu rezidiul uscat al extractelor analizate, în
grame (μMGAE/g), iar activitatea antiradicalică a fost determinată în % (tabelul 7.4).
Tabelul 7.4. Unele caracteristici ale extractelor analizate şi capacitatea de captare a radicalilor
Capacitatea Capacitatea
antiradicală
Activitatea

Reziduu Totalul de captare a de captare a

Diluţia

Extractele uscat polifenolic radicalilor radicalilor

%

analizate (RU), mg/ml peroxil in peroxil,

μMGAE/g μMGAE/g
mg/ml RU
Carpomase Fructe

T 500 C 6,68±0,13 0,589±0,015 0,1 58,18±0,84 284,46±26,99 188,38±17,88

T camerei 5,76±0,17 0,346±0,006 0,1 39,65±0,28 178,51±16,54 101,66±9,65
violacee 5,08±0,06 0,660±0,008 0,1 63,93±0,98 427,32±40,55 215,49±20,45
crem-roză 6,70±0,06 0,532±0,007 0,1 58,88±0,98 288,53±27,38 192,23±18,24
crem-albă 7,08±0,08 0,516±0,004 0,1 59,58±3,08 277,70±26,35 195,01±18,51
verde 6,15±0,06 0,368±0,009 0,1 38,11±1,82 155,40±14,75 95,34±9,05
Extractele capromaselor pigmentate şi ale fructelor au fost caracterizate prin valorile
conţinutului rezidului uscat. În fructe conţinutul rezidiului uscat oscilează în funcţie de condiţiile
de uscare: cele uscate la temperatura de 50oC au o valoare mai mare – 6,68±0,13 mg/ml, faţă de
fructele, uscate la temperatura camerei – 5,76±0,17 mg/ml. S-a constatat că rezidiul uscat maxim
(7,08±0,08 mg/ml) revine carpomasei crem-albă şi cel minim (5,08±0,06 mg/ml), pentru
carpomasa violacee, celelalte carpomase, ocupând poziţii intermediare.
Fructele se caracterizează cu valori intermediare, în raport cu carpomasele pigmentate.
Conţinutul totalului polifenolic este variabil în fructe, în funcţie de condţiiile de uscare, mai
sporit, fiind în cele uscate la temperatura de 50oC (0,589 mg/ml), faţă de cele uscate îndelung la

190
temperatura camerei (0,346 mg/ml). Sunt semnificative diferenţele, în conţinutul polifenolic,
între carpomasele pigmentate, comparativ cu conţinutul totalului polifenolic din fructe. Maximul
conţinutului polifenolic îi revine carpomasei calusale violacee – 0,660 mg/ml, ce este superior
fructelor de aronie uscate la temperatura – 50oC (0,589 mg/ml), carpomaselor crem-roză (0,532
mg/ml), crem-albă (0,516 mg/ml) şi aproape de 2 ori mai mult, decât în cele uscate la
temperatura camerei (0,346 mg/ml) şi în carpomasa verde (0,368 mg/ml). Rezultate similare, a
conţinutului totalului polifenolic sporit în celulele culturilor in vitro, în raport cu cele in vivo,
sunt şi în alte lucrări [188]. Este semnalată superioritatea conţinutului în metaboliţi secundari a
culturilor tisulare, în raport cu cele celulare în suspensie in vitro [118].
Este îmbucurător faptul că conţinutul polifenolic în carpomasele violacee, crem-roză şi
crem-albă este superior sau aproape egal cu cel din fructele de aronie, culturile in vitro, având
avantaje, faţă de cele in vivo cum ar fi independenţa de factorii climatici, rotaţia sezonieră şi
posibilitatea creşterii lor în condiţii controlate şi dirijate [118,298,361]. În unele studii [187,188]
se menţionează avantajul, exprimat prin izolarea şi evacuarea CF mai rapidă şi mai eficientă, cu
dificultăţi reduse, faţă de celulele tisulare in vivo. Activitatea antiradicalică în extractele analizate
în diluţie de 1/10 au valorile cuprinse între 38,11 şi 63,93% (tabelul 7.4; fig. 7.7).

450

400
Activitatea
350 antiradicalică %
300

250
Capacitatea de
200
captarea a
150 radicalilor în
μMGAE/g RU
100

50

0
)
)

ee

e
oz
ei
0o

rd
er

ac

-r
-5

ve
m

em
ol
ca
(T

vi

a
cr

as
(T

a
ie

m
a
as
on

as
ie

po
m
ar

m
on

po

ar
po
ar
de

C
ar

ar
C
de
te

C
uc

te
Fr

uc
Fr

Fig. 7.7. Activitatea antiradicalică şi capacitatea de captare a radicalilor în fructele şi

carpomasele pigmentate de aronie.
Trebuie de menţionat, că dintre extractele testate, cel al carpomasei violacee se
caracterizează printr-o activitate antiradicalică maximă, cu valoarea de 63,83% şi prevalează,
faţă de cea a extractelor fructelor de aronie – 58,18% şi faţă de celelalte carpomase pigmentate,
iar cea verde se caracterizează prin cea mai redusă activitate antiradicalică (38,11%).
Exprimarea capacităţii de captare a radicalilor peroxil, în echivalentul acidului galic, din
extractele analizate, variază în limitele, de la 155,40 pentru carpomasa verde, până la 427,32
μMGAE/g pentru cea violacee. Valorile pentru extractele din fructe ocupă o poziţie intermediară.

191
 Activitatea antiradicală a extractelor investigate (tabelul 7.4) poate fi prezentată în felul
următor: capromasa violacee>carpomasa crem-roză≥ fructele, uscate la T de 500C≥ carpomasa
crem-albă > fructele, uscate la T camerei> carpomasa verde şi este în corelaţie directă cu
conţinutul totalului polifenolic (tabelul 7.4, fig. 7.8). Capacitatea de captare a radicalilor liberi de
către extractele analizate se amplifică, odata cu creşterea continutului polifenolic, coeficientul
Pearson de corelare, fiind 0,89944.
Capacitatea antiradicalică
450
400
350
300
250
MGAE/g

200 y = 742,96x – 104,19

2
150 R = 0,8944
100
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Totalul polifenolic, mg/ml

Fig. 7.8. Curba dependenţei capacităţii antiradicalice şi totalul polifenolic.

Conform rezultatelor studiului efectuat, capacitatea de captare a radicalilor liberi a

extractelor fructelor de aronie şi carpomaselor pigmentate corelează direct cu conţinutul totalului
polifenolic, ce confirmă datele din literatură [148,356]. E dificil de determinat ponderea fiecărei
grupe de CF în captarea radicalilor liberi, totalul lor, constituind un complex polifenolic, cu
potenţial sporit, în acest sens, ceea ce se şi discută în diferite lucrări ştiinţifice [279].
Conform datelor ştiinţifice [356] capacitatea antioxidantă a fructelor de aronie este
determinată de structura chimică a constituienţilor fenolici. Quercitrina şi cianidina cu
substituienţii 3',4'-dihidroxil în inelul B şi conjugarea inelelor A şi B, determină capacitatea de
captare a radicalilor liberi. Acidul cafeic, la fel, manifestă o înaltă capacitate antioxidantă,
determinată de dihidroxilarea în poziţiile 3 şi 4, în calitate de donator de hidrogen.
Analizând capacitatea de captare a radicalilor şi activitatea antiradicalică (%) a probelor,
constatăm că valorile prevalează în carpomasa violacee, faţă de fructele de aronie şi faţă de
carpomasele crem-roză şi crem-albă, iar cea verde cedează mai mult de 2 ori (fig. 7.7). Toate
carpomasele pigmentate se caracterizează prin capacitate de captare a radicalilor liberi şi pot
servi ca sursă potenţială de PV, cu proprietăţi antioxidante. Carpomasele violacee, crem-roză şi
crem-albă reprezintă o sursă îmbogăţită cu CF şi activitate antioxidantă superioară fructelor de A.
melanocarpa (Michx.) Elliot, crecute în condiţii in vivo şi uscate în diferite regimuri termice.

192
7.3.2. Activitatea antimicrobiană a extractelor din fructele şi carpomasele in vitro de aronie
În ultimul timp, tot mai frecvent, se întâlnesc tulpini ale microorganismelor cu rezistenţă
sporită la acţiunea antibioticilor. Unul din obiectivele farmaciei contemporane este elaborarea
noilor remedii antimicrobiene de origine vegetală, eficiente împotriva patogenilor virulenţi.
Compuşii fenolici sunt metaboliţii secundari larg răspândiţi în lumea vegetală şi
constituie categoria de compuşi chimici naturali cu diferite efectete terapeutice, inclusiv
antimicrobiene [238,273,283,328]. Fructele de aronie se caracterizează printr-un conţinut sporit
de CF, reprezentaţi prin polifenoli, acizi fenolici, flavonoide, în care predomină flavonolii şi
antocianii [23,26,148]. Ele prezintă un interes fitoterapeutiuc vădit, graţie însuşirilor terapeutice
ale CF [68,119,315,327], iar pe parcursul ultimului deceniu au fost elucidate proprietăţile
antmicrobiene şi antivirale [238,273].
CF, prezenţi în diferite fructe, selectiv inhibă creşterea patogenilor gastrointestinali ai
organismului uman [273]. În ciclu de lucrări a Centrului de investigaţii farmacologice clinice din
or. Varna [328] s-a demonstrat că sucul din fructele de aronie diminuează creşterea speciilor
virulente de S. aureus şi E. coli, fără consecinţe toxice sau nedorite, în contrast, cu tratamentul
prin preparate antibiotice. În altă lucrare a aceluiaşi centru [286], s-a determinat rolul inhibător
al fructelor de aronie, graţie conţinutului de polifenoli, flavonoide şi, preponderent, de antociani,
în dezvoltarea I. virus de tip A la etapele iniţiale de reproducere.
Obiectivul studiului a fost de a determina activitatea antimicrobiană a extractelor
etanolice din carpomasele pigmentate in vitro, comparativ cu cele din fructele in vivo de aronie,
prin prisma conţinutului polifenolic. Pentru studiul activităţii antimicrobiene s-au utilizat culturi
de referinţă S. aureus (tulpina 209-P), E. faecalis, E. coli (tulpina ATCC 25822), P. aeruginosa
(tulpina ATCC 27853), P. vulgaris (tulpina MX 19222) şi extractele etanolice de 20% din
fructele şi biomasele frutiere de aronie. Pentru a exclude efectul acţiunii antimicrobiene a
alcoolului, s-a studiat activitatea antibacteriană a etanolului de 20% faţă de microorganismele,
antrenate în investigaţii. A fost utilizată metoda diluţiilor în serie în mediul lichid [4].
Analizele activităţii antimicrobiene ale extractelor din carpomasele pigmentate (violacee,
crem-roză, crem-albă, verde) şi fructe au demonstrat manifestarea diferită a sensibilităţii lor, faţă
de bacteriile S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa, P. vulgaris (tabelul 7.5). Analizele
rezultatelor denotă: concentraţia minimă bacteriostatică şi bactericidă a extractelor studiate faţă
de: S.aureus (t. 209-P) variază în limitele 1:1 – 1:4; E.faecalis şi E. coli (t.ATCC 25822) - în
limitele 1:1 – 1:2; P.aeruginosa (t. ATCC 27853) – în limitele 1:2 – 1:4; P. vulgaris (t. MX
19222) – în limitele diluţiei 1:2 – 1:4.

193
 Tabelul 7.5. Activitatea antmicrobiană a carpomaselor pigmentate şi fructelor de aronie
Extractele Culturile de referinţă

analizate
etanolice S. aureus E. coli P. aeruginosa P. vulgaris
20% (t. 209-P) E. faecalis (t.ATCC (t. ATCC (t. MX
25822) 27853) 19222)
CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB
Fructe 1:2 1:2 1:2 1:1 1:2 1:1 1:4 1:2 - -
violacee 1:4 1:4 1:2 1:2 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4
Carpomase

1:4
crem-roză 1:4 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2
1:2
crem-albă 1:2 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:2 1:2 1:2
verde 1:2 1:2 1:1 1:1 1:1 1:1 1:2 1:2 1:2 1:2
Alcool etilic 20% 1:1 1:1 1:1 1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:1 1:1
Legendă: CMI – concentraţia minimă de inhibiţie; CMB – concentraţia minimă bactericidă.

Extractul fructelor, care cedează puţin după conţinutul polifenolic, în raport cu carpomasa
violacee (fig.7.9-7.11), a demonstrat acţiunea bactericidă în diluţie de 1:2 faţă de S. aureus
(t.209-P) şi P. aeruginosa (t.ATCC 27853). Deşi, valorile conţinutului antocianic sunt mai mari
în fructele de aronie (fig.7.12) faţă de carpomasele pigmentate, activitatea bactericidă în ele este
redusă, ceea ce ne permite să concludem, că acţiunea antimicrobiană se datorează altor grupe de
CF prezente în carpomase, care alcătuiesc un complex fenolic cu rol hotărâtor în acest sens.
Activitatea bactericidă a extractului etanolic din carpomasa violacee este mai mare de 2
ori, în raport cu cel din fructele de aronie, faţă de S.aureus (t. 209-P), P.aeruginosa (t. ATCC
27853) E. coli (t. ATCC 25822). Extractul din carpomasa violacee manifestă sensibilitate faţă de
P. vulgaris (t. MX 19222), în diluţie de 1:4, pe când la extractul din fructe, sensibilitatea lipseste.
Celelalte carpomase pigmentate se caracterizează prin valorile indiciilor cantitativi a totalului
polifenolic, compuşilor fenilpropanici de tip C6-C3, flavonoidelor şi a antocianilor, mai mici, în
raport cu cele ale carpomasei violacee şi a fructelor şi, respectiv, şi activitatea bactericidă este
puţin redusă (tabelul 7.5). Extractele etanolice din carpomasele crem-albă şi verde, caracterizate
aproape prin acelaşi conţinut polifenolic au manifestat aproape aceeaşi activitate antimicrobiană,
faţă de microorganismele antrenate în experiment.
Este evident, că doar extractele carpomaselor pigmentate se caracterizează prin
sensibilitate faţă de P. vulgaris (t. MX 19222) – un patogen cu rezistenţă înaltă, în diluţie 1:4 –
cea violacee şi în diluţie de 1:2 – cele crem-roză, crem-albă şi verde (tabelul 7.5). Extractele
etanolice din fructele de aronie nu posedă sensibilitate faţă de acest patogen [30]. Probabil, că
acasta se datorează nu numai conţinutului sporit al unor constituienţi fenolici din carpomase, dar
şi a prezenţei unor spoturi fenolice neidentificate, cu diferite valori ale Rf pe CSS [23] şi a
prezenţei acidului p-cumaric şi a unor compuşi needentificaţi cu timpii de retenţie 20,5 şi 24,1
min prin metoda CLIP-SM [26]. Cea mai mare activitate antimicrobiană a manifestat extractul

194
 carpomasei violacee, caracterizat şi prin cel mai bogat conţinut polifenolic, al compuşilor
fenilpropanici şi al flavonoidelor, iar conţinutul antocianilor puţin cedează faţă de fructele de
aronie (fig. 7.12).

mg/kg mg/l
70 000 400
60 000 350
300
50 000
250
40 000
200
30 000 150
20 000 100
10 000 50
0 0
ie
ie on
on ar
 a r e 
te uct
c fr
fru

Fig. 7.9. Variaţia totalului polifenolic în Fig.7.10. Variaţia conţinutului de compuşi

fructe şi carpomasele pigmentate. fenilpropanici în fructe şi carpomase.
mg/100 g fructe
900
g% în rutozidă
% 800
700
1
600
1 500
0 400
300
0
200
0 100
0 0
ie
on
0
r
on
ie e a
e ar uct
ct fr
fru

Fig. 7.11.Variaţia conţinutului de flavonoide în Fig. 7.12. Variaţia conţinutului de antociani

fructe şi carpomasele pigmentate. în fructe şi carpomasele pigmentate.
Activitatea bactericidă a extractului etanolic de 20% al carpomasei violacee este mai
mare decât a etanolului de 20%, faţă de S.aureus (t.209-P), P.aeruginosa (t.ATCC 27853) şi P.
vulgaris (t.MX 19222) de 4 ori, iar faţă de E.faecalis şi E. coli (t.ATCC 25822) – de 2 ori.
Rezultatele obţinute pentru fructele de aronie, parţial coincid cu cele din literatura de specialitate
[328], exprimate prin acţiunea bactericidă faţă de S. aureus şi E. coli. În studiul nostru s-a
determinat acţiunea bactericidă a extractului etanolic din carpomasele in vitro cu un spectru mai
larg, manifestând sensibilitate şi faţă de microorganismele P. aeruginosa (t.ATCC 27853),
caracterizate prin virulenţă patogenică sporită. În altă lucrare [286] este dezvăluită sensibilitatea
sucului de aronie şi faţă de Influenza virus de tip A.

195
7.4. Concluzii la capitolul 7
• Biosinteza, topografia şi modul de distribuire a CF în pericarpul fructului suculent de aronie
are caracater dinamic, cumulativ şi selectiv, în funcţie de etapa carpoontomorfogenezei, ce
corelează cu grupa de CF: flavonoidele şi taninurile – în ascensiune la etapele iniţiale de
dezvoltare, iar antocianii –la etapa de 60 de zile de la înflorire până la maturarea fructelor.
• S-a stabilit existenţa unui gradient calitativ şi cantitativ polifenolic în ascensiune, în
ontomorfogeneza fructului şi în limitele pericarpului, de la subzona celulelor oval-alungite
(radiar) ale parenchimului spre endocarp şi foarte accentuat – spre hipodermă şi epicarp;
• CF au o distribuire, preponderent, periferică în pericarp, ce contribuie la sporirea potenţialului
protector, care funcţionează sinergic cu ansamblul structurilor anatomice protectoare periferice
şi constituie un mecanism, bazat pe principiul complimentarităţii, al complexului structural-
biochimic unic de adaptare a fructului la condiţiile concrete pedo-climatice în
ontomorfogeneza fructului.
• În biosinteza Cf se implică selectiv, individual şi treptat membranele următoarelor organite:
plastidele, mitocondriile, canalele şi veziculele RE, dictiozomii şi veziculele golgiene,
vacuolele şi plasmalema. Acumularea sub formă de incluziuni fenolice poate fi în spaţiile
intratilacoidale, apoi în stroma plastidei; în lumenul canalelor RE şi dictiozomilor, apoi în
veziculele detaşate; pe tonoplast, apoi in lumenul vacuolar; pe plasmalemă, apoi în lamela
mediana a peretelui celular.
• Translocarea fenolică are loc prin intermediul veziculelor, direcţionate de microtubulii şi
microfilamentele citosceletului cu două vectorizări: una – spre vacuom, ca colector în celulele
mature şi alta – murală, care contribuie la evacuarea CF din celulă şi localizarea lor
apoplastică, caracteristică celulelor senescente.
• Vectorizarea murală reprezintă un criteriu submicroscopic valoros, care ar facilita evacuarea
extracelulară în sistemele biotehnologice in vitro de producere profitabilă a biomasei garantate,
îmbogăţită cu compuşi naturali de natură fenolică în condiţii riguros dirijate şi controlate.
• Capacitatea de captare a radicalilor liberi corelează cu conţinutul totalului polifenolic,
compartiv, exprimată astfel: carpomasa violacee; carpomasele crem-roză şi crem-albă au valori
aproape egale; iar carpomasa verde – cedează mai mult de 2 ori.
• Activitatea antimicrobiană a carpomaselor in vitro şi fructelor corelează cu conţinutul
polifenolic: fructele şi carpomasele pigmentate posedă acţiune bactericidă faţă de S. aureus
(t.209-P) şi P. aeruginosa (t.ATCC 27853) şi doar bacteriostatică faţă de E. faecalis şi E. coli
(t.ATCC 27853). Carpomasele pigmentate obţinute in vitro, manifestă un spectru bactericid
mai larg, comparativ cu fructele, inclusiv şi faţă de P. vulgaris (t.MX 19222), caracterizată
prin rezistenţă sporită, datorită prezenţei unor CF, necaracteristici fructelor in vivo.

196
 CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI
1. Ş-au elaborat strategiile biotehnologice de iniţiere şi acumulare a biomasei frutiere in vitro din
pericarpul suculent al fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot, bazate pe criterii biologice
(natura histogenică a explantului, poziţia explantului în raport cu mediul nutritiv, vârsta fructului
donator de explant), chimice (tipul, doza şi combinaţiile hormonilor auxinici şi citokininici, sursa
de carbon) şi fizice (regimul de lumină şi temperatură), care determină direcţia non-
embriogenică de dezvoltare a carpoculturilor tisulare in vitro.
2. Capacitatea de inducere a carpocalusogenezei şi a acumulării carpomaselor in vitro este
taxonospecifică, determinată de particularităţile structurale specifice histogenului în calitate de
carpoexplant (gradul integrităţii celulare, nivelul rezervei trofice imobilizate, gradul de
vacuolizare, natura chimică şi grosimea pereţilor celulari, specializarea biosintetic-metabolică) în
corelaţie cu optimizarea balanţei hormonale adiţionate mediului nutriv de cultivare in vitro, a
regimului de lumină şi temperatură. Dozele de 2,0-2,5 mg/l de 2,4-D, în combinaţie cu 0,5 mg/l
K stimulează inducerea carpocalusului asimilator, iar dozele de 3,5 şi 4,0 mg/l de ANA, cu 0,5
mg/l K, stimulează inducerea carpocalusului antocianifer.
3. Investigaţiile ultrastructurale comparate ale celulelor în perioada carpocalusogenezei in vitro
şi pe parcursul maturării fructului in vivo de A. melanocarpa (Michx.) Elliot denotă prezenţa
unui plan similar de organizare ultrastructurală, dar cu un complex de specificări relevante,
exprimate prin amplitudă, ritm şi rată de desfăşurare a transformărilor ultrastructurale; mai
accelerate şi mai accentuate fiind în celulele carpomaselor in vitro, comparativ cu celulele
fructului, constituind un indicator al expresiei adaptabilităţii, vitalităţii şi specializării structural-
metabolice.
4. Transformările ultrastructurale şi metabolice ale carpocelulelor de aronie în cele 2 biosisteme,
in vivo şi in vitro, corespund anumitor principii evolutive, la nivel ultrastructural: intensificării,
substituţiei, diversificării, compartimentalităţii, compensaţiei funcţiilor şi ritmul diferit al
modificărilor; autonomizării în dezvoltare; integrităţii fragmentare în organizarea celulară, care
demonstrează existenţa paralelismului în modificările elementare de organizare celulară.
5. Rezultatele investigaţiilor proprii şi a datelor din literatura de specialitate asupra aspectelor
structurale, ultrastructurale şi biochimice ale CF, relevate din analizele dislocării spaţiale a CF în
compartimentele celulare şi histogenii pericarpului, în corelaţie cu specificul dinamicii
acumulării în carpoontomorfogeneză şi carpoecogeneză, comparativ cu dislocarea spaţială a CF
la nivel structural şi ultrastructural, în celulele carpomaselor in vitro, ne-au permis să elaborăm
schema verosimilă de biosinteză, translocare şi depozitare a CF, bazată pe implicarea
individuală, selectivă şi succesivă a diferitor organite celulare:

197
a) biosinteza CF se realizează la nivelul membranelor organitelor în următoarea consecutivitate:
plastidele, canalele şi veziculele reticulului endoplasmatic, mitocondriile; membranele şi
veziculele golgiene, vacuomul, corpii paramurali, plasmalema;
b) acumularea excesului de CF sub formă de incluziuni electrondense în spaţiile intratilacoidale
şi stroma plastidelor, în lumenul canalelor şi veziculelor reticulului endoplasmatic, veziculele
golgiene, pe tonoplast şi în lumenul vacuolar, în peretele celular şi în spaţiile intercelulare;
c) translocarea CF se realizează prin intermediul veziculelor de diferită geneză, direcţionate de
elementele citoscheletului celulei pe 2 vectori: unul – spre vacuom, ca un colector de bază şi
altul – mural-apoplastic, cu rol de expulzare şi depozitare extracelulară.
6. Investigaţiile complexe citochimice, ultrastrucurale, biochimice calitative şi cantitative au
stabilit că celulele carpomaselor pigmentate in vitro păstrează potenţa de biosinteză a CF,
caracteristică celulelor fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Ellior in vivo, dar condiţiile de
cultură in vitro favorizează biosinteza unor CF nespecifici fructelor in vivo (acidul p-cumaric şi
compuşi neidentificaţi, cu timpii de retenţie 20,5 şi 24,1 min, prin CLIP-SM şi multiple spoturi
neidentificate prin CSS). Balanţa hormonală acţionează selectiv asupra expresiei potenţei
biosintetice şi reprezintă factorul-vector în acumularea carpomasei îmbogăţită cu CF.
7. Balanţa hormonală, suplimentată MN, are acţiune selectivă asupra capacităţii proliferative a
explantului şi acumulării carpomaselor cu indici calitativi valoroşi, inducând specializarea
structural-funcţională a carpomaselor pigmentate. Carpomasa verde, obţinută pe MN cu 2,0-2,5
mg/l 2,4-D, prin prezenţa cloroplastelor devine asimilatoare; carpomasa violacee este specializată
în depozitarea materiilor fenolice, iar carpomasele crem-roză şi crem-albă acumulează materiile
de rezervă de natură amilacee, proteică, lipidică, fenolică în heteroplaste.
8. Carpocalusurile reprezintă biomase celulare cu tendinţa de stratificare, ca rezultat al
specializării morfo-funcţionale: stratul extern, alcătuit din celule, împachetate compact, cu pereţii
celulari îngroşaţi are funcţia de protecţie; stratul median e format din celule parenchimatice cu
funcţia de depozitare a materiilor de rezervă; zonele periferice sunt centre proliferative; stratul
intern are funcţiile de ancorare în MN şi de absorbţie a substanţelor nutritive.
9. Zonalitatea histoanatomică a pericarpului fructului matur de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
alcătuit din: epicarp, mezocarp (diferenţiat în 4 subzone: hipoderma, subzona externă a celulelor
oval-rotungite, subzona celulelor radiar-alungite, subzona internă a celulelor oval-rotungite) şi
endocarp confirmă principiul identităţii histoanatomice a carpotipului pommum. Zonele şi
subzonele histologice ale pericarpului au particularităţi structurale şi biochimice, care determină
reacţia morfogenică specifică in vitro.
10. Transformările selective şi succesive ale structurilor citoanatomice în ontomorfogeneza
fructului au caracter adaptiv, bazat pe mecanismul compensator al epistructurilor (gradul de

198
pubescenţă, grosimea şi tipul cuticulei, tipul şi distribuirea formaţiunilor cerifere) şi
endostructurilor (grosimea hipodermei, prezenţa şi modul de distribuire a druzelor de oxalat de
calciu, a sclereidelor, a granulelor de amidon şi incluziunilor fenolice).
11. Modificările graduale citoanatomice şi biochimice ale pericarpului suculent de aronie
corelează cu etapele carpoontomorfogenezei, topografia histogenilor pericarpului suculent şi cu
gradientul ecologo-geograrfic al reliefului R. Moldova, exprimând tendinţa de xeromorfozare la
acutizarea factorilor climatici de la Nord spre Sud.
12. Activitatea antioxidantă a fructelor in vivo şi carpomaselor in vitro la A. melanocarpa
(Michx.) Elliot corelează cu conţinutul polifenolic. Extractele carpomaselor pigmentate violacee,
crem-roză şi crem-albă posedă activitate antioxidantă superioară fructelor.
13. Activitatea antimicrobiană a fructelor in vivo şi carpomaselor in vitro, la aronie, corelează cu
conţinutul cantitativ şi calitativ polifenolic, iar sensibilitatea mai mare faţă de patogeni şi spectrul
bactericid şi bacteriostatic, mai larg, al carpomaselor in vitro este facilitat de conţinutul sporit şi
de biosinteza unor constituienţ fenolici, nespecifici fructelor.
14. Studiile biochimice ale carpomaselor au evidenţiat prezenţa diferitor grupe de CF de interes
farmaceutic, în cantităţi, ce justifică realizarea culturilor in vitro ca alternativă reală la tehnologiile
tradiţionale. Criteriile ultrastructural-biochimice elucidate constituie un suport argumentat pentru
elaborarea strategiilor biotehnologice in vitro de producere profitabilă a carpomasei garantate,
îmbogăţită cu compuşi naturali, în condiţii controlate, cu factori fizici şi chimici manipulabili.
RECOMANDĂRI
1. Optimizarea proceselor structural-biosintetice in vitro poate fi realizată prin utilizarea
rezultatelor, obţinute la carpocultura de aronie: indicii structurali şi biochimici ai histogenului
pentru inducerea şi acumularea carpomaselor in vitro; regimul nutriţional optim al MN, în vederea
inducerii şi acumulării carpomasei [1]; factorii-vectori şi dirijabili (regimul nutriţional şi de
lumină) vor fi aplicaţi în acumularea celei, bogate în CF de interes alimentar, farmaceutic [2].
2. Carpomasele violacee, crem-roză, crem-albă in vitro cu activitate antioxidantă superioară
fructelor in vivo, pot servi ca sursă antioxidantă şi ca remediu bactericid faţă de P. vulgaris (t.MX
1922), cu rezistenţă sporită, iar similar fructelor de aronie şi faţă de S. aureus (t.209-P), P.
aeruginosa (t.ATCC 27853); bacteriostatică, faţă de E. faecalis, E. coli (t.ATCC 25822) [3].
3. Schema biotehnologică de obţinere a carpomasei violacee, bogată în CF din fructul de aronie
se recomandă, ca model, pentru elaborarea strategiilor biotehnologice de producere a biomaselor,
ca materie primă de alternativă, la tehnologiile tradiţionale de interes farmaceutic şi alimentar.
4. Rezultatele investigaţiilor structurale şi biochimice ale carpomaselor in vitro şi fructelor in vivo
la A. melanocarpa (Michx.) Elliot se recomandă a fi introduse în programele de studii ale
facultăţilor de biologie, tehnologie alimentară şi farmaceutică.

199
 BIBLIOGRAFIE
1. Brevet de invenţie. 3763MD, A01H 4/00; C12N 5/04. Procedeu de obţinere in vitro a
biomasei de fructe de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. /Calalb T., Jacotă A., Bujoreanu
N., Chirilova E. (MD). Cererea depusă 27.06. 2008, BOPI nr. 12/2008.
2. Brevet de invenţie. 46MD, A01H 4/00; C12N 5/04; A01N 27/00. Procedeu de obţinere in
vitro a biomasei de fructe de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. /Calalb T., Jacotă A.,
Bujoreanu N., Chirilova E., Bejan N. (MD). Cererea depusă 03.03.2009, BOPI nr. 7/ 2009.
3. Brevet de invenţie. 83MD, A61K 36/28; A01H 4/00; C12N 5/04; A01N 27/00; A61P 31/04.
Biomasa de fructe de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot, obţinută in vitro pentru utilizare
în calitate de produs cu proprietăţi antimicrobiene. /Calalb T., Jacotă A., Bujoreanu N.,
Chirilova E., Bejan N. (MD). Cererea depusă 26.03.2009, BOPI nr. 9/2009.
4. Buiuc D., Neguţ M. „Tratat de microbiologie clinică”, Ed. a III., Bucureşti: Ed. Medicală,
2008, 1250 p.
5. Cachiţă D., Sand C. Biotehnologie vegetală. Baze teoretice şi practice. Sibiu: Mira Desing,
2004, vol. I, p. 32-64.
6. Calalb T. Aspecte ultrastructurale ale CF în carpocultura Aronia melanocarpa. În: Mater.
Conf. Ştiinţifico-didactică Anuală ULIM, Chişinău, 1998, p. 194-195.
7. Calalb T. Aspecte ultrastructurale privind biosinteza, traficul şi depozitarea compuşilor
fenolici în carpocultură. Deponat, nr. 1515-M 98, ICŞITE, Moldova. Chişinăi, 1998. 8 p.
8. Calalb T. Consideraţii ultrastructurale privind localizarea, translocarea şi depozitarea
fenolilor în dinamica carpocalusogenezei. În: Materialele Conferinţei a VI Republicană de
Microscopie Electronică. Chişinău, 1998, p. 35.
9. Calalb T. Indicii ultrastructurali ai carpoecogenezei. Deponat, Nr 1514-M.98, ICŞITE,
Moldova, 1998, 6 p.
10. Calalb T. Metode microscopice şi biotehnologice privind compuşii fenolici în cultura in vitro
a unor plante medicinale. În: Analele şt. ULIM, Medicina, Chişinău, 1999, p. 6-8.
11. Calalb T. Principiile active fenolice în carpocalusul Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. În:
Mater. Conferinţa Ştiinţifico-didactică Anuală ULIM “Symposia Professorum”, Seria
Medicină, Chişinău, 2000, p.141-142.
12. Calalb T. Inducerea carpocalusului în culturi in vitro la Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot.
Fiziologia şi biochimia plantelor la început de mileniu: realizări şi pespective. În: Mater.
Cong. II, Chişinău, 2002, p. 217-220.
13. Calalb T. Iniţierea calusului în culturi in vitro şi carpocalusogeneza la A.melanocarpa Elliot.
În: Rezum. Lucrăr. Şt. al XII-lea Cong. Naţion. de Farm. Bucureşti, 2002, vol. 1, p. 223-225.

200
14. Calalb T. Inducerea carpocalusului în culturi in vitro la Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot. În: Mater. Conf. Ştiinţifico-didactice Anuale ULIM “Symposia Professorum”, Seria
Medicină. Chişinău, 2002, p. 378-382.
15. Calalb T. Obţinerea produsului vegetal ecologic pur îmbogăţit cu principii active prin culturi
de ţesuturi in vitro. În: Mater. Conferinţei Corpului didactico-ştiinţific a USM, Chişinău,
2003, p.86-87.
16. Calalb T. Polimorfismul carpocalusului de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. În: Revista
medico-chirurgicală a „Societăţii de medici şi naturalişti”. Iaşi, 2003, vol. 107, nr. 2, supl. I,
p. 102-105.
17. Calalb T. Obţinerea produsului vegetal prin microtehnica biotehnologiilor moderne. În:
Mater. conferinţei „Ziua medicamentului”, Institutul Naţional de Farmacie, Chişinău, 2003,
p. 36-44.
18. Calalb T. Unii indicii citobiochimici ai carpocalusului de Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot. În: Analele ştiinţifice ale USMF ”Nicolae Testemiţanu”. Vol. I. Probleme medico-
biologice, farmaceutice, de sănătate publică şi management. Chişinău, 2003, p. 261-265.
19. Calalb T. Biotehnologiile moderne şi plantele medicinale. În: Analele ştiinţifice ale USMF
”Nicolae Testemiţanu”. Vol. I. Probleme medico-biologice, farmaceutice, de sănătate publică
şi management. Chişinău, 2004, p. 318-325.
20. Calalb T. Structuri anatomice ale fructelor de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot. – suport
potential in asigurarea calitatii. În: Analele ştiinţifice ale USMF „Nicolae Testemiţanu”.
Vol. I. Probleme medico-biologice si farmaceutice. Chişinău, 2005, p.480 - 483.
21. Calalb T. Aspecte ultrastructurale şi biochimice ale potenţialului fenoilic din carpomasele
calusale de aronie. In: Mater. Conf. Naţion. cu participare internaţională “Probleme actuale
ale geneticii, fiziologiei şi ameliorării plantelor”. Chişinău, 2008, p. 286-290.
22. Calalb T. Investigaţii ultrastructurale comparative ale biomasei frutiere in vitro şi a fructului
in vivo de Aronia melanocarpa (Michx.) Ellliot. In: Buletinul Academiei de Ştiinţe a
Moldovei. Ştiinţele vieţii. 2008, nr. 2 (305), p. 54-62.
23. Calalb T. Potenţialul fenolic comparativ al maselor calusale şi fructelor de aronie Aronia
melanocarpa Michx. (Elliot). In: Revista farmaceutică. 2008, nr. 1-4, p. 23-28.
24. Calalb T. Carpomasele generate in vitro – o reală concurenţă pentru fructele de Aronia
melanocarpa (Michx.) Elliot in vivo. În: Sănătate Publică, Economie şi Management în
Medicină. 2009, 4(31), p. 38-44.
25. Calalb T. Proprietăţile antioxidante comparative ale fructelor de aronie Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot. şi carpomaselor obţinute in vitro. În: Analele USMF, 2009, p. 338 – 392.

201
26. Calalb T. Studiul comparativ al polifenolilor din fructele de Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliot. in vivo şi in vitro prin metoda CLIP-MS. În: Buletinul Academiei de Ştiinţe a
Moldovei. Ştiinţele vieţii, 2009, nr.2 (307), p. 32 - 41.
27. Calalb T. Studiul histochimic şi biochimic al conţinutului fenolic în ontomorfogeneza
fructului A. melanocarpa Elliot. În: Bul. AŞ a Mold., Ştiinţe medicale. 2010, 1 (24), p. 56-63.
28. Calalb T., Bodrug M. Botanica farmaceutică. Chişinău: CEP “Medicina”, 2009. 498 p.
29. Calalb T., Dolghier S. Culturile celulare şi tisulare in vitro – surse de substanţe biologic
active. În: Analele ştiinţifice ale USMF “Nicolae Testemiţanu”. Vol. I. Probleme medico-
biologice si farmaceutice. Chişinău, 2008, p. 336-338.
30. Calalb T. Prisăcaru V., Jacotă A. Studiul comparativ al conţinutului fenolic şi a activităţii
antimicrobiene ale extractelor fructelor in vivo şi biomaselor frutiere pigmentate in vitro de
A. melanocarpa Elliot. In: Bul. AŞ a Mold.. Ştiinţele vieţii, 2009, nr. 1 (307), p. 49-55.
31. Chiru T., Nistreanu A., Calalb T. Studiul compuşilor fenilpropanici din specia Centaurea
cyanus L. În: Medicina Tradiţională şi Sanocreatologia, 2008, vol. 13, p. 42-45.
32. Ciubotaru A. Pagini alese din istoria creării primei Grădini Botanice (Institut) a Academiei
de Ştiinţe a Moldovei // Revista botanică, 2008, nr. 1, p. 37-52.
33. Ciulei I., Istudor V., Palade M., ş. a. Analiza Farmacognostică şi Fitochimică a Produselor
Vegetale. Bucureşti: Ed. Medicală, 1995, vol. II, 426 p.
34. Codrean V. Anatomia comparată a viţei de vie (Vitis L.). Autoref. teza dr. hab. în biologie.
Chişinău, 2001, 40 p.
35. Codreanu V. Anatomia comparată a viţei de vie (Vitis L.). Chişinău: Combinatul Poligrafic,
2006, 252 p.
36. Costica N., Matienco B., Toma C. Anatomia comparată şi ultrastructura fructului la soiuri
autohtone de măr. Chişinău: Ştiinţa, 1995, 175 p.
37. Crişan G. Studii farmacobotanice asupra unor specii indigene de Veronica
(Scrophulariaceae). Autoref. tezei de dr. în şt. farmaceutice. Cluj-Napoca, 2004, 165 p.
38. Dascaliuc A. Metaboliţii secundari: Sinteza şi rolul lor în reacţiile de adaptare a plantelor faţă
de factorii de stres, boli şi dăunători. În: Mater. Conf. Naţionale cu participare Internaţionale
„Probleme actuale ale geneticii şi ameliorării plantelor”. Chişinău, 2008, p. 336-344.
39. Florea V. Cultura plantelor medicinale. Chişinău: Agria-Vis, 2006, 312 p.
40. Florea V. Realizări în domeniul cercetării plantelor medicinale în R.Moldova. În: Mater.
„Probleme actuale ale Geneticii, biotehnologiei şi ameliorării”, Chişinău, 2005, p. 269-272.
41. Grati V. Citologie generală. Chişinău: Prut Internaţional, 2006, P. I, 200 p.

202
42. Grati V., Pulbere E. Anatomia şi morfologia plantelor. Compendiu de lucrări practice.
Chişinău: Prut Internaţional, 2008, 231 p.
43. Gheorghiţă G. ş. a. Reacţia morfogenetică a unor explante de Stachys sieboldii MIQ. în
cultura de ţesuturi in vitro. În: Acta Phytotherap. Romanica, 1996, vol. III (1-2), p. 18-23.
44. Ladâghina E., Safronici L., Otriaşenkova V ş.a. Analiza chimică a plantelor medicinale.
Chişinău: Universitas, 1993. 171 p.
45. Matienco B, Brezeanu A. Carpocultura – nou domeniu de cercetare în biotehnologia
vegetală. În: Simpozionul Naţ. de fiziologie plantelor. Bucureşti, 1995, p. 45.
46. Maximov E. Localizarea şi repartizarea calciului în structura şi ultrastructura fructelor de
măr. Autoref. teză dr. hab. în biologie. Chişinău, 1998. 38 p.
47. Miron A, Stănescu U. Antioxidanţii Naturali între Medicament şi Aliment. Iaşi: Ed. Gr.T.
Popa, 2003. 164 p.
48. Moţa C., Roşu A., Câmpeanu Gh. Compuşi bioactivi de origine vegetală. În: Abordări
biotehnologice, 2004, p. 99-115.
49. Oniga I., Benedec D., Hanganu D., ş. a. Analiza Produselor Naturale Medicinale, Cluj-
Napoca: Univ. Med. Farm. „Iuliu Haţieganu”, 2004. 68 p.
50. Palii A., Comarov G., Lozan A. ş.a. Biotehnologii moderne în fitotehni şi biosecuritate.
Chişinău: Tipografia Centrală, 2004. 232 p.
51. Postolache G., Ciubotaru A., Galupa D., ş. a. Resursele vegetale. Starea actuală, protecţia şi
folosirea raţională. În: Mediul ambiant, 2005, nr. 4 (22), p. 15-20.
52. Radovăţ D. Studii privind morfogeneza în vitrocultură a explantelor de Coleus, de
provenienţă diferită. Autoref. tezei de dr. în şt. farmaceutice. Oradea, 2007. 532 p.
53. Soran V., Fati V., Ardelean A. Biotehnologile – prezent şi viitor: Fiziologia celulelor
vegetale în regim de vitrocultură. In: Mater. Al XII-lea Simpozion Naţional de Culturi şi
Ţesuturi Vegetale. Satu Mare: Daya, 2003, p. 3-33.
54. Zagorneanu E., Bujoreanu V., Marâi L. Studierea variabilităţii morfologice şi structurii
anatomice a fructelor la descendenţii de tomate. În: NooSfera, 2009, nr. 2, p. 47-49.
55. Zagorneanu E, Zubcov I. Particularităţile obţinerii in vitro a calusului frutier de Capsicum
annuum L. În: Lucrările şt. ale Simp. III al Societăţii de Fiziologie şi Biochimie Vegetală a
R.Moldova “Fiziologia şi biochimia plantelor de cultură”. Chişinău, 2004, p. 267-271.
56. Zubcov I., Şişcanu Gh., Zagorneanu E. Analiza comparată morfo-funcţională a sistemului
carpoexplant-carpocalus in vivo şi in vitro la tomate (L.esculentum Mill.). In: Buletinul
Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţele vieţii, 2007, nr.2 (201), p. 41-46.
57. Zubcov I., Zagorneanu E. Diversitatea şi structura submicroscopică a calusului carpogen la
tomate (Lycopersicon esculentum Mill). În: NooSfera, 2008, nr.1, p. 16-19.

203
58. Zubcov I., Zagorneanu E., Matienco B. Structura plastidelor calusului de tomate cu
maturitate biologică. În: Mater. Simposia Professorum ULIM. Chişinău, 2002, p. 398-399.
59. Amiot M., Tacchini M., Aubert S., et al. Influence of cultivar, maturity stage, and storage
conditions on phenolic composition and enzymatic browning of pear fruits. In: J. Agric. Food
Chem., 1995, vol. 43, p. 1132–1137.
60. Australian New Crops. Web Site Supported by the Rural Industries Research and
Development Corporation. Listing of Interesting Plants of the World, 2007.
61. Ayan A., Çirak C., Yanar O. Variations in total phenolics during ontogenetic,
morphogenetic, and diurnal cycles in Hypericum species from Turkey. In: Journal of Plant
Biology, 2006, vol. 49, nr. 6, p. 432-439.
62. Balogun M., Akande S., Ogunbodede B. Effects of plant growth regulators on callus shoot
and root formation in fluted pumkin Telfairia occidentalis. In: African J. of Biotechnol.
2007, vol. 6, nr. 4, p. 355-358.
63. Barclay L. Chookeberry (Aronia): Rich in Polyphenoles, Antioxidants. În: Disease –
Fighting Power of Polyphenols. London, 2008, vol. 6, 136 p.
64. Barron L. Biochemical events during ripening of grape berries. In: Italian J. of Food Science,
1991, nr. 3, p. 173–180.
65. Baur P., Walkinshaw C. Fine structure of tannin accumulations in callus cultures of Pinus
elliotii (slash pine). In: Canadian Journal of Botany, 1974, vol. 52, p. 615–619.
66. Beattie J., Crozier A., Duthie G. Potential health benefits of berries. In: Curr. Nutr. Food Sci.,
2005, nr. 1, p. 71-86.
67. Beiderbeck R., Hohl K. Induction of cell divisions in isolated pericarp cells of Ligusticum
vulgare L. In: Biochem. Physiol Pflanzen., 1985, vol. 180, p. 547-550.
68. Bell D., Gochenaur K. Direct vasoactive and vasoprotective properties of anthocyanin-rich
extracts. In: Journal Appl. Physiol., 2006, vol. 100, nr. 4, p. 1164-1170.
69. Ben-Arie R, Kislev N, Frenkel C. Ultrastructural Changes in the Cell Walls of Ripening
Apple and Pear Fruit. In: Plant Physiology, 1979, vol. 64, nr. 2, p. 197-202.
70. Bennet R, Wallsgrove R. Secondary metabolites in plant defence mechanisms, Tansley
Review, New Phytol, 1994, nr. 72, 127, p.617–633.
71. Benvenuti S, Pellati F, Melegari M, et al. Polyphenols, anthocyanins, ascorbic acid, and
radical scavenging activity of Rubus, Ribes, and Aronia. În: J. of Food Sci., 2004, vol. 69, p.
164-169.
72. Berger S., Liddle L., Dillard W et al. Cytoskeleton 10nm filaments in cells of the algal phyla
Cholorophyta, Charophyta, and Chrysophyta and their developmentally regulated and
ppecies-specific association with prosomes. In: Protoplasma, 2003, 221, p. 277-288.

204
73. Blando F., Cardino A., Bellis L., Nicoletti I. Characterization of in vitro anthocyanin-
producting sour cherry (Prunus cerasus L.) callus cultures. In: Food Research Inter., 2006,
vol. 38, nr. 8-9, p. 937-942.
74. Blumenfeld A., Carit S. Growth its avocado fruit callus and its relation to exogenous and
endogenous cytokinins. In: Physiol. Plant., 1971, vol. 25, nr. 3, p. 369-371.
75. Boezinova L., Vlazinova H., Havel L., et al. Formation of lignans in plant cell culture of
Schisandra chinensisi. In: Plant Med., 2007, vol. 73, p. 66-69.
76. Brezeanu A., Matienco B., Cogalniceanu G., ş. a. Cytological and biochemical
characterisation of some non/morfogenetic cell lines from Vitis vinifera L. (cv. Ananas) long-
term callus culture. In: Current problems in cellular and molecular biology. Cluj-Napoca:
Resoprint, 1997, p. 426-433.
77. Buitelar R., Tramper J. Strategies to improve the production of secondary metabolites with
plant cell cultures: a literature review. In: Journal Biotechnology, 1992, vol. 23, p. 111-141.
78. Burbulis N., Blinstrubiene A., Sliesaravicius A. et al. Some factors affecting callus induction
in ovary culture of flax L. usitatissimum L. In: Biologia, 2007, vol. 53, nr. 2, p. 21-23.
79. Calalb T. Medicinal plants and some problematic aspects in the Republic of Moldova. În:
Revista farmaceutica. 2006, nr 1-4, p. 36-41.
80. Calalb T. Aronia melanocarpa tissue culture in vitro. In: Proceedings of the 8th National
Symposium „Medicinal plants – present and perspetives”. Piatra Neamţ, 2003, p. 40-43.
81. Calalb T. Carpocalli masses of black chokeberry Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot –
source of natural anthocyanins. In: Сб. науч. тр. междун. науч. конф. «Теоретические и
прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений». Минск, 2008, с. 248-251.
82. Calalb T. The dynamic of structure modifications and phenolic acumulation in carpoculture
of Aronia melanocarpa Elliot in in vitro. In: Archives of the Balkan Medical Union “The
XXXth Balcan Medical Week”, 2008, vol. 43, nr. 3, p.326-328.
83. Calalb T. Utrastructural aspects of synthesis, transport and deposition of phenolic substances
in the fruit callus. In: Proceedings of the 14th International Congress on Electron Microscopy.
Cancun (Mexico), 1998, vol. IV, p. 61-62.
84. Charanjit K., Harish K. Antioxidants in fruits and vegetables - the millennium's health. In:
International Journal of Food & Science Technology, 2001, vol. 36, nr. 7, p.703-725.
85. Cheng X., Wei T., Guo B., et al. Cistanche deserticola suspension cultures: Phenylethanoid
glycosides biosynthesis and antioxidant activity. In: Biotechnol-left. Dordrecht. Kluwer
Academic Publichers, 2003, vol. 25 (84), p.181-187.

205
86. Cong J., Tanksley S. Generation and Analysis of an Artificial Gene Dosage Series in Tomato
to Study the Mechanisms by Which the Cloned Quantitative Trait Locus fw2.2 Controls Fruit
Size. In: Plant Physiol, 2003, vol. 132, p. 292-299.
87. Cortella A., Pochettino M. Starch grain analysis as a Microscopic Diagnostic Feature in the
Identification of Plant Material. In: Economic Botany, 1994, vol. 48, nr 2, p. 171-181.
88. Cowan A., Cripps R., Richings E., et al. Fruit size: towards an understanding of the
metabolic control of fruit growth using avocado as a model system. In: Physiol. Plant, 2001,
vol. 111, p.127–136.
89. Croteau R, Lewis N. Natural Products (Secondary Metabolits). In: Biochemistry and
Molecular Biology of Plants, 2000, p.1250-1318.
90. Cruz-Castillo J., Woodlley D. Organogenesis potential for kiwi fruit (Actinidia deliciosa)
cuttings and pedicel treated with Agromil-plus. In: New Zealand J. of Crop and Horticulture
Science, 2003, vol. 31, p. 193-196.
91. Curtin C., Zang W., Franco C. Manipulating anthocyanin composition in Vitis vinifera
suspention cultures by elicitation with jasmonic acid and light irradiation. In: Biotechnol.
Lett. 2003, vol. 25, nr. 14, p. 1131-1135.
92. Czaninski Y., Catesson A. Electron microscopy of enzyme, In: Plant Physiology, 1974, vol.
2, nr 3, p. 31-34.
93. Dai G., Nicolae M., Andary C., et al. Flavonoids accumalate in cell walls, middle lamellae an
callose-rich papillae during an incompatible interction between Xanthomonas campestri v.
Malvacearu and cotton. In: Physiological and Molecular Plant Pathology, 1996, vol. 49, nr.
5, p. 285-306.
94. Decendit A, Ramawat K, Waffo P, et al. Anthocyanins, catechins, condensed tannins and
pigment production in Vitis vinifera cell bioreactor cultures. In: Biotechnol. Letters, 1996,
vol. 18, p. 659-662.
95. Dhar U., Joshi M. Efficient plant regeneration protocol through callus Sausseurea
obvallata (DC) Edgew (Asteraceae): Effect of explant type age and plant growth
regulators. In: Plant Cell Rep., 2005, vol. 24, p. 195-200.
96. Dhillon S., Hale M. Effect of plant hormones on growth of mature apple fruit tissue in
vitro. In: Science and Culture, 1975, vol. 41, nr. 9, p. 424-426.
97. Di Cosmo D., Misawa M. Plant Cell Culture Secondary Metabolism: Toward Industrial
Application. Plant biotechnology CRC Press, 1996. 244 p.
98. Dixon R, Paiva N. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. In: Plant Cell, 1995, nr. 7,
p. 243-255.

206
99. Dixon R., Summer L. Legume natural products: understanding and manipulating complex
pathways for human and animal health. In: Plant Physiology, 2003, vol. 131, p. 878-885.
100. Do C., Cormier F. Effects of low nitrate and high sugar concentrations an anthocyanin
content and composition of grape (V.vinifera) cell suspension. In: Plant Cell Reports, 1991,
vol. 9, p. 500-504.
101. Dubravina G, Zaytseva S, Zagoskina N. Changes in formation and localization of phenolic
compounds in the tissues of European and Canadian Yew durind dedifferentiation in vitro.
In: Journal of Plant Physiology, 2005, vol. 52, nr. 5, p. 672-678.
102. Dubrovnaja J., Tishchenko T. Genomic variability of sugarbeet morphogenetic and non-
morphogenetic callus. In: Cytology and genetics, 2003, vol. 37, p. 23-30.
103. Echevarria C, Garcia-Maurino S, Alvarez R, et al. Salt stress increases the Ca2+-
independent phosphoenolpyruvate carboxylase kinase activity in Sorghum leaves. In:
Planta, 2001, vol. 214, p. 283-287.
104. Einset J. Citrus tissue culture. Stimulation of fruit explants ultures with orange juice. In:
Plant Physiology, 1978, vol. 62, p. 885-888.
105. El-Ghaouth A., Wilson C., Wisniewski M. Ultrastructural and cytochemical aspects of the
biological control of Botrytis cinerea by Candida saitoana in apple fruit. In: J of Biological
control, 2004, vol 23, nr. 11, p. 56-61.
106. Espin C., Soler-Rivas C., Wichers H., et al. Anthocyanin-based natural colorants: a new
source of antiradical activity for foodstuffs. In: J.Agric. Food. Chem., 2000, vol. 48,
p.1588-1592.
107. Evans D., Coleman J., Kearns A. Plant cell culture. Lavoisier librairie, 2003. 208 p.
108. Fernandez L., Romieu C., Moing A., et al. The Grapevine fleshless berry Mutation. A
Unique Genotype to Investigate Differences between Fleshy and Nonfleshy Fruit. În: Plant
Physiology, 2006, vol. 140, p.537-547.
109. Flores A.M., Pais M.S. Organogenesis from interdode-derived nodules of Humulus lupus
var. Nugget (Cannabinaceae): histological studies and changes in the starch content. In:
Amer. Journal of Botany, 2000, vol. 87, p. 971-979.
110. Flores H. Use of plant cell and organ culture in the production of biological chemicals in
Applications of Biotechnology to Agricultural Chemistry. Washington,1987, 334, p. 66-68.
111. Floryanowicz-Czekalska, Podsedek A, Wysokinska A. Chlorogenic acid in vitro cultures of
Eleutherococcus senticosus. In: Herba Polonica, 2006, vol. 52, nr. 1/2, p. 67-74.
112. Floyd S., Wilhelm G. Plants the Chicago Region, MortoneArbore, 1994.

207
113. Fortes A. , Pais M. Organogenesis from internode derivated nodules of Humulus lupulus
var. Nugget (Cannabinaceae): Histological study and changes in the starch content. In:
Amer. Journal of Botany, 2000, vol. 87, p. 971-979.
114. Fougère-Rifot M, Benharbit El-Alami N, Brun O, Bouard J. Ontogenesis of the gynoecium
of Vitis vinifera L. var. Chardonnay in relation to the appearance of tannic vacuoles. In:
Journal Int. Sci. Vigne VIN, 1995, vol. 29, p. 105–130.
115. Fowler M. Plant cell culture – fiture perspectives in primary and secondary metabolism of
plant cell cultures. Neumann K.H. New York, 1985, 373, p. 362-373.
116. Franceschi V, Nakata P. Calcium oxalate in plants: formation and function. In: Annu. Rev.
Plant Biol., 2005, vol. 56, p. 41-71.
117. Frejnagel S. Comparison of polyphenolic composition of extracts from honeysuckle,
chokeberries and green tea. In: Polish. J.of Food and Nutr. Scien., 2007, vol. 57, p. 83-86.
118. Fu T. Safety consideratins for food ingredients produced by plant cell ant tissue culture. În:
Chemtech. 1998, vol. 28, nr. 1, p. 40-46.
119. Gasiorowski K, Brokos B, Kozubek A, Oszmianski J. The antimutagenic activity of two
plant-derived compounds. A comparative cytogenetic study. In: Cellular and Molecular
Biology Letters, 2000, vol. 5, p. 171-190.
120. Georgiev D, Georgieva M, Dinkova C. Influence of Pruning on the growth and fruit-
bearing of A. melanocarpa. In: J. of Central Europ. Agric., 2006, vol 7, nr. 1, p. 311-318.
121. Grusak M., Roges R., Yousef G., Erdman J., Lila M. An enclosed-chamber labeling system
for the safe 14C-enrichment of phytochemicals in plant cell suspention cultures. In: In
Vitro Cell. Dev. Biol. Plant., 2004, vol. 40, p. 80-85.
122. Gulsen J. Growth and development of Citrus pistils and fruit explants in vitro. In: Physiol.
Plant., 1981, vol. 53, nr. 3, p. 295-300.
123. Gunter E., Ovodo Y. The effect of ultraviolet radiation on the growth and polysaccharide
composition of callus culture of Silene vulgaris. In: Applied Biochem. and Microb., 2007,
vol. 43, nr. 4, p. 465-472.
124. Häkkinen S. Flavonols and Phenolic acids in Berries, Berry Products. Kuopio, 2000, 93 p.
125. Harada H., Mukai H., Takagi T. Effects of explant age, growth regulators and
carbohydrates on sugar accumulatin in Citrus juice vesicles cultured in vitro. In: Scientia
Horticulturae, 2001, vol. 90, nr. 1-2, p. 109-111.
126. Harborne J., Williams C. Advances in flavonoid research since 1992. In: Phytochemistry,
2000, vol. 55, p. 481-504.
127. Hardie W., Aggenbach S.The plastids of the grape pericarp and their significance in
isoprenoid synthesis. In: Austr. J. Grape and Wine Res., 1996, nr. 2, p. 144-154.

208
128. Hardin J. The enigmatic chokeberries (Aronia, Rosaceae). In: Bull. of the Torrey Bot.
Club., 1973, vol. 100, nr. 3, p. 170-184.
129. Heinonen I, Meyer A. Antioxidant in fruits, berries and vegetables. In: Fruit and vegetable
processing: Jongen ed. Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 2002, p. 23-51.
130. Hemmerle H., Burger H., Below P., et al. Chlorogenic acid and synthetic chlorogenic acid
derivates novel inhibitors of hepatic clucose-6-phosphate translocase. In: Journal Med.
Chem., 1997, vol. 40, p.137-145.
131. Herman E., Larrins B. Protein storage bodies and vacuoles. In: Plant Cell, 1999, nr. 11,
p. 601-613.
132. Hertog M., Hollman P., Venema D. Optimization of a quantitative HPLC determination of
potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits. In: Agric. Food Chem.,
1992, vol. 40, p. 1591-1598.
133. Hirokawa N., Kinesin and dynein superfamilly proteins and the mechanism of organelle
transport. In: Science, 1998, vol. 279, p. 519-526.
134. Hirota S, Shimoda T, Takahama U. Tissue and spatial distribution of flavonol and
peroxidase in onion bulbs and stability of flavonol glucosides during boiling of the scales.
In; Journal Agric. Food Chem., 1998, vol. 46, p. 3497–3502.
135. Hirvi T, Honkanen E.) Analysis of the Volatile Constituents of Black Chokeberry Aronia-
Melanocarpa. In: J. of the Science of Food and Agriculture, 1985, vol. 36, p. 808-810.
136. Ho L. Fruit growth and sink strength. In: C Marshall, J Grace, eds, Fruits and Seed
Production: Aspects of Development, Environmental Physiology and Ecology. Cambridge
University Press, Cambridge, UK, 1992, p. 101–124.
137. Hong Y, Read P, Harlander S, Labuza T. Development of a tissue culture system from
immature strawberry fruits. In: Journal of Food Science, 2006, vol. 54, nr. 2, p. 388-392.
138. Hovmman H., Jeppsson N., Bartish IV, et al. RAPD analysis of diploid and tetraploid
populations of Aronia points to different reproductive strategies within the genus. In:
Hereditas (Lund), 2004, vol. 141, p. 301-312.
139. Hrazdina G, Zobel A, Hoch H. Biochemical, immunological and immunochemical
evidence for the association of chalcone synthase with endoplasmic reticulum membranes.
In: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1987, vol. 84, p. 8966-8970.
140. Hrazdina G, Zobel A. Cytochemical localization of enzymes in plant cells. In: Botanical
Review, 1991, vol. 129, p. 269-322.
141. Hudec J, Bakos D, Mravec D, et al. Content of phenolic compounds and free polyamines in
black chokeberry (Aronia melanocarpa) after application of polyamine biosynthesis
regulators. In: J. of Agricultural and Food Chemistry, 2006, vol. 54, nr. 10, p. 3625-3628.

209
142. Ibrahim R, Barron D. Phenylpropanoids. In: Dey PM, Harborne JB, et al. Methods in Plant
Biochemistry. London, UK: Academic Press, 1989, p. 75-111.
143. Intrama V., Sitthithawon W. Comparison of secondary metabolites produced from in vitro
culture and natural Capsicum frutescens Linn. 2007. http//pharm.swu.ac.th/web.
144. Ipatova O., Prozorovskaya N., Rusina I., et al. Antioxidant properties of a procyanidin-
containing extract from A. melanocarpa leaves. In: Biomed. Khimya, 2003, vol. 49, p.165-
176.
145. Ito H., Yamada Y., Kim T., et al. Polyphenols from the leaves of Aronia melanocarpa. In:
Natural Medicines, 2005, vol. 59, nr. 1, p. 52-55.
146. Ivanova R. Antioxidant capacity of extracts from medicinal plants collected in Moldova.
In: Romanian biological sciences, 2007, vol. 5, nr. 1-2, p. 60-70.
147. Jaggi R., Bhatnagar J., Qadry J., et al. Static callus culture of fruit of Solanum
xanthocarpum. In: Indian J. of Pharmaceutical Sciences, 1987, vol. 49, nr. 6, p. 210-212.
148. Jakobek L., Seruga M., Medvidovic-Kosanovic M., et al. Antioxidant Activity and
Polyphenols of Aronia in comparision to other berry species. In: Agriculture Conspects
Scientificus, 2007, vol. 72, nr.4, p. 301-306.
149. Jankowski A., Jankovska B., Niedworok J. The Influence of Aronia melanocarpa in
Experimental Pancreatitis. In: Pol. Merkuriusz Lek., 2000, vol. 8 (48), p. 395-398.
150. Jefferson P., Johson D., Asay K. Epicuticular wax production. Water status and leaf
temperature in triticeeae range grasses of contrasting visible glauconsness. In: Can. J. Plant.
Sci., 1989, vol. 69, p. 513-520.
151. Jeppsson N. Evaluation of black chokeberry, Aronia melanocarpa, germplasm for
production of natural food colourant, ISHS Acta Horticulturae 484 In: Eucarpia
Symposium on Fruit Breeding and Genetics, 2006, p. 323-329.
152. Jeppsson N. The effects of fertilizer rate on vegetative growth, yield and fruit quality, with
special respect to pigments, in black chokeberry (Aronia melanocarpa) cv. 'Viking'. In:
Scientia Horticulturae (Amsterdam), 2000, vol. 83, p. 127-137.
153. Jeppsson N., Johansson R. Changes in fruit quality in black chokeberry (A. melanocarpa)
during maturation. In: J. of Horticultural Science and Biotech., 2000, vol. 75, p. 340-345.
154. Juniper B., Jefree G. Plant surfaces, London, 1983. 93 p.
155. Jurdith K, Conger B, Granham E. A histological study of tissue proliferation,
embryogenesis, and organogenesis from tissue cultures of Dactylis glomerata L. In:
Protoplasma, 1982, vol. 110, p. 121-28.
156. Kaack K, Kuhn B. Black chokeberry (Aronia melanocarpa) for manufacture of food
colorant. In: Tidsskrift for Planteavl, 1992, vol. 96, p. 183-96.

210
157. Kähkönen M., Hopia A., Heinonen M. Berry phenolics and their antioxidant activity. In:
Journal Agric. Food Chem., 2001, vol. 49, p. 4076-4082.
158. Kakegawa K., Suda J., Singiyana M., et al. Regulation of anthocyanin biosynthesis in cell
suspension cultures of Vitis in relation to cell division. In: Physiology Plantarum, 1995,
vol. 94, nr. 4, p. 661-666.
159. Kandil F.et al. Isolation of oligomeric proanthocyanidins from flavonoid producting cell
cultures. In: Vitro Cell Dev. Biol. Plant., 2000, vol. 36, p. 492-500.
160. Kask K. Large-Fruited Black Chokeberry Aronia-Melanocarpa. In: Fruit Varieties Journal,
1987, vol. 41, p.41-47.
161. Katoh M. Acetonitrile vacum drying method. In: J. of Electron Microscopy, 1979, vol. 28,
nr 2, p. 145.
162. Kawecki Z., Tomaszewska Z. The effect of various soil management techniques on growth
and yield in the black chokeberry (A. melanocarpa Elliot). In: J. Fruit Ornam. Plant Res.,
2006, vol. 14, p. 67-73.
163. Kazuhiro O., Ilieva I., Shiratori K., et al. Anti-inflammatory effects of Aronia extract on rat
endotoxin iduced uveitis. In: Annual Rev. Med., 2005, vol. 56, p. 431-439.
164. Kazuo S., Koichiro S., Kamada H., et al. IAA metabolism in embryogenic and non-
embryogenic carrot cells plant. In: Cell Physiology, 1994, vol. 35, nr. 8, p. 1159-1164.
165. Keli S, Hertog M, Feskens E, Kromhout D. Dietary flavonoids, antioxidant vitamins, and
incidence of smoke. In: Arch. Intern. Med., 1996, vol. 156, p. 637-642.
166. Kellera A., Frey-Koonen N., Wingender R., et al. Ultrastructure of sunflower protoplast
derived calluses differing in their regenerative potential. In: Plant Cell, Tissue and Organ
Culture., 1994, vol. 37, nr. 3, p. 277-285.
167. King J., Vernon M. Aronia Berries – What s their Potential? In: Nutrion Science News,
2004, vol. II, nr. 4, p. 31-38.
168. Kiong A., Huan H., Hessein S. Callus induction from leaf explants of Melaleuca
alternifolia. In: Inter. J. of Agricult. Research., 2007, vol. 2 (3), p. 227-237.
169. Kitahara K., Antoku M., Hori Y., et al. Developmental chance in starch granules in
sweetpotato callus. In: Carbohydrate polymers, 2002, vol. 49, nr.1, p. 91-92.
170. Knekt P, Jarvinen R, Seppanen R. Dietary flavonoids and the risk of lung cancer and pther
malignant neoplasms. In: Amer. J. Epidermal, 1997, vol. 146, p. 223-230.
171. Kokotkiewicz K et al., Aronia Plants: A review of traditional use, Biological Activities,
and Perspectives for Mordern Medicine. In: J. of Medicinal Food., 2010, 13 (2), p.1-15.
172. Konczak I., Zhang W. Anthocyanins – More than Natur′ s Colours. In: Journal of
Biomedicine and Biotechnology, 2004, vol. 5, p. 239-240.

211
173. Kordan H. Some morphological and physiological relationships of lemon fruit tissue in
vivo and in vitro. In: Bulletin of the Torrey Botanical Club, 1965, vol. 92, nr. 3, p. 209-216.
174. Kowalczyk E., Charyk K., Fijalkowski P., et al. Protective influence of natural
anthocyanins of Aronia melanocarpa on selected parameters of antioxidative status in
experimental intoxication with sulphide-2-chloroethyl-3-chloropropyl. In: Polish J.of
Environmental Studies, 2004, vol. 13, p. 339-341.
175. Kris-Etherton P., Hecker K., Bonanome A., et al. Bioactive compounds in foods: their role
in the prevention of cardiovascular disease and cancer. In: Amer. J. Med., 2002, vol. 113,
p. 71-88.
176. Kulling S., Rawel H. Chokeberry (Aronia melanocarpa) - a review on the Characteristic
Components and Potential Health Effect. In: Planta Med., 2008, vol. 74, p. 1625-1634.
177. Kuras M., Stefanowska-Wronka M., Lynch J., et al. Cytochemical Localization of Phenolic
Compounds in Columella Cells of the Root Cap in Seeds of Brassica napus. Changes in the
Localization of Phenolic Compounds during Germination. In: Annals of Botany, 1999, vol.
84, p.135-143.
178. Kutchan T. Ecological Arsenal and Developmental Dispatcher. The paradigm of Secondary
Metabolism. In: Plant Physiology, 2001, vol. 125, p. 58-60.
179. Lamboursain L., Jolicoeur M. In vitro propagation of secondary metabolites by cultivated
plant cells: the crucial rol of the cell nutritional status. In: Vasil I., et al. Plant
Biotechnology, 2003, p. 491-195.
180. Latche A., Pech J. Differential capacities of apple and pear fruit explant to enter cell
division in vitro during ripening and senescience. In: Physiol. Veget., 1983, vol. 21, nr.1,
p. 77-85.
181. Laublin G., Saini H. In vitro plant regeneration by embryogenesis from root culture of
some rhizomatous irises. In: Plant. Cell. Tiss. Org. Cult., 1991, vol. 29, p. 15-21.
182. Lavee S. The growth potential of olive fruit mesocarp in vitro (Olea europea). In: Acta
Hort. (ISHS). Sym. on Tissue Culture Horticultural Purposes, 1977, vol. 78, p. 115-122.
183. Lersten N., Horner H. Crystal macropattern development in Prunus serotina (Rosaceae,
Prunoideae) leaves. In: Ann. Bot. (Lond), 2006, vol. 97, nr. 5, p. 723-729.
184. Leja M., Mareczek A. , Wojciechowska R. Phenolic metabolism in root slices of selected
carrot cultivars. In: Acta Physiologiae Plantarum, 1997, vol.19, nr 3, p. 319-325.
185. Letham D. Cultivation of apple - fruit tissue in vitro. In: Nature, 1958, vol.182, p. 473-474.
186. Lila M. Anthocyanins and Human Health. An In Vitro Investigative Approach. In: Journal
of Biomedicine and Biotechnology, 2004, vol. 5 (200), p. 306-313.

212
187. Lila M. Bioflavonoids. Biotechnology and Biomedical Engineering. The board of Trustees
at the University of Illionois, 2006.
188. Lila M. In vitro bioflavonoid production technology. Biotechnology and Biomedical
Engineering. 2005.
189. Lila M. Valuable Secondary Products from In Vitro Culture. In: Food Technol., 2008, vol.
21, nr. 1, p. 8.
190. Lioyd A. Lignification and lignin topochemistry an ultrastructural view. In:
Phytochemistry, 2001, vol. 57, nr. 6, p. 859-873.
191. Lisa G. M., Purnell B. Differences in Number and Area of Mesocarp Cells between Small-
and Large-fruited Peach Cultivars. In: J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1991, vol. 116, p. 861-864.
192. Litwińczuk W. Propagation of black chokeberry (Aronia melanocarpa Elliot) through in
vitro culture. In: Electr. J. of Polish Agricultural Univ., 2002, vol. 5, nr.2, p. 22-26.
193. Liu R. Healt benefitis of fruits and vegetables are from additive and synergistic
combination of phytochemicals. In: Amer. J.Clinical Nutrition, 2003, vol. 78, p. 517-520.
194. Lu C., Vasil I. Histology of somatic embriogenesis in Panicum maximum (Guinea grass).
In: American Journal of Botany, 1985, vol. 72, p. 1908-1913.
195. Luza J, Gorsel R, Polito V, Chilling Injury in Peaches: A Cytochemical and Ultrastructural
Cell Wall Study. In: J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1992, vol. 117, nr. 1, p. 114-18.
196. Määttä-Riihinen K., Kamal-Eldin A., Mattila P., et al. Distribution and content of phenolic
compounds in eighteen Scandinavian berry species. In: Journal Agric. Food Chem., 2004,
vol. 52, p. 4477-4486.
197. Macheix J., Fleuriet A., Billot J. Occurrence of the enzymes of phenolic metabolism in
fruits. In: Fruit Phenolics, 2002, p. 169-176.
198. Madhavi D., Chand N., Rajalakshmi D., et al. Computerized optimization on the relative
growth of callus cultures of orange fruit. In: J.of Exper. Bot., 1991, vol.42, p. 917-923.
199. Manach C., Williamson G., Morand C., et al. Bioavailability and bioefficacy of
polyphenols in humans. I. Rewiew of 97 bioavailability studies. In: Amer. J. Clin. Nutr.,
2005, vol. 81, p. 230-242.
200. Marchant R., Robards A. Membrane system associated with the plasmalemma of plant
cells. In: Annals of Botany, 1968, vol. 32, p. 457–471.
201. Mandal S., Mitra A. Accumulation of cell wall-bound phenolic metabolites and their
upliftment in hairy root cultures of tomato Lycopersicon esculentum Mill. In: Biotechology
Leters, 2008, vol. 30, nr. 7, p. 1253-1258.
202. Marin J., Gella R. Fruits callus growth. In: Plant Cell Technology, 1992, nr. 4, p. 26-28.

213
203. Martinoia E., Klein M., Geisler M., et al. Vacuolar transport of secondary metabolites and
xenobiotics. Vacuolar Compartments. In: Annal Plant Reviews, 2000, vol. 5, p. 221-253.
204. Martynov E. Influence of Trace Elements on the Accumulation of Antho Cyanins in the
Fruit of Aronia-Melanocarpa. Chemistry of Natural Compounds. In: Химия природных
соединений, 1978, т. 14, с. 451-452.
205. Marzinek J., Mourão K.S.M. Morphology and anatomy of the fruit and seed in
development of Chorisia speciosa A. St.-Hil. Bombacaceae. In: Rev. Bras. Bot., 2003, vol.
26 no.1, p. 124-131.
206. Matienco B., Brezeanu A., Maximova E., et al. Carpoculture in vitro. Non-morphogenic
pathway. Chishinău: Ştiinţa, 2004. 130 p.
207. Matsumoto M., Hara H., Chiji H., et al. Gastroprotective Effect of Red Pigments in Black
Chokeberry fruit (Aronia melanocarpa Elliot) on Acute Gastric Hemorrhagic Lesions in
Rats. In: Journal Agric. Food Chem., 2004, vol. 52, p. 2226-2229.
208. Mayer J., Pepin M., Smith F. Anthocyaanin production from Vaccinium pahalae:
limitations of the physical microenvironment. In: J. Biotech., 2002, vol. 93, nr. 1, p. 45-57.
209. Mazza G. Health aspects of natural colors. In: Natural Food Colorants Science and
Technology. New York: Marcel Dekker, 2000, p. 289-314.
210. McNally A. Demand for superfruit aronia rockets. In: Consumer Trends, 2008, p.129-
145.
211. Mello O., Melo M., Appezzatoda-Glyria B. Histological analysis of the callogenesis and
organogenesis from root segments of Curcuma zedoaria Roscoe. In: Braz. Arch. Biol.
Technol., 2001, vol. 44, nr. 2, p.116-125.
212. Miller L.R. Antioxidants and Phyto-Nutrients are Found in Plants. In: Published Content,
2007, vol. 330, p. 212-220.
213. Moghaddam B., Taha R. Cellular behavior in embryogenic and non-embryogenic sugar
beet calluses. In: In vitro Cell. and Develop. Biol. Plant, 2005, vol. 41, nr. 4, p. 465-469.
214. Monje P., Baran E. Characterization of Calcium Oxalates Generated as Biominerals in
Cacti. In: Plant Physiol, 2002, vol. 128, p. 707-713.
215. Mokkila M. Berries and their components and row mateials for functional foods. In
Functinal Food Network. Freysing-Weihenstephan, 2006, 40 p.
216. Montefiori M., McGhie T., Hallet I., et al. Changes in pigments and plastid ultrastructure
during ripening of green-fleshed and yellow-fleshed kiwifruit. In: Scientia Horticulturae,
2008, nr. 4, p. 453-461.

214
217. Mori T., Sakurai M., Seki M., Furusaki S. Use of auxin and cytokinin to regalate
anthocyanin production on composition in suspension cultures of strawberry cell. In:
Journal of Science of Food and Agriculture, 2006, vol. 63, nr. 3, p. 271-276.
218. Morini S., D Onofrio C., Bellocchi G., Fisichella M. Effect of 2,4-D and light quality on
callus production and differention from in vitro cultured quince leaves. In: Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, 2000, vol. 63, nr. 1, p. 47-55.
219. Moskaug J., Carlsen H., Myhrstad M., Blomhoff R. Polyphenols and glutathione synthesisi
regulation. In: Amer. Journal. of Clinical Natrition, 2005, vol. 81, p. 277-283.
220. Moskowitz A.H., Hrazdina G. Vacuolar contents of fruit subepidermal cells from Vitis
species. In: Plant Physiology, 1981, vol. 68, p. 686-692.
221. Mueller W.C., Greenwood A.D. The ultrastructure of phenolic-storing cells fixed with
caffeine. In: Journal of Exp. Bot., 1978, vol. 29, nr. 3, p. 757-764.
222. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assay with tobacco
tissue cultures. In: Physiology Plantarum, 1962, vol. 15, nr. 95, p. 473-478.
223. Murata M., Tsurutani M., Tomita M., et al. Relationship between apple ripening and
browning: Changes in polyphenol content and polyphenol oxidase. In: Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 1995, vol. 43, p. 1115-1121.
224. Nakajima J., Tanaka I., Seo S., et al. LC/PDA/ESI-MS Profiling and Rdical Scavenging
Activity of Anthocyanins in Various Berries. In: Journal of Biomed. and Biotech., 2004, nr.
5, p. 241-247.
225. Nakata P., McConn M. Calcium oxalate crystal formation is not essential for growth of
Medicago truncatula. In: Plant Physiology and Bichemistry, 2003, vol. 41, is.1, p. 325-329.
226. Nakatani N., Kayano S., Kukuzaki H., et al. Identification quantitative determination and
antioxidative activities of chlorogenic acid isomers in prune. In: Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 2000, vol. 48, p. 5512-5516.
227. Nancy N. Callus-formation in low bush blueberry fruit explants cultured in vitro. In:
Horticulture Research., 1978, vol. 181, nr. 2, p. 85-92.
228. Naqvi S., Abbas S., Quraishi A. Effect of sucrose, phytohormones and some aminoacids on
callus culture and subsequent regeneration in "Basmati -385". In: Pakistan J. Agric. Res.,
1989, vol. 10, nr. 3, p. 224-230.
229. Naruszewicz M., Laniewska I., Millo B., et al. Combination therapy of statin with
flavonoids rich extract from chokeberry fruts enhanced reduction in cardiovascular risk
markers in patiens after myocardial infraction (MI). In: Artheroslerosis. 2007, vol. 194, nr.
2, p. 179-184.

215
230. Nawa Y., Ohtani T. Induction of callus from flesh of Gardenia jasminoides Ellis fruit and
formation of yellow pigment in the callus. In: Bioscien., Biotech.. and Biochem., 1992, vol.
56, p. 1732-1736.
231. Nawrath C. The biopolymers cutin and suberin. In: The Arabidopsis Bppk. American
Society of Plant Biologists, 2002, p. 2-14.
232. Netzel M., Netzel G., Tian Q., et al. Native Australian fruits – a novel source of
antioxidants for food. In: 4th International Cong.on Pigments in Food: Pigments in Food -
A Challenge to Life Sciences. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 2007,
vol. 8, nr. 3, p. 339-346.
233. Niedz R., Evens T. Regulating plant tissue by mineral nutrition. In: In vitro Cellular and
Development Biology Plant, 2007, vol. 43, nr 4, p. 370-381.
234. Nigra N., Caso O., Giulietti H. Production of solasodine by calli from different parts of
Solanum eleganifolium Cav. plants. In: Plants Cell Reports, 1987, vol. 6, nr. 2. p. 33-39.
235. Niki T., Sakai A. Ultrastructural changes related to frost hardiness in the cortical
parenchyma cells from mulberry twigs. In: Plant Cell Physiol., 1981, vol. 22, p. 171–183.
236. Nistri-Sangduc, Pronot-Klamsomboo. Histological and scanning electron observations on
embryogenic and non-embryogenic calli of aromatic thai rice Oryza sativa L. cv. Khao
Daw Mali. In: National Bibliografic Inform. on Dietary Suppliments, 2001, p. 131-138.
237. Nitsch J. Culture in vitro de tissus de fruits. Mesocarpe de pomme. In: Bull. Soc. Bot.
France, 1959, vol. 106, p. 420-424.
238. Nohynek L., Alakomi H., Kahkonen M., et al. Berry Phenolics: Antimicrobial properties
and mechanisms of action against severe human pathogens. In: Nutrition and Cancer, 2006,
vol. 54, nr.1, p. 18-32.
239. Novruzov E., Radzhabov A. Chemical investigation of the fruit of the black chokeberry (A.
melanocarpa Elliot). In: Изв. Акад. Наук Азербайд. Сер. Биол. наук, 1990, 9, p. 50-55.
240. Ohgami K., Ilieva I., Shiratori K., et al. Anti-inflammatory Effects of aronia Extract on Rat
Endotoxin-Induced Uveitis. In: Investigative ophtalmology and Visual Science, 2005, vol.
46, p. 275-281.
241. Ohl S., Hahlbrock K., Schafer E. A stable blue-light-derived signal modulates ultraviolet-
light-induced activation of the chalcone-synthase gene in cultured parsley cells. In: Planta,
1989, vol. 177, p. 228-236.
242. Okita T., Greenberg E., Kuhn D., et al. Subcellular Localization of the Starch Degradative
and Biosynthetic Enzymes of Spinach Leaves. In: Plant Physiol, 1979, vol. 64, nr. 2,
p. 187-192.

216
243. Olsson M., Gustavsson K., Andersson S., et al. Inhibition of cancer cell proliferation in
vitro by fruit and berry extracts and correlations with antioxidant levels. In: Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 2004, vol. 52, p. 7264-7271.
244. Onay A. Histology of somatic embryogenesis in cultured leaf explants of pistachio Pistacia
vera L. In: Turk. J. Bot., 2000, p. 91-95.
245. Orban N., Boldizsak I., Boka K. Structural and chemical study off callus formation from
leaves of R. tinctorium. In: Biologia Plantarum, 2007, vol. 51, nr. 3, p. 421-429.
246. Oszmianski J., Sapis J. .Anthocyanins in Fruits of Aronia Melanocarpa (Chokeberry). In:
Journal of Food Science, 2006, vol. 53, nr. 4, p. 1241-1242.
247. Oszmianski J, Wojdylo A. Aronia melanocarpa phenolics and their antioxidant activity. In:
Eur. Food Res. Tech., 2005, vol. 221, nr. 6. p. 809-813.
248. Ouyang J., Wang X., Zhao B., et al. Light intensity and spectal quality influencing the
callus growth of Cistanche deserticola and biosynthesis of phenylethanoid glycosides. In:
Plant Science, 2003, vol. 165, nr. 3. p. 657-661.
249. Oway A. Histology of somatic embryogenesis in cultured leaf explants of pistachio
(Pistacia vera L.). In: Turk. J. Bot., 2000, p.91-95.
250. Parc G., Rembur J., Rech Ph., et al. In vitro culture of tabacco callus on medium containing
peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stability. In: Plant
Cell Reports, 2007, vol. 26, nr.2, p. 145-152.
251. Parham A, Kaustien H. Differentiation of tannin, lipid, and starch in cultured plant cells.
In: IPC Technical Paper series, 1975, nr. 16, p. 3-12.
252. Parups E.V. Effect of various plant phenols on protein synthesis in excised plant tissues. In:
Canadian Journal of Botany, 1967, vol. 4, p. 427-434.
253. Pech J., Latche A., Fallot J. Tissue and cell culture of Passé Crassane Dears: Amylase
pattern of cultured tissues comparated with whole fruit. In: Physiologia Plantarum, 1979,
vol. 46, nr. 3, p. 260-264.
254. Perey F., Meza P., Berti M., et al. Effect of carbon source and scrose concentration on
growth and hexose accumulation of grape berries cultured in vitro. In: Plant Cell, Tissue
and Organ Culture, 2000, vol. 61, nr. 1, p. 37-40.
255. Pérez-Ilzarbe J., Hernández T., Estrella I. Phenolic compounds in apples: varietal
differences. In: Z Lebensm, Unters Forsch, 1991, vol. 192, p. 551–554.
256. Persson H., Jeppsson H., Bartish I., et al. RAPD analysis of diploid and tetraploid
populations of Aronia points to different reproductive strategies within the genus. In:
Hereditas, 2005, vol. 141, nr. 3, p. 301-312.

217
257. Peters N., Verma D. Phenolic compounds as regulators of gene expression in plant-microbe
interactions. In: Molecular Plant- Microbe Interactions, 1990, nr. 3, p. 4-8.
258. Petrovic D., Jacimovic-Plavsic M. Aronia melanocarpa and propagation in vitro. Acta
Hortiulture 300. In vitro Culture XXIII IHC, 2004, p.114-117.
259. Pignatelii P., Pulcinelli F., Celestini A. et al. The flavonoids quercetin and catechin
synergistically inhibit platelet function by antagonizing the intracellular production of
hydrogen peroxide. In: Amer. J. Clin. Nutr., 2000, vol. 72, nr. 5, p. 1150-1155.
260. Pilaczynska-Szczesniak L., Skarpanska-Steiborn A., Deskur E., et al. The influence of
chokeberry juice supplementation on the reduction of oxidative stress resulting from an
incremental rowwing ergometer exercise. In: Int. J. Sport. Nutr. Exerc.Metab., 2005, vol.
15 nr. 1, p. 45-48.
261. Pirie A., Mullins M. Concentration of phenolics in the skin of grape berries during fruit
development and ripening. In: Am. J. Enol. Vitic.,1980, vol. 31, p. 34-36.
262. Plata N., Konczak-Islam I., Jayram S., et al. Effect of Methyl Jasmonate and p-coumaric
acid on Anthocyanin Composition in a Sweet Potato Cell Suspension Culture. In:
Biochemical Engineering Journal, 2003, vol. 14, nr. 3, p.171-177.
263. Pogorzelski E., Wilkowska A., Kobus M. Inhibiting effect of tannin in chokeberry must on
the winemaking process. In: Pol. J. of Food and Nutrition Sciences, 2006, vol. 15, p. 49-53.
264. Polanska L., Vicankova A., Novakova M., et al. Altered cytokinin metabolism affects
cytokinin, auxin, and abscisic acid contents in leaves and cloroplasts ultrastructure in
transgenic tobacco. In: Journal of Experimental Botany, 2007, vol. 58, nr. 3, p. 637-649.
265. Polito V., Larson K., Pinney K. Anatomical and Histochemical Factors Associated with
Bronzing Development in Strawberry Fruit. In: J. Amer. Soc. Hort. Sci, 2002, vol. 127, nr.
3, p. 335-357.
266. Poljuha D., Balan B., Bancer A., et al. Morphology and ultrastructure of Mammillaria
gracilis (Cactaceae) in in vitro culture. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2003, vol.
75, nr. 2, p. 117-123.
267. Pomeroy M., Andrews C. Metabolic and ultrastructural chances associated with flooding at
low temperature in winter and barley. Plant Physiol., 1979, 64, p. 635-639.
268. Prabhe T., Salimath P., Patwardhan M. Primary metabolites and organic acid metabolism
in M. sylvestris fruit callus culture. In: J. Sci. Food and Agric., 1990, vol. 51, 3, p. 381-389.
269. Proteggente A., Pannala A., Paganga G. The antioxidant activity of reglatory concumed
frut and vegetables reflets their phenolic and vitamin C composition. In: Free Radic. Res.,
2002, vol. 36, nr. 2, p. 217-233.

218
270. Prusky D., Hamdan H., Ardi R., et al. Induction of biosynthesis of epicathechin in avocado
suspension cells treated with an enriched CO2 atmosphere. In: Physiol. and Molec. Plant.
Pathol., 1996, vol. 48, p. 171-178.
271. Prychid C, Jabaily R, Rudall P. Cellular Ultrastructure and Crystal Development in
Amorphophallus (Araceae). In: Annals of Botany, 2008, vol. 101, nr. 7, p. 983-995.
272. Puupponen-Pimia R., Biedermann O., Nahynek L, et al. Production of bioactive phenolic
compounds by berry cell cultures NJE. In: Seminar 399. Beneficial health substances from
berries and minor crops. Report. 2007, vol. 3, nr. 1, p. 21-28.
273. Puupponen-Pimia R., Nohynek L., Alakomi H., et al. The action of berry phenolics against
human intestinal pathogens. In: BioFactors, 2008, vol. 23, nr. 4, p. 243-251.
274. Radford A., Ahles E., Bell C. Manual of the Vascular Flora of the Carolinas. University of
North Carolina Press, Chapel Hill, North Carolina, 1964. 1183 p.
275. Ramachandra R., Ravishankar G. Plant cell cultures: Chemical factors of secondary
metabolites. In: Biotechnol. Adv., 2002, vol. 20, p. 101-153.
276. Rapoport H., Manrique T., Gucci R. Cell division and expansion in the olive fruit. In: Acta
Hortic., 2004, vol. 636, p. 461–465.
277. Razungles A., Oszmianski J., Sapis J. Determination of Carotenoids in Fruits of. R. canina,
R. rugosa and of A. melanocarpa. In: J. of Food Science, 1989, vol. 54, p. 774-745.
278. Revilla A., Fernández Tárrago J. Ultrastructure of Starch Grain Breakdown in Cotyledon
Cells of Germinating Lentil Seeds. In: Starch Stärke, 2006, vol. 38, nr. 11, p. 379-381.
279. Rice-Evans C. Flavonoid antioxidants. In: Cur.Med. Chemistry, 2001, nr. 8, p. 707-807.
280. Rodriguez S., Mondejar C., Ramos M,. et al. Sugarcane somatic embryogenesis: a
scanning electron microscopy study. In: Tissue and Cell, 1996, vol. 28, nr. 2, p. 149-154.
281. Rohrer J., Kenneth R., Phipps R., et al. Variation in Structure among fruits of Maloideae
(Rosaceae). In: American Journal of Botany, 1991, vol. 78, nr. 12, p. 1617-1635.
282. Rosenquist L., Morrison J. Some factors affecting cuticle and wax accumulation on grape
berries. In: Amer. J. Enol. Vitic., 1989, vol. 40, nr. 4, p 243-244.
283. Rossell M. The distribution and fruiting of red and black chokeberry (Aronia arbutifolia
and A. melanocarpa) in a southern Appalachian fen1. In: Journal of the Torrey Botanical
Society, 2003, nr. 4 (12), p. 313-320.
284. Rubczynski J., Turzycski D. Regeneration capacity of leaf blade of rootstock of apple tree
and A.melanocarpa Elliot. In: Prace Ogrodu Botanicznego PAN, 1992, nr. 2, p. 37-44.
285. Rumyantseva N., Valyeva A., Samochvalova N., et al. Pecularities of lignification of cell
walls of backwheat calli with different morphogenetic abillity. In: Цитология, 1998, т. 40,
с. 835-843.

219
286. Russev V., Valcheva-Kuzmanova S., Belcheva A. Study of the natural Aronia
melanocarpa juice for anti-viral activity. Pharmacology Section, Department of Preclinical
and Clinical Pharmacology and Biochemistry, Varna, 2003, nr. 3, p. 51-56.
287. Ruzic D. In vitro rooting and subsequent growth of black chokeberry (Aronia
melanocarpa) plants ex vitro. In: J. of Fruit and Ornam. Pl. Research, 1993, nr. 1, p. 1-8.
288. Sakuta M., Hirano H., Kakegawa K., et al. Regulatory mechanism of biosynthesis of
betacyanin and anthocyanin in relation to cell division activity in suspension cultures. In:
Plant cell Tissue and Organ Culture, 1994, vol. 38, p. 167-169.
289. Sandhu R., Pandhir V., Das A., et al. Induction and proliferation of different varieties of
Capsicum annuum. In: J.of Biochem. and Biotech., 2003, vol. 12, nr. 2, p. 159-162.
290. Sane D., Aberleng-Bertossi F., Gassama-Dia Y., et al. Histological analysis of
callusogenesis and somatic embryogenesis from cell suspensions of date palm (Phoenix
dactylifera). In: Annals of Botany, 2006, vol. 98, nr. 2, p. 301-308.
291. Sano M., Yoshida R., Degawa M., et al. Determination of peroxyl radical scavenging
activity of flavonoids and plant extracts using an automatic potentiometric titrator. In:
Journal Agricultural Food Chemistry, 2003, vol. 51, nr.10, p. 2912-2916.
292. Santos-Gomes P., Seabra R., Andrade P., et al. Determination of phenolic antioxidant
compounds produced by calli and cell suspensions of sage (Salvia officinalis L.). In:
Journal of Plant Physiology, 2003, vol. 160, nr. 9, p. 1025-1032.
293. Santos-Gomes P., Fernandes-Ferreira M. Essential oils produced by in vitro shoots of sage
(Salvia officinalis). In: J. Agricultural Food Chemistry, 2003, vol. 51, nr. 8, p. 2260-2266.
294. Saunders J., McClure T. The distribution of flavonoids in cloroplasts of 25 species of
vascular plants. In: Phytochemistry, 1976, vol. 15, p. 809-810.
295. Savraj C., Evans J., Edgar B. Drosophila TIF-IA is required for ribosome synthesis and
cell growth and is regulated by the TOR pathway, The J. of Cell Biology, 2007, vol. 179,
nr. 61, p. 105-113.
296. Schwendiman J., Pannetier C., Michaux-Ferriere N. Histology of somatic embryogenesis
from leaf explants of the oil palm Elaeis guineensis. In: An. of Bot., 1988, vol. 62, p.43-52.
297. Seydel P., Dornenburg H. Establishment of in vitro plants cell and tissue cultures from
Oldenlandia affinis for the production of cyclic peptides. In: Plant Cell, Tissuie and Organ
Culture, 2006, vol. 85, nr. 3, p. 247-255.
298. Shuler M., Hirasuna T., Prince C., et al. Bioreactor considerations for producting flavors
and pigments from plant tissue culture. In: Schwarzberg H., Rao M. Eds. Bioprocess and
Food Process Engineering. New York, 1990, p. 45-66.

220
299. Singleton V., Orthofer R., Lamuela-Reventos R. Analysis of total phenols and other
oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent. In: Methods in
Enzymology, 1999, vol. 299, p. 152-178.
300. Siorowski G., Szyba K., Brokos B., et al. Antimutagenic activity of anthocyanins isolated
from Aronia melanocarpa fruits. In: Cell. Biol. Mol. Lett., 2000, nr. 4, p. 37-46.
301. Skupień K., Ochmian I., Grajkowski J. Influence of mineral fertilization on selected
physical features and chemical composition of Aronia fruit. In: Acta Agrophysica, 2008,
vol. 11, nr. 1, p. 213-226.
302. Slimestad R., Torskangerpoll K., Nateland H. et al. Flavonoids from black chokeberries
Aronia melanocarpa. In: J. of Food Comp. and Analysis, 2005, vol. 18, nr. 1, p. 61-68.
303. Sommer N., Bradley M., Creasy M. Peach mesocarp explant enlargement and callus
production in vitro. In: Science, 1962, vol. 136, nr. 3512, p. 264-265.
304. Sparapano L., De Leonardis S., Campanella A., et al. Interaction between esca-associated
fungi, grapvine calli and micropropagated shoot cultures of grapevine. In: Phytopathol.
Mediterr., 2001, vol. 40, p. 423-428.
305. Stamp N. Out of the quagmire of plant hypotheses. In: Rev. Biol., 2003, vol. 78, p. 23-55.
306. Steer M. N. Plasma membrane turnover in plant cells. In: J. of Experimental Botany, 2005,
vol. 39, p. 987-996.
307. Stefanowska M., Kuras M., Kacperska A. Low Temperature-inducrd modifications in cell
ultrastructure and localization of phenolics in winter oilseed rape (Brassica napus L., var.
oleifera L.). In: Annals of Botany, 2002, vol. 90, nr. 5, p. 637-645.
308. Sterling C. Comparative Morphology of the Carpel in the Rosaceae. VI. Pomoideae:
Eriobotrya, Heteromeles, Photinia, Pourthiaea, Raphiolepis, Stranvaesia. In: American
Journal of Botany, 1965, vol. 52, nr. 9, p. 938-946.
309. Sterling M. Got anthocyanins? In: Nutrition Science News, 2001, p. 18-23.
310. Steven A. Mckay Demand increasing for Aronia and Elderberry in North America. In: New
York fruit Quarterly, 2001, vol. 9, nr.3, p. 41-47.
311. Stintzing F., Stintzing A., Carle R., et al. Color and antioxidant properties of cyanidin-
based anthocyanin pigments. In: J.Agric. Food Chem., 2002, vol. 50, nr. 21, p. 6172-6181.
312. Stöckigt J., Falkenhagen R., Lutterbach R.et al. Natural products and enzymes from plant
cell cultures. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2004, vol. 43, nr 2, p. 97-109.
313. Strack D. Phenolic metabolism. In: Dey PM, Harborne JB, eds. Plant Biochemistry.
London, UK:Academic Press, 1997, p. 387-416.
314. Strik B., Finn C., Wrolstad R. Performance of chokeberry (Aronia melanocarpa) in
Oregon, USA In: Acta Hort., 2003, vol. 626, nr. 16, p. 438-443.

221
315. Sueiro L., Yousef G., Seigler D., et al. Chemopreventive Potenţial of Flavonoid Extracts
From Plantation-bred and Wild Aronia melanocarpa (black chokeberry) fruits. In: Journal
of Food Science, 2006, vol. 71, nr. 8, p. 480-488.
316. Sujatha R., Babu C., Nazeem P. Histology of organogenesis from callus cultures of black
pepper Piper nigrum L. In: Journal of Tropical Agriculture, 2003, vol. 41, p.13-16.
317. Suvorova I., Davydov V., Prozorovskiy V. et al. Peculiarity of the antioxidant action of the
extract from Aronia melanocarpa leaves antioxidant on the brain. In: Биомедицинская
химия, 2005, т. 51, с. 66-71.
318. Suzuki T., Ucnohata M, Oosawa K. Polyploidy breeding of blue honeyseeckle and black
chokeberry by utilizing in vitro cultures treated with colchicine. In: Acta Horticult., 2006,
vol.12, nr.3, p. 760.
319. Tamas M., Oniga I., Crişan G., et al. Recherches sur Quelques Products avec Anthocyans.
In: Proceeding of the XVth Ed.of Balkan Medicinal Days, Iasi: Cantes, 2000, p. 202-205.
320. Tanaka T., Tanaka A. Chemical components and characteristics of Black chokeberry. In:
Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2001, vol. 48, p. 606-610.
321. Terao J., Pisku a M., Yao Q. Protective effect of epicatechin, epicatecin gallate and
quercetin on lipid peroxidation in phospholipid bilayers. In: Archives of Biochemistry and
Biophysics, 1994, vol. 308, p. 278-284.
322. Thunhorst G. Wetland planting guide for the northeastern United States-plants for wetland
creation, restoration, and enhancement. Environmental Concern, Inc., St. Michaels,
Maryland, 1993. 179 p.
323. Tikhomirova I. On studies of micromycetes on Aronia melanocarpa and Sorbus in
Leningrad region. În: Вестник Санкт-Петербургского. Серия Биология, 1992, с. 99-101.
324. Tomas-Barberan F., Espin J. Phenolic compounds and related enzymes as determinants of
quiality in fruits and vegetables. In: Journal Sci. Food. Agric., 2001, vol. 81, p. 853-876.
325. Valcheva-Kuzmanova S., Belcheva A. Current knowledge of Aronia melanocarpa as a
medicinal plant. In: Folia Med. (Plovdiv), 2006, vol. 48, nr. 2, p. 11-17.
326. Valcheva-Kuzmanova S., Gadjeva V., Ivanova D., et al. Antioxidant activity of Aronia
melanocarpa fruit juice in vitro. In: Acta Alimentara, 2007, vol. 36, nr. 4, p. 425-428.
327. Valcheva-Kuzmanova S., Kuzmanov K., Tancheva S., et al. Hypoglycemic effects of
Aronia melanocarpa fruit juice in streptozotocin-induced diabetic rats. In: Metods Find.
Exp. Clin. Pharmacol., 2007, vol. 29, nr. 2, p. 101-105.
328. Valcheva-Kuzmanova S., Russev V., Bojkova K., et al. Study of natural A. melanocarpa
fruit juice for antibacterial and antiviral activity. In: Scr. Sci. Med., 2003, vol. 35, p. 21-23.

222
329. Vanisree M. et al. Studies on the production of some important secondary metabolites from
medical plants by plant tissue cultures. In: Bot. Bull. Acad. Sin., 2004, vol. 45, p. 1-22.
330. Verdeil J., Hocher V., Huet C., et al. Ultrastructural changes in coconut calli associated
with the aequisition of embryogenic competence. In: An., of Bot., 2001, vol. 88, p. 9-18.
331. Vlase L., Radu L., Fodorea C., et al. Determination of Phenolic Compounds from
Geranium sanguineum by HPLC. In: Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies, 2005, vol. 28, nr. 19, p. 3109-3117.
332. Wallace G., Fry S. Phenolic components of the plant cell wall. In: Int. Rev. Cytol., 1994,
vol. 151, p. 229-267.
333. Wang J., Liao X,. Zhang H., et al. Accumulation of chlorogenic acid in cell suspension
cultures of Eucomia ulmoides. In: Plant Cell. Tiss. Org. Cult., 2003, vol. 74, p. 193-195.
334. Wang S., Lin H.S. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry, and
strawberry varies with cultivar and developmental stage. In: Journal Agricultural Food
Chemistry, 2000, vol. 48, p. 140–146.
335. Warren R. Impact of woody vegetation succession upon herbaceous communities in a
southern Appalachian wetland. M.S. In: Thesis, Western Carolina Univ., Cullowhee, NC,
2002. 89 p.
336. Waterhouse A. Determination of Total Phenolics. In: Current Protocols in Food Analytical
Chemistry, 2001, vol. II, nr. 1, p. 1-8.
337. Weier E. The structure of the chloroplast. In: The Bot. Rew. 2008, nr.4 (9), p. 497-530.
338. Wiegers J. Aronia in the Netherlands 1. Distribution and Taxonomy. In: Acta Botanica
Neerlandica, 1983, vol. 32, p. 481-488.
339. Wink M. Compartmentation of secondary metabolites and xenobiotics in plant vacuoles.
In: Leigh R., Sanders D., Callow J. ed. The Plant Vacuole: Advances in Botanical
Research. 1997, vol.25, p. 141-170.
340. Wink M. Production of plant secondary metabolites by plant cell in relation to the site and
mechanism of their accumulation. In: Plant vacuoles: their importance in solute
compartmentation in cells and their applications in plant biochemistry. Ed. Marin Plenum
Press., 1986, vol. 134, p. 477-484.
341. Wronka M., Kuras M., Tykarska T., et al. Inhibition of the production of phenolic
compounds in B.napus by 2-aminoxyacetic acid. In: An. of Bot., 1995, vol. 75, p. 319-324.
342. Wu G, Liu Q, Teixeira da Silva J. Ultrastructure of pericarp and seed capsule cells in the
developing walnut Junglans regia L. fruit. In: South African J. of Botany, 2008, nr. 4. p
324-331.

223
343. Wu X., Gu L, Prior R, McKay S. Characterization of anthocyanins and proanthocyanidins
in some cultivars of Ribes, Aronia and Sambucus and their antioxidant capacity. In:
Journal Agricultural Food Chemistry, 2006, vol. 52, nr. 26, p. 7846-7856.
344. Wu X., Beecher G., Holden J., et al. Concentrations of anthocyanins in common foods in
the United States and estimation of normal consumption. In: Journal Agricultural Food
Chemistry, 2006, vol. 54, nr. 1, p. 4069-4075.
345. Xu J. The effect of low-temperature storage on the activity of polyphenol oxidase in
Castanea henryi chestnuts. In: Postharvest Biol. and Technol., 2005, vol. 38, is. 1, p.91-98.
346. Yakovlev A., Martynov E.The Effect of micro elements on polysacharide accumulation in
fruit of Aronia melanocarpa. In: Химия природных соединений, 1977, № 6, с. 22-25.
347. Yang G., Lu Z. Guava callus production under different culture medium and plant growth
regulator conditions. In: Procedings 33ed PGRSA. Annual Conf. Meeting, 2006, 240 p.
348. Yeoman M., Yeoman C. Manipulating seconady metabolism in cultured plant cells. In:
Phytol., 1996, vol. 134, p. 553-569.
349. Young M. Avocado callus and bud culture. In: Proc. Fla. State. Hort. Soc., 1983, vol. 96,
p. 181-182.
350. Yousef G., Seigler D., Grusak M. et al. Biosynthesis and characterization of 14C-enriched
flavonoid fractions from plant cell suspension cultures. In: Journal Agricultural Food
Chemistry, 2004, vol. 52, nr. 5, p. 1138-1145.
351. Zagorneanu E., Zubcov I. The ultrastructure of plastids of tomato fruits in vitro in Electron
Microscopy. În: Biol. Sci. Research. Inter. Cong. Cancun (Mexico), Y, YI, 1998, vol.
14, p. 233-234.
352. Zagoskina N., Alyavina T., Gladyshko T., et al. Ultraviolet rays promote development of
photosystem II. Photochemical activity and accumulation of phenolic compounds in the tea
callus culture (C. sinensis). In: Rus. J. of Pl. Physiol., 2005, vol. 52, nr. 6, p. 731-739.
353. Zhang C., Zhang Z., Li Y., et al. Effect of plant hormone on callus induction and
redifferentiation of black chokeberry leaf in vitro. In: Journal of Jilin Agricult. Univ., 2005,
vol. 27, nr. 4, p. 396-400.
354. Zhang J., Yoshida M., Fujiyama D., et al. Enhancement of anthocyanin production by
Perilla frutescens cells in a stirred bioreactor with internal light irradiation. In: J. Fermant.
Bioeng., 1993, vol. 75, nr. 4, p. 299-303.
355. Zhang W., Curtin C., Franco C. Towards manipulation of post-biosynthetic events in
secondary metabolism of plant cell cultures. In: Enzyme Microb. Technol., 2002, vol. 30,
nr. 6, p. 688-696.

224
356. Zheng W., Wang S.Y. Oxygen radical absorbing capacity of phenolics in blueberries,
cranberries, chokeberries, and lingonberries. In: Journal Agricultural Food Chemistry,
2003, vol. 51, nr. 2, p. 502-509.
357. Zlatanov M. Lipid composition of Bulgarian chokeberry, black currant and rose hip seed
oils. In: Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, vol. 79, p. 1620-1624.
358. Zobel A, Hrazdina G. Chalcone synthase localization in early stages of plant development.
I. Immunohistochemical method employing plasmolysis for localization of enzyme in
cytoplasm of epidermal cells of illuminated buckwheat hypocotyls. In: Biotechnic. and
Histochemistry, 1995, vol. 70, p. 1-6.
359. Zobel A, Kuras M, Tykarska T. Localization of phenolic compounds in epidermis as the
first cellular barrier between the plant body and its environment. Abstracts, Joint Meeting
of International Society of Chemical Ecology and Phytochemical Society of North
America, Quebec, 1990, 40 p.
360. Zouzou M., Kouakou T., Kone M., et al. Effect of genotype, explants, growth regulators
and sugas on callus induction in cotton Gossypium hirsutum L. In: Australian Journal of
Crop Science, 2008, vol. 2, nr. 1, p. 1-9.
361. Булгаков В.П., Феодоров С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология - здоровью человека:
Научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке. В: Вестник
ДВО РАН, 2004, № 3, с. 93-99.
362. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки
результатов исследования). М.: Агропромиздат, 1985. 350 с.
363. Загорнян Е. Структурная основа развития плодов рода Lycopersicon Tourn. Дисс. на
соиск. уч. ст. др. биол. наук. Кишинев, 1991. 39 c.
364. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. Москва: Высшая школа,
1974, 212 с.
365. Зленко В., Котиков И., Влияние регуляторов роста на проявляение генетически
детерминированных признаков окраски кожицы и сока ягод винограда на уровне
каллусной ткани. В: Научный Электроннный журнал КубТАУ, 2004, с. 214.
366. Каден Н.Н. Эволюция плодов розоцветных. В: Бюллетень Московского общества
испытателей природы (МОИП). Отд. Биология, 1968, т. 73, вып. 2, с. 23-27.
367. Калалб T. Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot источник биологически активных
веществ в культуре. В кн.: Нетрадиционное растиниеводство. Эниология. Экология и
здоровье: Матер. ХI междун. симпоз. Симферополь, 2002, с. 415-417.

225
368. Калалб Т. Тканевая культура in vitro источник биологически активных веществ. B:
Материалы ХIII международного симпозиума, книга 1, “Нетрадиционное
растиниеводство. Эниология. Экология и здоровье”, Симферополь, 2004, с.534-535.
369. Калалб Т., Матиенко Б., Осадчий В. Экологические аспекты структуры и
ультраструктуры плодов яблони. Кишинев: Штинца, 1992. 50 с.
370. Круглова Н, Зайнутдинова Э. Андроклинный каллус пшеницы в динамике развития:
цитолого - гистохимический анализ. В: Изв. Башкир. Гос. Ун-та, 2004, № 2, с. 12-14.
371. Кузьмина Н. Культура растительных клеток. Морфофизиологические
характенистики каллусных тканей. Основы биотехнологии. М., 2006. 15 с.
372. Ладыгин В., Семенова Г. Б., Смолов А. Влияние аммония и нитрата питательной
среды на ультраструктурную организацию и фотосинтез клеток каллуса Glycine max
L. В: Цитология, 2003, т. 45, № 5, с. 380-386.
373. Лапшин П., Загорска Н., Бутенко Р. Влияние UV-В на пролиферации каллусной
культуры пшеницы. В: Биол. науки. Науч. докл. высш. шк., 2001, № 11, с. 107-118.
374. Лапшин П., Трошенкова Н., Дубравина Г., и др. Морфофизиологические
характеристики каллусных культур пшеницы устойчивых к действию УФ-Б
радиации. http://www.lapshin.org/science/sb-tcxa. htm 2008, 6 pag.
375. Лутова Л. Биотехнология высших растений. С-Пб: Изд-во С.-Пб. ун-та, 2003, 228 с.
376. Матиенко Б., Загорнян Е., Ротару Г., и др. Гистологическая зональность
суккулентных плодов. Кишинев: Штиинца, 1973, 121 с.
377. Матиенко Б., Азема Т., Кодрян В., и др. Клеточные мембраны и развитие плодов.
Кишинев: Штиинца, 1980, 132 с.
378. Матиенко Б., Загорнян Е., Ротару Г., и др. Принципы структурных преобразований у
растений. Кишинев: Штиинца, 1988, 237 с.
379. Матиенко Б., Загорнян Е., Ротару Г., и др. Структура и функциональность плодов.
Кишинев: Штиинца, 1995, 152 с.
380. Ротару Г.И. Сравнительная анатомия околоплодника подсемейства яблоневых.
Кишинев: Штиинца, 1972, 130 с.
381. Румянцева Н., Вальчева А., Самоквалова Н., и др. Характеристики лигнификации
клеточных стенок каллуса гречихи с различными морфогенетическими
возможностями. В: Цитология, 1998, т. 40, с. 835-843.
382. Скрипчинский В.В. Эволюция онтогенеза растений. Москва: Наука, 1977, 232 с.
383. Смолов А.П., Семенова Г.А., Ладыгин В.Г. и др. Влияние аммония и нитрата
питательной среды на ультраструктурную организацию и фотосинтез клеток каллуса
Glycine max L. В: Цитология, 2003, т. 45, № 4, с. 21-26.

226
384. Стефанов С.Б. Согласованный набор морфометрических сеток для стереологических
измерений. Пущино-на-Оке, 1972, 28 с.
385. Стрелков Р.Е. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительных интервалов
средних арифметических величин с помощью таблицы. Сухуми: Алашары, 1966, 41с.
386. Уйкли Б. Электронная микроскопия для начинающих. Москва: Наука, 1975, 132 с.
387. Фурст Г. Методы анатомо-гистологических исследований растительной ткани. М.:
Наука, 1979. 155 с.
388. Чаховский А. Черноплодная рябина, облeпиха и другие перспективные плодово-
ягодные растения. Минск: Ураджай, 1976, 77 с.

227
 ANEXE
Anexa 1. Studii biotehnologice la fructe suculente
Tabelul A.1.1. Experimente biotehnologice pe fructe suculente
Nr. Specia
d/o de plante Investigaţii Anul Autorii

1. Malus domestica Inducerea calusului frutier din 1958 Letham D.

Persea americana diferiţi histogeni.
Citrus limon
2. C. limon Inocularea cavităţilor veziculare in 1958- Kordan H.
vitro. 1965
3. Prunus piersica Obţinerea biomasei din mezocarp. 1962 Sommer N.
4. Persea americana Iniţierea calusului din epicarp, 1963; Kay E.
regenerarea sezonieră a calusului. 1971
5. Malus domestica Obţinerea calusului static şi a 1975 Pech J.
suspensiei celulare, capacitatea Dhillon S.
proliferativă a explantului matur. 1975
6. Olea europea Rolul hormonilor, vârstei fructului şi 1977 Lavee S.
a histogenului..
7. Vaccinium sp. Rolul compoziţiei chimice a MN de 1978 Nikerson N.
bază.
8. C.limon Selectarea factorilori stimulatori în 1978 Lavee S.
inducerea calusului din fructe.
9. C.limon, C.medica, Efectul stimulator al sucului de 1978 Einset J.
C.paradisi, portocal asupra calusării.
C.sinensis
10. Pyrus commumis Proliferarea carpoexplantelor mature 1979 Pech J.
şi conţinutul proteic al biomasei.
11. M.domestica, Capacitatea diferenţiată a inducerii 1983 Latche A.
Pyrus communis calusului din fructe mature şi
senescente.
12. Ligustrum vulgare Determinarea factorilor stimulatori 1985 Beiderbeck R.,
în biosinteza antocianilor. Hohe R.
13. Solanum Obţinerea calusului static în funcţie 1987 Jaggi B.
xanthocarpum de tipul MN.
14. Fragaria sp. Obţinerea calusului static, în 1989 Hong Y., Labiza
suspensie şi producerea în T., Harlande S.
bioreactoare cu capacităţi mari.
15. Malus sylvestris Studiul metaboliţilor primari în 1990 Prabhe T.,
calusul frutier. Salimath P
16 Citrus reticulata Optimizarea compiuterizată a 1991 Madhavi D.
hormonilor din MN.
17. Prunus cerasus Acumularea calusului static pe 1992 Marin J., Gella R.
perioada calusogenezei.
18. Gardenia Biosinteza carotenoizilor în calusul 1992 Nawa Y., Obtani
jasminoides frutier. T.

228
 Continuarea tabelului A.1.1.
19. Vitis vinifera Analize biochimice a carpomasei. 1992 Cormier F., Do C.
Studii citomorfologice. 1998- Matienco B.,
2004 Brezeanu A.,
Marinescu M.
20. Persea americana Biosinteza epicatehinelor în 1996 Prusky D.,
suspensia celulară. Hamdan H.
21. Actinidia polygama Obţinerea biomaselor carpogene în 1996 Janick J., Moore
corelaţie cu tipul MN şi a J.
hormonilor adiţionaţi. 1997 Bajaj P.
22. Aronia Obţinerea carpomasei din epicarp cu 1998- Calalb T.
melanocarpa hipodermă şi evaluarea 2009
citomorfologică şi biochimică.
23. Lycopersicon Obţinerea carpocalusului din 1998 Zagorneanu E.,
esculentum mezocarpul fructului juvenil şi Zubcov I.
studiul citomorfologic.
24. C. reticulata Rolul vârstei fructului şi a 2001 Harada H., Mukai
hormonilor în acumularea zahărului. H., Takagi T.
25. Capsicum annuum Acumularea calusului din diferite 2003 Sandhu R.,
varietăţi cu conţinut de alcaloizi. Pandhir V.

Studii citomorfologice. 2004 Zagorneanu E.

26. Actinidia deliciosa Studiearea potenţialului 2003 Cruz-Castillo et
embriogenic. al.
27. Cucurbita maxima Carpocalus carotenoidic din 2004 Matienco B.,
mezocarpul fructului juvenil. Marinecu M.,
Colesnicova L.
28. Psidium guajava Studiul morfologic al calusului 2006 Yang G.
frutier.
29 Citrus sinensis Rolul sărurilor minerale în 2007 Niedy R., Evens
acumularea calusului. T.

229
 Anexa 2. Particularităţile anatomice ale fructelor de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot

Fig. A.2.1. Secţiune transversală prin fructul de A. melanocarpa (Michx.) Elliot la faza de 60 zile
de la înflorire: 1 – pericarp; 2 – lojă seminală; 3 – sămânţă.

Fig. A.2.2. Secţiune transversală prin fructul de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 – lojă
seminală; 2 – seminţe. Reacţie cu soluţie de clor-zinc-iod, x150.

230
 1

Fig. A.2.3. Secţiune transversală prin pericarpul fructului juvenil (20 zile de la înflorire) de A.
melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 – perişorii tectori; 2 – epicarpul pubescent; 3 – hipoderma; 4 –
endocarpul pubescent, x150.

Fig. A.2.4. Epicarpul fructului juvenil (20 zile de la înflorire) în secţiune tangenţială: 1 – perişori
tectori, x180.

231
 Fig. A.2.5. Epicarpul în secţiune tangenţială, x180.

Fig. A.2.6. Secţiune transversală prin pericarpul fructului juvenil de A. melanocarpa (Michx.)
Elliot: 1 – perişori tectori în epicarp; 2 – perişori tectori în endocarp, x150.

232
 2

Fig. A.2.7. Aspect superficial al epicarpului: 1 – stomată; 2 – baza perişorului cu celule anexe,
x180.

1
2

Fig. A.2.8. Secţiune transversală prin pericarpul fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot: 1 –
epicarp; 2 – hipodermă; 3 – endocarp; 4 – sclereide. Reacţie cu soluţie de clor-zinc-iod, x150.

233
 1

Fig. A.2.9. Secţinune transversală prin partea periferică a pericarpului de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot la etapa de 40 zile de la înflorire: 1 – perişori tectori; 2 – druze de oxalat de
calciu, Reacţie cu soluţie de clor-zinc-iod x 220.

1 2

Fig. A.2.10. Scanograma fructului juvenil: Fig. A.2.11. Scanograma fructului matur: 1-
1 – complexul trihomo-lenticular, x 610. lenticelă, 2 – acumulări cerifere, x 680.

234
Fig. A.2.12. Scanograma epicarpului fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot fără formaţiuni
cerifere, x 495.

Fig. A.2.13. Scanograma suprafeţei pericarpului fructului de A. melanocarpa (Michx.),

x 1250.

235
 mm

Valoarea coraportului
8 pericarp/lojă seminală
7
6 Grosimea
5 pericarpului (mm)
4
3 Grosimea lojei
2 seminale (mm)
1
0
Zona de Zona Zona
Sud Centrală de Nord
r. Cimişlia r. Străşeni r. Briceni

Fig. A.2.14. Variaţia unor indici biometrici a fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în
funcţie de zona fizico-geografică a R. Moldova.

Fig. A.2.15. Secţiune prin regiunea periferică a pericarpului fructului de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot din zona de Sud, x 150.

236
Fig. A.2.16. Secţiune prin regiunea periferică a pericarpului fructului de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot din zona de Sud, x 280.

Fig. A.2.17. Formaţiuni cerifere lamelare, Fig. A.2.18. Formaţiuni cerifere

x1250. granulare, x 1050.

237
Fig. A.2.19. Formaţiuni cerifere în Fig.A.2.20. Fisuri căptuşite cu formaţiuni
regiunea calicială a fructului, x1050. cerifere în regiunea mediană a fructului, x
1050.

Fig. A.2.21. Secţiune transversală prin regiunea pedicelară a fructului de

A. melanocarpa (Michx.) Elliot din zona de Sud, x 200.

238
Fig. A.2.22. Secţiune transversală prin partea periferică a pericarpului de A. melanocarpa
(Michx.) Elliot din zona de Sud, x300.

Fig.A.2.23. Secţiune transversală prin regiunea periferică a pericarpului de A. melanocarpa

(Michx.) Elliot din zona Centrală, x300.

239
Fig. A.2.24. Scanograma epicarpului cu formaţiuni cerifere tubulare, x1380

Fig. A.2.25. Scanograma epicarpului cu formaţiuni cerifere lamelare, x1380

240
Fig. A.2.26. Scanograma epicarpului cu formaţiuni cerifere granulare, x1380.

241
 Anexa 3. Studii biotehnologice şi structurale ale carpomaselor pigmentate in vitro de
A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Tabelul A.3.1. Grupele şi variantele hormonale adiţionate mediului MS (1962), utilizare pentru
studiul carpoculturii in vitro la A. melanocarpa ( Michx.) Elliot
Grupele Variantele Hormonii (mg/l) Zaharoza
hormonale hormonale BAP KIN ANA 2,4 –D (g/l)
1 2 3 4 5 6 7
B B1-1 0,5 30
B2-1 0,5 60
B1-2 1,0 30
B2-2 1,0 60
BD BD-1 0,5 0,5 60
BD-2 1,0 1,0 60
BD-3 1,0 1,5 60
BD-4 1,0 2,0 60
BN BN-1 0,5 0,5 60
BN-2 1,0 1,0 60
BN-3 1,0 2,0 60
BN-4 1,0 3,0 60
BN-5 1,0 3,5 60
BN-6 1,0 4,0 60
KD KD1-1 0,5 1,0 30
KD2-1* 0,5 1,0 60
KD1-2 0,5 1,5 30
KD2-2* 0,5 1,5 60
KD1-3* 0,5 2,0 30
KD2-3* 0,5 2,0 60
KD1-4* 0,5 2,5 30
KD2-4* 0,5 2,5 60
KD1-5 0,5 3,0 30
KD2-5* 0,5 3,0 60
KD1-6 0,5 3,5 30
KD2-6* 0,5 3,5 60
KD1-7 0,5 4,0 30
KD2-7* 0,5 4,0 60

242
 Continuarea tabelului A.3.1.
1 2 3 4 5 6 6
KN KN1-1 0,5 1,0 30
KN2-1* 0,5 1,0 60
KN1-2 0,5 1,5 30
KN2-2* 0,5 1,5 60
KN1-3 0,5 2,0 30
KN2-3* 0,5 2,0 60
KN1-4 0,5 2,5 30
KN2-4* 0,5 2,5 60
KN1-5* 0,5 3,0 30
KN2-5* 0,5 3.0 60
KN1-6* 0,5 3,5 30
KN2-6* 0,5 3,5 60
KN1-7 0,5 4,0 30
KN2-7* 0,5 4,0 60
KN1-8 0,5 4,5 30
KN2-8* 0,5 4,5 60
KN1-9 0,5 5,0 30
KN2-9* 0,5 5,0 60
KN1-10 0,5 5,5 30
KN2-10 0,5 5,5 60
Legendă: variantele hormonale, marcate cu simbolul * - variantele selecte utilizate, în studiile
ulterioare complexe.

243
Tabelul A.3.2. Reactivitatea explantelor carpogene de A. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie de
grupa şi varianta hormonală a MN de bază
Grupele Variantele Intensitatea
hormonale hormonale Calusare % calusării Observaţii
KD KD2-2 65,3 +++ Calus verde, viabil
KD1-3 64,5 ++ Calus verde-crem.
KD2-3 68,8 ++++ Calus verde, viabil
KD1-4 85,9 ++++ Calus verde, viabil
KD2-4 88,6 +++++ Calus verde, viabil
KD1-5 66,8 +++ Calus verde, viabil
KD2-5 75,8 +++ Calus sănătos, viabil
KD1-6 63,6 ++ Calus verde, viabil
KD2-6 64,3 ++ Calus verde, viabil

KN KN1-3 41,1 ++ Calus crem-alb, friabil

KN2-3 43,9 +++ Calus crem-alb, friabil
KN1-4 53,8 ++ Calus violaceu, viabil
KN2-4 54,7 +++ Calus violaceu, viabil
KN1-5 63,3 +++ Calus violaceu, viabil
KN2-5 65,2 ++++ Calus violaceu, viabil
KN1-6 32,5 ++ Calus violaceu, viabil
KN2-6 34,6 +++ Calus violaceu, viabil
KN1-7 29,7 ++ Calus roz-crem, viabil
KN2-7 29,9 +++ Calus roz-crem, viabil
Legendă: intensitatea calusării - + minimă; ++ - relativă; +++ - moderată; ++++ - bună; +++++ -
maximă.

244
Tabelul A.3.3. Acţiunea regimului de lumină şi a grupei hormonale a mediului nutritiv asupra
carpocalusogenezei la A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Varianta Grupa Inducerea Intensitatea Observaţii

regimului de hormonală calusării calusogenez
lumină ei
Fotoperiodism KD a 6-a zi ++++ Calus verde, viabil, cu luciu.
natural
zi/noapte 16/8 KN a 6-a zi +++ Calus violaceu, cu sectoare crem
(martor) şi insuliţe verzi.
Iluminare KD a 5-a zi +++ Iniţial calusogeneză bună, apoi
continuă 1700 diminuează. Calus verde cu
lx sectoare crem, mat.
KN a 5-a zi ++ Calus crem cu sectoare violacee,
mat, friabil.
Obscuritate 1- KD a 6-a zi ++++ Iniţial calus crem, apoi verde,
7 zile, apoi viabil, marginal crem, mat.
fotoperiodism KN a 6-a zi + Calus crem cu insuliţe roz, mat,
zi/noapte 16/8 friabil.
Obscuritate KD a 6-a zi ++ Iniţial calus gri, care după a 14 zi
deplină brunifică.
KN a 6-a zi ++ Iniţial calus gri, care după a 12 zi
brunifică.
Lumină roşie KD a 7-a zi +++ Calus crem, zone mici verzi,
spongios, friabil.
KN a 8-a zi +++ Calus violaceu, viabil.
Raze KD a 4-a zi +++++ Calus verde, viabil, cu luciu.
ultraviolete
KN a 4-a zi +++ Calus violaceu, mat, friabil.

245
 Tabelul A.3.4. Influenţa variantelor hormonale ale MN la subcultivărea carpocalusului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot asupra intensităţii calusării
Varianta Intensitatea calusogenezei
Varinata Intensitatea hormonală
hormonală calusării a mediului Subcultivări Culoarea
iniţială (mg/l) transferat I II III IV V calusului
2,4D(1,0)+K(0,5) + identică + ++ ++ ++ + Verde-cremă
2,4D(1,0)+K(0,5) + 2,4D(2,5)+K(0,5) ++ +++ ++++ ++++ ++++ Verde-cremă
2,4D(1,5)+K(0,5) ++ identică ++ ++ +++ +++ ++ Verde
2,4D(1,5)+K(0,5) ++ 2,4D(2,5)+K(0,5) +++ ++++ ++++ +++++ +++++ Verde
2,4D(2,0)+K(0.5) +++ identică +++ ++++ ++++ ++++ ++++ Verde
2,4D((2,0)+K(0,5) +++ 2,4D(1,0)+K(0,5) ++ ++ ++ ++ + Verde-cremă
2,4D(2,5)+K(0,5) ++++ identică ++++ +++++ +++++ +++++ +++++ Verde
2,4D(2,5)+K(0,5) ++++ 2,4D(1,5)+K(0,5) +++ ++ ++ ++ ++ Verde-cremă
2,4D(3,0)+K(0,5) +++ identică +++ ++++ ++++ ++++ ++++ Cremă-verzui
2,4D(3,5)+K(0,5) +++ identică +++ +++ ++ ++ + Verde-cremă
246

2,4D(4,0)+K(0,5) ++ identică ++ ++ + + + Cremă-verzui

2,4D(2,0)+K(0.5) +++ Identică pentru 2 subcultivări, apoi transferul +++ ++++ +++ ++++ +++ Violacee
pe ANA (3.0 mg/l)+ K(0,5 mg/l)
2,4D(2,5)+K(0,5) ++++ Identică pentru 2 subcultivări, apoi transferul ++++ +++++ ++++ ++++ +++ Violacee
pe ANA (3.0 mg/l)+ K(0,5 mg/l)
2,4D(2,0)+K(0.5) +++ ANA (3.0 mg/l)+ K(0,5 mg/l) +++ +++ +++ ++ ++ Violacee
ANA(1,0)+K(0,5) + identică + + + + + Cremă-albă
ANA(2,0)+K(0,5) ++ identică ++ ++ ++ + + Cremă-albă
ANA(2,5)+K(0,5) ++ identică ++ +++ +++ +++ ++ Violacee
ANA(3,0)+K(0,5) ++ identică ++ +++ ++++ +++ +++ Violacee
ANA(3,0)+K(0,5) ++ 2,4D(2,5)+K(0,5) +++ +++ ++++ ++++ ++++ Verde-roză
ANA(3,5)+K(0,5) ++ identică ++ +++ +++ +++ ++ Violacee
ANA(3,5)+K(0,5) ++ 2,4D(2,5)+K(0,5) +++ +++ ++++ ++++ ++++ Verde-roză
Legendă: intensitatea calusogenezei - + minimă; ++ - relativă; +++ - moderată; ++++ - bună; +++++ - maximă.

246
Tabelul A.3.5. Reactivitatea explantelor carpogene de A.. melanocarpa (Michx.) Elliot în funcţie de
grupa şi varianta hormonală a MN de bază
Grupele Variantele Intensitatea
hormonale hormonale Calusare % calusării Observaţii
B B1-1, B2-1, 0,0 - Necrotizare
B1-2, B2-2
BD BD-1 0,0 - necrotizare
BD-2 18,8 + Calusare incipientă
BD-3 12,6 + Calusare incipientă
BD-4 15,4 + Calusare incipientă
BN BN-1 0,0 necrotizare
BN-2 20,1 + Calusare incipientă
BN-3, BN-4, 0,0 necrotizare
BN-5, BN-6
KD KD1-1 34,6 + Calus alb, incipient, necroză.
KD2-1 42,6 + Calus alb, incipient, necroză.
KD1-2 48,8 ++ Calus verde cu sectoare albe.
KD2-2 65,3 +++ Calus verde, viabil
KD1-3 64,5 ++ Calus verde-crem.
KD2-3 68,8 ++++ Calus verde, viabil
KD1-4 85,9 ++++ Calus verde, viabil
KD2-4 88,6 +++++ Calus verde, viabil
KD1-5 66,8 +++ Calus verde, viabil
KD2-5 75,8 +++ Calus sănătos, viabil
KD1-6 63,6 ++ Calus verde, viabil
KD2-6 64,3 ++ Calus verde, viabil
KD1-7 29,9 ++ Calus crem-alb
KD2-7 45,6 ++ Calus crem-alb
KN KN1-1; KN2-1 0,0 - necrotizare
KN1-2 38,8 + Calus incipient, necrotizare
KN2-2 39,9 + Calus incipient, necrotizare
KN1-3 41,1 ++ Calus crem-alb, friabil
KN2-3 43,9 +++ Calus crem-alb, friabil
KN1-4 53,8 ++ Calus violaceu, viabil
KN2-4 54,7 +++ Calus violaceu, viabil
KN1-5 63,3 +++ Calus violaceu, viabil
KN2-5 65,2 ++++ Calus violaceu, viabil
KN1-6 32,5 ++ Calus violaceu, viabil
KN2-6 34,6 +++ Calus violaceu, viabil
KN1-7 29,7 ++ Calus roz-crem, viabil
KN2-7 29,9 +++ Calus roz-crem, viabil
KN1-8 24,6 + Calus incipient, crem.
KN2-8 25,6 + Calus incipient crem.
KN1-9 9,9 + Calus incipient, necrotizare
KN2-9 11,9 + Calus incipient, necrotizare

Legendă: intensitatea calusării - + minimă; ++ - relativă; +++ - moderată; ++++ - bună; +++++ -
maximă.

247
Tabelul A.3.6. Citoreacţii chimice aplicate pe secţiuni ale carpomaselor pigmentate pentru
identificarea diferitor compuşi chimici
Carpomasa pigmentată
Colorarea şi
Reacţia aplicată expresia Compuşii

Violacee

Crem-

Crem-

Verde
morfologică identificaţi

roză

albă
Soluţie de 1% Colorare în verde- Taninuri. +++ ++ ++ ++
Fe2(SO4)3 în HCl de brun, masa uşor
0,1H granulată în
vacuole.
Soluţie 1% de Masa uşor Taninuri. +++ +++ ++ +
clorură fierică şi granulată, verde-
alăun de fier-amoniu negricioasă.
Soluţie de 5-10% Colorare, Taninuri. ++ ++ + +
K2Cr2O7 sediment negru-
verzui, brun,
aspect granulat.
Acid osmic Sediment negru. Taninuri. +++ ++ ++ +
Soluţie de amoniac Galben, la Flavonoide. +++ +++ ++ +
temperatură –
roşu.
Soluţie alcoolică de Precipitat Flavonoide. +++ ++ ++ ++
acetat de plumb Galben-oranj
Felii de carpomasă + La răcire, jelifică. Pectine. +++ ++ ++ +
65% zaharoză,
fierbere - 40-50 min
Albastru de metilen Violet-albastru Pectine in lamela ++ ++ + +
(mediul neutru sau mijlocie a peretelui
slab acid) celular, spaţiile
intercelulare,
vacuole.
Galben Pectine în lamela ++ ++ + +
Safranină mijlocie a peretelui
celular, spaţiile
intercelulare,
vacuole.
Soluţie de ruteniu Roz Pectine în peretele ++ + + +
(1:500) celuar.
Soluţie de iod Negru-violet Amidon. ++ +++ ++++ ++
iodurat
Soluţie de Cl-Zn-I Galben-oranj Perete celular + + ++ -
lignificat.
Sudan III Roşu Incluziuni lipidice. + + + -

Legendă: Intensitatea reacţiei: + - slabă; ++ - moderată; +++ - bună; ++++ - foarte bună.

248
 Fig. A.3.1. Carpomasă verde obţinută pe MN suplimentat cu 2,5 mg/l de 2,4-D şi 6% de
zaharoză.

Fig. A.3.2. Regiunea mediană a carpocalusului verde, obţinut pe MN, suplimentat cu 2,5 mg/l
de 2,4-D şi 6% zaharoză. Săgeată – centre de celule antocianifere.

249
Fig. A.3.3. Carpomasă crem-roză, generată pe MN de bază, suplimentat cu 4,0 mg/l de ANA
şi 6% de zaharoză

Fig. A.3.4. Secţiune transversală prin carpomasa violacee, cu mici zone de culoare crem-albă.

250
Fig. A.3.5. Secţinune prin carpomasa violacee în faza staţionară de calusogeneză. Centre
proliferative pe perimetrul periferic superior (săgeţi).

Fig. A.3.6. Secţiune transversală prin carpomasa violacee. Altenarea populaţiilor cu

celule cu conţinut diferit.

251
 Fig.A.3.7. Carpomasa crem-roză (viziune generală).

Fig. A.3.8. Populaţii omogene de celule de culoare roză.

252
Fig. A.3.9. Carpomasa crem-albă. Viziune generală.

Fig.A.3.10. Secţiune prin carpomasa crem-albă.

253
 Fig. A.3.11. Secţiune prin carpomasa crem-albă. Reacţie cu soluţie clor-zinc-iod, granule de
amidon (săgeţi).

Fig. A.3.12. Carpomasa crem-albă în faza staţionară a calusogenezei. Partea superioară.

254
Fig. A.3.13. Carpomasa crem-albă în faza staţionară a calusogenezei. Reacţie cu soluţie Lugol.
Granule de amidon.

Fig. A.3.14. Secţiune prin carpomasa verde cu făşie de celule violacee (săgeţi).

255
 Fig. A.3.15. Secţiune prin carpomasa verde cu populaţii de celule crem-albă.

Fig. A.3.16. Carpomasa verde în faza staţionară de calusogeneză. Un fragment din zona
mediană. Reacţie cu soluţie Lugol.

256
 Fig. A.3.17. Carpomasa verde în faza logaritmică de creştere a calusogenezei. Suprafaţa
superioară cu celule meristematice.

Fig. A.3.18.Carpomasa verde în faza staţionară de calusogeneză. Secţiune transversală prin

partea superioară.

257
Fig. A.3.19. Carpomasa verde în faza de senescenţă a calusogenezei. Partea superioară. Reacţie
cu soluţie Lugol.

Fig.A.3.20. Carpomasa verde. Suprafaţa inferioară din celule alungite, răsfirate în mediul
nutritiv. Reacţie cu soluţie Lugol (săgeţi).

258
Anexa 4. Studii biochimice comparate ale fructelor in vivo şi carpomaselor pigmentate in
vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Tabelul A.4.1. Identificarea principalelor grupe de compuşi naturali în soluţiile extractive ale
fructelor in vivo şi carpomaselor pigmentate in vitro de A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Grupe de
Specimenul Soluţia compuşi Procedee şi reacţii Rezultate şi efecte
analizat extractivă naturali chimice aplicate
1 2 3 4 5
Uleiuri volatile Distilare la sec,
organoleptic,
Sudan III +
Substanţe grase Sol.alcoolică 0,5 H KOH +
Cloroformică

Acizi H2SO4 c Inel roşu-violet slab

triterpenici – urme
Clorofile Cloroform şi anhidridă Nuanţă verde
Fructe de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot

acetică
Carotenoide H2SO4 c Culoare albăstruie
Acizi graşi HCl c Opalescenţă
Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj
Taninuri Sol.gelatină 1% Precipitat - ++
Acid acetic 10% + acetat Precipitat negricios
de Pb 10%
Sol. FeCl3 1% Culoare albastră-
negricioasă.Coloraţie
Alcoolică

HCl c + baia de apă brună verde.

Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj , +++

Proantocianidoli 0,5 ml HClk + T0 Roşu-violet - +++
Antociani Modelarea valorii pH Mediul acid – roşu;
alcalin – albastru,
++++
Hidraţi de
carbon: H2SO4 c + sol.alcoolică 1% Coloraţie roşie, ++
Apoasă

oze şi polioze; de timol.

pectine şi Tratarea alcoolică + Culoare albastru-
mucilagii; albastru de toluidină. violet, ++
amidon Soluţie Lugol Culoare albastră, +
Uleiuri volatile Distilare la sec, +
organoleptic
Substanţe grase Sol.alcoolică 0,5 N KOH +
Carpomasa violacee

Cloroformică

Acizi H2SO4 c Inel roşu-violet ,+

triterpenici
Clorofile Cloroform şi anhidridă -
acetică
Carotenoide H2SO4 c Culoare albăstruie,++
Acizi graşi HCl c Opalescenţă
Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj

259
 Continuarea tabelului A.4.1.
Taninuri Sol.gelatină 1% Precipitat - +++
Acid acetic 10% + acetat Precipitat negricios
de Pb 10%.
Sol. FeCl3 1% Culoare albastră-
negricioasă

Alcoolică
HCl c + baia de apă Coloraţie brună
verde
Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj - +++
Proantocianidoli 0,5 ml HClk + T0 Roşu-violet - +++
Antociani Modelarea valorii pH Mediul acid – roşu;
alcalin – albastru,
++++

Hidraţi de
carbon: H2SO4 c + sol.alcoolică 1% Coloraţie roşie, ++
oze şi polioze; de timol.
Apoasă

pectine şi Tratarea alcoolică + Culoare albastră-

mucilagii; albastru de toluidină violet
amidon Soluţie Lugol Culoare albastră, ++

Uleiuri volatile Distilare la sec, +

organoleptic
Substanţe grase Sol.alcoolică 0,5 N KOH +
Cloroformică

Acizi H2SO4 c Inel roşu-violet slab,

triterpenici urme
Clorofile Cloroform şi anhidridă -
acetică
Carotenoide H2SO4 c Culoare albăstră, ++
Acizi graşi HCl c opalescenţă
Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj, +++

Taninuri Sol.gelatină 1% Precipitat, +++

Carpomasa crem-roză

Acid acetic 10% + acetat Precipitat negricios

de Pb 10%
Sol. FeCl3 1% Culoare albastră-
negricioasă
HCl c + baia de apă Coloraţie brună
Alcoolică

verde

Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj - ++

Proantocianidoli 0,5 ml HClk + T0 Roşu-violet - +++

Antociani Prin modelarea valorii pH Mediul acid – roşu;

alcalin – albastru, ++
Hidraţi de Coloraţie roşie - +++
carbon: H2SO4 c + sol.alcoolică 1%
Apoasă

oze şi polioze; de timol. Culoare albastră-

pectine şi Tratarea alcoolică + violet
mucilagii; albastru de toluidină Culoare albastră-
amidon Soluţie Lugol violet, +++

260
 Continuarea tabelului A.4.1.
Uleiuri volatile Distilare la sec, +
determinare organoleptică
Substanţe grase Sol.alcoolică 0,5 N KOH +

Cloroformică
acizi triterpenici H2SO4 c Inel roşu-violet slab,
+
clorofile Cloroform şi anhidridă -
acetică
Carotenoide H2SO4 c Slab-albăstruie, +
Acizi graşi HCl c Opalescenţă
Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj, +

Taninuri Sol.gelatină 1% Precipitat - ++

Acid acetic 10% + acetat Precipitat negricios

de Pb 10%
Carpomasa crem-albă

Sol. FeCl3 1% Culoare

Alcoolică

albastră,negricioasă
HCl c + baia de apă Coloraţie brună
verde
Flavonoide Zn + HCl c Oranj-deschis, +

Proantocianidoli 0,5 ml HClk + T0 Roşu-violet, +++

Antociani Prin modelarea valorii pH +

Hidraţi de H2SO4 c + sol.alcoolică 1% Coloraţie roşie

carbon: de timol. intensă, ++++
- oze şi Tratarea alcoolică +
polioze; albastru de toluidină Culoare albastră-
violet, ++
Apoasă

- pectine şi Soluţie Lugol

mucilagii;

Culoare albastră-
- amidon Soluţie Lugol violet, ++++

Uleiuri volatile Distilare la sec, -

determinare organoleptică
-
Substanţe grase Sol.alcoolică 0,5 N KOH
Carpomasa verde

acizi triterpenici H2SO4 c Inel roşu-violet slab,

Cloroformică

urme
clorofile Cloroform şi anhidridă Culoare verde intens,
acetică +++
Carotenoide H2SO4 c Culoare
albăstruie,++

Acizi graşi HCl c opalescenţă

Flavonoide Zn + HCl c Culoare oranj, ++

261
 Continuarea tabelului A.4.1.
Taninuri Sol.gelatină 1% Precipitat, ++
Acid acetic 10% + acetat Precipitat negricios,

Alcoolică
de Pb 10% ++
Sol. FeCl3 1% Culoare albastră,
negricioasă, ++
HCl c + baia de apă Coloraţie brună
verde
Flavonoide Zn + HCl c Oranj, +
0
Proantocianidoli 0,5 ml HClk + T Roşu-violet ,+++
Antociani Prin modelarea valorii pH Mediul acid – roşu;
alcalin – albastru, +
Hidraţi de H2SO4 c + sol.alcoolică 1% Coloraţie roşie, ++
carbon: de timol.
Apoasă

oze şi polioze; Tratarea alcoolică + Culoare albastră-

pectine şi albastru de toluidină violet, ++
mucilagii;
amidon Soluţie Lugol Albastră, ++
Legendă: Efectele reacţiilor: – absenţă; + slab; ++ moderat; +++ pronunţat; ++++ foarte
pronunţat.

Tabelul A.4.2. Efectele reacţiilor specifice calitative pentru identificarea diferitor grupe
de flavonoide în extractele fructelor şi a carpomaselor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Reacţia Efectele reacţiilor aplicate în extractele alcoolice analizate din:

aplicată Fructe Carpomasă Carpomasă Carpomasă Carpomasa
violacee crem-roză crem-albă verde

Cianidinică Oranj-roşie Oranj-roşie Oranj-roşie Oranj Galben-oranj

Acetat de Pb Sediment roşu Sedimen roşu Galben

Galben Galben pal
Soluţie de Albastru Albastru Albastru
Galben- Galben-
amoniac violet violet albăstrui, la To verzui, la To -
- oranj oranj
Acid azotic Galben la To- Galben la To- Galben la To- Galben Galben
roşietic roşietic roşietic
Soluţie de Galben Galben- Galben- Brun- roşietic brun
vanilină în zmeuriu zmeuriu
HCl
NaOH 5% - Precipitat Precipitat Precipitat Precipitat
în alcool Galben, intens Galben, intens galben galben
etilic
NaOH 10% - Galben, Galben, Galben, Galben,
Acid sulfuric tulbure tulbure tulbure tulbure
concentrat Roşu Oranj Oranj Galben
AlCl3 1% Sediment Sediment Sediment Sediment Sediment
galben galben galben galben galben
În UV Fluorescenţă Fluorescenţă Fluorescenţă Fluorescenţă Fluorescenţă
galben- galben- galben- galbenă galbenă
verzuie verzuie verzuie

262
Tabelul A.4.3.Constituienţii flavonoidici şi spoturile neidentificate pe CSS în fructe şi carpomase

Valoarea
Constituenţi Fluorescenţa Fructe Carpomasele pigmentate

Rf
flavonoidici în UV
Violacee Crem- Crem- Verde
rozî albă
Rutozidă 0,60 Brună + + + + +
Cvercitozidă 0,80 Galben + + + + +
Cvercetol 0,88 Galben- + + + + +
albăstrui
0,43 Albastru- - + + + +
Spoturi neidentificate

violet
0,46 Albastru- - + + + -
verzui
0,72 Galben- - - - - +
verzui
0,70 Brun- + + + + +
cărămiziu
0,84 Brun-deschis - + + + +

Tabelul A.4.4. Constituenţii antocianici în carpomasele şi fructele de A. melanocarpa (Elliot)

Constituenţi Valoarea Fructe Carpomasele pigmentate

antocianici Rf
Violacee Crem-roză Crem-albă Verde
Cianidină 0,40 + + + + +
Pelargonidină 0,56 + + + + +
Spoturi 0,35 - + + + +
neidentificate 0,43 - + + + +
0,45 + + + - -
0,50 + + + - -
0,62 - - - - +
0,72 - + + + -
0,78 - + + + -

Tabelul A.4.5.Compuşii fenilpropanici în carpomasele şi fructele de A. melanocarpa Elliot

Carpomasele pigmentate
Compuşi Valoarea Fructe
Violacee Crem- Crem- Verde
fenilpropanici Rf
roză albă
Acidul cafeic 0,91 + + + + +
Acidul 0,55 + + + + +
clorogenic
Spoturi 0,32 - + + + -
neidentificate 0,42 - - - - +
0,52 - - - - +
0,62 + + + + +
0,73 - + + + +
0,94 - + + + -

263
 Tabelul A.4.6. Screening-ul reacţiilor de identificare a taninurilor în carpomasele in vitro şi fructele de A. melanocarpa (Michx.) Elliot

Nr Specimenele analizate
D/o Reacţii aplicate
Fructele de Aronia Carpomasele calusale pigmentate
melanocarpa (Michx.) Violacee Crem-roz Crem-albă Verde
Elliot e
Generale:
1. Gelatină Opalescenţă Opalescenţă Opalescenţă Opalescenţă Opalescenţă

2. Acid acetic 10%, acetat de Pb Coloraţie zmeurie, roz, Precipitat Precipitat brun- Precipitat slab Precipitat slab
10%, alăuni de Fe sediment brun-negricios pronunţat negricios, gri brun-verzui brun-verzui
negricios/verzui

3. Alăuni de fier + amoniac Coloraţie brună Precipitat brun- Opalescenţă, Opalescenţă Opalescenţă
264

negricios coloraţie negru- verde-gri verde

verde

4. Nitrat de sodiu în mediu acid Coloraţie zmeurie Zmeurie- Culoare roz Culoare roz Culoare roz
cărămizie
pronunţat

5. Clorură de Fe 1%, HCl Precipitat brun-negricios Precipitat Precipitat Precipitat gri Precipitat gri
pronunţat negru- negru-verzui
Specifice: verzui
1. Apă de brom (taninuri Precipitat galben-brun Precipitat galben-Precipitat Precipitat galben- Precipitat
catehice) brun-negricios galben- negricios galben-
2. negricios negricios
Cromat de potasiu în bisulfat Coloraţie roşie brună Coloraţie roşie Coloraţie roşie Coloraţie roşie Coloraţie roşie
de sodiu (taninuri galice) negricioasă negricioasă brună brună

264
 Tabelul A.4.7. Conţinutul polifenolic în fructele uscate de A. melanocarpa (Michx.) Elliot
Nr. Conţinutul polifenolic
d/o (mg/kg ) Autorul, anul
1. 34 210±610 Calalb, 2009
2. 42 210± 540 Kähkönen et al., 2001
4. 6902± 431 Benvenuti et al., 2004
3. 7 849±483 Wu et al., 2006
4. 37 600±865 Hudek et al., 2006
5. 10 637±1110 Jakobek et al., 2007
5. 11 756±796 Skupien et al., 2008

Tabelul A.4.8. Valorile timpilor de retenţie tr (min) şi parametrii dreptei de calibrare a

polifenolilor în calitate de substanţe de referinţă, folosite pentru indentificare, dozare şi detecţie
în UV [331]
Nr.
Polifenolii tr (min) Ecuaţia regresiei liniare
crt.
1 Acid caftaric 2.10 Calitativ

2 Acid gentisic 2.15 Calitativ

3 Acid cafeic 5.6 Calitativ

4 Acid clorogenic 5.6 Calitativ

5 Acid p-cumaric 8.7 A = - 0.325 + 33.23 x

6 Acid ferulic 12.2 A = - 1.016 + 39.55 x

7 Acid sinapic 14.3 A = - 0.236 + 37.10 x

8 Hyperozidă 18.6 A = 0.107 + 19.29 x

9 Isoquercitrină 19.6 A = - 0.273 + 12.97 x

10 Rutină 20.2 A = 0.226 + 13.47 x

11 Miricetol 20.7 A = -0.544 + 26.45 x

12 Fisetină 22.6 A = 0.241 + 19.19 x

13 Quercitrină 23.0 A = 0.047 + 10.69 x

14 Quercetol 26.8 A = -1.152 + 36.32 x

15 Patuletină 28.7 A= - 0.429 + 31.44 x

16 Luteolină 29.1 A = - 0.760 + 28.97 x

17 Kaempferol 31.6 A = - 1.270 + 30.15 x

18 Apigenină 33.1 A = - 0.908 + 20.40 x

Legendă: A – ecuaţia regresiei liniare; x – concentraţia în μgml.

265
 R R
R
OH OH
OH
HO O
HO O
HO O
H

OH O
OH
OH O
OH O

Flavone Favonoli Flavanone

R = H, apigenol R = H, kaemferol R = H, naringetol
R = OH, lutelol R = OH, quercetol R = OH, eriodictiol

R R

R OH OH

OH HO O HO O

HO O H H
OH OH
H H H H
OH OH
OH OH
H
OH O

Dihidroflavonoli Flavan-3-oli Flavan-3,4-dioli

R = H, dihidrokemferol R = H, afzelecol R = H, leucopelargonidol
R = OH, dihidroquercetol R = OH, catecol R = OH, leucocianidol

R
R
OH OH
3 +
OH HO
HO O
4
HO 1 O
4
1
OH
2 O OH
O

Calcone Aurone Antocianidoli

R = H, isoliquiritigenina hispidol R = H, pelargonidol
R = OH, buteina R = OH, cianidol

Fig. A.4.1. Clasificarea flavonoidelor [37].

266
 A. B.

C. D.

E. F.
Fig. A.4.2. Etapele de pregătire a CSS: A – extractele analizate; B – soluţiile etalon; C – sistemul
de cromatografiere; D – uscarea în etuvă; E – pulverizarea în boxă; F – cromatograma
developată.

267
13.0.

11.4

10.9

10.4

9.4

9.1

7.8

6.0

5.6

Rutozida Cvercet Cvercetol Fructe Violacee Crem - Crem-albă Verde

ozida aronie roză

Carpomase pigmentate

Fig. A.4.3. Identificarea flavonoidelor pe CSS în sistemul mobil:

butanol:acid acetic glacial:apă.

268
 Fig. A.4.4. Curba de etalonare a rutozidei

10,5

7,6
Distanţa de parcurgere a fazei

6,6

5,8
mobile

Fig.5.9.
4,7 Identificarea antocianilor în fructele de A.melanocarpa (Michx.) Elliot şi
carpomasele pigmentate prin CSS

4,2

3,7

Cianidina Pelargonidina Fructe Carpomasă Carpomas Carpomasă Carpomasă

de aronie violacee crem- crem-albă verde
roză

Fig. A.4.5. Identificarea antocianilor pe CSS

269
 CO2H CO2H

R H CO OCH 3
3
OH
OH

R = H, Acid p-cumaric Acid sinapilic

R = OH, Acid p-cafeic
R = OCH3, Acid ferulic

HO CO2H

HO
O O
OH

OH
OH

Acid clorogenic

Fig. A.4.6. Structura unor acizi fenilpropanici de tip C6-C3 [37]

270
 12
Distanţa de parcurgere a fazei

11 2 În UV

10.2

8.8

65
În UV
60

În UV

45 În UV

Acid cafeic Acid Fructe de Calus Calus Calus Calus

clorogenic aronie violaceu crem-roz crem- albă verde

Fig. A.4.7. Identificarea compuşilor fenilpropanici pe CSS:1.Rf=0.95 Acid cafeic; 2.Rf=0.91

Spot neidentificat; 3.Rf=0.73 Spot neidentificat; 4.Rf=0.6 Acid clorogenic; 5.Rf=0.5 Spot
neidentificat; 6.Rf=0.41 Spot neidentificat; 7.Rf=0.21 Spot neidentificat.

271
 CO2H CO2H

R H CO OCH 3
3
OH
OH

R = H, Acid p-cumaric Acid sinapic

R = OH, Acid p-cafeic
R = OCH3, Acid ferulic
HO CO2H

OH
HO
O O HO O
OH OH

O galactoza
OH O

OH
OH
Acidul clorogenic Hiperozidă

OH
HO O
OH

O rutinoza (ramnoza - glucoza)

OH O
R

HO O OH
OH
HO O
Rutozidă
O ramnoza
OH O OH
OH O

Quercitrină (quercitozidă) R = H, kaemferol

R = OH, quercetol

Fig. A.4.8. Formulele unor compuşi fenolici, implicaţi în cercetare [37].

272
 Intens.
mAU
1
60

40

20

2
34 5
0

0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

Fig. A.4.9. Cromatograma CLIP- MS a extractului fructelor de A. melanocarpa (Michx.) Elliot:

1 – acid clorogenic; 2 – hiperozida; 3 – izoquercitrina; 4 – rutozida; 5 – quercetolul.

Intens.
mAU 1

60

40

20

2 3 5
4 6
0
0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

Fig. A.4.10. Cromatograma CLIP-MS a extractului metanolic din carpomasa pigmentată

violacee: 1 – acid clorogenic; 2 – hiperozida; 3 – izoquercitrina; 4 – rutozida; 5 – quercetolul.

273
 Intens.
mAU

125

100

75

50

25

2 3 5
4 6
0

0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

Fig. A.4.11. Cromatograma CLIP-MS a extractului metanolic din carpomasa pigmentată crem-
roz:1 – acid clorogenic; 2 – acidul p-cumaric; 3 – hiperozida; 4 – izoquercitrina; 5 – rutozida; 6 –
quercetolul.
Intens.
mAU

150

100

50

2 34 5
0
0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

Fig. A.4.12. Cromatograma CLIP-MS a extractului metanolic din carpomasa pigmentată crem-
albă: 1 – acid clorogenic; 2 – hiperozida; 3 – izoquercitrina; 4 – rutozida; 5 – quercetolul.
Intens.
mAU
60

50

40

30

20

1
10

2 34
0

0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

Fig. A.4.13. Cromatograma CLIP-MS a extractului metanolic din carpomasa pigmentată verde:
1 – acid clorogenic; 2 – hiperozida; 3 – izoquercitrina; 4 – rutozida.

274
 Anexa 5. Particularităţile ultrastructurii celulelor carpomaselor pigmentate in vitro şi
pericapului fructului de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot

Fig.A.5.1. Un fragment al celulei pericarpului fructului de A. melanocarpa (Michx.) Elliot,

x16000.

Fig.A.5.2. Complexul Golgi. Acumulări Fig. A. 5.3. Cloroplast elongat, x14000.

fenolice, x18 600.

275
 Fig.A.5.4. Plastidă cu incluziuni amilacee, lipidice, fenolice, x14 200.

Fig.A.5.5. Plastidă cu incluziuni amilacee, lipidice, fenolice. Perete pecto-celulozic cu

plasmodesme, x16200.

276
Fig.A.5.6. Peretele celular pecto-celulozic. Incluziuni electondense fenolice sferice pe perimetrul
tonoplastului, x12 000.

Fig.A.5.7.Fragment al celulei. Arii citoplasmatice Fig. A.5.8. Fragment al celulei. Cloroplast

rarefiate şi veziculate, x9200. elongat, x9000.

277
 Fig. A.5.9. Făşie fenolică electrondensă pe Fig. A.5.10. Plastidă cu incluziuni:
tonoplast, x17 800. amilacee; lipidice; fenolice, x13 800.

Fig. A.5.11. Plastidă în formă de cupă. Fig. A.5.12. Vezicularea, dezorganizarea,

Ribozomi, x12 500. destrucţia celulară, x 10 200.

278
Fig. A.5.13. Citoplasmă dezorganizată, Fig. A 5.14. Acumulări fenolice în plastidă,
x10 200. pe plasmalemă, în peretele celular, x15 150.

Fig. A.5.15. Citoplasmă veziculată, rarefiată, x10 200.

279
Fig. A.5.16. Nucleu sferic, citoplasmă bogată, Fig.A.5.17. Mitocondrii elongate, x14 200.
x14 200.

Fig.A.5.18. Reticului endoplasmatic, acumulări Fig. A.5.19. Plastidă lenticulară.

fenolice, x 12 800. Incluziuni fenolice pe tonoplast, x14 200.

Fig. A.5.20. Plastida în formă de cupa, Fig. A. 5.21. Plastidă elongată în formă de
x14 200. cupă, x12 800.

280
Fig.A. 5.22. Incluziuni fenolice semisferice Fig.A.5.23. Acumulări fenolice pe
pe tonoplast, x9 200. plasmalemă, x12 000.

Fig.A.5.24. Aglomerări de incluziuni fenolice Fig. A. 5.25. Incluziuni fenolice aforme

în vacuolă, x12 200. în vacuolă şi în citoplasmă, x12 200.

Fig. A. 5.26. Un fragment al citoplasmei Fig. A. 5.27. Reticul endoplasmatic

veziculate, complexul Golgi, x18 000. fragmentat. Acumulări fenolice, x16 120.

281
Fig. A.5.28. Deplierea plasmalemei. Fig. A.5.29. Vacuolizarea celulei. Acumulări
Rarefierea citoplasmei, x12 310. fenolice, x11 000.

Fig. A.5.30. Dezorganizarea şi destrucţia Fig. A. 5.31. Resturi membranice cu acumulări

citoplasmei. Acumulări fenolice, x16 000. fenolice, x14 000.

Fig. A.5.32. Un fragment al citoplasmei Fig.A. 5.33. Plastidă cu incluziuni lipidice,

bogat în organite, x10 200. fenolice, amlilacee, x14 200.

282
Fig.A.5.34. Citoplasmă parietală. Acumulări Fig. A.5.35. Citoplasmă rarefiată. Fragment
fenolice, x11 200. a reticulului endoplasmic, x15 400.

Fig. A.5.36. Mitocondrie elongată cu strangulaţii. Fig.A.5.37. Incluziuni fenolice sferiforme

Acumulări fenolice, x13 200. în vacuolă, x12 400.

Fig. A.5.38. Citoplasmă parietală cu elemente de Fig. A.5.39. Formaţiuni sferiforme

dezorganizare şi destrucţie cu depuneri fenolice. membranice cu acumulări fenolice, x12 600.
Agregate membranice, x13 200.

283
Fig. A.5.40. Citoplasmă redusă cu acumulări Fig. A.5.41. Nucleu ovat cu nucleol,
fenolice, x10 800. x9800.

Fig.A.5.42. Plastide cu acumulări amilacee, Fig. A.5.43. Plastide cu acumulări

fenolice, lipidice, x12 400. amilacee şi lipidice, x12 400.

Fig. A.5.44. Granule de amidon neregulate, Fig. A.5.45. Plastide cu invaginări, x10 200.
x14 800.

284
Fig. A.5.46. Plastide cu diferite incluziuni, Fig. A.5.47. Proteocromoplast, x13 200.
x9 600.

Fig.A.5.48.Plastide cu incluziuni fenolice Fig. A.5.49.Fragmente a RE, plastidă cu

intratilacoidale şi stromatice, x10 200. acumulări amilacee, fenolice, lipidice,
x12 200.

Fig. A.5.50. Dezorganizarea şi destrucţia celulei, x15 200.

285
 Fig. A.5.51. Peretele celular pliat. Acumulări fenolice pe plasmalemă şi în peretele celular,
x12 800.

Fig.A. 5.52. Nucleu sferic, x12 200. Fig. A. 5.53. Nucleu cu invaginări, x15 800.

Fig.A.5.54. Reticul endoplasmatic, Fig. A.5.55. Complexul Golgi, Fig.A.5.56 Acumulări

veziculare, x15 800. x14 200. fenolice intratilacoidale,
. . x14 200.

286
Fig. A.5.57. Un fragment de citoplasmă Fig. A.5.58. Populaţie de mitocondrii
bogată în organite, x14 200. elongate, x14 200.

Fig.A.5.59. Cloroplast Fig. A.5.60. Cloroplast în Fig. A.5.61. Acumulări

în formă de cupă, x formă de cupă, x9 800. fenolice intratilacoidale,
14 200. x14 20

Fig. A.5.62. Acumulări fenolice Fig. A. 5.63. Acumulări fenolice în formă

intratilacoidale şi în stroma plastidei, de semisferă pe tonoplast, x10 200.
x12 400.

287
Anexa 6. Model biotehnologic de obţinere a biomasei frutiere de Aronia melanocarpa
(Michx.) Elliot pe suprafaţa mediilor nutritive semisolide

Recoltarea fructelor Spălarea cu H20 Decuparea

de distilată, apoi cu agent explantului,
A. melanocarpa (Michx.) chimic „Diacid”, timp de constituit din
Elliot donatoare de 7 min şi de 3 ori cu H2O epicarp şi
explant la bidistilată sterilă hipodermă cu
etapa ontomorfogenetică dimensiunile
- 60 zile de la înflorire de 4x4 mm

Carpomasă
Inocularea explantului Obţinerea I subcultivare spongioasă
cu poziţia – incizia calusului de culoare
internă în contact cu primar La a 18 zi verde
MN de bază MS (sfârşitul fazei
(1962), suplimentat cu logaritmice de
2,0 mg/l de 2,4-D şi 0,5 Durata creştere), pe
mg/l K şi 60g/l perioadei de MN identic
zaharoză, pH–5,7; caluspgeneză –
fotoperiodism normal 40 zile
(16 ore zi/8 ore
noapte), temperatura
22-24oC III subcultivare
[Brevet MD 3763]
La a 18 zi (sfârşitul
fazei logaritmice de Carpomasă
II creştere), pe MN spongioasă
subcultivare suplimentat cu 3,5 de culoare
Carpomasă mg/l ANA, 0,5 mg/l K verde-
La a 18 zi (sfârşitul spongioasă şi 60 g/l zaharoză, pH violacee
fazei logaritmice de de culoare – 5,7;
creştere), pe verde Fotoperiodism normal
MN identic (16 ore zi/8 ore
noapte), temperatura
22-24oC [Brevet MD
IV subcultivare
V
subcultivare Carpomasă
La a 18 zi Carpomasă de
(sfârşitul fazei de culoare culoare
logaritmice violacee La a 18 zi (sfârşitul
fazei logaritmice violacee,
de creştere), cu conţinut
pe MN identic de creştere),
pe MN identic fenolic sporit

Fig. A.6.1. Schema modelului biotehnologic de obţinere a carpomasei pigmentate cu

conţinut fenolic din fructele de Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot

288
Anexa 7. Brevetele MD3763, MD83, MD46

289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
Anexa 8. Acte de implementare

308
309
310
 DECLARAŢIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII

Subsemnatul, declar pe răspundere personală că materialele prezentate în teză de doctor

habilitat sunt rezultatul propriilor cercetări şi realizări ştiinţifice. Conştienzizez că, în caz contrar,
urmează să suport consecinţele în conformitate cu legislaţia în vigoare.

Numele de famile, prenumele Calalb Tatiana

Semnătura
Data

311
 CURRICULUM VITAE al AUTORULUI

Numele: Calalb
Prenumele: Tatiana
Data, luna, anul naşterii: 1.06.1958
Locul naşterii: s.Chircăeşti, raionul Căuşeni, Republica Moldova

Studii: Şcoala medie (1965-1975); Institutul Pedagogic de Stat „T. Şevcenko”, or. Tiraspol,
Facultatea Biologie şi Chimie (1975-1980); Doctorantura la specialitatea 03.00.05-Botanica în
Laboratorul de Structură şi Ultrastructură a Plantelor, Institutul de Fiziologie a Plantelor a
AŞM (1980-1983); Susţinerea tezei „Адаптивные изменения структур листового аппарата
растений кукурузы в условиях произрастания на склонах” şi obţinerea gradului ştiinţific de
doctor în biologie la specialiatatea 03.00.05-Botanica (1986); obţinerea titlului ştiinţifico-
didactic de conferenţiar universitar (docent) în botanică (2004).
Stagii: Şcoala tânărului biolog, Institutul de Botanică a Academiei de Ştiinţe din Tadjikistan,
Duşanbe, (iunie, 1988); Schimb de experienţă didactică şi cercetare, Catedra de Botanică
farmaceutică, Universitatea de Medicină şi Farmacie ”Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca (mai,
2009); Stagiu lingvistic de însuşire a limbii engleze, English Educational Centre „Crotalus”
(2003-2004); Stagiu Menajamentul Standardului Calităţii, Sistemul de Menajament al Calităţii,
USMF „Nicolae Testemiţanu” (2009-2010).
Activitatea profesională: Specialist-citolog (1983-1986), cercetător ştiinţific (1986-1994),
cercetător ştiinţific superior (1994-1998) în Laboratorul de Structură şi Ultrastructură a
Plantelor al Institutului de Fiziologie a Plantelor a AŞM; conferenţiar universitar, şef Catedră de
Chimie farmaceutică şi Farmacognozie, Departamentul Medicină, ULIM (1998-2002);
conferenţiar universitar (2002-2010), Sef Studii (2005-2010) la Catedra de Farmacognozie şi
Botanică farmaceutică USMF” Nicolae Testemiţanu”; prin cumul, conferenţiar universitar la
Catedra Biologie, Universitatea Academiei de Ştiinţe a Moldovei (2008-2010) şi cercetător
ştiinţific coordonator în Laboratorul Genetica şi Fiziologia Rezistenţei Plantelor a Institutului de
Genetică şi Fiziologie a Plantelor AŞM (2009-2010).
Domeniile de activitate ştiinţifică: Morfologia, anatomia şi ultrastructura plantelor; studii
farmacognostice la plante medicinale, biotehnologia culturilor celulare şi tisulare in vitro la
plante medicinale.

312
Participări la foruri ştiinţifice: La Conferinţele a IV-VI-a Republicane de Microscopie
Electronică (Chişinău, 1986; 1998); Simpozioane Unionale pe Ultrastructura Plantelor
(Chişinău, 1986; Moscova, Kiev, 1988); Conferinţe Unionale pe Anatomia Plantelor (Leningrad,
1884; Vladivostoc, 1990); Conferinţa Unională „Теоретическая и прикладная карпология”
(Chişinău, 1989); The 14th International Congress on Electron Microscopy, (Mexico, 1998);
Conferinţa Ştiinţifico-didactică Anuală, ULIM (Chişinău, 1998, 1999, 2000, 2002);
Mеждународный симпозиум “Нетрадиционное растeниеводство. Экология и здоровье”,
(Симферополь, 2002, 2003, 2004); Congresul al XII Naţional de Farmacie, (Bucureşti, 2002);
Congresul II, „Fiziologia şi Biochimia plantelor la început de mileniu: realizări şi pespective”,
(Chişinău, 2002); Conferinţa „Ziua medicamentului” (Chişinău, 2003); Conferinţa „Societăţii de
medici şi naturalişti din Iaşi” (Iaşi, 2003); The 8th National Symposium „Medicinal plants,
present and perspetives”, (Piatra Neamţ, 2003, 2006); Conferinţa Ştiinţifică Anuală a USMF
„Nicolae Testemiţanu”, (Chişinău, 2003, 2004, 2005, 2007, 2008, 2009,); The 12th Conference
„Eurasia Environment” (Istanbul, 2005); Международная научная конференция
„Теоретические и прикладные аспекты Биохимии и Биотехнологии растений”, (Минск,
2008); The International Congress “The XXXth Balcan Medical Week”, (Chişinău, 2008);
Conferinţa Naţională cu participare Internaţională “Probleme actuale ale geneticii, fiziologiei şi
ameliorării plantelor”, (Chişinău, 2008).
Lucrări ştiinţifice publicate: Autor şi coautor la 100 de titluri ştiinţifice, inclusiv 5 monografii,
60 articole ştiinţifice; 40 materiale ale comunicărilor ştiinţifice, 1 manual „Botanica
farmaceutică”; 2 compendii pentru lucrări de laborator la botanica farmaceutică şi 3 brevete de
invenţii.
Participări la proiecte ştiinţifice naţionale şi internaţionale: Proiect ştiinţific naţional
„Implementarea plantelor medicinale (autohtone, alohtone) valoroase şi obţinerea substanţelor
biologic active din ele, necesare producerii preparatelor medicamentoase vegetale” (2004-
2005); Proiect instituţional „Elaborarea, studierea, producerea şi standardizarea
medicamentelor autohtone din materia primă locală”, cod 06-420.039A (2006-2010); Proiect
instituţional „Studii privind elaborarea şi implementarea medicamentelor destinate optimizării
farmacoterapiei bazată pe observaţii” (2011-2014).
Premii şi menţiuni: Premiul Prezidiului Academiei de Ştiinţe a RSS Moldoveneşti pentru ciclul
de lucrări „Principiile transformărilor structurale la plante”, (1989).
Date de contact: or. Chişinău, telefon domiciliu 333367, telefon mobil 069311407.
E-mail: tatianacalalb@yahoo.com

313