ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI

INSTITUTUL DE GENETICĂ ŞI FIZIOLOGIE A PLANTELOR

Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 582.998.2:575.222.78:004.421

LEVIŢCHI ALEXEI

ESTIMAREA HETEROZISULUI
LA FLOAREA-SOARELUI (Helianthus annuus L.)
ÎN BAZA ALGORITMILOR INFORMAŢIONALI

03.00.15 – Genetică

Autoreferat
al tezei de doctor în biologie

Chişinău 2008
Teza a fost elaborată în Laboratorul Securitate biologică (LSB), Catedra
Biologie Vegetală a Universităţii de Stat din Moldova

Conducător ştiinţific:

Doctor habilitat în biologie,

DUCA Maria profesor universitar,
membru corespondent al AŞM

Referenţi oficiali:

Doctor habilitat în biologie,

Galina LUPAŞCU
conferenţiar cercetător

Doctor habilitat în biologie,

Alexandru ROTARU
conferenţiar cercetător

Susţinerea va avea loc la 27 martie 2008, ora 1200, în şedinţa Consiliului

Ştiinţific Specializat DH 10.03.00.15 – 05, din cadrul Institutului de
Genetică şi Fiziologie a Plantelor, adresa:
MD 2002, str. Pădurii, 20, Chişinău. Tel.: (373 22) 77 04 47, 66 04 24
Fax: (373 22) 55 61 80, E-mail: igcanc@mail.md

Teza de doctor poate fi consultată la biblioteca Institutului de Genetică şi

Fiziologie a Plantelor şi pe pagina web a CNAA
(www.cnaa.acad.md).

Autoreferatul a fost expediat la „21” februarie 2008

Secretar Ştiinţific
al Consiliului Ştiinţific
Specializat, Dr., COTENCO Eugenia
Conducător ştiinţific,
Dr. hab., prof. univ., DUCA Maria

Autor LEVIŢCHI Alexei

2
 INTRODUCERE

Actualitatea temei. Floarea-soarelui este una dintre culturile oleaginoase de

bază din Republica Moldova. Conform datelor statistice Food and Agriculture
Organization (FAO), Moldova ocupă locul 15 după exportul de seminţe de floarea-
soarelui, iar exportul de ulei se situează pe locul doi în lista mărfurilor comercializate
de ea (FAO, 2004). Anual, pe câmpurile agricole ale republicii se cultivă în jur de 260
mii ha de floarea-soarelui, însămânţate cu seminţe F1 de producţie autohtonă (500-600
t) şi de import (400-500 t). Mai mult ca atât, Republica Moldova exportă între 500-
1000 t de seminţe de floarea-soarelui hibridă în Rusia, Belarus şi Ucraina. Astfel,
importul/exportul anual al materialului semincer de elită constituie cca 1500-1800 t,
fiecare 25 t dintre care necesită a fi apreciate după calitate şi certificate.
Obţinerea hibrizilor de perspectivă prin ameliorarea plantelor de cultură, bazată
pe metode tradiţionale (Siminel, 1998; Vrânceanu, 2000) sau prin aplicarea ingineriei
genetice (Tracy, 2003) presupune, în egală măsură, aplicarea unor tehnici eficiente,
care asigură evaluarea materialului iniţial, utilizat în programele de selecţie, inclusiv
estimarea polimorfismului genetic al populaţiilor studiate, determinarea omogenităţii
liniilor consangvinizate şi a gradului de hibridare în F1.
Scopul cercetării. În contextul acestor constatări, ce vin să argumenteze
actualitatea temei investigate, s-a propus drept scop de a perfecta şi implementa unele
metode de cercetare fundamentală în vederea aplicării acestora în selecţie şi
producerea de seminţe şi de a elabora conceptul unui sistem informaţional de asistenţă
în cercetarea şi ameliorarea florii-soarelui.
Obiective de cercetare:
• Identificarea unor indici morfofiziologici şi moleculari, care se asociază cu
vigoarea hibridă şi gradul de hibridare în scopul utilizării acestora în prognozarea
efectului de heterozis şi în selectarea liniilor performante;
• Determinarea calităţii biologice a liniilor parentale şi a formelor hibride în
baza caracterelor cantitative, a spectrului polipeptidic al heliantininei şi aplicând
tehnica PCR cu primeri specifici şi primeri SSR;
• Formularea conceptului structural şi funcţional al sistemului informaţional
biologic (SIB) de asistenţă a procesului de ameliorare.
Noutatea ştiinţifică. În rezultatul analizei dispersionale şi corelative au fost
identificaţi indicii morfofiziologici şi cercetaţi cei biochimici, care corelează cu
productivitatea seminţelor şi au fost evidenţiaţi factorii asociaţi cu heterozisul.
Analiza electroforetică a heliantininei a demonstrat variabilitatea polipeptidelor
la nivelul lanţului β (Mr 20 – 25 kDa) al subunităţii C, precum şi la nivelul
componentului stabil la disociere (58 şi 61 kDa). În baza acestei variabilităţi s-au
identificat spectrele polipeptidice standard fiecărui genotip inclus în cercetare, a căror
reprezentativitate a determinat puritatea biologică a genotipurilor.
A fost elaborată metodologia de evaluare a gradului de hibridare în F1, cu
utilizarea marcherilor SSR şi de evidenţiere a nivelului de sterilitate la liniile materne
ASC prin tehnica PCR.
Importanţa practică. A fost formulat conceptul Sistemului Informaţional Biologic

3
(SIB), care reprezintă un instrument util, cu vaste posibilităţi de rezoluţie, ce facilitează
cercetările teoretice şi practice în biologie şi cele ce ţin de ameliorarea plantelor.
A fost elaborat un procedeu de extragere şi separare electroforetică a
heliantininei dintr-o singură seminţă pentru estimarea purităţii biologice (brevet de
invenţie nr. 3324) şi gradului de hibridare. S-au evidenţiat o serie de marcheri SSR
care pot fi utili pentru estimarea gradului de hibridare, dar şi pentru genotiparea
materialului ameliorativ utilizat în selecţia la heterozis.
Aprobarea rezultatelor. Rezultatele investigaţiilor au fost prezentate la:
Conferinţa Ştiinţifică Internaţională „Interconexiuni în contextul globalizării” (2004,
Chişinău), Conferinţa Ştiinţifică Internaţională în memoria prof. V.A. Zolotarevschi
“Ecuaţii Integrale şi Modelarea Problemelor Aplicative” (2006, Chişinău), Conferinţa
„Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate pe cunoaştere” (2006,
USM), a 55-a Expoziţie Internaţională a Inovaţiilor, Cercetărilor şi Tehnologiilor Noi
EUREKA (2006, Brussels), Seminarul ”Perspectives and Opportunities for Youth in
Informational Technologies in Moldova” (2007, Chişinău), Salonul Internaţional al
Invenţiilor, Cercetării Ştiinţifice şi Transferului Tehnologic ECOINVENT 2007, Ed.
XIII (Iaşi, România), Expoziţia de Invenţii Ştiinţifice INFOINVENT-2007.
Publicaţii. Rezultatele investigaţiilor sunt reflectate în 11 lucrări ştiinţifice
publicate şi 1 brevet de invenţie la tema de cercetare.
Structura şi volumul lucrării. Teza este expusă pe 112 pagini, inclusiv 26
tabele şi 52 figuri şi constă din 6 capitole şi 272 surse bibliografice.
Cuvinte cheie: floarea-soarelui, ameliorare, heliantinină, heterozis, SIB.

CAPITOLUL 2. OBIECTUL DE STUDIU ŞI METODE DE CERCETARE

Obiectul de studiu. În calitate de material pentru cercetare au servit hibrizi
Drofa, Valentino, Xenia şi şase linii consangvinizate.
Materialul semincer a fost oferit de T. Rotaru, dr. hab. în agricultură (CCŞ
AMG-MAGROSELECT SRL, or. Soroca).
Experienţele au fost efectuate pe câmpurile experimentale ale CCŞ AMG-
MAGROSELECT şi în laboratarele Securitatea Biologică şi Biochimia Plantelor,
USM. Au fost determinate înălţimea plantei, diametrul inflorescenţei şi numărul de
ramificaţii pe tulpină (30 plante pentru fiecare genotip), masa seminţei, masa miezului,
masa cojii, lungimea seminţei şi lăţimea seminţei (100 seminţe pentru fiecare genotip).
Analiza ADN-ului s-au realizat pe plantule etiolate, germinate timp de 4 zile în
termostat, la 25oC pentru testarea nivelului de sterilitate şi pe plantule la faza
vegetativă de două frunze adevărate – pentru efectuarea analizei SSR-PCR.
Metode de cercetare. Pentru realizarea obiectivelor propuse a fost utilizată
metoda de izolare a heliantininei şi analiza lor electroforetică (Laemmli, 1970), de
izolare a ADN-ului cu DNA-zol (Gibco BRL) şi CTAB (Sambrook şi al., 2001),
electroforeza acizilor nucleici (Sambrook şi al., 2001) şi tehnica PCR în baza primerilor
SSR (Brunel, 1994) şi a primerilor specifici pentru gena orfH522 (Duca, Port, 2006).
Prelucrarea statistică a inclus estimarea unor indici statistici generali, analiza
dispersională şi corelativă, determinarea coeficienţilor de parcurs, calcularea distanţei
Mahalanobis şi a parametrilor selecţiei (Доспехов, 1985; Лакин, 1991; Смиряев и

4
др., 1992; Statistica 6.0 User Manual, 2005). La prelucrarea rezultatelor experimentale
au fost utilizate o serie de programe: MS Excel XP, Statistica 6.0, Adobe Photoshop
CS2, CorelDRAW 12, ImageJ 1.37v, Densitogram Builder 1.0, Cadifra UML Editor
1.3. Sistemul SIB a fost elaborat cu aportul tehnologiei informaţionale avansate .NET
Framework (Corporaţia Microsoft). În calitate de sistem de gestiune a bazelor de date
a fost utilizat Microsoft SQL Server, iar structura şi funcţiile acestuia fiind reprezentate
prin aplicarea Cadifra UML Editor 1.3.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

Cercetările efectuate în cadrul tezei s-au axat pe două direcţii de bază:

• optimizarea unor tehnici de biologie moleculară, în scopul aplicării acestora
pentru ameliorarea plantelor de cultură;
• aplicarea diferitelor metode matematice în analiza datelor morfofiziologice cu
includerea lor ulterioară într-un sistem informaţional pentru formarea bazei de date,
automatizarea procesului de apreciere a calităţii biologice a materialului ameliorativ,
selectarea liniilor performante, însoţite de prognoza efectului de heterozis.

CAPITOLUL 3. STUDIEREA POLIMORFISMULUI GENETIC ÎN BAZA

SPECTRULUI DE HELIANTININĂ

Heliantinina, proteina de rezervă majoră a florii-soarelui, este reprezentată de o

globulină oligomeră cu masa moleculară de 300-305 kDa (Schwenke şi al., 1979;
Dalgararrondo şi al., 1984), care în condiţii denaturante se separă în polipeptide de 20-
40 kDa, la nivelul cărora poate fi pus în evidenţă polimorfismul sau uniformitatea
genotipică (Анисимова, Гаврилюк, 1989).

Elaborarea procedeului de extragere a heliantininei

În contextul bazei tehnico-materiale existente în Republica Moldova, în

controlul programelor de selecţie şi seminologie, amelioratorii pot utiliza cu succes
proteinele de rezervă pentru confirmarea purităţii biologice a liniilor şi a gradului de
hibridare. Însă, imperativul aplicării comerciale a diferitelor metode de identificare şi
tipizare a genotipurilor este maximalizarea eficienţei şi simplităţii acestora, precum şi
a nivelului de reproductibilitate a rezultatelor.
Reieşind din aceste considerente ne-am propus să adaptăm la condiţiile
laboratorului metoda de izolare şi separare electroforetică a heliantininei, drept suport
servind lucrările efectuate anterior (Анисимова, 1987; Анисимова, Гаврилюк, 1989;
Конарев и др., 1993; Vaintraub, Lapteva, 1994; Artâcov, 2003) prin combinarea
diferitelor etape ale acestora.
Varietatea de metode elaborate pentru izolarea heliantininei este limitată de:
• calitatea extractului,
• denaturarea proteinei şi insolubilitatea ei,
• obţinerea extractului proteic dintr-o singură sămânţă în cantităţi reduse.

5
 M Hel Pornind de la prelucrarea materialului
67 vegetal, aplicarea proprietăţilor fizico-chimice în
A purificarea extractului primar, selectarea gradului
B optimal de salifiere pentru separarea heliantininei
C şi precipitarea extractului proteic s-a reuşit
43 elaborarea procedeului eficient de extragere a
acestei dintr-o singură sămânţă care prezintă un şir
Figura 1. Subunităţile de avantaje: asigură extragerea unei cantităţi mai
identificate ale heliantininei. mari de proteină (cca 1 mg), este mai rapidă (1-2
M – marcherul, kDa; Hel – profilul zile) şi mai econoamă, comparativ cu altă metodă
heliantininei; A, B, C - subunităţi
(Анисимова, 1987).
Analiza electroforetică în gel de poliacrilamidă (GPAA) de 14% (comparativ
cu gelul de 12,5 şi 16,0%) la o intensitate de 25-26 mA timp de 4-4,5 ore permite
separarea cea mai relevantă a spectrelor polipeptidice ale heliantininei şi evidenţierea
adecvată a polimorfismului proteic.
Astfel, în condiţii native are loc disocierea incompletă a heliantininei, însă clar
sunt puse în evidenţă trei subunităţi ale acesteia, notate în literatura prin A (Mr 57,0
kDa), B (Mr 55,0 kDa) şi C (Mr 51,5 kDa) (fig. 1, fig. 2a), iar în condiţii denaturante
în gel au fost constatate 19-26 polipeptide, specifice proteinelor de rezervă ale florii-
soarelui (fig. 2b). Profiluri similare ale componentelor de bază ale heliantininei au fost
depistate la toate genotipurile estimate.

Polimorfismul polipeptidic al heliantininei

la diverse genotipuri de floarea-soarelui

Utilizarea proteinelor de rezervă în calitate de marcheri proteici a fost propusă

şi dezvoltată de academicianul V.G. Konarev, fiind pe larg aplicată pentru cercetări
fundamentale ce ţin de evoluţie, filogenie şi chemosistematică, precum şi în cercetări
aplicative cum ar fi paşaportizarea liniilor, soiurilor, hibrizilor şi altor genotipuri din
colecţia VIR (Конарев, 1983; Конарев, 1993).
Rezultatele obţinute în cadrul cercetărilor noastre au demonstrat, de rând cu
identificarea specificităţii diferitelor genotipuri, şi posibilitatea aplicării acestui grup
de proteine pentru evaluarea purităţii genetice a liniilor de floarea-soarelui.
Analiza celor nouă genotipuri, după spectrele polipeptidice ale heliantininei,
extrase în baza metodei elaborate, în condiţii denaturante, a pus în evidenţă anumite
particularităţi determinate de genotipul plantei. În total, au fost determinate 28 benzi
polipeptidice diferite, cu Mr 13,9 – 84,3 kDa, care constituie trei grupuri distincte ale
celor trei subunităţi specifice pentru heliantinină (fig. 3):
• componenta nedisociabilă şi polipeptide minore;
• componentele lanţului α (4 polipeptide, 30-37 kDa) şi polipeptide minore;
• componentele lanţului β (3-5 polipeptide 21-24 kDa) şi polipeptide minore.
Deosebirile dintre genotipurile analizate s-au remarcat preponderent la nivelul
componentei stabile la disocierea heliantininei, care a manifestat două tipuri de
polipeptide – cu Mr 58 şi 61 kDa. Genotipurile familiei Drofa, precum şi genotipul

6
patern Xenia şi Valentino F1 s-au caracterizat prin polipeptida cu masa moleculară mai
mică, pe când toate celelalte genotipuri – prin polipeptida cu Mr mai mare.
La nivelul lanţului α a fost relevată o uniformitate deplină a polipeptidelor
pentru toate cele nouă genotipuri analizate, iar la nivelul polipeptidelor lanţului β –
doar genotipul patern al hibridului Valentino s-a caracterizat prin prezenţa a trei
polipeptide, în timp ce celelalte genotipuri au pus în evidenţă câte cinci polipeptide.

a b
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

93,0
67,0 A Gr. I
43,0
B Gr. II
30,0
C
Gr. III
20,1

14,4
Figura 2. Analiza electroforetică a extractelor de heliantinină a diferitelor
genotipuri de floarea-soarelui.
M – marcherul maselor moleculare, kDa; a – condiţii native; b – condiţii denaturante; 1 – Xenia ♀; 2 –
Xenia ♂; 3 – Xenia F1; 4 – Valentino ♀; 5 – Valentino ♂; 6 – Valentino F1; 7 – Drofa ♀; 8 – Drofa ♂;
9 – Drofa F1. A, B, C – subunităţile heliantininei

Generalizând rezultatele obţinute şi pornind de la datele din literatură, putem

considera că heliantinina, deşi se caracterizează printr-un înalt grad de conservatism
(Chesnokov, Shutov, 2004), întrucât demonstrează o identitate absolută şi stabilitate
doar la nivelul polipeptidelor din cadrul subunităţilor A şi B, determinate respectiv de
genele Hel A şi Hel B (Анисимова, 2005), la nivelul polipeptidelor din cadrul
subunităţii C, determinate de gena Hel C, manifestă o variabilitate genotip dependentă,
care poate fi utilizată în paşaportizarea genotipurilor de floarea-soarelui şi în
aprecierea purităţii genetice a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor.

Estimarea purităţii genetice în baza heliantininei

la floarea-soarelui

Calitatea biologică a seminţelor de floarea-soarelui, exprimată prin

omogenitatea proteinelor de rezervă, s-a apreciat în baza a 900 spectre electroforetice a
heliantininei, izolată din 100 de seminţe individuale, constatându-se spectrele tipice şi
atipice pentru fiecare genotip cercetat (fig. 3).
Spectrele tipice includ toate componentele heliantininei, descrise în spectrul-

7
 ♀ ♂ F1

DROFA

T At T T T At
♀ ♂ F1

VALENTINO

T At T T T T
♀ ♂ F1

XENIA

T At T T T At
Figura 3. Spectre tipice (T) şi atipice (At) la nouă genotipuri de floarea-soarelui.
Săgeţile indică prezenţa benzilor minore.
etalon (Анисимова, 1987; Анисимова, Гаврилюк, 1989), iar spectrele atipice conţin
polipeptide cu frecvenţa mai joasă de 10% (Конарев, 1993) şi se caracterizează prin
scăderea intensităţii componentelor de bază sau chiar prin lipsa lor.
Reieşind din numărul total de polipeptide, poziţia şi frecvenţa lor, numărul
polipeptidelor de bază şi al celor minore, s-a constatat că puritatea materialului
biologic variază în limitele de 76 – 100% (tab. 1).
Tabelul 1
Evaluarea purităţii genetice în baza spectrului polipeptidic al heliantininei

Numărul de seminţe Puritatea

analizate cu spectrul tipic cu spectrul atipic biologică, %
♀ 67 60 7 89,6
DROFA ♂ 71 71 0 100,0
F1 91 79 12 86,8
♀ 82 62 20 75,6
VALENTINO ♂ 90 90 0 100,0
F1 67 67 0 100,0
♀ 91 88 3 96,7
XENIA ♂ 86 86 0 100,0
F1 68 64 4 94,1

8
 Cel mai redus nivel al omogenităţii s-a constatat la genotipurile materne şi
cele hibride Drofa şi Xenia, care variază de la cca 76 până la 97%. Toate genotipurile
paterne au manifestat un singur tip de spectru polipeptidic al heliantininei şi s-au
caracterizat prin omogenitate de 100%.

CAPITOLUL 4. UNELE ASPECTE ALE ESTIMĂRII CALITĂŢII FLORII-

SOARELUI PRIN METODELE BIOLOGIEI MOLECULARE

Ameliorarea plantelor de cultură, asistată de marcheri moleculari asigură

eficienţă şi rapiditate în realizarea programelor de selecţie. Rezultatele vizează
estimarea gradului de sterilitate împreună cu evaluarea calităţii biologice a seminţelor
şi caracterizarea genotipurilor de floarea-soarelui în baza secvenţelor minisatelite,
utilizând tehnicile de biologie moleculară, combinate cu testările de câmp.

Estimarea gradului de sterilitate la liniile materne

Androsterilitatea reprezintă o caracteristică larg răspândită în regnul vegetal,

fiind identificată la peste 150 de specii (Horn, Friedt, 1998) şi constituie incapacitatea
plantelor de a produce polen funcţional – rezultat al blocării procesului de
microsporogeneză. Astăzi la floarea-soarelui sunt cunoscute peste 60 surse de
sterilitate citoplasmatică masculină (Ispas, 2002; Serieys, 1991), însă majoritatea
hibrizilor sunt creaţi în baza ASC de tipul PET, descoperită de Leclerq (1966).
Valorificarea altor surse de ASC este limitată de stabilitatea manifestării
androsterilităţii în descendenţă şi în condiţii variabile de mediu, precum şi posibilitatea
estimării rapide a nivelului de sterilitate.
Deci, implementarea unor metode eficiente de apreciere a gradului de sterilitate
şi selectare a indivizilor sterili dintr-un eşantion de seminţe ar permite diversificarea
surselor de ASC, explorate în crearea hibrizilor F1 şi controlul gradului de sterilitate la
plantele liniei materne.
Utilizarea tehnicii RAPD pentru testarea genotipurilor parentale, în general
(Chenuil, 2006) şi a celor feminine cu ASC, în special, bazată pe un set de mai mulţi
primeri (Indian Council for Agricultural Research, www.icar.delhi.nic.in) nu a primit o
largă răspândire printre amelioratori, întrucât posedă reproductibilitate joasă (Henry,
2001). De aceea, s-a propus să se adapteze metoda PCR cu primeri specifici pentru gena
mitocondrială orfH522 cu scopul de a determina gradul de sterilitate la liniile materne.
În cadrul cercetărilor, la linia cu ASC şi la hibridul de prima generaţie, a fost
identificată o singură secvenţă cu mărimea de 321 pb, care reprezintă produsul de
amplificare a genei androsterilităţii cu primerii selectaţi.
Rezultatele obţinute au scos în evidenţă că ampliconii daţi se întâlnesc în toate
seminţele analizate doar la linia maternă a hibridului Xenia, relevând un nivel
performant de sterilitate a acesteia. Celelalte două linii materne analizate au prezentat
un amestec de plante fertile şi sterile, forma maternă a hibridului Drofa manifestând
ampliconii respectiv în 30 de probe din cele 33 analizate, iar Valentino – în 22 din cele
28 de probe analizate.

9
 Ampliconii 321 pb au fost identificaţi şi la genotipurile hibride, care au servit în
calitate de martor pozitiv şi care fiind creaţi în baza sistemului ASC-Rf, demonstrează
atât prezenţa genei orfH522, transmisă de la forma maternă, cât şi rolul funcţional al
genei Rf la nivel de expresie a acesteia (fig. 4).

0,5
0,3 321pb
A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0,5
0,3
321pb
B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0,5
0,3 321pb
C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 4. Electroforeza în gel de agaroză 1,5% a ampliconilor.
Xenia (A) ♀- 1-14; F1-15; ♂-16; Drofa (B) ♀- 1-11; F1-12; ♂-13; Valentino (C) ♀- 1-9; F1-10; ♂-11.

Rezultatele obţinute au permis determinarea gradului de sterilitate; fiind

comparate cu rezultatele testărilor în câmp, acestea au demonstrat un grad de sterilitate
între 71 şi 96 % pentru liniile cercetate.

Aplicarea secvenţelor minisatelite în estimarea variabilităţii genotipurilor de

floarea-soarelui

Secvenţele simple repetitive (SSR) reprezintă marcheri moleculari înalt

specifici şi pot servi la identificarea purităţii liniilor şi a gradului de hibridare, primele
cercetări de utilizare a minisateliţilor pentru identificarea soiurilor de floarea-soarelui
fiind efectuate de Brunel (Brunel, 1994).
Variaţiile microsatelite la hibridul Valentino şi formele lui parentale au fost
evidenţiate prin analiza SSR cu 19 perechi de primeri cu o localizare exactă, selectaţi
dintr-un grup de 48. Locii SSR identificaţi au demonstrat prevalarea repetiţiilor
dinucleotide (şapte cazuri), fiind determinate, de asemenea, şi repetiţii mono- (patru
cazuri), tri- (un caz), tetranucleotidice (patru cazuri) şi combinate (tab. 2).
Nivelul polimorfismului acestora a fost de 89,5%, deoarece 17 din cei 19 loci
analizaţi au relevat un nivel variabil de polimorfism (2-12 alele), iar ceilalţi 2 loci
(ORS158 şi ORS166) au fost monomorfi. În total s-au pus în evidenţă 83 alele SSR,
iar numărul de alele detectat per locus a variat între 1 (ORS158 şi ORS166) şi 12
(ORS70), cu o valoare medie de 4,3 alele per locus. Cele mai multe alele au fost
evidenţiate pentru grupa de linkage 9 având o valoare medie de 5,2.
Rezultatele obţinute au demonstrat prezenţa unor alele noi pentru marcherii
locilor ORS70, ORS78, ORS123, ORS135, ORS176, ORS188, ORS261.
Valoarea medie a parametrului Polymorphic Information Content (PIC), ce
caracterizează polimorfismului, pentru fiecare locus a fost de 0,59, cea mai mare, de
0,88, fiind la ORS204 şi cea mai joasă, de 0,34 – la ORS123.
10
 Tabelul 2
Caracteristica locilor microsateliţi investigaţi
Lungimea, pb Numărul alelelor
Grupa de
Locusul Repetiţia în genotipurile în genotipurile PIC
linkage în specii în specii
analizate analizate
ORS31 (AAG) 16 282-307 250-300 7 5 0,79
ORS53 (T) 1 438-483 450-510 6 4 0,82
ORS70 (CTT) 8 125-185 125-185 5 12 0,57
ORS78 (AAG) 9 162-174 160-172 4 8 0,72
ORS123 (TC) 12 158-184 150-180 3 4 0,34
ORS134 (AC) 3 299-301 209-301 2 2 0,48
ORS135 (AC) (CA) 14 183-189 185-190 2 5 0,42
ORS158 (CA) 9 253-259 260 3 1 0,46
ORS163 (CA) (CA) 7 380-395 380-395 4 3 0,58
ORS166 (AC) 8 333-375 340 7 1 0,72
ORS176 (TG) 9 453-479 430-480 4 6 0,76
ORS188 (GT) 9 119-167 115-160 3 8 0,62
ORS203 (AC) (CA) (CA) 17 188-271 255-275 5 5 0,64
ORS204 (GT) 17 294-320 280-300 8 4 0,88
ORS216 (CT)(TC)(TC) 15 145-184 145-170 4 3 0,54
ORS240 (GCG) 5 253-267 250-270 3 2 0,70
ORS254 (TACA) 15 543-599 550-580 17 2 0,76
ORS258 (CT)(CA) 9 319-340 315-340 6 4 0,46
ORS261 (GGT)(CG) 5 201-207 190-200 2 4 ―

Studiul secvenţelor microsatelite la nivelul genotipului hibrid Valentino şi a

formelor lui parentale a stabilit modul de moştenire dominant (locii ORS123 şi
ORS163), co-dominant (ORS53, ORS176, ORS188, ORS203, ORS204, ORS240,
ORS254) şi mixt al marcherilor SSR (tab. 3).
Genotipul matern a fost caracterizat prin 46 alele, cei mai polimorfi fiind locii
ORS70 (8 alele) şi ORS188 (6 alele). Doi marcheri (ORS163 şi ORS261) au
manifestat prezenţa alelelor nule, frecvenţa acestora fiind de cca 4%. Şapte loci au
relevat doar o singură alelă, însă nici un locus nu a fost specific.
Forma paternă a hibridului Valentino s-a caracterizat prin 47 alele ale locilor
SSR. Locusul ORS123 nu a fost depistat. Cel mai mare număr de alele a fost
evidenţiat pentru locusul ORS78. Genotipul patern s-a caracterizat prin şase loci
monoalelici (forma maternă - 7), fără o anumită specificitate pentru linia dată.
La hibridul de prima generaţie au fost puse în evidenţă 73 alele. Cei mai
polimorfi loci – ORS78 şi ORS188 – au demonstrat câte 8 alele, iar locii ORS134,
ORS158, ORS166 s-au caracterizat prin prezenţa unei singure alele, numărul locilor
monoalelici fiind mic, comparativ cu formele parentale (7 la ♀ şi 6 – la ♂). Alelele
nule lipsesc.
Numărul mai mare de alele evidenţiate la genotipul hibrid este determinat de
manifestarea combinată a transmiterii prin dominanţă, co-dominanţă sau modalitate
combinată a locilor cercetaţi. Astfel, locusul ORS188 este unul dintre cei mai
polimorfi loci la forma maternă, iar ORS78 – la forma paternă, ambii loci fiind cei mai
polimorfi şi la genotipul hibrid.

11
 Tabelul 3
Variabilitatea locilor SSR depistaţi în cadrul familiei Valentino
Genotip Genotip Genotip Genotip
Primer Alela Primer Alela Primer Alela Primer Alela
♀ ♂ F1 ♀ ♂ F1 ♀ ♂ F1 ♀ ♂ F1
1 + + + 1 + + + 1 + + 4 + +
ORS203
2 + + 2 + + + ORS163 2 + + 5 + +
ORS31 3 + + 3 + + 3 + + 1 + + +
4 + + 4 + + ORS166 1 + + + 2 + +
ORS78 ORS204
5 + + 5 + + 1 + + 3 + +
1 + + 6 + + + 2 + + 4 + +
2 + + 7 + + + 3 + + 1 + +
ORS53 ORS176
3 + + 8 + + 4 + + ORS216 2 + + +
4 + + 1 + + 5 + + 3 + +
1 + 2 + + 6 + + 1 + +
ORS123 ORS240
2 + 3 + + 1 + + 2 + +
3 + 4 + + 2 + + 1 + +
ORS254
4 + 1 + 3 + + 2 + +
ORS134
5 + 2 + + 4 + + 1 + +
ORS188
6 + 1 + + 5 + + 2 + + +
ORS70 ORS258
7 + 2 + + 6 + + 3 + + +
8 + ORS135 3 + + 7 + + 4 + + +
9 + + 4 + + 8 + + 1 + +
10 + + 5 + 1 + + 2 + +
ORS261
11 + + ORS158 1 + + + ORS203 2 + + 3 +
12 + + 3 + + 4 +

CAPITOLUL 5. VARIABILITATEA PARAMETRILOR MORFOLOGICI LA

DIFERITE GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI

Capacitatea de evidenţiere a indicilor de estimare a efectului de heterozis se

bazează pe aplicarea variatelor metode statistice şi modele matematice:
• a priori cu posibilitatea de prognoză a fenomenului dat în combinaţii variate
dintre formele parentale sau
• a posteriori – prin valorificarea datelor referitoare la diverse familii de
culturi agricole şi evidenţierea asocierilor cu manifestarea vigorii hibride.
Utilizarea diferitelor metodologii de apreciere a polimorfismului genetic la
nivel fenotipic şi includerea acestora într-un sistem informaţional biologic va deschide
perspective în exploatarea fenomenului de heterozis.

Puritatea biologică a diferitelor genotipuri de floarea-soarelui în baza

indicilor morfologici

Calitatea biologică reprezintă un indice important atât în ameliorarea, cât şi în

comercializarea soiurilor şi hibrizilor de culturi agricole. Estimarea purităţii seminţelor la
liniile parentale (seminţe de bază) şi la hibrizii F1 (seminţe certificate) este importantă
pentru certificarea loturilor de seminţe. Conform MAA-ISCSMS (www.iscsms.ro),
12
puritatea fizică minimală trebuie să fie 98%. Normele de certificare a seminţelor de
floarea-soarelui în Franţa (GNIS, www.gnis.fr) solicită un nivel de puritate varietală –
cel puţin 99% pentru seminţele de bază şi 95% – pentru cele comercializate.
Analiza statistică a diferiţilor indici cantitativi ai seminţelor la cele 9 genotipuri
de floarea-soarelui, inclusiv masa seminţei, masa miezului, masa cojii, lungimea şi
lăţimea seminţei în conformitate cu încadrarea valorilor estimate în eşantionul general
(criteriul Student), a permis de a constata că puritatea biologică a materialului analizat
variază în limitele 98-100%, hibridul Valentino caracterizându-se prin cel mai înalt
nivel de omogenitate (tab. 4).
Rezultatele demonstrează că seminţele celor trei hibrizi, precum şi a liniilor
parentale, cu excepţia liniei ♀ a hibridului Xenia, corespund cerinţelor înaintate de
standardele internaţionale.
Tabelul 4
Valorile purităţii biologice a genotipurilor de floarea-soarelui
Indexul genotipului ♀ ♂ F1
DROFA
Puritatea biologică, % 99,2 99,0 99,8
VALENTINO
Puritatea biologică, % 98,8 99,2 100
XENIA
Puritatea biologică, % 98,4 100 98

Similaritatea diferiţilor indici în estimarea efectului de heterozis

Distanţa genetică (DG) dintre diferite genotipuri reprezintă un criteriu de estimare

a variabilităţii şi un indice efectiv în selectarea formelor parentale pentru obţinerea
hibrizilor înalt productivi, întrucât DG corelează pozitiv şi puternic cu performanţa
hibridă (Melchinger, 1999; Mohammadi, Prasanna, 2003, Duca şi al., 2005). Estimarea
DG a fost efectuată în baza calculului distanţei Mahalanobis (la evaluarea parametrilor
morfologici) şi în baza similarităţii genetice (la analiza polimorfismului proteic).
Clasificarea genotipurilor analizate în baza parametrilor cantitativi ai seminţei,
exprimată prin distanţa Mahalanobis, a demonstrat că cele nouă genotipuri s-au clasat
în 6 grupuri distincte, trei dintre care s-au separat solitar (fig. 5a).
Astfel, hibridul Xenia se caracterizează prin nivelul maxim de asemănare cu
linia paternă a hibridului Xenia, ambele fiind distanţate de forma maternă a acestui.
Valentino F1 posedă asemănare cu linia maternă a hibridului Drofa. Genotipurile
parentale ale hibridului Valentino se deosebesc semnificativ de hibrid, fiind cele mai
distanţate între ele. Genotipul hibrid Drofa s-a clasat într-o grupă cu linia maternă a
hibridului Xenia, în timp ce genotipul ♂ a hibridului Drofa a format o grupă aparte, iar
cel matern se află în alt cluster. De menţionat, că, grupându-se în clustere diferite,
hibrizii nu au manifestat similaritate, fapt ce pune în evidenţă specificitatea acestora.
Estimarea coeficientului de similaritate în baza numărului şi prezenţei/absenţei
polipeptidelor în spectrele determinate (fig. 5b) a permis să punem în evidenţă trei
grupe de genotipuri. Prima grupă include liniile parentale a hibridului Drofa şi forma
♂ a hibridului Xenia.
13
 a b
Drofa matern
Drofa m Drofa matern
Drofa matern

Valentino hibrid
Valentino F1 Drofa patern
Drofa patern

Xenia patern
Xenia p Xenia patern
Xenia patern

Xenia Xenia
hibridF1 Drofa Drofa
hibridF1

Drofa patern
Drofa p XeniaXenia
matern
matern

Drofa Drofa
hibrid
F 1 Xenia Xenia
hibrid F1

Xenia m Valentino matern

Xenia matern Valentino matern
Valentino patern
ValentinoValentino
matern m
Valentino patern
ValentinoValentino
paternp Valentino hibrid
Valentino F1

38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Distanţa
Distan ta estimată
estimata Distanţa
Distanta estimată
estimata
Figura 5. Dendrograma variabilităţii genotipurilor de floarea-soarelui elaborată
în baza parametrilor morfologici (a) şi spectrului polipeptidic al heliantininei (b)
Cea de-a doua este alcătuită de formele hibride Drofa şi Xenia şi de linia ♀ a
hibridului Xenia. Grupa a treia corespunde familiei Valentino, care se distinge puternic
de celelalte genotipuri.
Compararea rezultatelor clusterizării în baza parametrilor morfologici şi în baza
spectrului polipeptidic al heliantininei demonstrează că genotipurile parentale ale
hibridului Valentino în ambele cazuri se situează separat de alte familii. Hibridul dat
după parametrii săi morfologici se aseamănă cu forma ♀ a hibridului Drofa. S-a
demonstrat şi o anumită asemănare dintre Drofa F1 şi forma maternă a hibridului
Xenia – atât în baza parametrilor morfologici, cât şi în baza spectrului heliantininei,
care în ambele cazuri au fost membrii unei grupe. Separarea genotipurilor parentale a
hibridului Xenia în diferite grupe a fost relevată în ambele cazuri de clasificare.
Evaluarea performanţei hibrizilor, efectuată în baza distanţei Mahalanobis
între genotipurile parentale, a clasat genotipurile hibride în strictă concordanţă cu
valoarea productivităţii acestora (Valentino – 29 chintale/ha, Drofa – 25 chintale/ha,
Xenia – 21 chintale/ha) (Rotaru, 2007).

Aspecte privind estimarea şi prognoza efectului de heterozis

Asocierea indicilor variabilităţii cu heterozisul. Analiza indicilor morfologici

cantitativi ai seminţelor a permis evidenţierea diferitelor aspecte variaţionale şi
funcţionale dintre parametrii care se caracterizează prin asimetria graficelor de
distribuţie. Semnele asimetriilor, corespunzătoare genotipurilor parentale şi hibride,
constatate doar pentru parametrii masa seminţei şi masa miezului, sunt similare.
Formele maternă şi hibridă în cadrul familiilor se caracterizează prin acelaşi semn al
asimetriei, pe când linia paternă manifesta semnul opus (fig. 6). Astfel, genotipurile
matern şi hibrid ale familiilor Valentino şi Drofa posedă asimetrie negativă, fapt ce
relevă o tendinţă spre valori mai mari ale masei seminţelor, iar cel patern – asimetrie
pozitivă. În cadrul familiei Xenia a fost constatată o situaţie inversă.
Aceste date demonstrează, pe de o parte, influenţa puternică a liniei materne în
manifestarea caracterelor respective la hibrizi, iar, pe de altă parte – asocierea
distribuţiei asimetrice negative cu heterozisul.
Generalizând rezultatele analizei dispersionale (criteriul Fisher), a fost

14
 90 80 90

80 80
70
70 70
60
60 60
50

Nr. de obs .

Nr. de obs.
Nr. de obs.
50 50
40
40 40
30
30 30

20 20
20

10 10 10
0 0 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Masa seminţei, g
Masa semintei, g Masa
Masaseminţei,
semintei, g g MasaMasa
seminţei,
semintei, g
g
45
100 60
40

35 50
80
30
40

Nr. de obs.
Nr. de obs.
Nr. de obs.
60 25

20 30
40
15
20
10
20
10
5

0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 5 15 25 35 45 55 65 75 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Masa miezului, g
Masa miezului, g
MasaMasamiezului,
miezului, g
g MasaMasa
miezului,
miezului, g
g

DROFA VALENTINO XENIA

Figura 6. Caracterul distribuţiei parametrilor Masa seminţei şi Masa miezului la

hibrizii F1 şi formele lui parentale.
determinată, în baza similarităţilor dintre valorile medii şi dispersiile parametrilor
respectivi, influenţa genotipurilor parentale asupra formei hibride, legităţi specifice
fiind notate doar pentru lăţimea seminţei şi masa cojii.
La hibridul Valentino şi formele lui parentale s-a stabilit că valoarea medie şi
dispersia masei cojii la hibridul F1 este determinată de influenţa genotipului patern, iar
valoarea medie a lăţimii seminţei – de genotipul matern, pe când a dispersiei – de
acţiunea combinată a ambilor părinţi.
Pentru hibrizii Drofa şi Xenia şi liniile sale parentale, valoarea medie şi
dispersia pentru ambii parametri este influenţată de genotipul matern, cu excepţia
dispersiei la Drofa F1, unde este constatată o influenţă intermediară a ambilor părinţi.
Asociaţia indicilor corelativi cu heterozisul. Analiza corelativă a parametrilor
analizaţi la formele hibride a atestat cea mai puternică relaţie pozitivă a masei miezului
(r=0,96) cu productivitatea hibrizilor. Înălţimea plantei (r=0,84), lungimea seminţei
(r=0,83) şi masa seminţei (r=0,80) de asemenea corelează puternic şi pozitiv cu
productivitatea. Diametrul inflorescenţei corelează negativ cu productivitatea (r=-
0,95). Un grad mediu de corelare a productivităţii s-a manifestat cu lăţimea seminţei şi
masa cojii (0,61 şi, respectiv, 0,38).
Productivitatea hibrizilor F1 corelează puternic cu masei miezului (r=0,87) şi
lungimea seminţei (r=0,93), mediu – cu masa seminţei (r=0,65) şi slab – cu lăţimea
seminţei şi masa cojii (0,10 şi, respectiv, 0,29) a formelor materne. Înălţimea plantei
genotipurilor ASC manifestă o corelare pozitivă joasă (r=0,18), iar diametrul
inflorescenţei – negativă joasă (r=-0,19) cu productivitatea formelor hibride.
Spre deosebire de formele materne, liniile paterne au manifestat corelări
puternice a celor cinci parametri ai seminţei şi a înălţimii plantei cu productivitatea
hibrizilor, care au variat de la r=-0,76, pentru lungimea seminţei, până la r=-0,99,
pentru lăţimea seminţei. Diametrul inflorescenţei a corelat mediu pozitiv (r=0,64), iar
numărul de ramificaţii – slab pozitiv (r=0,2) cu productivitatea hibrizilor.

15
 Coeficienţii de corelare între indicii cercetaţi, în cadrul familiilor analizate a
permis să punem în evidenţă anumite asocieri specifice în raport cu productivitatea
(fig. 7).

VALENTINO
MsxLu
♀ MsxLă F1
MsxMc
MsxMc LuxLă ♂
LuxMc
McxMm LuxMm
LuxMc McxMm

DROFA
MsxLu
♀ MsxLă F1
MsxMc
MsxMc LuxLă ♂
McxMm LuxMm
LuxMc
LuxMc McxMm

XENIA
MsxLu
♀ MsxLă F1
MsxMc
MsxMc LuxLă ♂
McxMm LuxMm
LuxMc
LuxMc McxMm

Figura 7. Nivelul corelaţiei în dependenţă de productivitatea hibrizilor cercetaţi.

Ms – Masa seminţei, Lu – Lungimea seminţei, Lă – Lăţimea seminţei, Mc – Masa cojii, Mm – Masa
miezului. - lipsa corelaţiei; - corelaţie slabă; - corelaţie medie; - corelaţie
puternică.
Deosebiri relevante între hibrizii cu productivitate diferită s-au constatat la
nivelul corelaţiilor dintre masa seminţei şi masa cojii, lungimea seminţei şi lăţimea
seminţei, lungimea seminţei şi masa cojii. Astfel, Valentino F1 (cel mai productiv) s-a
caracterizat prin corelare puternică pentru prima pereche de parametri, lipsa corelaţiei
pentru cea de-a doua şi corelare slabă pentru ultima, iar Xenia F1 (cu cea mai joasă
productivitate) a manifestat un grad mediu de corelare pentru cei trei perechi de
parametri. Hibridul Drofa se caracterizează prin corelare similară cu forma hibridă
Valentino pentru prima pereche de parametri, iar pentru celelalte două – cu Xenia F1,
fapt ce reflectă şi poziţia intermediară a acestui hibrid privind productivitatea.
Corelaţiile puse în evidenţă permit estimarea efectului de heterozis, dat fiind
faptul că toate corelaţiile observate au fost semnificative.

CAPITOLUL 6. APLICAREA TEHNOLOGIILOR INFORMAŢIONALE

ÎN CERCETARE ŞI SELECŢIE

Biologia contemporană se află în continuă dezvoltare datorită relaţiilor

16
interdisciplinare şi implicării metodelor şi tehnologiilor din diverse ramuri ale ştiinţei
în explicarea mecanismelor şi funcţiilor vitale. Volumul în creştere al informaţiei din
domeniul biologiei necesită a fi analizat şi sistematizat, lucru care poate fi realizat prin
aplicarea Tehnologiilor Informaţionale.
Produsul program SIB elaborat permite prelucrarea datelor stocate pe un
calculator plasat la distanţă şi conectat într-o reţea locală. În sistemul SIB realizarea
interfeţei utilizatorului final şi prelucrarea datelor are loc cu aportul tehnologiei
informaţionale avansate .NET Framework (Corporaţia MICROSOFT). În calitate de
sistem de gestiune a bazelor de date este utilizat Microsoft SQL Server 2000.
Baza de date (BD) include parametrii:
• morfologici (masa seminţei, masa cojii, masa miezului, lungimea seminţei,
lăţimea seminţei, înălţimea plantei, diametrul inflorescenţei);
• biochimici (heliantinina);
• moleculari (amplificarea genei orfH522, SSR markeri).
BD a sistemului SIB este normalizată până la forma a doua, ce reprezintă de
fapt un compromis între simplicitatea reprezentării datelor şi gradul de redundanţă a
bazei de date. Această formă normalizată solicită, ca datele în toate coloanele non-
cheie să fie complet dependente de cheia primară a tabelei.
Baza de date propusă (fig. 8) reprezintă un model de Sistem informaţional
suport (SIS), care poate fi modificată şi completată la solicitarea biologilor şi
amelioratorilor în funcţie de destinaţie şi aspectele de cercetare şi poate fi utilizată
separat sau în complex cu SIB.
Baza de date
Parametrii morfologici Parametrii Parametrii
Masa seminţei biochimici moleculari
Lungimea seminţei Heliantinina Locii SSR amplificaţi
Masa miezului
Lăţimea seminţei
Masa cojii
Înălţimea plantei Ampliconii genei
Diametrul inflorescenţei orfH522

Figura 8. Structura bazei de date din cadrul SIB.

Sistemul SIB este compus din două componente: sistemul client-server cu baza
de date şi aplicaţia client. SIB dispune de o singură bază de date, care poate fi accesată
de aplicaţiile client, plasate pe diferite calculatoare din reţeaua locală, ce conferă
sistemului următoarele avantaje:
• stocarea informaţiilor într-un singur loc;
• prelucrarea datelor la distanţă;
• reducerea costului de menţinere a sistemului;
• flexibilitatea sistemului;
• mobilitatea sistemului.
SIB include şi un subsistem funcţional – Sistem Suport pentru asistarea
Deciziei (SSD) (fig. 9), care prin aplicarea criteriilor, evaluate în cercetările
fundamentale sub diferite aspecte (morfologic, biochimic, genetic), permite estimarea
efectului de heterozis în mod direct, prin:

17
• indicii MPH şi BPH;
• gradul de hibridare în baza locilor SSR
şi indirect, prin determinarea:
• caracterului variaţiei parametrilor la formele parentale şi influenţei lor asupra
manifestării parametrilor respectivi la genotipurile hibride;
• coeficienţilor de corelare seminţei dintre parametrii estimaţi în condiţii de câmp
la formele parentale şi cele hibride;
• funcţiei de calitate şi distanţei Mahalanobis dintre formele parentale;
• gradului de puritate în baza parametrilor morfologici ai seminţei şi în baza
spectrului polipeptidic al heliantininei;
• distanţei genetice în baza similarităţii genetice;
• gradului de sterilitate în baza primerilor specifici pentru gena mitocondrială
orfH522.
DATE PROCESARE REZULTATE

Clasificarea
Măsurări a parametrilor Funcţii de Clusterizarea
morfologici, fiziologici,
estimare Estimarea

Prelucrarea
biochimici

statistică
indicilor
Imaginile gelurilor MPH, BPH; Puritatea
electroforetice a Distanţa biologică
parametrilor biochimici Mahalanobis;
(heliantinina) sau Procesarea Gradul de
moleculari (locii imaginilor DG; sterilitate
amplificaţi prin SSR- SG; Gradul de
PCR) FQ hibridare

Figura 9. Tehnologia prelucrării datelor experimentului biologic.

Capacităţile SIB asigură estimarea automatizată a tuturor acestor indici, care
pot fi utilizaţi în procesul de ameliorare pentru prognozarea efectelor dorite şi
evaluarea succesului unui program de selecţie. Astfel, proprietăţile unui sistem
inteligent cu structura şi componentele utilizate în construcţia SIB asigură o dezvoltare
şi acumulare rapidă a materialului faptologic şi permite aplicarea variatelor modalităţi
de prelucrare a lui, elaborarea şi soluţionarea modelelor matematice asupra unor
observaţii biologice, dar şi pronosticarea valorii plantelor în ameliorare.
Sistemul SIB poate deveni un sistem universal de administrare, stocare şi
analiză a rezultatelor procesului de ameliorare a plantelor de cultură. Facilitarea
etapelor de prelucrarea a datelor, compararea acestora cu cele deja existente în baza de
date şi, în special, a etapei de luare a deciziei va permite economisirea timpului şi
resurselor financiare şi umane alocate pentru cercetările biologice. Modelele
matematice cu care operează sistemul vor permite pronosticarea productivităţii
hibrizilor şi estimarea nivelului de manifestare a heterozisului la hibrizii generaţiei F1
în baza criteriilor, asocierilor şi instrumentelor care au fost elaborate şi adaptate la cele
trei familii de floarea-soarelui.

18
 SINTEZA REZULTATELOR
Cercetările efectuate în cadrul lucrării au permis să identificăm o serie de
indici morfo-fiziologici şi moleculari, care se asociază cu vigoarea hibridă şi gradul de
hibridare. Metodologiile elaborate au demonstrat un grad înalt de rezoluţie şi claritate,
fiind recomandate pentru utilizare la diferite etape ale programelor de selecţie. În baza
cercetărilor a fost creat un Sistem Informaţional Biologic, care serveşte drept sistem
suport de decizii în estimarea calităţilor biologice a materialului ameliorativ, inclusiv a
polimorfismului genetic, purităţii liniilor parentale, gradului de sterilitate a liniilor
materne, gradului de hibridare etc. în evaluarea vigorii hibride şi efectului de
heterozis.
CONCLUZII

1. Investigaţiile morfologice şi genetico-moleculare ale diferiţilor indici cantitativi

au demonstrat posibilitatea aplicării tehnicilor de cercetare fundamentală şi a
tehnologiilor informaţionale în selecţia şi seminologia florii-soarelui, precum şi în
prognoza efectului de heterozis, contribuind la facilitarea şi eficientizarea diferitelor
etape ale acestor procese.
2. A fost elaborat un procedeu de extragere a heliantininei, mai econom în timp, în
resurse financiare şi umane, care permite izolarea unei cantităţi mai mari de proteine şi s-
a demonstrat că proteinele de rezervă, la nivelul variabilităţii polipeptidelor subunităţii C,
pot fi utilizate cu succes în estimarea purităţii biologice a seminţelor.
3. În baza analizei electroforetice a heliantininei şi a variabilităţii spectrelor
electroforetice la nivelul componentelor lanţului β (Mr 20-25 kDa) şi la nivelul
componentului stabil la disociere (58 şi 61 kDa) s-au identificat spectrele polipeptidice
standard pentru fiecare genotip inclus în cercetare, a căror reprezentativitate a determinat
puritatea biologică a genotipurilor analizate.
4. S-a constatat că particularităţile specifice ale seminţelor şi plantelor relevă
elocvent puritatea biologică a materialului ameliorativ, iar analiza corelativă
demonstrează că indicii masa seminţei, masa miezului, lungimea seminţei, înălţimea
plantei şi diametrul inflorescenţei în combinare cu valoarea distanţei Mahalanobis între
genotipurile parentale, constituie indici relevanţi, care pot fi utilizaţi pentru prognozarea
efectului de heterozis. A fost demonstrată influenţa genotipurilor parentale asupra naturii
asimetrice de distribuţie a masei seminţei şi masei miezului şi asupra variaţiilor
parametrilor lăţimea seminţei şi masa cojii în legătură cu productivitatea hibrizilor.
5. Puritatea biologică a genotipurilor a variat în limitele 76-100%, cel mai înalt
nivel de puritate fiind constatat la liniile paterne (100%), iar cel mai redus nivel – la
genotipul matern Valentino. Puritatea hibrizilor a variat în limitele 87-100%. Puritatea
biologică, estimată în baza indicilor morfofiziologici, care a fost de 98-100%, manifestă
legităţile generale, confirmate la analiza electroforetică a heliantininei.
6. S-a demonstrat că şapte dintre cei 19 primeri SSR utilizaţi în cercetare se
moştenesc co-dominant şi pot servi nu doar pentru genotiparea liniilor consangvinizate şi
a formelor hibride, ci şi la estimarea gradului de hibridare, iar primerii specifici pentru
gena orfH522 pot fi utilizaţi în controlul nivelului de sterilitate la liniile cu ASC.

19
 7. Sistemul Informaţional Biologic elaborat serveşte drept sistem suport de decizii
în estimarea calităţilor biologice ale materialului ameliorativ, inclusiv a: polimorfismului
genetic, purităţii liniilor parentale, gradului de sterilitate a liniilor materne, gradului de
hibridare etc. în evaluarea creşterii vigorii hibride.

RECOMANDĂRI
Pentru stabilirea calităţii materialului semincier a liniilor de floarea-soarelui
se propune procedeul de extragere a heliantininei dintr-o singură seminţă şi de
estimare a purităţii biologice.
Metodele bazate pe aplicarea tehnicii PCR cu utilizarea primerilor specifici
pentru gena orfH522 şi a celor SSR sunt propuse pentru estimarea gradului de
sterilitate şi, respectiv, a gradului de hibridare.
Strategia de prelucrare statistică a parametrilor morfologici se recomandă
pentru estimarea directă şi indirectă a productivităţii seminţelor şi manifestării
heterozisului la floarea-soarelui.
Sistemul Informaţional Biologic elaborat este oferit amelioratorilor în calitate
de sistem suport pentru automatizarea parţială a etapelor de estimare şi control a
materialului ameliorativ, precum şi pentru estimarea şi prognozarea efectului de
heterozis la floarea-soarelui.

20
 LISTA PUBLICAŢIILOR

Articole recenzate
1. Leviţchi A. Informatizarea şi globalizarea în ştiinţă. Conferinţa Internaţională Ştiinţifică
dedicată a 10 ani de la fondarea Facultăţii de Relaţii Internaţionale, Ştiinţe Politice şi
Administrative Interconexiuni în contextul globalizării, 20-21 Noiembrie, 2004, Chişinau,
p. 186-189
2. Leviţchi A. Aspectele prognozării heterozisului la floarea-soarelui. Lucrările Ştiinţifice ale
Simpozionului Ştiinţific Internaţional, Universitatea Agrară de Stat din Moldova, vol. 13,
AGRONOMIE, Chişinău, 2005, p. 131-134
3. Duca M., Glijin A., Port. A., Leviţchi A. Studiul manifestării heterozisului la floarea-
soarelui în baza unor parametri biochimici şi fiziologici. Analele Ştiinţifice ale Universităţii
de Stat din Moldova, Ştiinţe chimico-biologice, Chişinău, 2005, p. 337-341
4. Leviţchi A. Analiza corelativă a unor indici biochimici şi fiziologici la floarea-soarelui.
Analele Ştiinţifice ale Universităţii de Stat din Moldova, Ştiinţe chimico-biologice,
Chişinău, 2005, p. 350-353
5. Leviţchi A., Palade E., Nichitina C. Perspective de modelare a creşterii pentru
pronosticarea fenomenului de heterozis. Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2007, nr. 1,
p.88-91
6. Duca M., Leviţchi A., Rotaru T. Posibilităţi de estimare a purităţii genetice la floarea-
soarelui. Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2007, nr. 7, p. 62-67
7. Duca M., Port A., Leviţchi A., Rotaru T. Aspecte privind estimarea gradului de sterilitate a
liniilor de floarea-soarelui. Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, 2007, nr. 7, p. 54-61
8. Duca M., Lapteva N., Leviţchi A. Elaborarea procedeului de extragere a heliantininei din
seminţele de floarea-soarelui. Studia Universitatis, Ştiinţe ale naturii, nr. 7, 2007 p. 50-53

Articole la conferinţele ştiinţifice

9. Căpăţână Gh., Duca M., Leviţchi A., Podduchin V. Sisteme informaţionale în biologie.
Conferinţa Ştiinţifică Internaţională în memori profesorului universitar V.A. Zolotarevschi
“Ecuaţii Integrale şi Modelarea Problemelor Applicative”, Chişinau, Republica Moldova,
20-25 iunie, 2006, p. 256-258

Teze la conferinţe ştiinţifice

10. Duca M., Căpăţână Gh., Leviţchi A., Podduchin V. Sistem inteligent de asistenţă a unei
clase de experimente în biologie. Rezumatele comunicărilor de la Conferinţa Ştiinţifică
internaţională cu genericul “Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate
pe cunoaştere” dedicată jubileului de 60 ani ai Universităţii de Stat din Moldova, 28
Septembrie, Chişinau, 2006, p. 23-24
11. Leviţchi A., Palade E., Ţurcan E., Culicov A., Popistaş E. Determinarea purităţii genetice a
liniilor de floarea-soarelui. Rezumatele comunicărilor de la Conferinţa Ştiinţifică
internaţională cu genericul “Învăţământul superior şi cercetarea – piloni ai societăţii bazate
pe cunoaştere” dedicată jubileului de 60 ani ai Universităţii de Stat din Moldova, 28
Septembrie, Chişinau, 2006, p. 265-266

BREVET DE INVENŢII
1. M.Duca, A.Leviţchi, N.Lapteva, A.Căpăţână. Metoda de determinare a purităţii genetice
a florii-soarelui. Cerere de brevet nr. A20060194 din 21.07.2006; Hotărâre de acordare nr.
5087 din 2007.03.26

21
 ABSTRACT

Levitsky Alex „Heterosis estimation at sunflower (Helianthus annuus L.) based

on informatic algorithms”
PhD thesis in Biology, Chişinău, 2008, 112 p., 26 tab., 52 fig., 272 bibl. references.
Key words: sunflower, breeding, helianthinin, heterosis, informational systems.

The goal of the research includes adaptation and implementation of some

basically studies for their involving in crop breeding and seed control, which will stay
at the foundation of the concept of an informational system for the assistance in
sunflower investigations and breeding.
The researches were directed to the revealing of few morphological and
molecular features and their utilization in prognosis of hybrid vigor, both with
selection of most prospective inbred lines. Besides, it was done the evaluation of the
biological quality of the parental lines based on qualitative traits of the seeds, protein
spectra of helianthinin and PCR analyses using specific and SSR primers, which,
finally, were integrated in the structural and functional concept of the informational
system. Implementation of the dispersional and correlational analyses permit to
display those morphological and molecular features which correlate with the seed
productivity and the factors associated with heterosis manifestation.
Electrophoretic analysis of the helianthinin showed variability at the level of
β chain polypeptides of C subunit (Mr 20 – 25 kDa) and at the level of the stable to
dissociation component (58 and 61 kDa), which were used for the elaboration of the
standard spectra for every studied genotype, it’s frequency characterizing the
biological purity of the genotype. As the result, it was processed a method of
helianthinin extraction from a single seed and the strategy of its analysis for the
determination of biological purity of the sunflower genotypes (patent # 3324). Also,
there was proposed the method of the estimation of the level of hybridization based on
the SSR markers and the method of evaluation of the level of sterility in CMS lines,
both based on PCR technique.
All the outcomes of the investigations were put into the concept of the
Biological Informational System (BIS), which may become a strong tool including the
Data Base, considered as Support Informational System of data administration, and
with SSD component for the decision making, with large possibilities which facilitate
theoretical and practical researches of the sunflower biology and breeding.

22
 АННОТАЦИЯ

Левицкий Алексей «Определение гетерозиса у подсолнечника (Helianthus

annuus L.) с помощью информационных алгоритмов»
Диссертация доктора биологических наук, Кишинев, 2008, 112 стр., 26 таб.,
52 рис., 272 библ. ист.
Ключевые слова: подсолнечник, селекция, гелиантинин, гетерозис, БИС.

Цель исследований проведенных автором заключалась в адаптации и

внедрении некоторых методов фундаментальных исследований для их
использования в селекции и семеноводстве, а также в разработке концепции
информационной системы для изучения и селекции подсолнечника.
Исследования были направлены на выявление некоторых
морфофизиологических и молекулярных признаков для их использования в
предсказании эффекта гетерозиса и для выбора наиболее перспективных линий.
Кроме того, производилась биологическая оценка качества родительских линий
и их гибридов на основе количественных признаков, белкового спектра
гелиантинина и анализа ПЦР с применением специфичных и SSR праймеров,
которые, в конечном итоге, были использованы для разработки структурной и
функциональной концепции информационной системы в селекции
подсолнечника. Применение дисперсионного и корреляционного анализа
позволило выявить морфофизиологические и биохимические признаки, которые
коррелируют с продуктивностью семян, а также факторы, ассоциирующиеся с
проявлением гетерозиса.
С помощью электрофоретического анализа гелиантинина была показана
изменчивость полипептидов на уровне β цепи субъединицы С (Mr 20 – 25 кДа) и
на уровне компонента стабильного к диссоциации (58 и 61 кДа), на основе
которых были разработаны стандартные спектры для каждого изученного
генотипа, репрезентативность которых и определяла биологическую чистоту
генотипов. В результате данных исследований был разработан способ выделения
и электрофоретического разделения гелиантинина для определения
биологической чистоты (патент № 3324). К тому же, был предложен метод
оценки уровня гибридности в первом поколении с помощью маркеров SSR и
метод определения уровня стерильности ЦМС линий на основе ПЦР анализа.
Результаты исследований были заложены в концепцию Биологической
Информационной Системы (БИС), которая является важным инструментом,
включая в себя Информационную Систему Поддержки для администрирования
данных, и Систему поддержки принятия решений, с большими возможностями,
позволяющим облегчить теоретические и практические исследования в
биологии и селекции растений.

23